Abstract (CZ):
Extracelulární ATP a purinerginí P2 receptory (P2X a P2Y) hrají roli v signalizačním systému zvaném “purinergní signalizace”, který je hojně využíván jak somatickýmí tak nervovými tkáněmi, a působí také v endokrinním systému. Středem zájmu mé disertační práce je úloha a výskyt P2X a P2Y receptorů v hypotalamických supraoptických jádrech (SON) produkujících hormony vasopresin a oxytocin, a v suprachiasmatických jádrech (SCN), která představují centrum biologických hodin u savců.
V první části mé práce jsme testovali hypotézu, že P2X a P2Y receptory se účastní zvýšené tvorby a sekrece hormonů v magnocelulárních SON neuronech stimulovaných prostřednictvím experimentálního protokolu hladovění/ dokrmování. Studovali jsme účinek 2 hodinového dokrmování po 48 hodinovém hladovění na expresi hormonální, P2X a P2Y mRNA v SON tkáni u 30ti denních potkanů, a účinek aplikace ATP na elektrofyziologické vlastnosti SON neuronů v mozkových řezech kontrolního a experimentálního potkana. Kvantitativní real-time PCR analýza ukázala, že exprese mRNA pro P2X2 a arginin vasopresin (AVP) je zvýšena a exprese P2Y1 mRNA snížena u potkanů vystavených hladovění/dokrmování ve srovnání s kontrolami, zatímco hladiny mRNA pro P2X4, P2X7, P2Y2 a oxytocin nebyly významně změněny. Snímání z celé buňky technikou patch clamp ukázala, že amplituda ATP-evokovaného proudu a ATP stimulované zvýšení frekvence miniaturních GABAergních inhibičních postsynaptických proudů jsou významně zvýšeny v subpopulaci SON neuronů, pravděpodobných AVP neuronů, u potkanů dokrmovaných po vyhladovění. Tyto výsledky prokázaly, že zvýšená exprese a funkce P2X2 receptorů je úzce spřažena s komplexní stimulací SON neuronů a tvorbou AVP za podmínek fyziologicky stimulované sekrece tohoto hormonu. Ve druhé části mé disertační práce jsme testovali hypotézu, že aktivace P2X7 a P2Y receptorů, které mají v SCN tkáni relativně vysoké zastoupení na úrovni mRNA, přispívá k
rytmickému uvolňování ATP z SCN astrocytů. Tuto hypoyézu jsme testovali pomocí bioluminiscenčního měření ATP, imunohistochemie, elektrofyziologie a měření intracelulárního vápníku. Zjistili jsme, že rytmická akumulace extracelulárního ATP v mediu SCN organotypické kultury je inhibována
AZ10606120, A438079 a BBG, specifickými blokátory P2X7, a zvýšena GW791343, pozitivním
alosterickým modulátorem tohoto receptoru. Dvojité imunohistochemické značení prokázalo expresi P2X7 proteinu v astrocytech mozkového SCN řezu. Dále bylo nalezeno, že MRS2179, specifický antagonista P2Y1 receptoru, a carbenoxolon, blokátor kanálu pannexin 1, také částečně inhibovali akumulaci extracelulárního ATP. Tímto jsme zjistili, že SCN astrocyty využívají několika typů P2 receptorů a panexinový kanál k uvolňování ATP. Celkově tyto výsledky ukazují, že unikátní vlastnosti P2X receptorů mohou podporovat různé hypotalamické funkce, do kterých jsou zapojeny. Tyto výsledky jsou shrnuty ve dvou recenzovaných publikacích, jedné prvoautorské, které tvoří základ mé disertační práce.
