Summary of the doctoral thesis Autoreferát dizertační práce

Charles University Faculty of Science Study program: Biochemistry

Mgr. Michal Tupec

Functional analysis of insect fatty acyl-coenzyme A reductases and desaturases

Funkční analýza hmyzích reduktáz a desaturáz mastných acylkoenzymů A

Summary of the doctoral thesis Autoreferát dizertační práce

Supervisor: Ing. Iva Pichová, CSc.

Consultant: Prof. RNDr. Irena Valterová, CSc.

Prague 2023

Contents

I Summary of the doctoral thesis 3

1 Introduction 4

2 Aims 6

3 Result summaries 6

3.1 Publication I: Pheromone-biosynthetic FARs in bumble bees . . . 6

3.2 Publication II: A single specificity switch in moth desaturases . . . 8

3.3 Publication III: Proton transfer chain disruption in castor desaturase . . . 10

3.4 Publication IV: Insects as a source of enzymes for lipid biotechnology? . . . 11

4 Conclusions 12

II Autoreferát dizertační práce 14

7.2 Publikace II: Přepínaní specificity desaturáz u nočních motýlů . . . 19

7.3 Publikace III: Přerušení protonového přenosového řetězce u skočcové desaturázy 21 7.4 Publikace IV: Hmyz jako zdroj enzymů v biotechnologii lipidů? . . . 22

8 Závěry 23

Reference 25

Part I

Summary of the doctoral thesis

Abstract

Fatty acid-derived lipids are an important class of biomolecules. In addition to their primary role in cellular architecture, energy storage and signaling, they function in many other ways, e.g.

as isolating or waterproof coatings, defense compounds and pheromones. Multiple enzymes modify intermediates originating from fatty acid biosynthetic pathway, including desaturases (FADs) which synthesize unsaturated fatty acids, and reductases (FARs) which synthesize fatty alcohols. Functionally highly diversified fatty acyl-modifying enzymes from insects, one of the most abundant animals in the world, present a significant source for modern biotechnology of cell factories. This thesis summarizes available information on the FADs and FARs and describes the results which we have obtained while studying them.

In bumblebees, we identified several FAR transcripts which are abundantly expressed in male pheromone-producing tissue. We then functionally characterized the corresponding enzymes in yeasts, and estimated their participation in the biosynthesis of fatty alcohols ob- served in the marking pheromone-producing tissue. The studied enzymes reduce broad range of substrates, from short fatty acyls (e.g. C14) to very long ones (e.g. C26), from saturated fatty acyls to polyunsaturated ones. We also found that expansion and subsequent diversification of male-specific bumblebee FARs might have been driven by transposable elements adjacent to the FAR genes.

In addition, we studied the effect of various residues in the substrate tunnel on the speci- ficity of the hornworm FADs. Previous studies have pinpointed that the specificity switch be- tween evolutionarily related desaturases D2 and D3, which perform either Δ¹¹/conjugase or Δ¹⁴reaction, respectively, is governed by a single residue at the bend of the substrate tunnel.

We further expanded the set of residues of various properties at this position. Using bothin vitrofunctional characterization in yeasts and molecular dynamics simulations, we found that smaller, more hydrophilic residues, e.g. alanine and threonine, promote Δ¹¹/conjugase reaction in the desaturase. On the other hand, the bulkier, more hydrophobic residues, e.g. valine and isoleucine, promote Δ¹⁴reaction.

We also focused on evolutionarily unrelated soluble desaturase from castor in which we disrupted the proton transfer chain (PTC). We exchanged polar residues in the PTC for their homologous nonpolar counterparts from soluble methane monooxygenase (MMO). MMO

shares common active site architecture with the desaturase, but performs hydroxylation rather than desaturation. We found that the PTC mutations enhance minor hydroxylation channel in the desaturase, i.e. formation of alcohols, and they also promote formation of other minor oxygenated products, e.g. diols, allylic alcohols and epoxides.

1 Introduction

The thesis is dedicated to two types of enzymes whichreduceanddesaturate fatty acyls.

The products of reactions catalyzed by these enzymes are extremely important components for nearly all living organisms, ranging from ubiquitous unsaturated phospholipids regulating the fluidity of cellular membranes to unique plasmalogens in brain tissue, from energy-storing wax esters in some plant seeds to the sexual pheromones emitted in tiny quantities by female moths.

Fatty alcohols are long (>C10) linear alcohols which are synthesized from corresponding coenzyme A (CoA)-activated fatty acids by fatty acyl-CoA reductases (FARs;Fig. 1A) [1,2]. The majority of findings available to this day indicate that the FAR enzymes in general exhibit diverse substrate specificities while the chemical reaction they catalyze is rather a simple one. They act on quite a narrow substrate range in terms of the fatty acyl chain length (around 0–4 carbon atoms) and some of them can be very specific based on the unsaturation state of the substrate.

Animals, fungi and plants, and also some microorganisms, synthesize or consume fatty alcohols to support various vital functions [3]. For example, the fatty alcohols function as components of protective layers in plants [4–7], lubricants and plasmalogen precursors in birds and mammals [8,9] and components or precursors of insect pheromones [10–14].

The modulation of fluidity of cellular membranes largely depends on desaturases, which introduce double/triple bonds into the fatty acyl chain [15–17]. Based on their structure, there are essentially two types of desaturases: a) membrane-associated fatty acyl-CoA desaturases (mFADs;Fig. 1B), and b) soluble fatty acyl-(acyl carrier protein) (ACP) desaturases (sFADs;Fig.

1C). Both types are di-iron enzymes which contain a narrow tunnel-like substrate cavity ac- commodating the fatty acyl substrate.

The mFADs are a rich resource of enzymatic activities. Notably, some specialized desat- urases – conjugases and acetylenases – can catalyze 1,4-conjugation of a double bond to form two conjugated ones or desaturation of a pre-existing double bond to form a triple bond [18,19], respectively. The most abundant regiospecificity is Δ⁹, followed by Δ⁵, Δ⁶, Δ¹², and Δ¹⁵speci- ficities. The enzymatically highly diverged insect desaturases further broaden the unsaturated lipid repertoire with otherwise rare regiospecificities such as Δ⁴, Δ⁸, Δ¹⁰, Δ¹¹, Δ¹³and Δ¹⁴. The sFADs occur in some bacteria and in chloroplasts of plants [20,21], where they primarily synthe-

size oleoyl-ACP. Multiple desaturases have been characterized, with regiospecificities ranging from the most common Δ⁹to less common Δ⁶or Δ⁴, and chain length specificities ranging from the most common C18 to less common C16 or C14 [15,22–26]. Additionally, certain desaturases are bi-functional [26] and others can accept unsaturated substrates resulting in diunsaturated products [26,27].

O P NH O NH

O O

O OH

O S

O

P O NH O NH

O O

O OH

O S

O 14:ACP

sFAD

Fd

9Z-14:ACP

O2

O PO

NH

O O NH

O O P

O

O O OH O

N N

N N H2N

HO O O O P

O O S 12:CoA

mFAD

cyt b₅ O2

O SCoA 9E-12:CoA

cyt b₅ O2

O SCoA 8E10E-12:CoA O

PO NH

O O NH

O O P

O

O O OH O

N N

N N H2N

HO O O O P

O O S

FAR OH 7E9Z-12:CoA

7E9Z-12:OH NADPH

mFAD

A

B

C

Figure 1:Reactions catalyzed by the FARs and FADs.

The atoms/bonds at which the reactions took place are highlighted withgrey background.

(A) Reduction of acyl-CoA to alcohol product catalyzed by a FAR enzyme. Two molecules of NADPH are required. (B) Desaturation of acyl-CoA to mono- and diunsaturated products cat- alyzed by an mFAD enzyme. The enzyme is a bifunctional Δ⁹desaturase and 8,10-conjugase (Δ⁸Δ¹⁰ desaturase). cyt b₅is reduced cytochromeb₅ (two molecules). (C) Desaturation of acyl-ACP to unsaturated product catalyzed by an sFAD enzyme. The fatty acyl is coupled to 4’-phosphopantetheine moiety which is bound to a serine residue of the ACP.Fdis reduced ferredoxin (two molecules).

2 Aims

1. To characterize the enzymes which could be involved in the biosynthesis of fatty alcohols within male pheromone glands in three common bumble bee species.

2. To study the effect of rationally designed mutations in the substrate tunnel bend on specificity of a pheromone-biosynthetic desaturase from silk moth.

3. To study the effect of rationally designed mutations in the proton transfer chain on specificity of a chloroplastic desaturase from castor.

3 Result summaries

3.1 Publication I: Pheromone-biosynthetic FARs in bumble bees

The male marking pheromones of three common European bumble bees, the buff-tailed (Bom- bus terrestris), the white-tailed (B. lucorum) and the red-tailed (B. lapidarius) bumble bee (Hy- menoptera: Apidae), consist of various fatty acyl and isoprenoid derivatives [28,29]. Because previous study on mFADs from the same bumble bee species had not uncovered any specific enzyme which could explain the varying fatty alcohol composition of the marking pheromone [30], we set out to characterize FARs in order to map the pheromone-biosynthetic pathway further and possibly find enzymes with a more specialized function.

The original research article was published in 2019 as:

Michal Tupec, Aleš Buček, Václav Janoušek, Heiko Vogel, Darina Prchalová, Jiří Kindl, Tereza Pavlíčková, Petra Wenzelová, Ullrich Jahn, Irena Valterová, Iva Pichová: Expansion of the fatty acyl reductase gene family shaped pheromone communication in Hymenoptera. eLife. 2019, 8:e39231.

First, we performed gas chromatographic (GC) analyses of fatty alcohol and fatty acyl pools in male bumble bee labial gland (LG) as a site of marking pheromone biosynthesis. We found several saturated and unsaturated fatty alcohols and their potential precursor fatty acyls.

In addition to 16:OH, 9Z12Z15Z-18:OH and 9Z12Z-18:OH which are similarly abundant in bothB. terrestrisandB. lucorum, 15Z-20:OH, 15Z-22:OH and 20:OH are also present in larger quantity inB. terrestris. The LG of maleB. lapidariuscontains large quantities of 9Z-16:OH and 16:OH.

In order to identify the FARs for functional characterization, we sequenced fat body (FB) and LG transcriptomes in maleB. lapidarius. Out of all identified putative FAR transcripts inB.

terrestris(26) andB. lucorum(16) [30,31], andB. lapidarius(12) transcriptomes, a set of 10 highly

abundant candidates were chosen for transcript quantification by RT-qPCR: FAR-A1s and FAR- Js fromB. terrestris,B. lucorumandB. lapidarius, FAR-A2s fromB. terrestrisandB. lucorum, and FAR-A4 and FAR-A5 fromB. lapidarius. We confirmed the specific expression of some of the candidate FARs in male LGs.

Next, we cloned 9 candidate FARs and expressed them in yeast in order to characterize them functionally. The FAR-A1s fromB. terrestrisandB. lucorumand the FAR-Js reduce C16 to C26 acyls, with 22: and 24: being the most preferred acyls for the FAR-A1s and the FAR-Js, respectively. BlaFAR-A1 specifically produces only unsaturated alcohols 9Z-16:OH and 9Z- 18:OH. Similar preference towards unsaturated acyls (9Z-16:, and to a lesser extent 9Z-18:) is observed inBlaFAR-A4, yet this enzyme also efficiently reduces saturated 16: acyl.BlaFAR-A5 produces saturated 16:OH. The FAR-A2s produce only small quantities of 16:OH and 18:OH.

In addition, we performed several cultivations with precursors of potential FAR sub- strates which we detected in bumble bee tissues but which are not present in yeast cells. We found that bothBlaFAR-A1 andBlaFAR-A4 reduce common polyunsaturated acyls 9Z12Z-18:

and 9Z12Z15Z-18:, and that FAR-A1s fromB. terrestrisandB. lucorumproduce 15Z-20:OH from the corresponding substrate precursor supplemented to culture medium. We were able to correlate the specificities of several FAR enzymes to the fatty alcohols present in the male LG.

Several phylogenetic analyses have been performed to gain a better view at the evolu- tionary aspects of FAR family in insects. The FAR genes can be divided into 11 ortholog groups, FAR-A to FAR-K. We speculated that the overall large number of FAR-A orthologs might be specific exclusively for bumble bees (tribe Bombini). However, when more species from hy- menopteran clades are included into the phylogenetic analysis, FAR-A group expansion can be also observed in a sister group of bumble bees, the stingless bees (tribe Meliponini); at the same time, this gene expansion is absent in another close relative from the Apinae subfamily, the honey bee. In addition, the genes of FAR-A group tend to have more members with incomplete sequence compared to other groups.

Notably, while analyzing the shared syntenic blocks of FAR genes between bumble bees (B. terrestris) and honey bee, we noticed that most of the FAR-A genes inB. terrestrisare present in short read genomic regions which are not mapped to any chromosomes. On the contrary, the non-FAR-A genes localize to parts of theB. terrestrisgenome assembled to linkage groups. We found significant enrichment of transposable elements in the vicinity of FAR-A genes (50%) in B. terrestrisandB. impatiensgenomes, compared to non-FAR-A genes or other genes in general (10%). Thus the FAR-A group expansion in Bombini and Meliponini might have been facilitated by the transposable elements in close vicinity of the FAR-A genes.

My contribution

I extracted pheromones (fatty alcohols) and fatty acids from bumble bee tissues and analyzed them by GC. I isolated RNA from bumble bee tissues, reverse-transcribed it to cDNA and deter- mined FAR transcript levels using qPCR. I prepared cDNA library fromB. lapidariustissue and cloned its FAR sequences into a vector. I transformed several FAR-containing vectors intoS.

cerevisiaeand optimized the expression conditions on FAR5. I designed additional fatty acyls for supplementation of yeast. I expressed all cloned bumble bee FARs in yeast, and extracted and an- alyzed the lipids by GC. I performed statistical analysis of GC and RT-qPCR data. I drafted parts of the manuscript dealing with FAR cloning/functional characterization and bumble bee lipid analysis, participated in writing discussion, and prepared several figures, supplementary figures, tables and source data files. I participated in revisions and proof-reading of the manuscript.

3.2 Publication II: A single specificity switch in moth desaturases

Insect mFADs represent an immense source of desaturation activities with varying substrate length preference and regio- and stereospecificity. Their catalytic properties have been explored mainly through mutagenesis and functional characterization in yeast [32–38]. In recent years, structure prediction-based modeling has become increasingly useful tool to uncover possible structural features [37,39–43].

Recent studies on mFADs from a pest of Solanaceae plants, the tobacco hornworm (Man- duca sexta, Lepidoptera: Sphingidae), have focused on mapping of the female pheromone biosyn- thesis [32,44]. Ultimately, major pheromone-biosynthetic mFADs inM. sexta, were identified:

MseD2 andMseD3. These two enzymes substantially differ in specificity albeit being highly similar in sequence [32]. MseD2 Δ¹¹ desaturates 16:CoA to 11Z-16:CoA, and it also 10,12- conjugates 11Z-16:CoA into a mixture of 10E12E/Z-16:CoAs. The 10E12Ediene is then a sub- strate forMseD3 which converts it via Δ¹⁴desaturation to a mixture of 10E12E14E/Z-16:CoAs.

Notably, only 10E12Z-16:CoA and 10E12E14Z-16:CoA serve as precursors for corresponding fatty aldehydes in the pheromone.

Using reciprocal swapping experiments, the specificity switch betweenMseD2 andMseD3 was narrowed down to a single residue at position 224 (Ala224 inMseD2 and Ile224 inMseD3) which is located at a bend of the substrate tunnel near to the active site [32]. As a follow-up to these findings, we decided to study a mechanism controlling the specificity in moth desaturases by bothin vitromutagenesis andin silicoexperiments.

This research article was published in 2020 as:

Aleš Buček, Mario Vazdar, Michal Tupec, Aleš Svatoš, Iva Pichová: Desaturase specificity is controlled by the physicochemical properties of a single amino acid residue in the substrate binding tunnel.Computational and Structural Biotechnology Journal. 2020,18:1202–1209.

To uncover the factor(s) contributing to the specificity switching by the residue at po- sition 224, we first mutated this position bothMseD2 andMseD3 with small (glycine, alanine), mid-sized (threonine, valine) or bulky (isoleucine, phenylalanine) residues. We found that the mutant enzymes bearing the same residues at position 224 behave similarly, regardless whether they originate fromMseD2 orMseD3. With smaller/less hydrophobic alanine and threonine residues, the enzymes show 11Zdesaturase and 10,12-conjugase activities on 16: and 11Z- 16: substrates, respectively. In contrast, with bulkier/more hydrophobic valine and isoleucine residues, the specificity gradually shifts to Δ¹⁴. In addition, we found less strict position 224- based regulation of the Δ¹¹specificity with C14 substrates.

Next, we focused on pheromone-biosynthetic desaturase D1 from phylogenetically more distant silk moth (Bombyx mori, Lepidoptera: Bombycidae), specificity of which closely re- sembles that ofMseD2 [18] but probably evolved rather convergently [32]. When we mutated Thr227 inBmoD1 (homologous to position 224 inMseD2) to bulkier isoleucine residue found inMseD3, we observed a decrease in 11Z-16: production and a complete loss of conjugase ac- tivity. At the same time, this mutation conferred a novel Δ¹⁴desaturase activity on the mutant D1. By mutatingBmoD1 using the same criterion as inM. sextadesaturases, i.e. side chain vol- ume in the substrate tunnel bend, we changed the native specificity of this enzyme (functionally homologous toMseD2) towards a specificity resembling that ofMseD3.

Subsequently, we constructed structural models of MseD2 and the mutants (glycine, threonine, valine, isoleucine and phenylalanine residues at position 224). In order to better understand the observed specificity switching, we performedin silicosimulations and quantum chemical calculations on complexes of the enzymes with 16:CoA which is a native substrate of MseD2 (Δ¹¹desaturation), and then with 10E12E-16:CoA which is a native substrate ofMseD3 (Δ¹⁴desaturation). We focused on substrate approach to the active site, represented by a number of contacts (< 0.7 Å) and an average distance between metal ions and the C–C bond being desat- urated, and on substrate dynamics, represented by a time evolution of distances and a standard deviation of distances between metal ion and the C–C bond being desaturated. In summary, the combination of number of contacts and average distance quite reliably predicts the functional- ity of the enzymes in Δ¹¹and Δ¹⁴desaturation reactions with mid-sized amino acid residues, e.g. those of wild typeMseD2, and ofMseD2-224T,MseD2-224V andMseD2-224I mutants.

However, we still lack mechanistic explanations for simulations with glycine (i.e. small) and phenylalanine (i.e. large, aromatic, hydrophobic) residues.

My contribution

I cloned the optimized sequence ofBmoD1 and its mutant into a yeast vector. I expressed both enzymes in yeast with supplementation by synthetic precursors, and extracted and analyzed

the lipids by GC. I drafted parts of the manuscript dealing with functional characterization of BmoD1 mutant, and participated in writing discussion. I participated in revisions and proof- reading of the manuscript.

3.3 Publication III: Proton transfer chain disruption in castor desat- urase

The Δ⁹desaturase from castor,Ricinus communis(Malpighiales: Euphorbiaceae), orRcoΔ⁹D, has been an extensively studied enzyme model with focus on mechanism of catalysis and in- teractions with reaction partners [45–52]. Recent computational studies have shown that there is a fragile balance between desaturation and hydroxylation channels during the sFAD reac- tion [50,51]; the desaturation channel depends on the access of protons to the active site. These protons are presumably channeled onto Glu105 by one of the proposed proton transfer chains (PTCs), which are conserved in plants and also in some bacteria [51]. If either electron or proton transfer to the active site is impaired, it could possibly result in a different reaction outcome, e.g. hydroxylation of the substrate.

Despite reactivities other than desaturation, including hydroxylation, have been reported inRcoΔ⁹D and several mutants [53–58], these were observed only with substrates which have been already pre-oxidized by functionalization of C–H or C–C bond(s). So far there has been no example of unactivated alkane chain hydroxylation by a single sFAD reaction. We decided to test the hydroxylating potential ofRcoΔ⁹D by disrupting its PTC and characterizing the mutants usingin vitroreactions.

Our research article was published in 2022 as:

Michal Tupec, Martin Culka, Aleš Machara, Stanislav Macháček, Daniel Bím, Aleš Svatoš, Lubomír Rulíšek, Iva Pichová: Understanding desaturation/hydroxylation activity of castor stearoyl Δ⁹- desaturase through rational mutagenesis. Computational and Structural Biotechnology Journal.

2022,20:1378–1388.

We decided to disrupt the PTC A and designed the individual mutations based on a se- quence of structurally similar soluble methane monooxygenase (MMO) [59]. Interestingly, in addition to its native hydroxylation reaction on methane, the MMO is able to catalyze side de- saturation reaction on pre-oxidized substrates like ethylbenzene or cyclohexadiene [60]. The amino acid residues in MMO at positions which are structurally homologous to those in PTC A of Δ⁹D are fairly non-polar (isoleucine, valine, phenylalanine) [61], so they could considerably impede the proton transfer efficiency towards the active site. We constructed four mutants in total: Δ⁹D-101I and Δ⁹D-203I aiming individually at the residues common to both PTCs, Δ⁹D- 101I203I which combines the latter two single mutants, and Δ⁹D-101I203I206V222F which

makes the swapping in the proposed PTC A complete.

Next, we expressed and purified all mutants and wild type Δ⁹D, and we tested their desaturase activities using 18:CoA as a substrate. We used GC to analyze the components of de- saturase reactions. We found that the all mutants 9Z-desaturate 18:CoA to oleoyl-CoA, but the accumulation of PTC-disruptive mutations gradually decreases the activity, i.e. the quadruple mutant is the least active. Surprisingly, we also detected small amounts (up to tenths of % in ab- solute numbers) of hydroxylated C18s in all reaction mixtures containing desaturase, even wild type Δ⁹D, which were identified as mainly 9-, 10- and 11-monohydroxylated 18: acyls. There is a clear (almost 100-fold) shift in relative specificity from almost exclusively desaturation-specific wild type Δ⁹D to more hydroxylation-prone mutant Δ⁹D-101I203I206V222F.

We also detected diol, epoxide and enol structures in the reaction mixtures of wild type Δ⁹D and the mutants. These were the result of a secondary oxidation of the native product 9Z- 18:CoA rather than 18:CoA [57,58], and we identified them primarily aserythro-9,10-dihydroxy- 18: andcis-9,10-epoxy-18:. In addition, we tested 9-OH-18:CoA and 11-OH-18:CoA, prepared enzymatically by FadD ligase, as potential substrates. With the former, we detectederythro-9,10- dihydroxy-18: as product, and with the latter, we detected diol and allylic alcohol products.

My contribution

I cloned wild type and double/quadruple Δ⁹D mutants into a vector. I participated inE. coli expression and chromatographic purification of wild type and all mutant Δ⁹Ds. I expressed and purifiedEcoFadD fromE. coliand optimized the acyl-CoA coupling reaction conditions. I took part in carrying out preparative enzymatic coupling reactions and in product purification using HPLC. I proposed target structures for organic synthesis and prepared GC standards from the synthetic precursors. I performed desaturase reactions with four different substrates, and extracted and analyzed the products by GC-MS. I performed statistical analysis of GC-MS data.

I participated in drafting a part of introduction and drafted results/discussion and methods sections. I prepared several figures, supplementary figures/tables and the graphical abstract. I participated in revisions and proof-reading of the manuscript.

3.4 Publication IV: Insects as a source of enzymes for lipid biotechnol- ogy?

An alternative way of fine chemical production lies in bio-based approach using engineered enzymes and microorganisms. In order to achieve this, we need a large enough array of tools (e.g. enzymes) of known function at our disposal; transcriptome and genome-based functional characterization of newly described putative enzymes is a centerpiece to mapping the available

sequence–function space.

Insects represent an immense source of various enzymes which could be used in the ever growing field of cell factories. Several patents have been filed in recent years employing insect-derived FARs, mFADs and other fatty acid-modifying enzymes, in order to produce fatty alcohols or unsaturated fatty acyls in yeasts [62–66].

Our review article was published in 2017 as:

Michal Tupec, Aleš Buček, Irena Valterová, Iva Pichová: Biotechnological potential of insect fatty acid-modifying enzymes. Zeitschrift für Naturforschung C – Journal of Biosciences. 2017, 72(9–10):387–403.

In this review, we provide the first comprehensive overview of functionally character- ized mFADs and FARs from several insect orders (Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Orthoptera and Hymenoptera). The two lists contain more than 70 mFADs and more than 20 FARs includ- ing information on both major and minor products and on expression system. In addition, we provide a brief summary on structural and sequence determinants of mFADs and FARs, and we discuss potential challenges of insect enzyme usage in expression hosts. The review can act as a starting point for biotechnologists searching for a specific enzyme while designing a route towards fatty acid or fatty alcohol production.

My contribution

I drafted parts of the manuscript dealing with FARs (including Table 2), participated in writing the section on applications, and drafted the figures. I participated in revisions and proof-reading of the manuscript.

4 Conclusions

• The fatty alcohols detected in male bumble bee labial glands (LGs) partially correspond to the specificities of fatty acyl-CoA reductases (FARs) which exhibit abundant and spe- cific expression in the LGs. All of these LG-specific FARs belong to a single orthologous group FAR-A. Phylogenetic analysis shows an expansion of FAR-A group only among the species of bumble bees (Bombini) and stingless bees (Meliponini). Notably, we de- tected transposable elements in the vicinity of FAR-A genes in two bumble bee genomes.

The TE-mediated duplications thus might play an important role in FAR evolution in Hymenoptera.

• Introduction of identical residues at position 224 in desaturases D2 and D3 fromMan- duca sextaresults in similar effects on specificity. The switching between Δ¹¹/conjugase specificity and Δ¹⁴specificity likely manifests due to changes in residue bulkiness and

hydrophobic effect. With smaller and more hydrophilic residues, both desaturases per- form Δ¹¹desaturation and 1,4-conjugation. On the other hand, with larger and more hydrophobic residues, the specificity shifts in both enzymes towards Δ¹⁴desaturation.

Notably, in Δ¹¹desaturase/conjugase D1 from evolutionarily more distant lepidopteran, Bombyx mori, the tunnel bend residue-derived specificity switching is also conserved.

• Disruption of a proton transfer chain (PTC) in soluble Δ⁹desaturase fromRicinus com- munisby introducing homologous residues from methane monooxygenase leads to in- creased substrate hydroxylation. Furthermore, aside from alcohols, the mutations pro- mote formation of other oxygenated products, e.g. allylic alcohols, epoxides and diols.

The desaturase accepts not only saturated and monounsaturated fatty acyls as substrates, but also monohydroxylated fatty acyls. The effect of PTC disruption can be explained by a limited access of protons to the active site which are necessary for water release during desaturation reaction.

Část II

Autoreferát dizertační práce

Abstrakt Abstrakt

Lipidy odvozené od mastných kyselin představují důležité biomolekuly. Kromě své hlavní role při stavbě buněk, ukládání energie a signalizaci, slouží celé řadě dalších funkcí, např. jako izo- lační či nesmáčivé povrchy, obranné látky a feromony. Na úpravách intermediátů vznikajících při biosyntéze mastných kyselin se podílí celá řada enzymů, mezi něž se řadí např. i desatu- rázy, které syntetizují nenasycené mastné kyseliny, a reduktázy, jež syntetizují mastné alkoholy.

Funkčně vysoce diverzifikované desaturázy a reduktázy z hmyzu, jakožto jedněch z nejhojněji zastoupených zvířat na světe, představují podstatný zdroj pro moderní biotechnologii buněč- ných továren. Tato práce shrnuje dostupné informace o reduktázách a desaturázách a popisuje výsledky, které jsme při jejich studiu získali.

U čmeláků jsme identifikovali několik reduktázových transkriptů, jež jsou hojně za- stoupeny v samčí feromonové žláze. Příslušné enzymy jsme následně funkčně charakterizovali v kvasinkách a odhadli jejich zapojení do biosyntézy mastných alkoholů v tkáni produkující značkovací feromon. Studované enzymy redukují širokou řadu substrátů, od krátkých mast- ných acylů (C14) až po velmi dlouhé (C26), od nasycených mastných acylů po polynenasycené.

Dále jsme poukázali na to, že na expanzi a následném funkčním rozrůznění čmeláčích reduk- táz, které se vyskytují převážně u samců, se nejspíše podílely transpozony, jichž jsme poblíž reduktázových genů nalezli zvýšené množství.

Dále jsme sledovali vliv různých aminokyselinových zbytků v substrátovém tunelu na specificitu desaturáz z lišaje. Předchozí práce odhalily přepínání specificity mezi Δ¹¹/konjugázovou a Δ¹⁴reakcí u dvou evolučně blízkých desaturáz D2 a D3 založeném na jediném zbytku umís- těném v ohybu substrátového tunelu. Na tuto pozici v enzymu jsme postupně zavedli další zbytky s různými vlastnostmi. Kombinací funkční charakterizace v kvasinkách a molekulárně- dynamických simulací jsme zjistili, že menší hydrofilnější zbytky jako alanin či threonin podpo- rují u enzymu D2 a D3 Δ¹¹/konjugázovou reakci, kdežto větší hydrofobnější zbytky jako valin nebo izoleucin vedou spíše k Δ¹⁴reakci.

Zaměřili jsme se také na evolučně nepříbuznou rozpustnou desaturázu ze skočce, v níž jsme uměle přerušili řetězec pro přenos protonů záměnou zbytků tohoto řetězce za homologní

zbytky z rozpustné methanmonooxygenázy, která má podobnou architekturu aktivního místa, ale místo desaturace hydroxyluje. Zjistili jsme, že mutace v protonovém přenosovém řetězci desaturázy zvyšují úroveň minoritního hydroxylačního kanálu, tj. tvorby alkoholů, a zvyšují tvorbu dalších kyslíkatých produktů jako diolů, allylalkoholů a epoxidů.

5 Úvod

Dizertace se věnuje dvěma druhům enzymů, ježredukujíadesaturují mastné acyly. Pro- dukty reakcí katalyzovaných těmito enzymy tvoří velmi důležitou součást téměř všech živých organizmů, od nenasycených fosfolipidů regulujících fluiditu buněčných membrán po unikátní plasmalogeny v mozkové tkáni, od voskových esterů ukládajících energii v semenech některých rostlin po sexuální feromony emitované ve velmi drobných množstvích samičkami můr.

Mastné alkoholy jsou dlouhé (>C10) lineární alkoholy syntetizované z příslušných ko- enzymem A (CoA) aktivovaných mastných kyselin pomocí reduktáz mastných acyl-CoA (FAR;

Fig. 2A) [1,2]. Většina dostupných zjištění ukazuje, že přestože je reakce, kterou katalyzují, po- měrně jednoduchá, mají FAR obecně velmi různorodé substrátové specifity. Často působí na omezeném souboru substrátů, co se týče délky řetězce (rozdíl přibližně 0–4 uhlíkových atomů), a substráty mohou rozlišovat i na úrovni jejich nenasycenosti. Zvířata, houby a rostliny včetně některých mikroorganizmů podporují biosyntézou či konzumací mastných alkoholů své různé životní funkce [3]. Mastné alkoholy fungují například jako složky ochranných vrstev u rost- lin [4–7], lubrikanty a prekurzory plasmalogenů u ptáků a savců [8,9] a složky či prekurzory hmyzích feromonů [10–14].

Modulace fluidity buněčných membrán do velké míry závisí na činnosti desaturáz, jež zavádějí dvojné/trojné vazby do řetězců mastných acylů [15–17]. Na základě své struktury se desaturázy dělí na dva typy: a) membránové desaturázy mastných acyl-CoA (mFAD;Fig. 2B) a b) rozpustné desaturázy mastných acyl-(proteinů přenášejících acyly) (ACP) (sFAD;Fig. 2C).

Oba typy obsahují dva ionty železa a úzkou substrátovou dutinu, která připomíná tunel a pojme substrát mastný acyl substrátu.

Enzymy mFAD představují bohatý zdroj enzymových aktivity. Specializované desatu- rázy, konjugázy a acetylenázy, například katalyzují 1,4-konjugaci nebo desaturaci dvojných va- zeb za vzniku dvou konjugovaných vazeb či jedné trojné vazby [18,19]. Nejčastější regiospecifi- tou je Δ⁹následovaná Δ⁵, Δ⁶, Δ¹², a Δ¹⁵. Enzymově velmi divergované hmyzí desaturázy navíc rozsah regiospecifit dále rozšiřují o vzácné Δ⁴, Δ⁸, Δ¹⁰, Δ¹¹, Δ¹³and Δ¹⁴. Enzymy sFAD se vysky- tují u některých bakterií a v chloroplastech rostlin [20,21], kde primárně syntetizují oleoyl-ACP.

Mnoho sFAD již bylo charakterizováno, přičemž popsané regiospecifity se pohybují od nejčas-

tější Δ⁹až po méně časté Δ⁶or Δ⁴a popsané specifity z hlediska délky řetězce se pohybují od nejčastější C18 po méně časté C16 nebo C14 [15,22–26]. Byly objeveny bifunkční sFAD [26] a rovněž takové, které přijímají nenasycené substráty [26,27].

O P NH O NH

O O

O OH

O S

O

O P NH O NH

O O

O OH

O S

O 14:ACP

sFAD

Fd

9Z-14:ACP

O2

O PO

NH

O O NH

O O P

O

O O OH N O

N

N N H2N

HO O O O P

O O S 12:CoA

mFAD

cyt b₅ O2

O SCoA 9E-12:CoA

cyt b₅ O₂

O SCoA 8E10E-12:CoA O

PO NH

O O NH

O O P

O

O O OH N O

N

N N H2N

HO O O OP

O O S

FAR OH 7E9Z-12:CoA

7E9Z-12:OH NADPH

mFAD

A

B

C

Obrázek 2:Reakce katalyzované enzymy FAR a FAD.

Atomy/vazby, na nichž reakce proběhly, jsou zvýrazněny šedým pozadím. (A) Redukce of acyl- CoA na alkoholový produkt katalyzovaná FAR, jež vyžaduje dvě molekuly NADPH. (B) Desatu- race acyl-CoA na jedno- a dvounenasycené produkty katalyzovaná mFAD. Enzym je bifunkční Δ⁹ desaturáza a 8,10-konjugáza (Δ⁸Δ¹⁰ desaturáza).cyt b5je redukovaný cytochromb₅ (dvě molekuly). (C) Desaturace acyl-ACP na nenasycený produkt katalyzovaná sFAD. Mastný acyl je připojen k serinovému zbytku ACP skrze 4’-fosfopantetheinovou skupinu.Fdje redukovaný ferredoxin (dvě molekuly).

6 Cíle

1. Charakterizovat enzymy, které by se mohly podílet na biosyntéze mastných alkoholů v samčí feromonové žláze u tří běžně se vyskytujících čmeláků.

2. Popsat vliv racionálně navržených mutací v ohybu substrátového tunelu na specificitu desa- turázy, která se podílí na biosyntéze feromonu u bource.

3. Popsat vliv racionálně navržených mutací v protonovém přenosovém řetězci na specificitu chloroplastové desaturázy ze skočce.

7 Shrnutí výsledků

7.1 Publikace I: Čmeláčí reduktázy podílející se na biosyntéze feromonu

Samčí značkovací feromon tří běžných evropských čmeláků (blanokřídlí: včelovití), zemního (Bombus terrestris), hájového (B. lucorum) a skalního (B. lapidarius) se skládá z různých derivátů mastných acylů a isoprenoidů [28,29]. Jelikož se během předchozí práce na enzymech mFAD ze stejných čmeláčích druhů nepodařilo popsat specifické enzymy, které by mohly být zodpovědné za odlišné zastoupení mastných alkoholů ve značkovacím feromonu [30], zaměřili jsme se na enzymy FAR, abychom mapovali biosyntetickou dráhu feromonu dále a potenciálně odhalili druhově specifické enzymy.

Původní článek byl zveřejněn v roce 2019 jako:

Michal Tupec, Aleš Buček, Václav Janoušek, Heiko Vogel, Darina Prchalová, Jiří Kindl, Tereza Pavlíčková, Petra Wenzelová, Ullrich Jahn, Irena Valterová, Iva Pichová: Expansion of the fatty acyl reductase gene family shaped pheromone communication in Hymenoptera.eLife. 2019, 8:e39231.

Nejprve jsme provedli plynově-chromatografické analýzy směsí mastných alkoholů a acylů v samčí labiální žláze (LŽ), která je místem produkce značkovacího feromonu. Nalezli jsme řadu nasycených i nenasycených mastných alkoholů a jejich potenciálních prekurzorů, mastných acylů. Kromě 16:OH, 9Z12Z15Z-18:OH a 9Z12Z-18:OH hojně zastoupených vB.

terrestrisiB. lucorumjsme u B. terrestrisodhalili i vyšší množství 15Z-20:OH, 15Z-22:OH a 20:OH. LŽ samcůB. lapidariusobsahuje velké množství 9Z-16:OH and 16:OH.

Abychom vybrali kandidátní FAR k funkční charakterizaci, nejprve jsme sekvenovali transkriptomy tukového tělesa a LŽ samcůB. lapidarius. Ze všech identifikovaných transkriptů domnělých FAR v transkriptomechB. terrestris(26) aB. lucorum(16) [30,31] aB. lapidarius(12) jsme vybrali sadu 10 vysoce zastoupených FAR k jejich stanovení pomocí kvantitativní PCR s reverzní transkripcí: transkripty FAR-A1 a FAR-J zB. terrestris,B. lucorumaB. lapidarius, transkripty FAR-A2 zB. terrestrisaB. lucoruma FAR-A4 a FAR-A5 zB. lapidarius. U některých kandidátních FAR jsme potvrdili specifickou expresi v samčích LŽ.

Dále jsme klonovali 9 kandidátních FAR a exprimovali je v kvasinkách, abychom je funkčně charakterizovali. Enzymy FAR-A1 zB. terrestrisaB. lucoruma FAR-J redukují acyly C16 až C26, přičemž nejvíce preferovaný acyl je 22: u enzymů FAR-A1 a 24: u enzymů FAR-J.

BlaFAR-A1 specificky produkuje pouze nenasycené 9Z-16:OH a 9Z-18:OH. Podobnou prefe- renci k nenasyceným acylům (9Z-16: a méně i 9Z-18:) jsme pozorovali uBlaFAR-A4, avšak tento enzym zároveň efektivně redukuje acyl 16:;BlaFAR-A5 produkuje nasycený 16:OH. En- zymy FAR-A2 produkují jen malá množství 16:OH a 18:OH.

Navíc jsme provedli řadu kultivací s prekurzory potenciálních substrátů FAR, jejichž pří- slušné alkoholy jsme detekovali ve tkáních čmeláků, ale které nejsou přítomny v kvasinkových buňkách. Zjistili jsme, že z prekurzorů přidaných do médiaBlaFAR-A1 aBlaFAR-A4 redukují polynenasycené acyly 9Z12Z-18: a 9Z12Z15Z-18: běžně se vyskytující uB. terrestrisaB. lu- corum, a že enzymy FAR-A1 zB. terrestrisaB. lucorumprodukují 15Z-20:OH. Byly jsme tak schopni korelovat specifity některých FAR s mastnými alkoholy přítomnými v samčí LŽ.

V průběhu práce jsme provedli několik fylogenetických analýz s cílem lépe porozumět evolučním aspektům u enzymové rodiny FAR u hmyzu. Geny FAR se zde dělí na 11 ortologních skupiny, FAR-A až FAR-K. Spekulovali jsme nejprve o tom, že zvýšené množství genů ve skupině FAR-A je specifické výhradně pro členy tribu čmeláků (Bombini). Nicméně po zahrnutí dalších kladů blanokřídlého hmyzu do analýzy jsme podobnou expanzi v počtu genů FAR-A skupiny detekovali také u bezžihadlových včel (Meliponini), tj. sesterského tribu čmeláků, ale už nikoliv u včely medonosné jako dalšího blízce příbuzného zástupce podčeledi Apinae. Geny skupiny FAR-A mají navíc oproti jiným skupinám častěji nekompletní nukleotidovou sekvenci.

Při srovnávání syntenických segmentů u genů FAR ze čmeláků (B. terrestris) a včely jsme si rovněž všimli, že většina genů FAR-A uB. terrestrisse nachází v částech genomu pokrytých pouze krátkými úseky sekvencí a tudíž nemapovaných na žádný z chromozomů; naopak ostatní FAR geny se nachází v částech genomu, jež jsou pokryty vazebnými skupinami. Dále jsme v genomechB. terrestrisaB. impatiensnalezli zvýšenou koncentraci transpozibilních elementů v blízkosti genů FAR-A (50 %) v porovnání s ostatními geny FAR i ostatními geny (10 %). Specifická expanze skupiny FAR-A u tribů Bombini a Meliponini tudíž mohla být umožněna právě těmito transpozibilními elementy.

Mé přispění

Extrahoval jsem feromony (mastné alkoholy) a mastné kyseliny ze tkání čmeláků a následně je analyzoval pomocí plynové chromatografie. Izoloval jsem RNA ze tkání čmeláků, provedl její přepis do cDNA a stanovil hladiny transkriptů reduktáz využitím kvantitativní PCR. Připravil jsem cDNA knihovnu ze tkáněB. lapidariusa klonoval sekvence FAR do vektoru. Transfor- moval jsem řadu vektorů obsahujících sekvence FAR do kvasinek a optimalizoval podmínky

exprese na enzymu FAR5. Navrhl jsem mastné kyseliny pro dodatečné kultivace se suplemen- tací. Exprimoval jsem všechny klonované reduktázy ze čmeláků v kvasinkách a poté extrahoval a analyzoval lipidy pomocí plynové chromatografie. Provedl jsem statistickou analýzu dat z ply- nové chromatografie a RT-qPCR. Navrhl jsem části rukopisu zabývající se klonováním a funkční charakterizací FAR a analýz lipidů ze čmeláků, podílel jsem se na psaní diskuze a připravil jsem řadu obrázků, doplňujících obrázků a tabulek a souborů zdrojových dat. Podílel jsem se na re- vizích a závěrečné kontrole rukopisu.

7.2 Publikace II: Přepínaní specificity desaturáz u nočních motýlů

Hmyzí mFAD představují nesmírný zdroj desaturačních aktivit s různorodou preferencí pro délku řetězce substrátu a regio- a stereospecifitou. Jejich katalytické vlastnosti byly zatím studo- vány prostřednictvím mutageneze a funkční charakterizace v kvasinkách [32–38]. V posledních letech zároveň při zkoumání strukturních zákonitostí funkce vzrůstá vliv modelů získaných predikcemi [37,39–43].

Nedávné práce na enzymech mFAD z lišaje tabákového (Manduca sexta, motýli: lišajo- vití), škůdce rostlin z čeledi lilkovitých, byly zaměřeny na mapování biosyntézy samičího fero- monu [32,44]. Výsledkem byla identifikaceMseD2 aMseD3 jako dvou mFAD zodpovědných za biosyntézu feromonu. Oba enzymy se od sebe značně liší ve specifitě, ačkoliv jsou si velmi sek- venčně podobné [32].MseD2 Δ¹¹-desaturuje 16:CoA na 11Z-16:CoA a rovněž 10,12-konjuguje 11Z-16:CoA na směs 10E12E/Z-16:CoA. Dien 10E12Edále slouží jako substrátMseD3, která jej pomocí Δ¹⁴desaturace převádí na směs 10E12E14E/Z-16:CoA. Jako prekurzory příslušných mastných aldehydů ve feromonu přitom slouží pouze 10E12Z-16:CoA i 10E12E14Z-16:CoA.

Pomocí recipročních záměn byl funkce přepínače specifity meziMseD2 aMseD3 zúžena na jediný zbytek v pozici 224 (Ala224 uMseD2 a Ile224 uMseD3), který se nachází v ohybu sub- strátového tunelu poblíž aktivního místa [32]. Rozhodli jsme se na tato zjištění navázat dalšími mutačními experimenty ain silicovýpočty.

Původní práce byla vydána v roce 2020 jako:

Aleš Buček, Mario Vazdar, Michal Tupec, Aleš Svatoš, Iva Pichová: Desaturase specificity is con- trolled by the physicochemical properties of a single amino acid residue in the substrate binding tunnel.Computational and Structural Biotechnology Journal. 2020,18:1202–1209.

Abychom odhalili potenciální faktory přispívající k přepínání specifity pomocí zbytku na pozici 224, mutovali jsme postupně tento zbytek uMseD2 iMseD3 za malé (glycinový, alani- nový), středně velké (threoninový, valinový) nebo objemné (isoleucinový, fenylalaninový) zbytky.

Zjistili jsme, že mutované enzymy nesoucí stejné zbytky na pozici 224 se chovají podobně nezá- visle na tom, zda jsou odvozené odMseD2 neboMseD3. U malých a méně hydrofobních zbytků

alaninu a threoninu enzymy vykazují 11Zdesaturázovou a 10,12-konjugázovou aktivitu na sub- strátech 16: a 11Z-16:. Naproti tomu u větších a hydrofobnějších zbytků valinu a isoleucinu se specifita posouvá k Δ¹⁴. Dále jsme objevili, že výše popsaná regulace dle zbytku na pozici 224 je v případě Δ¹¹desaturačních reakcí s kratším substrátem 14: méně striktní.

Poté jsme se zaměřili na desaturázu D1 biosyntetizující feromon u fylogeneticky vzdá- lenějšího bource morušového (Bombyx mori, motýli: bourcovití). Ačkoliv se specifitaBmoD1 velmi blížíMseD2 [18], u obou enzymů se spíše předpokládá konvergentní vývoj [32]. Jakmile jsme mutovali Thr227 uBmoD1, jenž je homologní k pozici 224 uMseD2, na objemnější zbytek isoleucinu nacházející se na téže pozici uMseD3, u mutantního enzymu jsme pozorovali sní- žení tvorby 11Z-16: a úplnou ztrátu konjugázové aktivity. Tato mutace však u stejného enzymu zároveň vedla ke vzniku nové Δ¹⁴desaturázové aktivity. Mutací dle podobného kritéria jako u desaturáz zM. sexta, tj. dle objemnosti postranního zbytku v ohybu substrátového tunelu, jsme tak změnili nativní specifitu tohoto enzymu, která se podobáMseD2, na specifitu připomínající MseD3.

Také jsme vytvořili strukturní modelyMseD2 a mutantů (se zbytky glycinu, threoninu, valinu, isoleucinu and fenylalaninu na pozici 224). Na komplexech těchto enzymů s 16:CoA, tj.

nativním substrátemMseD2 (pro Δ¹¹desaturaci), jsmein silicoprovedli simulace a kvantově- chemické výpočty,abychom lépe porozuměli pozorovanému přepínání specifity. Simulace a výpočty jsme rovněž provedli analogicky s 10E12E-16:CoA, tj. nativním substrátemMseD3 (pro Δ¹⁴desaturaci). Během in silicoexperimentů jsme se zaměřovali na přístup substrátu k aktivnímu místu, reprezentovaný počtem kontaktů (< 0.7 Å) a průměrnou vzdáleností mezi ionty kovu a desaturovanou vazbou C–C, a na dynamiku substrátu, reprezentovanou časovým vývojem a standardní odchylkou vzdáleností mezi ionty kovu a desaturovanou vazbou C–C.

Výsledky je možné shrnout tak, že počet kontaktů a průměrná vzdálenost poměrně spoleh- livě předpovídají rozsah funkcí enzymů při Δ¹¹a Δ¹⁴desaturačních reakcích, nejlépe v případě středně objemných zbytků, tj. uMseD2 a mutantůMseD2-224T,MseD2-224V aMseD2-224I.

Stále však chybí mechanistické vysvětlení simulací se zbytky glycinu (malým zbytkem) a feny- lalaninu (objemným, aromatickým a hydrofobním zbytkem).

Mé přispění

Klonoval jsem optimalizované sekvenceBmoD1 a jejího mutanta do kvasinkového vektoru. Ex- primoval jsem oba enzymy v kvasinkách za suplementace syntetickými prekurzory a extraho- val a analyzoval lipidy pomocí plynové chromatografie. Navrhl jsem části rukopisu zabývající se funkční charakterizací mutovanéBmoD1 a podílel se na psaní diskuze. Podílel jsem se na revizích a závěrečné kontrole rukopisu.

7.3 Publikace III: Přerušení protonového přenosového řetězce u skoč- cové desaturázy

Δ⁹desaturáza ze skočce obecného (Ricinus communis; malpígiotvaré: pryšcovité) neboliRcoΔ⁹D je z hlediska mechanizmu katalýzy a interakcí s reakčními partnery důkladně studovaným en- zymovým modelem [45–52]. Podle nedávných výpočetních prací se během reakcí katalyzova- ných enzymy sFAD uplatňuje křehká rovnováha mezi desaturačním a hydroxylačním kaná- lem [50,51], přičemž desaturační kanál závisí na přístupu protonů k aktivnímu místu. Tyto protony jsou na Glu105 pravděpodobně přivedeny jedním z navrhovaných protonových pře- nosových řetězců (PTC), jež jsou konzervované napříč rostlinami a některými bakteriemi [51].

Dojde-li k narušení přenosu elektronů či protonů k aktivnímu místu, reakce může vést jiným směrem, např. k hydroxylaci substrátu.

Ačkoliv byly uRcoΔ⁹D a několika mutantů popsány reaktivity jiné než desaturační včetně hydroxylačních [53–58], byly vždy pozorovány pouze na substrátech předem oxidovaných funk- cionalizací vazeb C–H nebo C–C a zatím nebyla popsána žádná jednokroková hydroxylace ne- aktivovaného alkanového řetězce pomocí sFAD. Rozhodli jsme se tedy ověřit hydroxylační po- tenciálRcoΔ⁹D přerušením PTC a následnou charakterizací mutantů při reakcíchin vitro.

Náš původní článek byl zveřejněn v roce 2022 jako:

Michal Tupec, Martin Culka, Aleš Machara, Stanislav Macháček, Daniel Bím, Aleš Svatoš, Lubo- mír Rulíšek, Iva Pichová: Understanding desaturation/hydroxylation activity of castor stearoyl Δ⁹-desaturase through rational mutagenesis.Computational and Structural Biotechnology Jour- nal. 2022,20:1378–1388.

Pro přerušení jsme zvolili řetězec A a navrhli mutace na základě sekvence strukturně podobné rozpustné methanmonooxygenázy (MMO) [59]. Je zajímavým faktem, že MMO je kromě nativní hydroxylační reakce s methanem schopná desaturovat předem oxidované (ak- tivované) substráty [60], např. ethylbenzen či cyklohexadien. Aminokyselinové zbytky v MMO, jež jsou strukturně homologní k těm v PTC A u Δ⁹D, jsou poměrně nepolární (isoleucin, valin, fenylalanin) [61], takže jsme předpokládali značné snížení efektivity přenosu protonů směrem k aktivnímu místu. Celkem jsme připravili čtyři mutanty: Δ⁹D-101I a Δ⁹D-203I zaměřené na zbytky společné oběma PTC (A i B), Δ⁹D-101I203I kombinujícího oba předchozí mutanty a Δ⁹D-101I203I206V222F završujícího úplnou záměnu zbytků v navrženém PTC A.

Δ⁹D a všechny mutanty jsme nejprve exprimovali a purifikovali a následně jsme u nich ověřili aktivitu na substrátu 18:CoA. Při analýze složek desaturačních reakcí jsme používali GC.

Všechny enzymy 9Z-desaturují 18:CoA na oleoyl-CoA, avšak se zvyšujícím se počtem mutací se aktivita postupně snižuje, tj. nejméně aktivní je čtyřnásobný mutant. Překvapivě jsme také ve všech reakčních směsích s desaturázou, včetně těch s Δ⁹D, detekovali malá množství (ab-

solutně do desetin %) hydroxylovaných C18 řetězců, jež jsme identifikovali jako 9-, 10- a 11- monohydroxylované acyly 18:. Zjistili jsme, že dochází k jasnému, téměř 100násobnému, po- sunu v relativní specifitě od Δ⁹D, která skoro výhradně desaturuje, k mutantu Δ⁹D-101I203I206V222F, který je náchylnější k hydroxylaci.

V reakčních směsích Δ⁹D a mutantů jsme rovněž nalezli diolové, epoxidové a enolové struktury, jejichž původ jsme odhadovali v sekundární oxidaci 9Z-18:CoA [57,58], tj. produktu nativní reakce, a mezi nimiž převažovalyerythro-9,10-dihydroxy-18: acis-9,10-epoxy-18:. Jako potenciální substráty jsme také ověřovali 9-OH-18:CoA a 11-OH-18:CoA, které jsme připravili enzymaticky pomocí ligázy FadD. U prvně jmenovaného jsme jako produkt detekovalierythro- 9,10-dihydroxy-18:, u druhého pak diolové a allylalkoholové produkty.

Mé přispění

Klonoval jsem Δ⁹D a její dvojitý a čtyřnásobný mutant do vektoru. Podílel jsem se na expresi Δ⁹D a všech jejích mutantů vE. colia následné chromatografické purifikaci. Exprimoval jsem EcoFadD vE. colia enzym poté purifikoval a optimalizoval jsem reakční podmínky acylace CoA.

Podílel jsem se na provedení preparativních enzymových acylací CoA a purifikaci produktů pomocí HPLC. Navrhl jsem cílové struktury pro organickou syntézu a ze syntetických látek připravil řadu standardů pro plynovou chromatografii (GC). Provedl jsem desaturační reakce se čtyřmi různými substráty a extrahoval a analyzoval produkty pomocí GC s hmotnostní de- tekcí. Provedl jsem statistickou analýzu dat z GC. Podílel jsem se na psaní části úvodu a navrhl oddíly výsledků/diskuze a metod. Připravil jsem řadu obrázků, doplňujících obrázků/tabulek a grafický abstrakt. Podílel jsem se na revizích a závěrečné kontrole rukopisu.

7.4 Publikace IV: Hmyz jako zdroj enzymů v biotechnologii lipidů?

Alternativní cestou k výrobě chemických látek s vysokou přidanou hodnotou je biologicky založený přístup, jenž využívá enzymy a mikroorganizmy upravené genovým inženýrstvím.

Při zvolení této cesty potřebujeme mít k dispozici dostatečně rozsáhlou knihovnu nástrojů (např. enzymů) známé funkce. Funkční charakterizace nových domnělých enzymů získaných sekvenováním transkriptomů a genomů je hlavním pilířem mapování dostupného sekvenčně- funkčního prostoru. Hmyz představuje nesmírně bohatý zdroj různých enzymů, které mohou být využity v neustále rostoucím odvětví buněčných továren. V posledních letech byly hmyzí FAR, mFAD a další enzymy modifikující mastné acyly registrovány v několika patentech [62–66].

Náš přehledový článek byl publikován v roce 2017 jako:

Michal Tupec, Aleš Buček, Irena Valterová, Iva Pichová: Biotechnological potential of insect fatty acid-modifying enzymes.Zeitschrift für Naturforschung C – Journal of Biosciences. 2017, 72(9–10):387–403.

V tomto review přinášíme první ucelený přehled funkčně charakterizovaných mFAD a FAR z několika hmyzích řádů (motýlů, dvoukřídlých, brouků, rovnokřídlých a blanokřídlých).

Dva seznamy zahrnují více než 70 enzymů mFAD a více než 20 enzymů FAR včetně údajů o hlav- ních a vedlejších produktech a informaci o expresním systému. Dále krátce shrnujeme prvky sekvencí mFAD a FAR, jež jsou klíčové pro jejich funkci, a diskutujeme potenciální výzvy spo- jené s užitím hmyzích enzymů v expresních systémech. Přehledový článek může sloužit jako výchozí bod pro biotechnology, kteří hledají specifické enzymy v rámci návrhu biosyntetické dráhy pro nenasycené mastné kyseliny či pro mastné alkoholy.

Mé přispění

Navrhl jsem části rukopisu pojednávající o enzymech FAR (včetně tabulky 2), podílel jsem se na psaní oddílu o aplikacích a navrhl obrázky. Podílel jsem se na revizích a závěrečné kontrole rukopisu.

8 Závěry

• Mastné alkoholy, které jsme detekovali v samčích labiálních žlázách čmeláků, částečně odpovídají specificitám reduktáz mastných acylkoenzymů A (FAR), jež jsou hojně a spe- cificky exprimovány právě v labiálních žlázách; všechny tyto specifické FAR patří do orto- logní skupiny FAR-A. Při fylogenetické analýze je patrná specifická expanze FAR-A pouze u čmeláků a bezžihadlových včel. Navíc jsme v blízkosti genů FAR-A v genomech dvou čmeláků detekovali transpozony, jimiž zprostředkované duplikace by se tak mohly podí- let na evoluci FAR u blanokřídlých.

• Zavedení totožných zbytků na pozici 224 v desaturázách D2 a D3 z lišaje má podobný účinek na jejich specificitu. Přepínání mezi Δ¹¹/konjugázovou a Δ¹⁴specificitou je nej- spíše způsobeno změnami ve velikosti zbytku a hydrofobním efektem. U menších a hyd- rofilnějších zbytků obě desaturázy upřednostňují Δ¹¹desaturaci a 1,4-konjugaci, naproti tomu větší a hydrofobnější zbytky posouvají specificitu obou enzymů směrem k Δ¹⁴. Po- psaný přepínací mechanizmus založený na jediném zbytku v ohybu substrátového tunelu je konzervovaný též u Δ¹¹desaturázy/konjugázy D1 z evolučně vzdálenějšího motýla – bource.

• Přerušení protonového přenosového řetězce (PTC) v rozpustné Δ⁹desaturáze ze skočce zavedením odpovídajících zbytků z methanmonooxygenázy u ní zvyšuje míru hydroxy- lace substrátu. Kromě alkoholů navíc mutace podporují vznik dalších kyslíkatých pro- duktů, např. allylalkoholů, epoxidů a diolů. Desaturáza jako substráty kromě nasycených

a jednonenasycených mastných acylů přijímá rovněž monohydroxylované mastné acyly.

Vliv přerušení PTC je vysvětlitelný omezeným přístupem protonů, které jsou stěžejní pro uvolnění vody během desaturační reakce, k aktivnímu místu.

Reference

[1] Experientia,41(6):707–713, 1985. DOI:10.1007/BF02012564.

[2] Plant Physiol.,122(3):635–644, 2000. DOI:10.1104/pp.122.3.635.

[3] Prog. Chem. Fats Other Lipids,15(4):255–299, 1977. DOI:10.1016/0079-6832(77)90010-6.

[4] Plant J.,12(3):615–623, 1997. DOI:10.1046/j.1365-313X.1997.d01-8.x.

[5] Plant J.,30(6):613–623, 2002. DOI:10.1046/j.1365-313X.2002.01313.x.

[6] Plant Physiol.,142(3):866–877, 2006. DOI:10.1104/pp.106.086785. [7] Plant Physiol.,153(4):1539–1554, 2010. DOI:10.1104/pp.110.158238.

[8] J. Biol. Chem.,279(36):37789–37797, 2004. DOI:10.1074/jbc.m406225200.

[9] BMC Biochemistry,12(1):64, 2011. DOI:10.1186/1471-2091-12-64.

[10] Proc. Natl. Acad. Sci.,100(16):9156–9161, 2003. DOI:10.1073/pnas.1531993100.

[11] Proc. Natl. Acad. Sci.,107(24):10955–10960, 2010. DOI:10.1073/pnas.1000823107.

[12] PLOS One,7(5):e37230, 2012. DOI:10.1371/journal.pone.0037230.

[13] Nat. Commun.,5(1):3957, 2014. DOI:10.1038/ncomms4957. [14] Sci. Rep.,6(1):29927, 2016. DOI:10.1038/srep29927.

[15] J. Biol. Chem.,284(28):18559–18563, 2009. DOI:10.1074/jbc.R900009200.

[16] Eur. J. Lipid Sci. Technol.,122(12):2000181, 2020. DOI:10.1002/ejlt.202000181.

[17] Appl. Microbiol. Biotechnol., (106):5957–5972, 2022. DOI:10.1007/s00253-022-12142-3.

[18] Proc. Natl. Acad. Sci.,101(23):8631–8636, 2004. DOI:10.1073/pnas.0402056101.

[19] Science,280(5365):915–918, 1998. DOI:10.1126/science.280.5365.915.

[20] Biochem. J.,118(5):681–693, 1970. DOI:10.1042/bj1180681g. [21] Prog. Lipid Res.,85:101138, 2022. DOI:10.1016/j.plipres.2021.101138.

[22] J. Biol. Chem.,257(20):2141–2147, 1982. DOI:10.1016/S0021-9258(18)33690-1.

[23] J. Biol. Chem.,269(44):27519–27526, 1994. DOI:10.1016/S0021-9258(18)47015-9.

[24] Plant Mol. Biol.,33(6):1105–1110, 1997. DOI:10.1023/a:1005821007291.

[25] Proc. Natl. Acad. Sci.,94(10):4872–4877, 1997. DOI:10.1073/pnas.94.10.4872.

[26] J. Biol. Chem.,280(31):28169–28176, 2005. DOI:10.1074/jbc.M504205200.

[27] J. Inorg. Biochem.,78(1):7–14, 2000. DOI:10.1016/s0162-0134(99)00199-3. [28] Annu. Rev. Entomol.,59(1):299–319, 2014. DOI:10.1146/annurev-ento-011613-161949.

[29] Z. Naturforsch. C,74(9-10):233–250, 2019. DOI:10.1515/znc-2019-0003.

[30] Insect Biochem. Mol. Biol.,43(8):724–731, 2013. DOI:10.1016/j.ibmb.2013.05.003.

[31] ChemBioChem,17(3):260–267, 2015. DOI:10.1002/cbic.201500415.

[32] Proc. Natl. Acad. Sci.,112(41):12586–12591, 2015. DOI:10.1073/pnas.1514566112.

[33] Insect Biochem. Mol. Biol.,74:68–75, 2016. DOI:10.1016/j.ibmb.2016.05.002.

[34] J. Biol. Chem.,293(51):19844–19853, 2018. DOI:10.1074/jbc.RA118.005972.

[35] Biochemistry,59(14):1398–1409, 2020. DOI:10.1021/acs.biochem.0c00110.

[36] J. Biol. Chem.,295(32):11337–11345, 2020. DOI:10.1074/jbc.RA120.014258.