UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Efeitos de um extrato aquoso de porangaba (Cordia salicifolia) na marcação de constituintes sanguíneos com tecnécio-99m e na morfologia de hemácias
JACQUES NATAN GRINAPEL FRYDMAN
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Efeitos de um extrato aquoso de porangaba (Cordia salicifolia) na marcação de constituintes sanguíneos com tecnécio-99m e na morfologia de hemácias
JACQUES NATAN GRINAPEL FRYDMAN
Dissertação a ser apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Mario Bernardo Filho Co-orientador: Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros
Divisão de Serviços Técnicos
Catalogação da Publicação na Fonte UFRN Frydman, Jacques Natan Grinapel
Efeitos de um extrato aquoso de porangaba (Cordia salicifolia) na marcação de constituintes sanguíneos com tecnécio-99m e na morfologia de hemácias / Jacques Natan Grinapel Frydman. – Natal, RN, 2009. xii, 54p.
Orientador: Mário Bernardo-Filho Co-orientador: Aldo da Cunha Medeiros
Tese (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Professora Doutora Técia Maria de Oliveira Maranhão
Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde
JACQUES NATAN GRINAPEL FRYDMAN
Efeitos de um extrato aquoso de porangaba (Cordia salicifolia) na marcação de constituintes sanguíneos com tecnécio-99m e na morfologia de hemácias
BANCA EXAMINADORA
MEMBROS TITULARES
PRESIDENTE DA BANCA:
Prof. Dr. Mario Bernardo Filho – Universidade do Estado do Rio de Janeiro Prof. Dr.
Prof. Dr.
Natal / RN 2009
DEDICATÓRIA
À minha esposa Vanessa, por seu apoio e incentivo incondicionais e por estar sempre ao meu lado superando todas as adversidades.
“A adversidade desperta em nós capacidades que, em circunstâncias favoráveis,
teriam ficado adormecidas” (Horácio)
Ao meu filho João Gabriel, meu mais precioso projeto. Fonte de toda a minha inspiração e energia.
“A criança é alegria como o raio de sol e estímulo como a esperança” (Coelho
Neto)
Aos meus pais, pelo apoio e orientação no caminho a ser trilhado.
“Somos o resultado de muitos esforços que não são nossos” (Georges Chevrot)
“É na educação dos filhos que se revelam a virtude dos pais” (Coelho Neto)
A Deus, fonte fecunda de luz, felicidades e virtudes. Que Ele continue sempre a nos prodigalizar os seus benefícios.
A eles dedico tudo o que fiz, faço e farei.
AGRADECIMENTOS
Obrigado Senhor por ter me permitido aprender e ter me concedido a oportunidade de colaborar com mais um conhecimento para a humanidade.
“Quem é o sábio? Aquele que aprende de cada pessoa” (Pirkei Avot)
À minha esposa e filho por todo amor, carinho, vibração em cada conquista e compreensão da necessidade de minha ausência em determinados momentos.
“Apenas em torno de uma mulher que ama se pode formar uma família” (Friedrich
Schlegel)
Ao Professor Mario Bernardo Filho por todo seu esforço em conduzir seus alunos no caminho da busca do conhecimento e da excelência, forjando o caráter do cientista. Como orientador soube indicar caminhos e sugerir soluções para que esta caminhada pudesse ter êxito, meu respeito e admiração. Um exemplo a ser seguido.
“A coisa principal da vida não é o conhecimento, mas o que dele se faz” (Talmude)
Ao Professor Adenilson de Souza da Fonseca pela orientação, e grande incentivo durante a iniciação científica e todo o processo de seleção, execução e conclusão do mestrado.
“Não se pode ensinar tudo a alguém, pode-se apenas ajudá-lo a encontrar por si mesmo.” (Galilleu Galilei)
Aos amigos e companheiros de pesquisa: Gabrielle Rocha, Márcia Pereira, Camila Godinho, Rosane Neves, Bernardo Rebello, Angélica Garcia-Pinto, Mônica Benarroz, Maria Regina Macedo e Sebastião Santos Filho, nos momentos difíceis e alegres.
“O prazer dos banquetes não está nos pratos, mas sim nas pessoas que acompanham a mesa.” (Talmude)
Ao Serviço de Medicina Nuclear e ao Laboratório de Endocrinologia do Hospital Universitário Pedro Ernesto pelo suporte aos resultados obtidos.
Ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde. Ao auxílio dado pelo CAPES, FAPERJ e CNPq.
LISTA DE ABREVIAÇÕES, SIGLAS E SÍMBOLOS
Células Vermelhas do Sangue CVS
Cloreto estanoso SnCl2
Cordia salicifolia C. salicifolia
Extrato Aquoso da Porangaba ExPo
Pertecnetato de sódio Na99mTcO4
Tecnécio-99m (meta estável) 99mTc
Molibdênio-99 99Mo
99-Molibdênio / Tecnécio-99m 99Mo / 99mTc
Nanômetro nm
Micrograma g
Microlitro L
Quiloeletronvolt kev
Porcentagem de radioatividade incorporada %ATI
Cloreto de sódio NaCl
Milímetro cúbico mm3
Íon estanoso Sn+2
Universidade do Estado do Rio de Janeiro UERJ
Universidade Federal do Rio Grande do Norte UFRN
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAPES Fundo de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro FAPERJ Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq
SUMÁRIO
Dedicatória...v
Agradecimentos...vi
Lista de abreviações siglas e símbolos………...………...…...…viii Sumário...………...………...ix
Abstract...x
Resumo………...………...………...xi
1 INTRODUÇÃO...1
2 REVISÃO DA LITERATURA...3
3 REFERÊNCIAS ...7
4 INDEXAÇÃO DE ARTIGOS ...12
4.1 Artigos publicados...12
5 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES...18
ABSTRACT
Effects of a Cordia salicifolia (porangaba) extract on the labeling of blood cells (BCs) with technetium-99m ((99m)Tc) and on the morphology of red BCs were evaluated. Labeling of cellular and molecular structures with (99m)Tc depends on a reducing agent. Some physical characteristics, as visible absorbance spectrum, electric conductivity, and refractive index of this porangaba extract, were also determined. Blood samples from Wistar rats were incubated with porangaba extract or with 0.9% NaCl (control). Labeling of blood constituents with (99m)Tc was performed. Plasma (P) and BCs, both soluble (SF-P and SF-BC) and insoluble (IF-P and IF-BC) fractions, were separated. The radioactivity in each fraction was counted, and the percentage of radioactivity incorporated (%ATI) was calculated. Blood smears were prepared, fixed, and stained, and the morphology of the red BCs was evaluated. Data showed an absorbance peak at 480 nm and electric conductibility and refractive index concentration-dependent. Porangaba extract decreased significantly (P < .05) the BC, IF-P, and IF-BC %ATI, and no modifications were verified on the shape of red BCs. Analysis of the results reveals that some physical parameters could be useful to aid in characterizing the extract studied. Moreover, it is possible that chemical compounds of this extract could have chelating/redox actions or be capable of binding to plasma and/or cellular proteins.
RESUMO
Extratos aquosos de Cordia salicifolia (porangaba) têm sido utilizados popularmente para tratamento de diversas doenças. O uso de radionuclídeos com finalidades diagnósticas e terapêuticas tem contribuído para avanços em Ciências da Saúde. Radiofármacos marcados com tecnécio-99m (99mTc) tem possibilitado a obtenção de imagens diagnósticas em Medicina Nuclear. Tem sido descrito que fármacos sintéticos e extratos de plantas medicinais podem interferir na marcação de constituintes sanguíneos com 99mTc. Este estudo teve como objetivos a obtenção de um extrato aquoso de porangaba (ExPo) com a realização de controles de reprodutibilidade de preparo do mesmo e avaliação de seu efeito in vitro na marcação de constituintes sanguíneos com 99m
Esse estudo é uma pesquisa experimental com caráter multidisciplinar. Foi desenvolvido em colaboração com diferentes Departamentos da Universidade do Estado do Rio de Janeiro e Serviços da área Biomédica do Hospital Universitário Pedro Ernesto, UERJ, atestando o caráter multidisciplinar da pesquisa .
1. INTRODUÇÃO
Células vermelhas do sangue (CVS) são marcadas com tecnécio-99m (99mTc) e usadas em diferentes aplicações em medicina nuclear1-4. O processo de marcação de estruturas celulares e moleculares com 99mTc depende de um agente redutor e o cloreto estanoso (SnCl2) tem sido o agente redutor mais utilizado5. Tem sido sugerido, para CVS, que o transporte do íon pertecnetato para o meio intracelular ocorra através do sistema de transporte transmembrana do tipo banda-36, enquanto o transporte do íon estanoso ocorreria através de canais de cálcio7. A ligação do 99mTc, agora com número de oxidação reduzido, ocorreria, principalmente, na cadeia da beta hemoglobina6.
Estudos têm mostrado que drogas naturais e sintéticas podem alterar a marcação de constituintes sanguíneos com 99mTc. Os dados obtidos nestes trabalhos científicos têm estimulado a utilização de procedimentos que envolvam esta marcação de com 99mTc como em ensaio in vitro para análise de propriedades químicas de fármacos sintéticos e produtos naturais8-10.
A análise morfológica qualitativa e quantitativa tem sido utilizada como um método para avaliar se os efeitos dos fármacos no processo de radiomarcação poderiam estar relacionados com alterações na forma das CVS9.
dados experimentais ou clínicos estão disponíveis sobre suas propriedades farmacológicas no PubMed (www.pubmed.com), mas alguns de seus efeitos sobre o sistema cardiovascular11, ações antiviral12, cicatrizante13, além de efeito citotóxico14 foram descritos. Dados sobre a análise fitoquímica do extrato de porangaba também são escassos e, atualmente, sabe-se que frutos vermelhos ou bagas de porangaba contêm cafeína, potássio, alantoína e ácido alantóico13.
Propriedades físicas do extrato de porangaba não foram encontradas na literatura (PubMed). Uma propriedade física útil e que pode ajudar a caracterizar e estimar o grau de pureza ou a determinar a concentração de uma substância ou solução é o índice de refração15. Condutibilidade elétrica e o perfil do espectro de absorbância são outros parâmetros físicos que podem ser utilizados para caracterizar uma solução de composição desconhecida, como um extrato de plantas medicinais9.
Poucos são os dados experimentais disponíveis sobre as características físicas, bem como os efeitos biológicos do extrato de porangaba, apesar de sua popularidade no Brasil. A utilização de diferentes ensaios e testes pode permitir a avaliação e obtenção de mais informações sobre as características físicas e possíveis mecanismos de ação das substâncias presentes neste produto natural. Esses fatos têm estimulado o estudo de efeitos biológicos de um extrato aquoso de porangaba (ExPo) na marcação de constituintes sanguíneos com 99mTc e na morfologia de CVS isoladas de ratos Wistar.
2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Aplicações do tecnécio-99m em Saúde
As aplicações das radiações ionizantes e de elementos radioativos são de grande interesse em Ciências da Saúde como um meio de auxiliar o diagnóstico e o tratamento das doenças. Os avanços no conhecimento para a manipulação e controle dos elementos radioativos têm permitido que os processos envolvidos na sua produção, no seu armazenamento e no seu uso se tornassem cada vez mais seguros5.
Em medicina nuclear, os radionuclídeos podem ser utilizados como fontes de radiação, onde o meio biológico recebe apenas as radiações emitidas pelo radionuclídeo usado, e como traçadores (radiofármacos), o próprio radioisótopo é incorporado no meio biológico que se deseja estudar5, 16.
O tecnécio-99m (99mTc) é o radionuclídeo mais utilizado para obtenção de imagens cintilográficas em medicina nuclear17. Isto se deve por este radionuclídeo apresentar propriedades que favorecem a sua utilização, tais como: (i) um metal de transição do grupo 7; (ii) decaimento com uma meia vida de 6 horas; (iii) emissão de radiação gama com energia de 140 keV, (iv) é facilmente eluído de gerador Molibdênio-99/Tecnécio-99m (99Mo/99mTc); (v) rejeitos radioativos praticamente desprezíveis. Além disso, os números de oxidação mais estáveis são +7 e +4, mas outras formas com número de oxidação entre -1 a +7 também são encontradas, o que possibilita a marcação de inúmeras estruturas de interesse biomédico de variadas formas químicas5, 18.
2.2. Marcação de constituintes sanguíneos com 99mTc: aplicações em Saúde e
modelo experimental
Hemácias marcadas in vitro com 99mTc são utilizadas para obtenção de imagens diagnósticas de hemorragias gastrintestinais19, fluxo sanguíneo arterial periférico20, hemangiomas hepáticos21, carcinoma renal22, retículo endotelial esplênico23, tromboses veínicas24. Além disso, a marcação de constituintes sanguíneos com 99mTc tem sido utilizada como modelo experimental, conveniente e útil para o estudo de propriedades químicas de fármacos sintéticos e extratos de plantas medicinais12, 14, 25.
Na ligação 99mTc-hemácias tem sido sugerido que: (i) o íon estanoso (Sn+2) é transportado através de canais de cálcio para o interior das células, ligando-se ao componente celular; (ii) o íon pertecnetato vai para o meio intracelular através do sistema de transporte transmembrana do tipo banda-3; (iii) ao mesmo tempo, o íon pertecnetato, dentro da célula na presença do Sn+2 é reduzido e se liga principalmente à cadeia-beta da hemoglobina26, 27.
Na técnica da marcação de hemácias com 99mTc, na forma de pertecnetato, esse radionuclídeo também pode estar ligado às proteínas plasmáticas dependendo, da concentração do agente redutor e do tempo de incubação considerado28, 29.
2.3. Hemácias: morfologia e modelo experimental
As células do sangue são geralmente estudadas em distensões preparadas pelo espalhamento de uma gota de sangue sobre lâminas de vidro para microscopia de luz30.
A composição interna das hemácias é mantida à custa de mecanismos que requerem energia. A membrana que reveste a hemácia é semipermeável, permitindo a passagem de água e eletrólitos32, 33.
As hemácias apresentam alterações em sua morfologia as quais podem refletir estados de anormalidade do organismo. O conhecimento de tais alterações pode ser utilizado no diagnóstico de doenças34.
2.4. Plantas medicinais: utilização na medicina popular e efeitos biológicos
Está amplamente evidenciado na literatura que as plantas medicinais possuem uma variedade de substâncias, os fitoquímicos, que podem apresentar propriedades antioxidantes, anticarcinogênicas35, ação antiplaquetária36, bem como antimicrobianas e antifúngicas37, podendo agir na estabilização da membrana mitocondrial e aumento de sua função, como quelante de metais, na estimulação do sistema de defesa antioxidante da célula e na indução de apoptose em células pré-neoplásicas e neoplásicas36.
A marcação de constituintes sanguíneos com 99mTc pode ser alterada por uma variedade de fármacos sintéticos e plantas medicinais14, 29, 38.
2.5. Cordia salicifolia: utilização na medicina popular, efeitos biológicos e caracterização de extrato aquoso
identificados incluem a cafeína, a alantoína e o ácido alantóico40.
Propriedades físicas do ExPo não foram determinadas até o presente momento (www.pubmed.com). Uma propriedade física útil para caracterizar e estimar a pureza ou para determinar a concentração de uma substância ou de uma solução é o índice de refração41. A condutibilidade elétrica e o perfil do espectro da absorbância são outros parâmetros físicos que poderiam ser determinados e usados para caracterizar uma solução de composição desconhecida, tal como um extrato de uma planta medicinal29.
Poucos dados experimentais estão disponíveis sobre os efeitos biológicos de extratos de porangaba, apesar de seu uso no Brasil40. A utilização de diferentes ensaios poderia permitir a obtenção de mais informações sobre as características físicas e o possível mecanismo de ação das substâncias presentes neste produto natural.
2.6. Efeitos de produtos naturais na marcação de constituintes sanguíneos com
99mTc e na morfologia de hemácias
Pelo fato dos produtos naturais estarem presentes na dieta ou como medicamentos, eles podem alterar a marcação de constituintes sanguíneos com 99mTc7, 29, 42. Entretanto, esta interação ainda não está completamente compreendida, o que poderia acarretar alterações nos resultados obtidos em exames de medicina nuclear, levando a um diagnóstico incorreto e à necessidade da repetição do procedimento43.
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5. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES Todo profissional que busca a excelência no desempenho e vislumbra a possibilidade de ser um formador de opinião e um multiplicador de conhecimentos, precisa hoje cumprir uma etapa marcante e fundamental na carreira acadêmica: o mestrado.
A educação continuada, através de um curso de pós-graduação strictu sensu, possibilita ao aluno participar das mudanças no contexto social decorrentes dos avanços tecnológicos, a partir do aperfeiçoamento, capacitação e qualificação técnica, bem como agregar valores inerentes ao cientista: investigação, crítica e criatividade.
Ingressar no Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte foi uma experiência ímpar. Ainda que cumprindo créditos e exercendo as atividades acadêmicas e científicas em outra Universidade (UERJ). Cursar as disciplinas em diferentes departamentos e compartilhar experiências e o conhecimento com profissionais das áreas mais diversas foi muito enriquecedor.
A convivência com mestres e doutores, alunos de iniciação científica, mestrandos e doutorandos foi um grande desafio. Um ambiente restrito, cujo crivo não é apenas o saber, mas o aprimoramento do saber, o compromisso com a ciência e a dedicação no estudo em desenvolvimento. Entretanto, o mais desafiador foi desenvolver um projeto em modelos experimentais, avaliando efeitos biológicos e interações entre drogas naturais e sintéticas com material radioativo, linha de pesquisa do Laboratório de Radiofarmácia Experimental do Departamento de Biofísica e Biometria (UERJ), local onde desenvolvi minha pesquisa.
Entretanto, como todo serviço público, as restrições orçamentárias estão presentes e prejudicam muitos projetos. A restrição do número de “bolsas de estudo” impede a
dedicação integral do discente, visto que o trabalho remunerado é uma necessidade real para muitos. A carência de recursos humanos (secretário ou auxiliar administrativo) e recursos materiais (por exemplo computadores), podem ser citados como pontos críticos nas condições gerais do desenvolvimento de uma pesquisa científica. Contudo, as dificuldades foram superadas com o trabalho em equipe e a boa vontade de todos os integrantes do grupo de pesquisa.
Como biólogo, investigar os efeitos biológicos de produtos naturais era pertinente. A escolha de um produto natural que tivesse efeitos biológicos diversos e com boa aceitação popular no mercado foi meu primeiro passo investigatório. A porangaba (Cordia salicifolia), uma planta largamente empregada na medicina popular, tem despertado interesse de alguns pesquisadores, especialmente na América do Sul, onde tem sido investigada por inúmeras propriedades e daí a curiosidade de estudá-la.
O desenvolvimento dos experimentos descritos nesta dissertação baseou-se nos modelos experimentais de marcação de hemácias com material radioativo (99mTc) e na morfologia de sangue de animais. No tratamento in vitro amostras de sangue isoladas de animais foram incubadas com extrato de porangaba. Esse modelo é bem estabelecido, com diversas publicações em revistas indexadas.
Este estudo, apesar de ser uma pesquisa experimental, tem caráter multidisciplinar. Foi realizado em colaboração com o Setor de Medicina Nuclear e o Laboratório de Endocrinologia do Hospital Universitário Pedro Ernesto – UERJ e através do convênio entre duas universidades públicas, a UERJ e a UFRN. Essas parcerias possibilitaram novas idéias e perspectivas, além de agregar conhecimentos de diferentes áreas.
Os resultados deste estudo viabilizaram a publicação de um artigo original
blood constituents and on the morphology of red blood cells” em revista internacional de impacto relevante, Journal of medicinal food, com índice de impacto 1,3 (referente ao ano de 2006) e Qualis A internacional.
Em outros estudos em paralelo, um artigo que está no prelo, intitulado:
“Acetylsalicylic acid and morphology of red blood cells” em revista internacional de impacto relevante, Brazilian Archives of Biology and Technology, com índice de impacto 0,353 (referente ao ano de 2008) e Qualis B Internacional, bem como a co-autoria de
outros três artigos, “Cinnamomum zeylanicum extract on the radiolabelling of blood
constituents and the morphometry of red blood cells: In vitro assay” (Applied Radiation and Isotopes - 2008), “Effects of a Chronic Sucralose Sweetener on the Labeling of Blood Constituents with Technetium-99m, Morphology of Red Blood Cells and the Biodistribution
of Sodium Pertechnetate in Rats” (Brazilian Archives of Biology and Technology - 2008) e
“Acetylsalicylic acid decreases the labeling of blood constituents with technetium-99m”
(Acta Biologica Hungarica – 2007).
Verificou-se, através de pesquisa bibliográfica e experimental, que as substâncias presentes nos extratos vegetais podem produzir efeitos que possibilitem uma alteração no processo de marcação de hemácias com 99mTc, assim como na morfologia das células vermelhas.
Neste estudo, o objeto de pesquisa foi a Cordia salicifolia, uma planta popularmente conhecida como porangaba, chá de bugre, café do mato ou ainda bugrinho. O produto foi adquirido na forma de apresentação em folhas e pequenos galhos, mas foi utilizado na forma de extrato aquoso para a metodologia aplicada.
perímetro/área.
Os dados obtidos neste trabalho são de relevante importância por descreverem algumas das interações entre a porangaba, como planta medicinal e os constituintes sanguíneos marcados com 99mTc, como radiobiocomplexos. Além disso, até o momento não foram encontrados relatos dos efeitos de extratos de porangaba sobre radiofármacos.
Embora, os resultados apresentados sejam experimentais, podem ser úteis para compreensão de problemas associados à interpretação inadequada de exames de medicina nuclear e/ou à necessidade de repetição deste tipo de procedimento clínico em pacientes que estejam fazendo uso da porangaba como planta medicinal.
A porangaba vem sendo largamente estudada em diferentes áreas, seja nas ciências biomédicas ou na química ou ainda na indústria farmacêutica. Portanto colaborar com o meio científico com informações da pesquisa básica pode em algum aspecto trazer esclarecimentos sobre o tema.
6.2. Artigo no prelo
ACETYLSALICYLIC ACID AND MORPHOLOGY OF RED
BLOOD CELLS
Jacques Natan Grinapel Frydman1,2, Adenilson de Souza da Fonseca2,*, Vanessa Câmara da Rocha2, Monica Oliveira Benarroz1,2, Gabrielle de Souza Rocha1,2, Marcia de Oliveira Pereira1,2, Mario José
Pereira3 and Mario Bernardo-Filho2 1
Universidade Federal do Rio Grande do Norte,Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Rio Grande do
Norte, Brasil. 1
Departamento de Biofísica e Biometria; 3Departamento de Fisiologia, Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Avenida 28 de Setembro 87,
fundos, 20551-030, Rio de Janeiro, Brasil.
ABSTRACT
Acetylsalicylic acid (ASA) is a classical antipyretic, analgesic, anti-inflammatory and for secondary prevention of thrombotic phenomenon in the heart, brain and peripheral circulation.
Undesirable gastric effects can occur at therapeutic doses. This work has evaluated the effect of in vitro and in vivo treatment with ASA on the morphology of the red blood cells. Blood samples or Wistar rats were treated with ASA during 1 hour. Blood samples or animals treated with saline were used as control group. Blood smears were prepared, fixed, stained and the qualitative and quantitative morphology of red blood cells were evaluated under optical microscopy. Data showed that the in vitro treatment during 1 hour with ASA at higher dose used significantly (p<0.05) modified the perimeter/area ratio of the red blood cells. No morphological alterations were obtained with the in vivo treatment. ASA acid use at highest doses may interfere on shape of red blood cells.
Keywords: Acetylsalicylic Acid; Blood Cells; Morphology
Corresponding author.
INTRODUCTION
Acetylsalicylic acid is a classical nonsteroidal antipyretic, analgesic and anti-inflammatory drug and in the United States alone, 35,000 kg are consumed daily (Jack, 1997). Its actions are based on irreversible inhibition of cyclooxygenases 1 and 2 that are responsible for the prostaglandin synthesis and some autacoids (Catella-Lawson, 2001; Amann & Peskar, 2002; Aude & Mehta, 2002). The anti-thrombotic action of acetylsalicylic acid is due mainly to its antiplatelet action (Grotta et al., 1985; Catella-Lawson, 2001; Insel, 2001) but it has been postulated that the inhibition of oxidative stress could be related to ability of this drug to prevent cerebrovascular accidents (Sagone & Husney, 1987; Guerrero et al., 2004).
On the other hand, acetylsalicylic acid at
therapeutic doses could induce gastrointestinal adverse effects as gastric ulceration, erosive gastritis, gastrointestinal hemorrhage and exacerbation of peptic ulcer symptoms (Bollini et
al., 1992), as well as ions imbalance associated to
respiratory alkalosis with increased Na+, K+ and bicarbonate excretion (Lauwerys & Bernard, 1989; Nuyts et al., 1989).
Morphometric analysis has been used to evaluate morphological changes induced in different cellular systems: (i) chronic ocular hypertensive effects on thickness of retinal nerve fiber layer and optic disc structure (Shimazawa et
al., 2006), (ii) relationship between infarct-related
artery stenosis and capillary density (Prech et al., 2006) and (iii) effects of sexual hormones on mamma gland (Pompei et al., 2005). Red blood cells have been
the structure and morphology of these cells (Nwafor & Coakley, 1986; Scheiman & Elta, 1990; Li et al., 1999; Shacter & Weitzman, 2002; Suwalsky et al., 2003; Hubner et al., 2005; Santos
et al., 2005; Zhang et al., 2005). The
morphometric analysis (area, shape and volume measurements) has been used to evaluate the alterations induced by natural products and synthetic drugs on membrane of red blood cells (Oliveira et al., 2002; Moreno et al., 2004).
The aim of this work was to evaluate the effect of in vitro and in vivo treatment with acetylsalicylic acid on the morphology of the red blood cells.
MATERIAL AND METHODS
Animals
Adult male Wistar naive rats (3-4 month of age, body weight 250-350g) were housed, five per cage, in an environmental controlled room. Animals had free access to water and food and ambient temperature was kept at 25 2oC. Experiments were conducted in accordance with the Department Committee of Animal Care.
Drugs
Commercial acetylsalicylic acid used in this study was purchased from Bayer (Aspirin , Brazil).
In vitro treatment with acetylsalicylic acid
Samples of heparinized whole blood were treated during 1 hour with acetylsalicylic acid at different doses (0.01, 0.10 and 1.00 mg/mL). Blood samples treated with 0.9% NaCl were used as control group. These concentrations were
chosen to be similar the plasma levels found in human beings under antiinflammatory therapy with this drug (Insel, 2001).
In vivo treatment with acetylsalicylic acid
Wistar rats (n=9) were treated during 1
hour with acetylsalicylic acid at different doses (1.5, 3.0 and 6.0 mg/kg, intragastric adminstration) and after heparinized whole
blood were withdrawn. Animals (n=10) treated with saline solution (0.9% NaCl, intragastric
adminstration) were used as control group. These doses are similar to used in antiinflammatory therapy with this drug (Insel,
2001) and experimental investigations (Guerrero et al., 2004).
Morphological evaluation of red blood cells
Histological preparations were carried out with blood samples in vitro or in vivo treated with acetylsalicylic acid during 1 hour at room temperature, or with NaCl 0.9% as control group. Blood smears were prepared, dried, fixed and staining by May-Grünwald-Giensa method (Junqueira & Carneiro, 2002). After that, the images of red blood cells were acquired (Optronics, Japan) from blood smears to qualitative morphology analysis under optical microscopy (x1000). To morphometric analysis of red blood cells the perimeter/area ratio was obtained from images by specific program (Image ProPlus Software). Morphological analysis were
carried out by blind way by a specialist in histological analises.
Statistical analysis
Data are reported as means ± SD of perimeter/area ratio and they were compared between the treated and control group by One way analysis of variance - ANOVA, followed by Bonferroni post test with a p<0.05 as significant level. InStat Graphpad software was used to perform statistical analysis (GraphPad InStat version 3.00 for Windows 95, GraphPad Software, San Diego California, USA).
RESULTS
The figures 1 and 2 show the photomicrographs of the blood smears from blood
in vitro treated with 0.9% NaCl solution (control)
and with acetylsalicylic acid at the highest concentration used (1.0 mg/mL), respectively. The qualitative morphological analysis by the comparison between these figures suggests that the acetylsalicylic acid induces important changes on the shape of the red blood cells.
The figure 3 shows the perimeter/area ratio for red blood cells from blood samples in
vitro treated with acetylsalicylic acid at different
concentrations. The analysis of these data indicates that acetylsalicylic acid significantly (p=0.014)
FIGURE 1: Photomicrography of blood smears
from blood samples in vitro treated with 0.9% NaCl solution (control group). Samples of whole blood from Wistar rats were treated with 0.9% NaCl solution during 60 minutes. Blood smears were prepared, dried, fixed and staining by May-Grünwald-Giensa method. The morphology of red blood cells was evaluated under optical microscopy (x1000) after image capture.
FIGURE 2: Photomicrography of blood smears
from blood samples in vitro treated with acetylsalicylic acid. Samples of whole blood from
Wistar rats were treated with acetylsalicylic acid
(1.0 mg/mL) during 60 minutes. Blood smears were prepared, dried, fixed and staining by May-Grünwald-Giensa method. The morphology of red blood cells was evaluated under optical microscopy (x1000) after image capture.
FIGURE 3: Effects of acetylsalicylic acid on the
perimeter/area ratio of red blood cells from blood
in vitro treated. Samples of whole blood from Wistar rats were treated with acetylsalicylic acid
at different concentrations during 60 minutes. Blood smears were prepared, dried, fixed and staining by May-Grünwald-Giensa method. The morphology of red blood cells was evaluated under optical microscopy (x1000) after image captures of five fields for each smear and five smears for each acetylsalicylic acid concentration. After that, morphometric measurements (perimeter and area) were carried out and perimeter/area calculated.
The figures 4 and 5 show the photomicrographs of the blood smears from blood
in vivo treated with 0.9% NaCl solution (control)
and with acetylsalicylic acid at the highest dose used (6 mg/kg), respectively. The qualitative morphological analysis by the comparison between these figures suggests that the in vivo acetylsalicylic acid not induce important modifications in the shape of the red blood cells.
The figure 6 shows the perimeter/area ratio for red blood cells from blood samples in
vivo treated with acetylsalicylic acid at different
doses. The analysis of these data indicates that in
vivo acetylsalicylic acid not alter significantly
(p=0.749) the perimeter/area ratio of red blood cells.
DISCUSSION
The data obtained in this work have showed that in vitro or in vivo acetylsalicylic acid has not effect on morphology of red blood cells at doses similar to used in anti-thrombotic, antipyretic or anti-inflammatory therapy (figures 3, 5 and 6). However, in vitro acetylsalicylic acid at the higher dose studied (1.0 mg/mL) could alter the morphology of red blood cells as observed by
qualitative analysis and confirmed by morphometric measurement of perimeter/area ratio (figures 2 and 3).
FIGURE 4: Photomicrography of blood smears
from blood samples in vivo treated with 0.9% NaCl solution (control group). Wistar rats were treated with NaCl 0.9% solution during 60 minutes. After that, blood samples were withdraw, blood smears were prepared, dried, fixed and staining by May-Grünwald-Giensa method. The morphology of red blood cells was evaluated
under optical microscopy (x1000) after image capture.
FIGURE 5: Photomicrography of blood smears
from blood samples in vivo treated with acetylsalicylic acid. Wistar rats were treated with acetylsalicylic acid (6.0 mg/kg) during 60 minutes. After that, blood samples were withdraw, blood smears were prepared, dried, fixed and staining by May-Grünwald-Giensa method. The morphology of red blood cells was evaluated under optical microscopy (x1000) after image capture.
FIGURE 6: Effects of acetylsalicylic acid on the
perimeter/area ratio of red blood cells from blood
in vivo treated. Wistar rats were treated with
acetylsalicylic acid at different concentrations during 60 minutes. After that, blood samples were withdraw, blood smears were prepared, dried, fixed and staining by May-Grünwald-Giensa method. The morphology of red blood cells was evaluated under optical microscopy (x1000) after image captures of five fields for each smear and five smears for each acetylsalicylic acid concentration. After that, morphometric measurements (perimeter and area) were carried out and perimeter/area calculated.
Different techniques have been used to evaluate the effects of the interaction between drugs and plasma membrane. Using a photometric method it was demonstrated that derivates but not acetylsalicylic acid are capable of induce changes in red blood cell shape (Li et al., 1999). However, in an in vitro study was verified that acetylsalicylic acid at highest doses could increase the deformability and osmotic fragility of the membrane of red blood cells (Bilto, 1999). By electron spin resonance spectroscopy it was demonstrated that human beings submitted to highest doses of acetylsalicylic acid presented structural changes of the membrane of red blood cells (Mazorow et al., 1985).
It was demonstrated that 30 minutes after a single dose of 0.65g, only 27% of acetylsalicylic is in acetylated form due its metabolism in plasma, liver and erythrocytes (Amann & Peskar, 2002). About 50% of acetylsalicylic acid are de-acetylated to salicylate already during and immediately after its absorption (Amann & Peskar, 2002). In this condition acetylsalicylic acid reaches detectable plasma level at 30 minutes but the higher plasma concentration occurs only after 1 hour (Insel, 2001). However, our data suggest that the acetylsalicylic
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
0 1.5 3.0 6.0
Acetylsalicylic Acid (mg/kg)
acid concentration reached 1 hour after in vivo treatment could be low and no alterations on membrane shape could be observed. This hypothesis was confirmed by in vitro treatment at high dose (1.0 mg/mL) where modifications on membrane shape were observed (figures 2 and 3).
Acetylsalicylic acid at normal dose (10mg/kg/day) can cause peroxidation in human erythrocytes increasing glutathione peroxidase and catalase activities but without to change the susceptibility to oxidation (Durak et al., 2001).
Other authors reported decreasing of glutathione levels in Wistar rats after acetylsalicylic acid treatment at 10mg/kg with plasma levels about 10 g/mL (Guerrero et al., 2004). In fact, it was hypothesized that gastric
damage induced by acetylsalicylic acid may be connected with the degradation of the lipid components of the cellular membranes (Javor et
al., 1986). Salicylates may cause direct cellular
toxicity via inhibition of membrane transport properties (Scheiman & Elta, 1990). Other data have demonstrated that acetylsalicylic acid can alter the inward calcium currents by voltage-gated Ca+2 channels (Greffrath et al., 2002; kim et al., 2001). Indeed, salicylates uncouple oxidative phosphorylation leading diminished cellular ATP concentrations at pharmacologic relevant doses (Cronstein et al., 1994). This effect may alter ions balance ATP-dependent and induce alterations on membrane. These mechanisms could be involved in effects of in vitro acetylsalicylic acid on membrane of red blood cells for us observed.
In conclusion, acetylsalicylic acid at doses similar to anti-thrombotic, antipyretic, analgesic or anti-inflammatory therapy could be not capable but at toxic doses alterations on membrane of red blood cells could be induced.
RESUMO
O ácido acetilsalicílico (AAS) é uma droga com ação antipirética, analgésica, anti-inflamatóra e para prevenção de eventos trombóticos no coração, cérebro e circulação periférica. Efeitos gástricos indesejados podem ocorrer em doses terapêuticas. Este trabalho avaliou o efeito do tratamento in vitro e in vivo com AAS na morfologia dos eritrócitos. Amostras de sangue ou ratos Wistar foram tratadas com AAS durante 1 hora. Amostras sangüíneas ou animais tratados com salina foram utilizados como grupos controle. Distensões de sangue foram preparadas, fixadas, coradas e a análise morfológica qualitativa e quantitativa dos
Os dados mostraram que o tratamento in vitro durante 1 hora com AAS na maior dose utilizada modificou significativamente (p<0.05) a relação perímetro/área dos eritrócitos. Não foram obtidas alterações morfológicas com o tratamento in vivo. O uso do AAS em doses altas poderia interferir na forma dos eritrócitos.
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