Avaliação imunohistoquímica comparativa do efeito da anestesia repetitiva com isoflurano e sevoflurano sobre o fígado de rato.

REVISTA

BRASILEIRA

DE

ANESTESIOLOGIA

www.sba.com.br

ARTIGO

CIENTÍFICO

Avaliac

¸ão

imunohistoquímica

comparativa

do

efeito

da

anestesia

repetitiva

com

isoflurano

e

sevoflurano

sobre

o

fígado

de

rato

夽

Flavia

Ruxanda

_,

_Adrian

_Florin

_Gal

_,

_Cristian

_Rat

_¸iu

_,

_Viorel

_Micl˘

_aus

_¸

_,

_Vasile

_Rus

e

Liviu

Ioan

Oana

a_{DepartmentofCellBiology,HistologyandEmbriology,UniversityofAgriculturalSciencesandVeterinaryMedicine,}

Cluj-Napoca,Romênia

b_{DepartmentofPathologicalAnatomy,UniversityofAgriculturalSciencesandVeterinaryMedicine,Cluj-Napoca,Romênia} c_{DepartmentofImplantology,FacultyofMedicineandPharmacy,UniversityofOradea,Oradea,Romênia}

d_{DepartmentofAnesthesiologyandSurgicalPropedeutics,UniversityofAgriculturalSciencesandVeterinaryMedicine,}

Cluj-Napoca,Romênia

Recebidoem14dejaneirode2015;aceitoem11defevereirode2015 DisponívelnaInternetem21dejulhode2016

PALAVRAS-CHAVE Anestesia;

Caspase-3; Isoflurano; Fígado; Sevoflurano

Resumo

Justificativaeobjetivos: Anestésicosinalatóriossãousadosemhumanosetambémnaprática médicaveterinária.Nopresenteestudoinvestigamosoefeitodeisofluranoesevofluranoem hepatócitosderato.

Métodos: Foramusadosnesteestudo40ratosWistarfêmeas.Osanimaisforamdivididosem gruposdecinco.OsgruposIMeSMserviramcomocontrole.OsgruposI1,I2eI3foramusados paraoestudodeisofluranoeosgruposS1,S2eS3paraoestudodesevoflurano.Osratosforam anestesiadostrêsvezes,duranteduashorasemintervalosdedoisdias,comumaconcentrac¸ão de1,5%deisoflurano(I1,I2,I3)e2%desevoflurano(S1,S2,S3).Ofornecimentodeoxigênio duranteaanestesiafoide1LO2/min.OsgruposIM,IS,I1eS1foramsacrificadosimediatamente

apósaúltimaanestesia.OsgruposI2eS2foramsacrificadosseishorasapósaúltimaanestesia eosgruposI3eS3foramsacrificados24horasapósaanestesia.Amostrasdosfígadosforam colhidaspararessaltaracaspase-3emhepatócitosapoptóticos.

Resultados: Apósaadministrac¸ãodeisoflurano,haviamenosde1%dascélulas emapoptose em destaque nos fígados dos ratos dos grupos IM, I1 e I2. Às 24 horas após a anestesia (grupoI3),umpequenonúmerodehepatócitosapoptóticosfoidestacado(3,23%decélulasem apoptose), comumadisposic¸ão estritamenteperiacinar,distribuídosaleatoriamente em um pequenonúmerodelóbuloshepáticos.Apósaadministrac¸ãodosevoflurano,menosde1%de hepatócitosapoptóticosfoiidentificadoemtodososmomentosdecontroleaolongodoestudo.

夽

EstudofeitonoDepartamentodeAnestesiologiaePropedêuticaCirúrgica,UniversidadedeCiênciasAgráriaseMedicinaVeterinária, Cluj-Napoca,Romênia.

∗_{Autorparacorrespondência.}

E-mail:adrianfloringal@yahoo.com(A.F.Gal). http://dx.doi.org/10.1016/j.bjan.2015.09.007

Conclusões:Osresultadossugeremqueosanestésicosnãoapresentamumahepatotoxicidade considerável.Aavaliac¸ãocomparativadosdoisanestésicosmostraquesevofluranoésuperior aoisoflurano.

©2015SociedadeBrasileiradeAnestesiologia.PublicadoporElsevierEditoraLtda.Este ´eum artigoOpen Accesssobumalicenc¸aCCBY-NC-ND( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

KEYWORDS Anesthesia; Caspase-3; Isoflurane; Liver; Sevoflurane

Comparativeimmunohistochemicalassessmentoftheeffectofrepetitiveanesthesia

withisofluraneandsevofluraneonratliver

Abstract

Backgroundandobjectives: Inhalationanestheticsareused inhuman,as wellas veterinary medicalpractice.Inthepresentstudyweinvestigatedtheeffectofisofluraneandsevoflurane onrathepatocytes.

Methods:Atotalof40Wistarfemaleratswereusedinthisstudy.Animalsweredividedingroups of5rats.GroupsIM,SMservedascontrolgroups.GroupsI1,I2,I3wereusedtostudyisoflurane andS1,S2,S3forsevofluranestudy.Theywereanesthetized3times,for2hlong,at2days intervalwithaconcentrationof:1.5%isoflurane(I1,I2,I3)and2%sevoflurane(S1,S2,S3).The oxygensupplythroughouttheanesthesiawas1LO2/min.GroupsIM,IS,I1,S1weresacrificed

immediatelyafterthelastanesthesia.GroupsI2,S2weresacrificed6hafterthelastanesthesia, andgroupsI3,S3,24hpost-anesthesia.Liversampleswereharvestedtohighlightcaspase-3in apoptotichepatocytes.

Results:Followingisofluraneadministration,therewerelessthan1%cellsinapoptosis high-lighted inrat livers from groups IM, I1 andI2. At 24h post-anesthesia (group I3),a small number ofapoptotic hepatocytes was highlighted(around 3.23% cellsinapoptosis), witha strictlyperiacinardisposition,randomlydistributedinasmallnumberofhepaticlobules.After sevofluraneadministration,lessthan1%apoptotichepatocyteswereidentifiedatallcontrol momentsthroughoutthestudy.

Conclusions:Theresultssuggestthattheanestheticsdonotpresentaconsiderable hepatoto-xicity.Thecomparativeassessmentofthetwoanestheticsshowsthatsevofluraneissuperior toisoflurane.

©2015SociedadeBrasileiradeAnestesiologia.PublishedbyElsevierEditoraLtda.Thisisan openaccessarticleundertheCCBY-NC-NDlicense( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Introduc

¸ão

Anestésicos inalatórios são amplamente usados em medi-cina humana e veterinária. Podem ser usados no manejo anestésico em um grande número de espécies, incluindo aves,répteiseanimaisselvagens.1---5_{Oprincipallocalpara}

o metabolismo dos anestésicos inalatórios é o fígado.6,7

Nessas circunstâncias, é possível que algumas alterac¸ões fisiológicas ou morfológicas aparec¸am no fígado devido à ac¸ão direta desses anestésicos ou de alguns metabólitos intermediáriosque resultaram durante a sua degradac¸ão. Essesaspectosforamtemasdeváriosestudosquetrouxeram informac¸õesmuitoúteis,masaindahácontrovérsiassobre a ac¸ão dos anestésicos inalatórios sobre o fígado. Assim, háestudosquerelatamumapequenaelevac¸ãodasenzimas hepáticas, enquanto outros relatam hepatite necrótica fulminante,queresultanamortedopaciente.8---10

A grande maioria das pesquisas avaliou os efeitos dos anestésicos inalatórios sobre a func¸ão hepática.11

Aspec-tos macro e especialmente microscópicos foram o objeto deestudodeumnúmerorelativamentepequenode pesqui-sas.Algunsautores sustentamquea anestesiaprolongada comisofluranonãoinduzlesõeshepáticasemanimais.12---14

Soubhia et al.10 _{avaliaram histologicamente a atividade}

datransaminase e tambémo fígado após a exposic¸ão ao

sevofluranoeregistraramvaloresligeiramenteaumentados paraaatividadedatransaminaseenenhumaalterac¸ão mor-fológica do parênquima hepático em microscopia de luz. Hondaetal.15 _{avaliaramtantoafunc¸ãoquantoa}

morfolo-giahepáticaapós aexposic¸ãoao isofluranoe sevoflurano. A conclusão do estudo foi que o grau das lesões hepá-ticas induzidas pela exposic¸ão ao isoflurano foi maior do que o grau das lesões induzidas pela exposic¸ão ao sevo-flurano. Elena et al.16 _{estudaram a fisiologia e histologia}

do fígado, rim e bac¸o após anestesia repetida com sevo-flurano.Osautoresnãodetectaramalterac¸õesnasfunc¸ões hepáticaerenaloualterac¸õesnaarquiteturadessesórgãos. Outrosautoresrelatamlesõeshistopatológicasquevariam depanlobularamultifocaleaténecrosefulminante.17 _Um

casodeinsuficiênciahepáticafulminantefoirelatadoapós aterceiraexposic¸ãoaoisoflurano,comnecrosesubmacic¸a e macic¸a no exame histopatológico.8 _{Zizek et al.}9

tam-bém relatam insuficiência hepática subaguda fatal, com necrose macic¸a dos hepatócitos em anestesia repetida comsevoflurano.

Métodos

OprotocoloexperimentalfoiaprovadopeloComitêdeÉtica emPesquisaCientíficadaUniversityofAgriculturalSciences and Veterinary Medicine (UASVM) Cluj-Napoca e condu-zidodeacordo comasnormas doMinistériodaSaúdee a legislac¸ão europeia sobre o tema.O estudo experimental foifeitonoBiobaseenoDepartamentodeAnestesiologiae PropedêuticaCirúrgicadaUASVMCluj-Napoca.

Foram usados no estudo experimental 40 ratos da linhagem Wistar,fêmeas deseis semanas. Osratos foram alocados aleatoriamente em oito grupos com cincocada. Dois desses grupos serviram como controles: Grupo IM (controlepara isoflurano)e grupoSM (controlepara sevo-flurano);osratosdesses gruposforamexpostosaoxigênio isolado(1L.min-1_{)portrêsvezes,duranteduashoras, com} doisdiasdeintervalo. Trêsgrupos (I1,I2eI3)foram sub-metidosàanestesiacomisofluranoa1,5%deconcentrac¸ão e os outros três grupos (S1,S2eS3) à anestesia com sevoflurano a 2% de concentrac¸ão. Nas concentrac¸ões usadas, a concentrac¸ão alveolar mínima (CAM) foi de aproximadamenteum,tantoparaisoflurano18 _quantopara

sevoflurano.19 _{A concentrac¸ão do anestésico foi ajustada}

comumvaporizador.

Usamosumacaixadeinduc¸ãoparaasanestesias.Osratos foramintroduzidosnacaixadeinduc¸ão15minutosantesdo inícioda anestesia, com o objetivode acomodar. Os gru-pos experimentaisforam anestesiadostrês vezes,durante duashoras, em dois dias deintervalo. O fornecimento de oxigênioduranteaanestesiafoide1LO2.min-1paraambos isofluranoesevoflurano.Seguimosoprotocolorecomendado porHondaetal.,15_{asanestesiasforamrepetidastrêsvezes}

paraavaliarosefeitosdaanestesiarepetidacomisoflurano esevoflurano.

Apósa conclusãodasanestesias,osratosforam sacrifi-cadospordeslocamentocervical,emdiferentesmomentos pós-anestésicos: os grupos IM, SM,I1 e S2imediatamente apósaanestesia;osgruposI2eS2seishapósaanestesiae osgruposI3eS324horasapósaanestesia.

Imediatamente após a eutanásia, amostras do fígado foram colhidas, introduzidas em formalina tamponada a 10% para fixac¸ão. Após o período de fixac¸ão, as amostras foram embebidas em parafina e depois seccio-nadas a uma espessura de 5␮m e montadas em lâminas

microscópicas revestidas com poli-L-lisina (para a reac¸ão imunohistoquímica).

Para detectar os hepatócitos apoptóticos, usamos a reac¸ão imunohistoquímica para realc¸ar a expressão da caspase-3, como marcador de morte celular programada. Para esse propósito, o sistema Leica Bond-maxTM Imu-nohistochemistry (Leica Biosystems Melbourne, BondMax, M2 12154) foi usado. A imunomarcac¸ão foi feita com anticorpos anti-caspase-3 policlonal de coelho (diluic¸ão 1/75,RabbitAnticaspase 3Polyclonal,Linaris,Biologische Produkte,Dossenheim,Alemanha---Cat.N◦_{RB-1197-R7).As}

etapasdosistemaparacorarassec¸õesforamasseguintes: (a)desparafinizac¸ãoe lavagemcom umasoluc¸ãode EDTA com pH 8,8 (soluc¸ão de recuperac¸ão de epitopo2), 98◦_C

por20minutos;(b)apósalavagem,okitDC9800foiusado por 10minutos (Leica Microsystems GmbH) para bloquear a peroxidase endógena; (c) lavagem e, em seguida, o anticorpoprimárioanti-caspase-3decoelhofoiadicionado

e incubado por 30minutos; (d) adic¸ão e incubac¸ão da polimerasepor10minutos,obteve-seareac¸ãodecorcom aajudadeDAB(diaminobenzidina).

A avaliac¸ão do marcador foi feita por meio de quantificac¸ãodascélulasimunomarcadas.Ascélulascomum citoplasmamarromdeintensidadediferenteforam conside-radaspositivas.Ascélulasimunomarcadasdecincocampos microscópicos, com ampliac¸ão de 400×, foram contadas.

Oseguintemétododeclassificac¸ãofoiusadoparacadacaso: (I)menosde1%decélulasem apoptose,(II)1-2%de célu-lasemapoptosee(III)maisde2%decélulasem apoptose. As imagens microscópicas foram obtidascom o microscó-pioópticoOlympus BX51conectado a umacâmeradigital Olympus DP-25, armazenadas em cartão de memória digitalemostradasnomonitor.

Resultados

Areac¸ãoimunohistoquímicaparaacaspase-3destacouum númeropequeno decaspase-3 em células positivas hepá-ticas dosratos dos grupos IM e SM(i. é, menosde 1%de célulasemapoptose),nãomaisdoqueataxadetrocados hepatócitos normais. Além do fato deserem escassas, as célulaspositivasparacaspase-3 estavamisoladase disper-sasnoslóbuloshepáticos.Namaiorpartedaáreadesecc¸ão, oslóbuloshepáticosapresentavam estruturanormale não continhamcélulasapoptóticas(fig.1).

OsfígadosdosratosdoGrupoI1nãoapresentarammais célulaspositivas para caspase-3 do que o Grupo controle (i.é,menosde1%decélulasem apoptose),demodoque não estavam presentes na grande maioria dos lóbulos, nem mesmo isoladamente. A situac¸ão foi semelhante no Grupo I2, em relac¸ão tanto ao aspecto geral do órgão quanto ao pequeno número de células em apoptose, em comparac¸ão com o grupo controle (i. é, menos de 1% de células em apoptose). As primeirasalterac¸ões visíveis aparecemsomentenoGrupoI3econsistiamnapresenc¸ade célulaspositivas para caspase-3 em alguns lóbulos(3,23% das células em apoptose, o que representa mais de 2% das células em apoptose, de acordo com o método de classificac¸ãosugerido).Algumasdascélulasbempróximasà

Figura2 GrupoexperimentalI3---célulasapoptóticas distri-buídasemáreascentrolobulares(sugeridasporumcitoplasma maisescuro)---setaspretas;reac¸ãoimunohistoquímica, anticor-pospoliclonaisanti-caspase-3;contracoradocomhematoxilina deMayer.

veiacentrolobularpareceramafetadas(fig.2).Observamos queo fenômenonão estavapresenteem todosos lóbulos hepáticos, mas apenas em alguns deles. Não observamos alterac¸ões inflamatóriasou distúrbioscirculatórios após a exposic¸ãodosratosaoisoflurano.

NosfígadoscolhidosderatosnoGrupoS1,asituac¸ãofoi comparávelcom a do grupo controle, o número de célu-laspositivasparacaspase-3foimuitopequeno.Umgrande aumentodascélulaspositivasparacaspase-3nãofoi obser-vado nos grupos S2 e S3. Não observamos outras lesões associadas(p.ex.,lesõesdistróficas, inflamatóriasou dis-túrbioscirculatórios)nofígado apósa exposic¸ão dosratos aosevoflurano.

Discussão

Osfígadosdosratos nosgrupos decontrole apresentaram umaspectonormal quantoà lobulac¸ão e ao padrão lobu-lar. Células positivas para caspase-3 (i. é, em apoptose) foramidentificadas,masseunúmerofoipequeno; na ver-dade,representaramataxanormaldetrocadehepatócitos (aspecto sugerido pela disposic¸ão isolada, dispersa pelos lóbulos hepáticos, com numerosos lóbulos hepáticos sem célulasimunomarcadas).

Os fígados dos ratos no Grupo I1 foram comparáveis com os dos ratos no grupo controle, em todos os aspec-tos. Células positivas para caspase-3 estavam presentes empequenasquantidades e apenasemalguns lóbulos,de modoque nãopodemos afirmarqueapós a administrac¸ão doanestésicohouvereac¸õesadversasimediatas,oumesmo reac¸ões discretas. No Grupo I2 não foram observadas alterac¸õesemrelac¸ãoàdistribuic¸ãodeapoptosesnofígado, em comparac¸ão com os dois grupos apresentados ante-riormente. No Grupo I3, um ligeiro aumento do número de células positivas para caspase-3 foi observado, em comparac¸ãocomosgruposcontrole,I1eI2ecomo obser-vadonosgruposIM,I1eI2;nocasodossujeitosdoGrupoI3, umnúmeromaiordecélulasimunomarcadas(emapoptose) foiidentificado,focalmentedispostas,predominantemente

centroacinares. Uma possível explicac¸ão para a afetac¸ão das células na vizinhanc¸a imediata da veia centrolobular pode ser o fato de o anestésico atingir o fígado através dosistemacirculatório,masnesse caso oshepatócitosna periferia dos lóbulos deveriam ser asprimeiras células a ceder,porqueesseéolocaldeentradadossinusoidesnos lóbulos hepáticos.Porém, oshepatócitos na periferia dos lóbulossãofavorecidosemtermosdesuprimentode nutri-enteseoxigênio,sãoosprimeirosaserbeneficiadosdevido àsuadisposic¸ão,o queparececonferirresistência àac¸ão anestésica.Ascélulaspróximasàveiacentrolobularsãoas últimas a ser supridas. Aparentemente, isso as torna um poucovulneráveis,algumasentramemapoptosesobaac¸ão anestésica.Outrosrelatossugeremqueazonaperiacinaré particularmentevulnerávelànecrose/apoptose(conhecida comonecrose/apoptosedazona3ouperiacinar),emparte porqueestãomaisdistantesdachegadadosanguearteriale venosoportalquetrazoxigênioenutrientesessenciais.20,21

Contudo,onúmerodecélulasapoptóticasfoipequeno; podemos afirmar que isoflurano é um anestésico com boa tolerância. As reac¸ões adversas que apareceram no fígadoapósasuaadministrac¸ãoemdoseterapêuticaforam mínimas, sem outras lesões celulares (p. ex., distrofias, necroses,desordensvasculares)queinduzemalterac¸õesno padrãodoórgão.

Aadministrac¸ãodesevofluranonãoresultounoaumento donúmerodehepatócitospositivosparacaspase-3nos gru-pos experimentaisimediatamenteapósa anestesiaounos outros tempos deavaliac¸ão (6h e 24h após a anestesia). Em nenhum desses momentos, as células positivas para caspase-3estiveramemumnívelquesugerisseaapoptose dehepatócitosprovocadapeloanestésico.Apoptoses esti-veram presentes em um pequeno número de células, de algumaformacomparávelemtodososgrupos,oquenos per-mitedeclararquesuapresenc¸afoiabsolutamentenormale vinculadaàtaxanormaldetrocadehepatócitos.Emoutras palavras,sevoflurano parecenãoinduzir reac¸õesadversas emfígadoderato,detectáveispormeiodeexame histoló-gico.Issodemonstraumatolerabilidadehepáticamuitoboa desevoflurano.

Aavaliac¸ão comparativadoefeitodos doisanestésicos em fígado de ratosublinhao fatode que,embora ambos tenhamsidobemtolerados,pelomenosnadoseenotempo deadministrac¸ãoescolhidospornósnopresenteprotocolo experimental existem certas diferenc¸as entre eles. Essas diferenc¸asreferem-seaofatodequeapesardeapresentar uma boa tolerância, isoflurano desencadeou a apoptose em um número relativamente pequeno de hepatócitos, enquanto sevoflurano não o fez. Embora as diferenc¸as sejam mínimas, o fato de sevoflurano apresentar uma tolerabilidadesuperioremcomparac¸ãocomisofluranoéum destaque.Aesserespeito,nossosresultadossão consisten-tescomosresultadosdeNishiyamaetal.22 _eNishiyama.23

Eles relataram que o grau das lesões hepáticas induzidas pela exposic¸ão ao isoflurano foi maiordo que o induzido porsevoflurano.Hondaetal.15_{fizeramdeclarac¸ões}

tersidoinfluenciadospeladoseque,segundoeles,podeter sidomuitoaltaparapermitirapoptose.Adeclarac¸ãoparece correta,sabe-se quea necroseocorre quandoahipóxiaé graveeaapoptoseocorrequandoahipóxiaéleve.24

Aviaexatadeinduc¸ãodeapoptoseporanestésicos inala-tóriosnãoétotalmenteconhecida,masexistemestudosque propõemdiferenteshipóteses.Zhangetal.25_mostraramque

isofluranoa2%paratratamentoporseishoraspodecausar apoptose.Oestudofoifeitoemculturasdecélulasde neurô-niosprimáriosderatos.Osautoresrelataramqueisoflurano podeaumentaroníveldofatorpró-apoptóticoBax,diminuir oníveldofatorantiapoptóticoBcl-2,aumentaroacúmulo deespéciesreativasde oxigênio,permitir alibertac¸ão de citocromo-cdasmitocôndriasnocitosol,induziraativac¸ão dacaspase9ecaspase-3einduzirassimaapoptoseatravés dafamíliadeproteínasBcl-2eviamitocondrial.

Wei etal.26 _{propuseramoutra hipótese:aativac¸ãodos}

receptoresdeinositol1,4,5-trifosfato(IP3)nasmembranas doretículoendoplasmáticoporisoflurano.Essefatocausa aliberac¸ãoexcessiva decálcioedesencadeia aapoptose. Os autores especificaram que a apoptose induzida por isoflurano, dependente da concentrac¸ão e durac¸ão do anestésico,aumentou ocálcio citosólico e,em seguida,o mitocondrial.Turrilazzietal.27_{relatamumcasodenecrose}

hepáticafulminantefatalapósanestesiacomsevofluranoe atribuíramcomocausaoaumentodecálciocitoplasmático porsevoflurano.

Em conclusão, nossos resultados mostramque sevoflu-ranonãodesencadeiaaapoptosedehepatócitos,enquanto isofluranodeterminaapoptoseperiacinarmoderada incons-tante,24horasapósaanestesia.Nossosresultadossugerem que os anestésicos testados não apresentam uma hepa-totoxicidade significativa, sevoflurano provou ter uma tolerabilidadesuperioremcomparac¸ãocomisoflurano.

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

Agradecimentos

EsteartigofoipublicadosobopatrocíniodoEuropeanSocial Fund, Human Resources Development Operational Pro-gramme2007-2013,projeton◦ _{POSDRU/159/1,5/S/136,893}

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