Juliane Silberschmidt Freitas
Efeito do hormônio 17β-estradiol na gametogênese dos órgãos de Bidder e
testículos e no tecido hepático em machos de
Rhinella schneideri
(Anura:
Bufonidae)
Juliane Silberschmidt Freitas
Efeito do hormônio 17β-estradiol na gametogênese dos órgãos de Bidder e
testículos e no tecido hepático em machos de
Rhinella schneideri
(Anura:
Bufonidae)
Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biologia Animal, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto.
Orientador: Prof. Dr. Classius de Oliveira
Freitas, Juliane Silberschmidt.
Efeito do hormônio 17β-estradiol na gametogênese dos órgãos de Bidder e testículos e no tecido hepático em machos de Rhinella
schneideri (Anura: Bufonidae) / Juliane Silberschmidt Freitas. - São José do Rio Preto : [s.n.], 2013.
150 f. : il. ; 30 cm.
Orientador: Classius de Oliveira
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas
1. Reprodução. 2. Anuros. 3. 17β-estradiol. I. Oliveira, Classius. II. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título.
CDU – 597.8
Juliane Silberschmidt Freitas
Efeito do hormônio 17β-estradiol na gametogênese dos órgãos de Bidder e
testículos e no tecido hepático em machos de
Rhinella schneideri
(Anura:
Bufonidae)
Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biologia Animal, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto.
Banca Examinadora
Prof. Dr. Classius de Oliveira
UNESP – São José do Rio Preto
Orientador
Prof(a). Dr(a). Dr(a). Rosicleire Verissimo Silveira
UNESP – Ilha Solteira
Prof. Dr. Sebastião Roberto Taboga
UNESP – São José do Rio Preto
Agradecimentos
Agradeço em primeiro lugar aos meus pais, Aparecida e Jolindo, pela educação, pelo carinho incondicional, pela oportunidade de estudo, pelo apoio e por me mostrarem sempre o caminho certo. Agradeço ainda por colocarem a mim e a meus irmãos sempre em primeiro lugar em suas vidas.
Aos meus irmãos, Juninho e Joemar, pelo amor e carinho nos momentos difíceis.
Ao meu orientador e amigo, Prof. Dr. Classius de Oliveira pelos ensinamentos e por sempre acreditar e confiar em mim.
A toda equipe do laboratório de Anatomia, pela convivência tão agradável e por tornar esse trabalho possível. Em especial à Lilian, pelo apoio, pelas ideias e disposição e aos amigos, Gabi, Nego e Lara.
Aos integrantes do Centro de Microscopia do IBILCE pelo auxílio nas análises e execução dos procedimentos experimentais. Em especial ao Luiz, pela paciência e dedicação.
A todos os professores que contribuíram para minha formação pessoal e profissional durante a graduação e pós-graduação. Em especial à Professora Lilian Casatti, pelas oportunidades e por acreditar em nós, alunos da Pós Graduação em Biologia Animal.
Aos membros que participaram da banca de Qualificação, Silvana Gisele Pegorin de Campos e Rejane Maira Gões, pelas sugestões e dicas.
Às minhas amigas e companheiras Carol e Lari, pela convivência, pela amizade, pelo carinho, pelo apoio, pelas alegrias e por tornar meus dias mais engraçados.
A todos os meus amigos que cursaram a Graduação e que fizeram parte dessa linda história. Para aqueles que se mudaram e para aqueles que ficaram. Obrigada pelos momentos incríveis!
Aos amigos, Deia, Carol Zanon, Ana Claudia, Fabi, Cíntia, Tadeu, Thiago, Plinio, Batatais e àqueles membros da Associação Atlética Acadêmica, por fazerem parte da minha vida e de boas recordações.
A todos os amigos dos demais laboratórios do IBILCE, pela paciência, ajuda e ensinamentos.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo apoio financeiro concedido na forma de Bolsa de Mestrado (Proc. 2010/12939-1).
A todos aqueles que eu possa ter me esquecido de agradecer nesse momento, mas que sabem que fizeram parte da minha trajetória... Obrigada!
Sumário
RESUMO ... 1
ABSTRACT ... 3
I. Introdução ... 5
I.1. Panorama geral dos anfíbios ... 5
I.2. A Família Bufonidae ... 6
I.3. A espécie Rhinella schneideri ... 7
I.4. O Aparelho reprodutor ... 8
I.5. O hormônio 17β-estradiol: caracterização e influência no aspecto reprodutivo de organismos dependentes do ambiente aquático. ... 10
II. Justificativa e Relevância do tema ... 12
III. Objetivos ... 13
IV. Materiais e Métodos... 13
IV.1. Delineamento experimental: ... 14
IV.1.1. Tratamento Hormonal ... 14
IV.1.2. Processamento e análise do material ... 16
V – Resultados e Discussão ... 18
VI- Referências Bibliográficas ... 20
Capítulo 1 ... 30
Abstract ... 31
Introduction ... 32
Materials and Methods ... 33
Results ... 37
Discussion ... 43
Acknowledgements ... 47
References ... 55
Capitulo 2 ... 61
Resumo ... 62
Introdução ... 63
Metodologia ... 65
Resultados ... 66
Discussão ... 71
Agradecimentos ... 76
Figuras ... 77
Capítulo 3 ... 92
Resumo ... 93
Introdução ... 94
Metodologia ... 96
Resultados ... 99
Discussão ... 104
Agradecimentos ... 112
Figuras ... 113
Referências Bibliográficas ... 117
Capítulo 4 ... 126
Resumo ... 127
Introdução ... 128
Metodologia ... 129
Resultados ... 132
Discussão ... 135
Agradecimentos ... 140
Figuras ... 141
Referências Bibliográficas ... 145
1
RESUMO
2 de lipofuscina aumentou em todos grupos experimentais, com exceção ao tratamento de 30 dias. Além disso, observamos que a quantidade do pigmento melanina também variou frente à ação hormonal, diminuindo nos tratamentos de curto prazo e aumentando naqueles de exposição prolongada. Em suma, nosso trabalho mostra que o 17β-estradiol pode comprometer a reprodução de machos de R. schneideri por meio da alteração da ocorrência de células germinativas masculinas viáveis e das células femininas do órgão de Bidder. Além disso, as análises do fígado, principal órgão de detoxificação, sugerem que a responsividade dos pigmentos hepáticos ocorrem devido à ação citoprotetora. Compostos estrogênicos e outros desreguladores endócrinos são assumidos por contribuir ao declínio mundial de populações de anfíbios, principalmente por intervir em vias reprodutivas. Essa pesquisa contribui para preservação de anuros bufonídeos, os quais apresentam uma condição próxima ao hermafroditismo e estão frequentemente expostos a ambientes influenciados por ações antrópicas degradantes.
3
ABSTRACT
4 assumed to contribute to the worldwide decline of amphibian populations, primarily by causing disturbances in reproductive pathways. This research contributes to the preservation of bufonids anurans, which present a condition close to hermaphroditism and are often exposed to environments influenced by anthropogenic actions.
5
I. Introdução
I.1. Panorama geral dos anfíbios
A classe Amphibia (Gray, 1825) inclui animais de sangue frio com tegumento úmido e sem escamas. São considerados como grupo pioneiro de vertebrados a viver em ambiente
terrestre há cerca de 350 a 400 milhões de anos e apresenta-se dividida em três subclasses:
Labyrinthodontia, Lepospondyli e Lissamphibia (Linzey, 2001; Pough et al., 2003). As subclasses Labyrinthodontia e Lepospondyli foram as pioneiras sobre a face da Terra, mas
encontram-se extintas. Os Amphibia ainda existentes, ou Lissamphibia, apareceram no
período Jurássico da era Mesozóica, há cerca de 150 milhões de anos (Linzey, 2001).
Atualmente são conhecidos três grupos de anfíbios: as salamandras (Caudata),
amplamente distribuídas, principalmente no hemisfério norte; as cobras-cegas
(Gymnophiona), caracterizadas pela ausência de membros; e os anuros (Anura), conhecidas
como sapos, rãs e pererecas, que constituem o principal grupo de anfíbios encontrados no
Brasil (Bastos et al., 2003). Segundo a Sociedade Brasileira de Herpetologia (SBH, 2012),
no país, foram reconhecidas 946 espécies de anfíbios, dos quais 913 pertencem à Ordem
Anura e 578 da família Bufonidae, sendo o Brasil o país que possui a maior diversidade.
Nas últimas décadas os anfíbios têm sido mencionados como o principal grupo
ameaçado de extinção (Stuart et al., 2004; Wake e Vredenburg, 2008; Hayes et al., 2010;
Blaustein et al., 2011). Alguns pesquisadores acreditam que estamos observando um
episódio de extinção em massa (Wake e Vredenburg, 2008), uma vez que a perda e
diminuição de espécies estão ocorrendo a taxas sem precedentes (May, 2010), sendo que os
valores relatados para esses animais são quase 200 vezes mais alto do que para os demais
6 As causas atribuídas ao declínio dos anfíbios são complexas e incluem uma série de
fatores como destruição do habitat, introdução de espécies exóticas, alterações climáticas e
atmosféricas e poluição dos ambientes aquáticos por diversos contaminantes (Wake e
Vredenburg, 2008) provenientes de efluentes da indústria, agricultura e esgoto doméstico
(Desbrow et al., 1998; Snyder et al., 1999; Boyd et al., 2003). Além disso, os anfíbios apresentam características peculiares, como permeabilidade cutânea e ciclo de vida
dependente do ambiente aquático e do terrestre, que os tornam vulneráveis a uma gama de
estressores (Rabb, 1990; Duellman e Trueb, 1994). Pelo caráter próprio e declínio
populacional de certas espécies, o grupo é reconhecido como bioindicador de qualidade
ambiental (Weygoldt, 1989; Vitt et al., 1990; Blaustein e Wake, 1995).
Dados da IUCN (International Union for Conservation of Nature) indicam que
aproximadamente 32% das espécies mundiais dos anfíbios estão ameaçadas. O maior
problema é que o declínio das espécies está acontecendo muito rapidamente e poucos
desses processos têm sido observados ocorrer. Na maioria das vezes somente obtem-se a
informação que essas espécies desapareceram. Apesar de muitas vezes ser atribuída uma
causa enigmmática para o fênomeno em algumas populações, devido à grande quantidade
de cofatores associados (Stuart et al., 2004), não há dúvidas de que a intensa pressão
humana, direta ou indiretamente, está causando profundos efeitos nos ambientes naturais
(Wake e Vredenburg, 2008).
I.2. A Família Bufonidae
A família Bufonidae (Gray, 1825) é caracterizada por agrupar os “verdadeiros
sapos” e apresenta-se composta por 39 gêneros e 578 espécies com ampla distribuição em
grandes extensões mundiais (Frost, 2010). Inclui animais de pele seca, com glândulas
paratóides situadas superiormente aos olhos e com os membros anteriores e posteriores
7 A reprodução neste grupo é diversificada, com espécies que colocam seus ovos na
água e produzem larvas aquáticas, outras que apresentam desenvolvimento terrestre e nos
gêneros Nectophrynoides e Nimbaphrynoides ocorre viviparidade. As características
compartilhadas entre os animais da família são: presença de órgão de Bidder, sendo esse
exclusivo dos bufonídeos; ausência de dentes na maxila superior e inferior; músculo
constritor ausente; depressão no músculo mandibular originando unicamente de um
esquamosal, presença de corpos adiposos e crânio altamente ossificado, sendo os demais
compartilhados entre outros anfíbios (Amphibiaweb, 2009).
O hermafroditismo, embora bem documentado em peixes, é considerado bastante
raro entre os tetrápodas (Warner, 1978). Porém, sabe-se que entre os anfíbios, a
característica mais próxima para tal propriedade ocorre entre bufonídeos, os quais
apresentam o órgão de Bidder (Pancak, 1987; Witschi, 1933; Pancak-Roessler e Norris,
1991). Esse órgão está presente em ambos os sexos e apresenta capacidade de produzir
células germinativas femininas mesmo quando presente em machos. Esse caráter peculiar
tem sido utilizado como característica sistemática do grupo (Duellman e Trueb, 1994).
I.3. A espécie Rhinella schneideri
A espécie Rhinella schneideri (Werner, 1894) é popularmente conhecida como sapo-cururu devido às suas vocalizações bastante típicas, que durante as estações
reprodutivas ecoam em quase todas as áreas abertas do Cerrado. Apresenta ampla
distribuição geográfica na América do Sul com adensamento populacional em áreas
antrópicas pela alta disponibilidade de alimentos (Cochran, 1955).
É um animal de porte relativamente grande, atingindo entre 180 a 210 mm de
comprimento rostro-cloacal, e a coloração varia do castanho-claro a escuro ou esverdeado.
8 cutâneas (Cochran, 1955). Duas dessas, localizadas superiormente e atrás dos olhos, são
chamadas de glândulas paratóides e atrás da tíbia estão as glândulas paracnemis. Quando
comprimidas liberam veneno através de grandes poros que escorre pela pele do animal
(Cardoso et al., 2003) atuando como um mecanismo de defesa passiva.
Os machos costumam vocalizar nas margens de lagoas e açudes, e m áreas abertas e
apenas durante a noite e possuem comportamento reprodutivo explosivo. O amplexo é
axilar e a desova é depositada na forma de cordões gelatinosos, em ambientes lênticos, nos
quais os girinos se desenvolvem (Cochran, 1955; Bastos et al., 2003).
I.4. O Aparelho reprodutor
De todas as características dos anfíbios, nenhuma é mais notável que a variedade
dos modos de reprodução, sendo ela muito maior que a de qualquer outro grupo de
vertebrados, com exceção dos peixes (Duellman e Trueb, 1994; Pough et al.,2003).
Para as três ordens de anfíbios, o aparelho reprodutor é constituído por um par de
gônadas conectadas por meio de ductos genitais próprios, constituindo a via gametogênica.
Nos anuros, os testículos são estruturas arredondadas, compactas e de coloração geralmente
amarelada (Goin e Goin, 1962), estes normalmente são mais lisos, firmes e menores que os
ovários na mesma espécie e, entre os dois membros do par, não é rara a ocorrência de
assimetria de tamanho e posição (Hildebrand, 1995).
Devido à transparência da túnica albugínea, são observados os lóculos seminíferos,
os quais são unidades de formas compactas de coloração esbranquiçada e que alojam
células de linhagem germinativa (Oliveira, 1996) equivalentes aos túbulos seminíferos dos
mamíferos. No epitélio seminífero, as células germinativas encontram-se associadas às
células de Sertoli, constituindo cistos espermatogenéticos ou espermatocistos (Santos e
9 estabelecendo uma sincronia de desenvolvimento, característica comum dos anfíbios (Lofts,
1974; Franchi et al., 1982; Ucci, 1982; Cavicchia e Moviglia, 1983; Rastogi et al., 1988; Báo et al.,1991; Oliveira, 1996), organização que também ocorre em outros animais, como
os peixes.
Após a diferenciação e o desenvolvimento sexual do indivíduo, frequentemente
também são descritas estruturas vestigiais que permanecem como não funcionais. Para a
família Bufonidae, o órgão de Bidder ocorre em machos e em fêmeas (Witschi, 1933;
Wake, 1980; Pancak-Roessler et al., 1991; Duellman e Trueb, 1994; Farias et al., 2002;
Oliveira et al., 2003) e é caracterizado como uma massa de tecido ovariano vestigial que em
certas circunstâncias pode tornar-se funcional (Orr, 1986). Petrini e Zaccanti (1998) relatam
que nos bufonídeos, durante a fase larval, a região anterior do primórdio gonadal
desenvolve-se em órgão de Bidder e a região posterior se diferencia em ovário ou testículo.
O primórdio gonadal tem inicialmente características de ovário, que é mantida em fêmeas
de anuros. Entretanto, em machos, o primórdio posterior diferencia-se em testículos até o
término da metamorfose, e o primórdio anterior retém a condição feminina e se transforma
em órgão de Bidder (McDiarmid, 1971; Petrini e Zaccanti, 1998).
Em machos, esse órgão é localizado na extremidade cranial dos testículos
(Duellman e Trueb, 199. Cada órgão de Bidder apresenta tipicamente a morfologia de um
ovário e externamente está coberto por uma cápsula de tecido conjuntivo.
Histologicamente, o órgão é composto por uma região cortical e outra medular, sendo que a
primeira exibe folículos em diferentes estágios de desenvolvimento (Farias et al., 2002). Em
geral, ovócitos femininos e ovócitos bidderianos são similares, sendo que ambos têm a
mesma estrutura básica e uma camada de células foliculares os circundando (Vitale-Calpe,
10 Embora seja relatada a baixa função gametogênica no Bidder de machos, há fortes
indícios de que persistam funções endócrinas no órgão. Basu e Mondal (1960)
demonstraram que ovidutos de machos de Bufo melanostictus podem ser estimulados ao
crescimento pela ação do estradiol. Sob condições naturais, em fêmeas, o órgão pode
produzir ovos viáveis, capazes de fertilizar e se desenvolver em girinos, em pelo menos
algumas espécies de Bufo, atuando como um anexo ovariano. Apesar da possibilidade de
desenvolvimento em fêmeas, isso não ocorre em machos sob condições naturais. Na
realidade, o órgão de Bidder provavelmente funciona como partes do ovário em muitas
espécies de Bufo, porque são suscetíveis aos mesmos hormônios e possuem basicamente a mesma estrutura (Roessler, 1990).
Autores relatam que a remoção dos testículos dos machos pode resultar no
desenvolvimento do órgão de Bidder em ovário funcional, o qual atuaria como estratégia
morfológica de reprodução (Tanimura e Iwasava, 1986; Duellman e Trueb, 1994). Estudos
com B. woodhousei revelam que a rica fonte vascular e a abundância na atividade esteroidogênica mostram uma grande dificuldade em negar a funcionalidade endócrina do
órgão. Embora não essencial para a sobrevivência desses anuros, a presença do órgão de
Bidder pode beneficiar os organismos fornecendo uma fonte suplementar de esteróides
(Pancak, 1987).
I.5. O hormônio 17β-estradiol: caracterização e influência no aspecto reprodutivo de
organismos dependentes do ambiente aquático.
Dentre as principais causas envolvidas no processo de declínio dos anfíbios, o
desequilíbrio hormonal provocado pelos desreguladores endócrinos nos sistemas naturais
tem sido motivo de preocupação crescente nas últimas décadas, o que tem aumentado o
11 et al., 2010; Hoffmann e Kloas, 2012). Muitos desses contaminantes interferem no sistema
endócrino dos organismos mesmo em pequenas concentrações (Vandenberg et al., 2012),
causando uma série de distúrbios relacionados à reprodução, crescimento, entre outros (Hall
e Henry, 1992; Carey e Bryant, 1995). Há uma gama de desreguladores endócrinos
resultantes das atividades antrópicas que são encontradas no ambiente (Schäfer e Waite,
2002). Contudo, os hormônios naturais (estrona, 17β-estradiol e estriol) e sintéticos
(17a-etinilestradiol e mestranol) são os principais causadores de atividades estrogênicas
encontrados em corpos aquáticos (Aerni et al., 2004).
Estrogênios ambientais são compostos provenientes principalmente de efluentes
municipais e industriais (Desbrow et al., 1998; Snyder et al., 1999; Boyd et al., 2003) e têm sido sugeridos como principais causadores do aumento na incidência de distúrbios do trato
reprodutor masculino (Lofts, 1974). Em peixes, o aumento da concentração de vitelogenina
no plasma também é um indicativo da presença de substâncias com atividade estrogênica
(Sumpter e Jobling, 1995; Korach e McLachlan, 1995; Folmar et al., 2000). A vitelogenina
é considerada um biomarcador de exposição estrogênica em machos ou jovens. Geralmente
só é encontrada nas fêmeas, porém os peixes machos podem apresentar a expressão
hepática da vitelogenina induzida, quando expostos a ambientes contaminados por essas
substâncias (Kramer et al., 1998; Rose et al., 2002; Versonnen et al., 2003; Weber et al.,
2004). Nos anfíbios, esses compostos são também mencionados por provocar
desmasculinização e alterações gonadais em machos (McCoy et al., 2008; Hayes et al.,
2011), além de afetar a diferenciação gonadal em larvas (Mackenzie et al., 2003).
Estudos mostram que a exposição de diversas espécies a um ou mais compostos
químicos estrogênicos é capaz de induzir uma gama de efeitos adversos como
hermafroditismo, redução do tamanho normal dos testículos, comprometimento do
12 espermatozóides, entre outros (Witorsch, 2002; Lathers, 2002). Os testes in vivo são
necessários para a avaliação dos impactos dos desreguladores endócrinos como um todo,
(Birkett e Lester, 2003) uma vez que a maioria dos poluentes requer o metabolismo in vivo
para exercer os efeitos hormonais, os quais não podem ser abordados em modelos in vitro (Daly et al. 1989; Seegal e Schain, 1992).
Dentre os principais contaminantes encontrados no meio, destaca-se o hormônio
17β-estradiol, hormônio natural o qual possui um alto potencial estrogênico, exibindo
elevada atividade mesmo em concentrações muito baixas. Possui 18 carbonos com um anel
fenólico que é o componente estrutural responsável pela alta afinidade em ligar-se ao
receptor de estrogênio e desencadear a resposta estrogênica (Huber et al., 2003). É o
hormônio responsável pela formação das características femininas, comportamento sexual e
ovulação. Sua principal função consiste em determinar o crescimento e proliferação celular
de tecidos e órgãos sexuais que estejam relacionados à reprodução (Routledge e Sumpter,
1996; Tapiero et al., 2002; Nogueira, 2003; Kuster et al., 2004; Nghiem et al., 2004).
II. Justificativa e Relevância do tema
A presença de espermatozoides e ovócitos, derivados de células germinativas
primordiais em sapos machos, estabelece uma condição excepcional de estudo da
diferenciação de células germinativas em vertebrados (Brown et al., 1964). No órgão de
Bidder são encontradas células germinativas femininas, as quais permanecem em um
estágio inicial de desenvolvimento, não completando sua maturação em condições normais.
Devido às características específicas dos anfíbios, como permeabilidade da pele e ciclo de
vida dependente do ambiente aquático, esses animais são bastante vulneráveis às variações
ambientais (Feio et al., 1998) e, por isso, fortemente afetados quando situados em
13 Embora a presença do órgão de Bidder em machos tenha sido descoberta no século
passado (Spengel, 1876), informações sobre a morfologia e sua possível funcionalidade
frente à exposição de substâncias estrogênicas são escassas, ainda menos há com enfoque
nas análises testicular e hepática. Dessa maneira, esse trabalho tem como objetivo avaliar o
efeito do hormônio sexual feminino 17β-estradiol sobre a gametogênese dos órgãos de
Bidder e testículos, sob concentração de 2mg/kg, em diferentes tempos experimentais.
Adicionalmente à análise dos órgãos reprodutivos, também será avaliado o efeito do
hormônio no tecido hepático, uma vez que o fígado é o principal órgão de detoxificação e
umas das principais vias de metabolismo do 17β-estradiol.
III. Objetivos
O projeto teve como objetivo investigar o efeito de curto prazo e de exposição
prolongada do hormônio sexual feminino 17β-estradiol sobre a morfologia do órgão de
Bidder, testículos e fígado em machos de Rhinella schneideri, com o auxílio de análises
anatômicas, morfológicos, histoquímicas e ultraestruturais.
IV. Materiais e Métodos
Foram utilizados quarenta exemplares machos da espécie R schneideri capturados
através de coletas noturnas durante o período chuvoso (em janeiro e fevereiro de 2011), no
Município e região de São José do Rio Preto – São Paulo, Brasil. Os animais capturados
foram acondicionados em sacos plásticos e transportados ao Laboratório de Anatomia
Comparativa do Instituto (IBILCE/UNESP-SJRP) onde foram mantidos em terrários
contendo terra e água para evitar desidratação dos animais, além de galhos, folhas e
14 um período de aclimatização e foram mantidos em meio externo para respeitar ritmos
circadianos de fotoperíodo, temperatura e umidade.
Todos os animais foram coletados sob licença n.18573-1, autorizada pelo Instituto
Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) e eutanasiados
de acordo com as recomendações do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA).
IV.1. Delineamento experimental:
IV.1.1. Tratamento Hormonal
Exemplares machos foram tratados com hormônio sexual feminino 17β-estradiol
(Sigma) durante períodos diferentes. Para R. schneideri foi administrado 2mg/kg de
hormônio dissolvidos em óleo mineral Nujol® (Santos et al. 2007, adaptado). O hormônio
foi administrado por meio de injeções subcutâneas em dias alternados, com dosagem
constante (0,2 ml por aplicação), em quatro grupos experimentais:
Grupo experimental 1: cinco exemplares machos foram submetidos à injeção de
hormônio 17β-estradiol dissolvido em óleo mineral em dias alternados, em um período
experimental de 3 dias. Foram realizadas duas aplicações hormonais e os animais foram
eutanasiados no quarto dia experimental para avaliação do efeito de curto prazo.
Grupo experimental 2: cinco machos foram submetidos ao tratamento hormonal
com injeção em dias alternados, durante um período experimental de 7 dias. Foram
realizadas quatro aplicações hormonais e os animais foram eutanasiados no oitavo dia
experimental.
Grupo experimental 3: cinco machos receberam tratamento hormonal, em dias
alternados, durante um período experimental de 15 dias. Oito aplicações foram realizadas e
15 Grupo experimental 4: cinco exemplares receberam injeção do hormônio durante
um período experimental de 30 dias. Foram administradas dezesseis aplicações e os animais
foram eutanasiados no 31° dia experimental pra análises de efeito prolongado.
Grupo controle: para o controle vinte animais receberam injeção de óleo mineral
sem a presença do hormônio feminino. Grupos de cinco animais foram sacrificados nos
períodos de 3, 7, 15 e 30 dias, de maneira que cada grupo experimental teve seu respectivo
grupo controle. Todos os animais deste grupo tiveram as mesmas análises registradas como
os animais tratados.
Os grupos experimentais foram estabelecidos procurando uma linearidade temporal,
visando esclarecer o efeito estrogênico do hormônio 17β-estradiol em períodos de curto
prazo (representados pelos Grupos Experimentais 1 e 2) e em exposição prolongada
(representados pelos Grupos Experimentais 3 e 4) sobre os órgãos de Bidder, testículos e
células hepáticas.
Os animais foram medidos no comprimento rostro-cloacal e pesados (antes e após o
procedimento experimental). Após os tratamentos, os animais foram anestesiados e
eutanasiados com saturação do anestésico benzocaína (5g/L). A dissecação foi realizada
através de incisão mediana na região ventral desde a cloaca até a altura da cintura dos
membros anteriores, expondo os órgãos para análises macroscópicas e fotodocumentação
em microscópio estereoscópico (Leica MZ16) acoplado ao sistema de captura de imagem
(Image Manager-IM50). Foram removidos os testículos, órgãos de Bidder e fígado de cada
animal e pesados (g) em uma balança analítica de precisão (0,001g). O processamento do
material seguiu-se de acordo com as análises empregadas: morfológicas, ultraestruturais e
16 IV.1.2. Processamento e análise do material
Análise Morfológica e Estereoscópica:
Os fragmentos de fígado, testículo e Bidder foram fixados em solução Karnovsky
(paraformaldeído a 5% e gluraraldeído a 2,5% em tampão fostato Sörensen 0,1M, pH 7,2)
por 24 horas, e encaminhados à rotina histológica (Ribeiro e Lima, 2000) para desidratação
em série alcoólica e incluídos em historesina (Historesin Leica). Secções de 2μm foram
coradas com Hematoxilina-eosina e observadas em microscopia de luz (Robinson e Gray,
1990). As imagens foram capturadas com câmera (Leica DFC280) acoplada ao sistema de
captura (Image Manager-IM50) e analisadas em programa Image Pró-plus versão 4.5.
Para a análise morfométrica do epitélio germinativo dos testículos e órgãos de
Bidder foram aleatorizados campos histológicos (25 para cada animal) capturadas com
câmera (Leica DFC280) acoplada ao sistema de captura (Image Manager-IM50). As
análises quantitativas foram realizadas com a utilização do programa Image Pro-Plus,
Media-Cybernetics Inc.(versão 6.0). Para os testículos, foi utilizada a ferramenta para
medição de área, onde foram obtidas as medidas das áreas ocupadas pelos cistos
espermatogênicos de todas as fases de desenvolvimento. A área dos lóculos seminíferos e
da região intersticial também foi mensurada. Para o órgão de Bidder, foi realizada
quantificação manual dos folículos em diferentes estágios.
Para avaliar o efeito do hormônio sobre o tecido hepático, foram realizadas análises
quantitativas das substâncias pigmentares melanina, lipofuscina e hemosiderina. Para isso,
as imagens histológicas também foram aleatorizadas e capturadas com câmera (Leica
DFC280) acoplada ao sistema de captura (Image Manager-IM50). As análises quantitativas
foram realizadas com a utilização do programa Image Pro-Plus, Media-Cybernetics
Inc.(versão 6.0) de acordo com a proposta de Lehr (1997), com adaptações, a qual se baseia
17 As análises macroscópicas e de fotodocumentação foram realizadas com a utilização
de um microscópio estereoscópico (Leica MZ16) e programa de captura de imagens (Image
Manager-IM50) para as descrições da arquitetura morfológica geral dos testículos, fígado
órgão de Bidder.
Análise histoquímica:
Para a detecção da substância lipofuscina foram utilizados cortes histológicos de órgão
de Bidder, testículos e fígado com 2 μm de espessura, em historresina. Os cortes foram
incubados por 15 mim em solução de Schmorl, composta de 75mL de cloreto férrico a 1%,
10mL de ferricianeto de potássio e 15mL de água destilada, posteriormente imersas em
solução aquosa de vermelho neutro a 1% seguida de solução aquosa de eosina 1%. Após
esses procedimentos, os cortes foram montados em lâminas permanentes. A lipofuscina é
um pigmento intra-lisossomal resultante da polimerização oxidativa de ácidos graxos
poliinsaturados, sendo acumulado em células pós-mitóticas (Pickford, 1953). Durante a
degradação autofágica normal da mitocôndria e proteínas contendo ferro, nos lisossomos, o
ferro é liberado intra-lisossomicamente, onde ele pode reagir com peróxido de hidrogênio
formando radicais hidroxila. Dependendo de sua taxa de formação, estes radicais altamente
reativos podem se ligar a materiais lisossômicos, levando à formação de lipofuscina, ou
desestabilizando a membrana lisossomal, o que induz apoptose e necrose tecidual (Kurz,
2008; Terman e Brunk, 2004).
Análises ultraestruturais
Foram fixadas amostras de testículos, órgão de Bidder e fígado por 2 h a 25°C em
3% de glutaraldeído e 0.25% de ácido tânico em tampão Millöning pH 7.3. Depois de
18 no mesmo tampão por 1h, desidratados em acetona e incluídos em Araldite (Cotta-Pereira
et al., 1976). Secções ultrafinas foram contrastadas com 2% de acetato de uranila por 20
minutos (Watson, 1958) e citrato de chumbo em solução de hidróxido de sódio 1N
(Venable e Coggeshall, 1965) por 8 minutos, e examinados com microscópio eletrônico de
transmissão Leo-Zeiss EM - 906 operando a 80 kV.
Análises estatísticas:
Primeiramente foi verificada a existência de valores discrepantes (outliers), em
seguida, a normalidade dos dados foi testada por Shapiro-Wilk, e quando necessário,
submetidos à normalização (x + 0,5)1/2 (Lehner, 1996). Para dados paramétricos, utilizou-se
a análise de variância um critério (ANOVA One Way), seguido do teste a posteriori de
Tukey. Para dados não paramétricos mesmo após a transformação, foi utilizado
Kruskal-Wallis. Todos os testes foram conduzidos no software R versão 2.11.1 (R Development
Core Team. 2010). Foi considerado p ≤ 0,05 como referência para se atribuir significância
estatística, sendo todas as análises baseadas em Zar (1999).
V – Resultados e Discussão
Os resultados serão apresentados na forma de capítulos, a fim de facilitar a organização
dos dados e análises efetuadas no trabalho.
Capítulo 1: “Morphological, Histochemical, and Ultrastructural aspects of the Bidder´s
organ in males of Rhinella schneideri (Amphibia: Anura) during the breeding season”.
Capítulo 2: “Morfologia testícular e espermatogênese de Rhinella schneideri no período
19 Capítulo 3: “17β-estradiol induz alterações na gametogênese dos órgãos de Bidder e
testículos de machos de Rhinella schneideri (Anura: Bufonidae)”.
Capítulo 4: “Aspectos morfológicos do fígado de Rhinella schnederi (Anura: Bufonidae) e
20
VI- Referências Bibliográficas
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30
Capítulo 1
Morphological, Histochemical, and Ultrastructural aspects of the
Bidder´s organ in males of
Rhinella schneideri
(Amphibia: Anura)
during the breeding season
Juliane Silberschmidt Freitas¹, Lilian Franco-Belussi1, Lia Raquel de Souza Santos2, Classius de Oliveira3
1Animal Biology Graduate School, Laboratory of Anatomy, Department of Biology, São Paulo State University – UNESP/IBILCE, São José do Rio Preto, São Paulo, 15054-000, Brazil.
2 Federal Institute of Goiás – IFG, Rod. Sul Goiana Km 01, Rio Verde, Goiás, 75908-000, Brazil.
3 Department of Biology, São Paulo State University – UNESP/IBILCE, São José do Rio Preto, São Paulo, 15054-000, Brazil.
Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas,
Universidade Estadual Paulista, São José do Rio Preto, São Paulo, 15054-000, Brazil. Tel.: +55 17 3221-2387. Fax: +55 17 3221-2390.
31
Abstract
Bufonids have an organ that produces female germ cells in both sexes, known as Bidder’s organ. In males, these cells are similar to ovarian follicles, but do not develop into female gametes. We examined morphological aspects of the Bidder’s organ in males of Rhinella schneideri during the breeding season using routine and histochemical techniques for light and transmission electron microscopy. We also built a topographic model using three-dimensional (3D) reconstruction methodology. Bidder´s organ is located at the cranial portion of the testes and consists of two distinct regions: the cortex and medulla. In the medullar region, most of cell population is composed of somatic cells. However, pigmented cells with phagocytic activity, defense cells and fibroblasts with distinct metabolic capacities also occur in this region. Bidderian follicles at different developmental stages were found in the cortex. They are rich in cytoplasmic organelles, such as mitochondria, smooth reticulum and Golgi complex. We also found many lipidic droplets, but not yolk granules. In the ooplasm, myelin bodies resulting from the degradation of cellular material occur in different sizes and positions. Bidderian oocytes originate from divisions of peripheric oogonia. They are surrounded by pre-follicle cells and then differentiated into follicular structures, when reach diplotene stage. Atretic follicles, identified by nuclear disintegration and follicular cells invagination, were the most common follicle type in the Bidder´s organ. Lipofuscin also accumulates around oocytes and in medullar region, suggesting that Bidder´s organ has a high capacity of autophagocytosis and renovation of intracellular components.
Key words: Reproductive biology, Rhinella schneideri, Bidder’s organ, Bidderian
32
Introduction
All bufonids (except some Dendrophryniscus) have a structure known as
Bidder’s organ, which is a rudimentary ovary producing female germ cells (Spengel,
1876; Petrini and Zaccanti, 1998). This organ is found in both males and females and
consists of a vestigial ovarian tissue, which may become functional in certain
circumstances (Vitale-Calpe, 1969; Pancak-Roessler and Norris, 1991; Duellman and
Trueb, 1994).
The Bidder’s organ originates in the larvae before ovarian and testicular
differentiation (Falconi et al., 2007). The anterior portion of the gonadal primordium in
larvae develops into the Bidder’s organ and the posterior portion differentiates into an
ovary or testis (Petrini and Zaccanti, 1998). The gonadal primordium is initially similar
to ovaries, which are retained in females. However, the posterior primordium
differentiates into a testis in males throughout the development, since the anterior
portion retains the female aspect and becomes a Bidder's organ (McDiarmid, 1971;
Petrini and Zaccanti, 1998).
This vestigial ovarian tissue is located at the cranial portion of the testis in adults
and has been used as a character in systematic studies of the group (Duellman and
Trueb, 1994). The germ cells of the organ are associated to follicle cells, forming the
so-called Bidderian follicles, found at several developmental stages. In general, both
female and Bidderian oocytes are similar, having the same general morphology and a
layer of surrounding follicle cells (Vitale-Calpe, 1969; Pancak-Roessler and Norris,
1991; Duellman and Trueb, 1994). Despite the similarities, Bidderian oocytes do not
attain the same developmental stages of female oocytes under normal conditions
33 The production of feminine germ cells by the Bidder´s organ may represent a
morphological strategy for reproduction in bufonids. In fact, some authors (e.g., Orr,
1986; Tanimura and Iwasawa, 1986) reported that the Bidder’s organ develops into a
functional ovary after the removal of testes. The ability of producing a succeeding
generation is an essential attribute to species maintenance in the environment (Tanimura
and Iwasawa, 1986; Duellman and Trueb, 1994).
Despite an increasing number of studies, information on the Bidder’s organ
remains scarce for many bufonids. For example, the morphology of Bidder´s organ is
still unknown for Rhinellaschneideri, a member of a clade restricted to South America. This species is widely distributed in South America, occupying even disturbed areas
(Cochran, 1955), which are often affected by a variety of compounds (e.g., endocrine
disruptors) that interfere in the growth of germinal tissue. The contamination of aquatic
environments has been linked to the decline of amphibians (Berger et al. 1998,Wake
1998, Alford and Richards 1999, Kiesecker et al. 2001, Davidson et al. 2002, Lips et al.
2003), mostly by triggering a series of changes in the reproductive system. Information
about the morphology of reproductive structures is relevant in designing efficient
strategies for conservation of anurans species. Thus, our aim in this study was to
evaluate the histological and morphological aspects of the Bidder’s organ in males of
Rhinella schneideri, during the reproductive period using routine and histochemical
techniques for light and electron microscopy. We also built a topographic model of the
Bidder´s organ using three-dimensional (3D) reconstruction methods.
Materials and Methods
34 southeastern Brazil (20º 47’ 07.05’’ S; 49º 02’ 42.09’’ W). Animals were placed in
plastic bags and transported to the laboratory, then immediately anesthetized and
euthanized with benzocaine (5g/L water). Male gonads were weighed, measured, and
analyzed to confirm that toads were in same sexual developmental stage. All handling
and procedures were authorized by the Ethics committee of the São Paulo State
University (Protocol #09/50956-8) and followed the NIH Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals.
Histological and Histochemical analyses
We dissected the animals by a middle incision into the belly, from the cloaca to
the pectoral girdle, exposing the Bidder's organs for macroscopic analysis and photo
documentation in a dissecting microscope (Leica MZ16), coupled to an image capture
system (Image Manager - IM50).
For histological analysis, we removed and fixed the Bidder’s organ and testes for
24 hours at 4° C in a Karnovsky fixative solution (Sörensen buffer phosphate 0.1M,
phosphate buffer pH 7.2, containing paraformaldehyde 5 % and glutaraldehyde 2.5 %).
Subsequently, the material was dehydrated in ascending series of ethanol and embedded
in a glycol methacrylate resin (Historesin Leica®). Sections of 2 µm were obtained in a
microtome (RM 2265, Leica, Switzerland) and stained with Hematoxylin-eosin,
Gömori’s trichrome, and Silver ion impregnation (AgNor; Howell and Black 1980). We
described the general morphology and germ cells of the Bidder’s organ under a
microscope (Leica DM4000 B) coupled with an image capture system (Leica DFC 285).
To detect lipofuscin pigments, we incubated sections in Schmorl’s solution for
35 and 15 mL of distilled water. Then, we immersed sections in 1% neutral red aqueous
solution, followed by a 1% eosin aqueous solution to conduct histochemical analysis.
Tridimensional Reconstruction (3D)
The tissue mass containing the Bidder’s organ, testes, and fat bodies was
embedded in historesin. Serial sections with 3 μm tickness were stained with
Hematoxylin-eosin. Image capture and processing were made with software Reconstruct
3.2 (Build 743; Digivision-SIS, San Diego, CA). After image alignment, regions
containing the Bidder’s organ, testes, and fat body were isolated in each image and later
processed to obtain the interface limit of each section, generating a tridimensional
model (3D). The model allows an improved visualization of the topographical anatomy
of the organ, as well as its limits and connections with male gonad.
Ultrastrutural analysis
We fixed tissue samples for 2h at 25° C in 3% glutaraldehyde and 0.25% tannic
acid in Millonig buffer pH 7.3. Posteriorly, samples were post-fixed in 1% osmium
tetroxide diluted in the same buffer for 1h, dehydrated in acetone, and embedded in
Araldite (Cotta-Pereira et al., 1976). Ultrathin sections (50 - 75 nm) were contrasted
with 2% uranyl acetate for 20 min (Watson, 1958), and lead citrate in a solution of 1 N
sodium hydroxide (Venable and Coggeshall, 1965) for 8 minutes, and examined with
electron microscope Leo-Zeiss EM - 906 operating at 80 kV.
Cytometric analysis and cell quantification
We took the following measures from 100 cells for each animal: widest
36 medullar Bidderian oocytes. We used the distance and area measurement tools in the
software Image Pro-plus v. 4.5. The data were used to calculate the mean diameter,
follicular area, and nuclear area of cells in each cortical region. We calibrated the tool
for 10x magnification. Measurements are presented in micrometers (µm). Data
exploration included the identification of outliers and square-root transformation to
conform to data normality and homoscedasticity. Posteriorly, we conducted a one-way
ANOVA.
Based on the morphology of oocytes, we analyzed 250 histological sections of
the germinal epithelium using the program Image Pro-plus v. 4.5, through manual
counting to quantify the occurrence of cell type in the Bidder´s organ. Developmental
stages of oocytes were determined according to morphological and histological
characteristics used in the classification of oogenesis (e.g., Roca and Echeverria, 1996;
Santos and Oliveira, 2004; Gomez et al., 2010): oocyte size; nucleus size;
nucleus/cytoplasm volume; nucleus and cytoplasm basophilia; number and position of
nucleoli; presence of yolk and pigments; amount and form of follicular cells.
We used a G test for goodness-of-fit, with Yates’ correction (Sokal and Rohlf
1995) to test for a difference in the amount of cell types. This test was implemented
with the code provided by Prof. Peter Hurd, available at
http://www.psych.ualberta.ca/~phurd/cruft/g.test.r. All analyses were run using the
37
Results
General characterization of the Bidder´s organ
Bidder´s organs are paired structures, located at the cranial portion of testes in
males of Rhinella schneideri (Fig. 1A). Male toads have well-developed testes with
smaller Bidder´s organ. Bidder is yellow-brown and weight 0.05 g (+ 0.002 g) in mean.
Externally, the organ is covered by a thin capsule of connective tissue (Fig. 3B).
Tridimensional model showed that Bidder’s organ has an irregular shape, with
projections of different sizes that resemble lobes (Fig. 2). Some lobes are adhered to the
testes, so that the Bidderian tissue is intermingled to testicular tissue (Fig. 2D). There is
no physical barrier between the Bidder´s organ and male gonads, thus the Bidderian
oocytes are close to seminiferous locules with spermatocytes at different stages (Fig.
1B).
Histological, Histochemical, and Ultrastrucutural analyses
Histologically, two distinct regions can be observed in the Bidder´s organ: the
cortex (Figs. 3A, 3B and 3D) and medulla (Figs. 3A, 3B and 3C). The medulla is
smaller than the cortex and more centrally located. Medulla receives the input of blood
vessels (Fig. 3C) and has abundant collagen fibers, synthesized by fibroblast with
different metabolic capacities (Figs. 5E and 5F). Lipofuscin granules, pigment cells
containing melanin and defense cells were also detected in this region (Figs. 3E and
3F). However, most of the cell population is represented by somatic cells in the
medulla. The cortical region is basically constituted by Bidderian oocytes of different
sizes, surrounded by follicular cells (Fig. 3D).
Somatic cells with different shapes are found in the Bidder´s organ. They occur
38 4E, 4F, 4H, 4I, 5C and 6E). They have highly basophilic nuclei, due to chromatin
compaction, well-defined nucleoli, and are relatively small and highly electron dense,
when compared to germ cells (Figs. 7A and 7B). The somatic cells surrounding oocytes
are also called follicular cells, because they constituted the follicular layer. In the
periphery, oocytes are accompanied by prefollicle cells, which are derived from
epithelial cells (Figs. 4A, 4C, 5A, 5B and 5C). Pre-follicular cells are similar to
follicular cells. However, the nucleus is slightly triangular and a few organelles occur in
the cytoplasm.
Follicular cells are mostly flat (Figs. 4D, 4E and 4H), but may be rounded when
attached to oocytes in advanced stages of development (Fig. 4H). We found that these
follicular cells differ not only in shape, but also in the degree of electron density, both in
the nucleus and cytoplasm (Fig. 7B). Dark and clear follicular cells are associated
around of the oocytes by cytoplasmic communications. The limit between them is easily
visualized due to differences in color. Nonetheless, all other features and structures are
shared. They have many organelles, such as mitochondria, well developed endoplasmic
reticulum, and some vesicles.
Follicular cells around oocytes form the Bidderian follicles. These cells are
attached to oocytes by focal adhesions, connecting the cytoplasm of the two cells (Figs.
6F, 6G and 7C). Follicles of different sizes and morphologies are found in the Bidderian
cortex, which may be accompanied by many or few follicular cells, depending on the
developmental stage of the oocyte (Fig. 4). In general, Bidderian follicles are large
structures with diameter ranging from 68.763 to 172.394 µm and mean area varying
from 3108.2 µm² to 16887.354 µm².
Bidderian follicles have an either oval or rounded acidophilus nucleus with
39 nucleus ranges from 627.235 µm² to 3349.88 µm². Furthermore, they have one or more
well-defined nucleoli with intense basophilia and uniform electron density. The size,
number, and position of nucleoli in the nucleus vary with the developmental stage of the
oocyte. In early development, oocytes have one or two very small nucleoli (Figs. 4C
and 4D). As the cell develops, the nucleolus increases in size and a single, large
nucleolus remains in the central or peripheral region of the nucleus. Nuclear
amplification in intermediate oocytes results in the production of multiple nucleoli
perinuclearly positioned in advanced oocytes (Fig. 4E). Bipartite nucleoli, with two
zones with distinct affinity for stains are also observed. The volume and cytoplasmic
basophilia in these cells also vary along the development and a decrease in ooplasmic
basophilia occurs as oocytes increase.
The ooplasm of Bidderian oocytes is rich in organelles and structures (Figs. 6,
6B and 6C). The endoplasmic reticulum widely distributed, with tubular projections
throughout the cytoplasm. The Golgi complex is most often positioned in the peripheral
region of the oocyte (Fig 6C). The Golgi apparatus consists of 4-5 elongated cisterns,
with vesicles with different sizes. Mitochondria are found in large numbers in Bidderian
oocytes (Figs. 6A and 6D). They are elongated, moderately electron dense, either
scattered along the cytoplasm or in peripherical clusters. There are also many lipid
droplets (Fig. 6A) and protein granules.
Oocytes have neither yolk granules nor cortical alveoli in the cytoplasm. Thus,
there are only pre-vitellogenic oocytes and oogonias in the Bidder’s organ. Oogonias
occur only at the periphery of the organ, near the germinal layer (Figs. 4A, 4B, 5A and
5B). They have irregular and elliptical shape, very lobed and slightly acidophilic
nucleus and abundant nuage material mainly associated with the nuclear membrane
