“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO
CAROLINE DE ALMEIDA ROSSI
EFEITOS DE DOSES SUBLETAIS DO IMIDACLOPRIDE NO
CÉREBRO, VENTRÍCULO E TÚBULO DE MALPIGHI DE Apis
mellifera AFRICANIZADA.
Rio Claro
2011
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
CAROLINE DE ALMEIDA ROSSI
EFEITOS DE DOSES SUBLETAIS DO IMIDACLOPRIDE NO CÉREBRO, VENTRÍCULO E TÚBULO DE MALPIGHI DE Apis mellifera AFRICANIZADA.
Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biologia Celular e Molecular)
Orientador: Prof. Dr. OSMAR MALASPINA Co-orientadora: Profª. Drª. THAISA C. ROAT
Rio Claro - SP 2011
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
Efeitos de doses subletais do imidaclopride no cérebro, ventrículo e túbulo de Malpighi de Apis mellifera africanizada / Caroline de Almeida Rossi. - Rio Claro : [s.n.], 2011
101 f. : il., figs., tabs.
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro
Orientador: Osmar Malaspina Co-Orientador: Thaisa Cristina Roat
1. Abelha. 2. Toxicidade do imidacloprie em abelhas. 3. Inseticida. 4. Citotoxicidade. I. Título.
R831e
Dedicado aos meus pais, Lodovico e Fátima,
AGRADECIMENTOS
Ao CEIS (Centro de Estudos de Insetos Sociais), Departamento de Biologia e UNESP por me fornecer suporte e condições para a realização de minhas pesquisas.
Ao CNPq, pela concessão da bolsa de estudo e suporte financeiro à pesquisa realizada.
Ao Prof. Dr. Osmar Malaspina, pela orientação e incentivo aos meus estudos, pela atenção e paciência diante às minhas dúvidas e pelas experiências adquiridas ao longo desses anos. Ao Tiago Favaro de Souza, por toda ajuda e correções realizadas.
À Thaisa Cristina Roat, pela co-orientação e principalmente pela amizade. Muito obrigada pelas correções dos trabalhos, pela ajuda nos experimentos e preparação dos materiais biológicos. Seu apoio foi fundamental para a realização desse trabalho.
À Elaine e à Roberta, pela ajuda, pelos esclarecimentos e pelo fornecimento de alguns materiais utilizados na metodologia.
A todos os colegas do laboratório de bioensaio e histologia. Em especial, agradeço a Daiana e a Cintya pela amizade, apoio e incentivo.
Ao técnico Antônio Sérgio Pascon, pela atenção e disponibilidade em ajudar, coletando as abelhas até mesmo durante as férias.
Ao Prof. Dr. Fernando Carlos Pagnocca e Dr. Mário Sérgio Palma, por permitirem o uso de equipamentos de seus laboratórios.
À Necis, à Vanessa, à Ita, à Marcela e à Olívia pela atenção e pelos empréstimos de material. Ao técnico Gerson Mello Souza, pelo auxílio em laboratório, pela amizade e por tornar a rotina no laboratório muito mais animada e divertida.
Ao “The nine” (Mila, Dani, Dé, Lara, Quel, Nat, Ina e Marcelo) pelo apoio e incentivo em todas as horas.
À Juliana Vasconcelos Mello, Karina Fernandes Baccile e Larissa Adorno Pivatto, provas de que a amizade resiste à distância.
Ao José Diego e à Miriam, meus cunhados, pela amizade.
A toda minha família, principalmente ao meu irmão, Diego, e aos meus pais, Lodovico e Fátima, pela confiança, pelo amor e pelo incentivo. Por que me ensinaram que o sucesso é conseqüência de muito trabalho e perseverança.
“O sucesso nasce do querer, da determinação
e persistência em se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence
obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis.”
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO GERAL... 10
2. OBJETIVOS GERAIS... 19
3. ARTIGO 1... 20
A comparação do efeito de doses subletais do inseticida imidaclopride no lobo óptico, corpo pedunculado e lobo antenal de Apis mellifera africanizada. 4. ARTIGO 2... 48
Alterações morfológicas e histoquímicas nas células digestivas do ventrículo de abelhas Apis mellifera africanizada expostas a doses subletais do inseticida imidaclopride. 5. ARTIGO 3... 72
Avaliação dos efeitos das doses subletais do inseticida imidaclopride no túbulo de malpighi de Apis mellifera africanizada. 6. DISCUSSÃO GERAL... 93
7. CONCLUSÃO GERAL... 95
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS... 96
RESUMO
Uma preocupação atual consiste no uso indiscriminado de muitas substâncias sintéticas no controle de pragas na agricultura. Estudos atuais indicam que algumas dessas substâncias podem estar envolvidas em casos de intoxicação de insetos, como as abelhas, que são fundamentais em muitas culturas, devido à atividade de polinização realizada por elas. No Brasil, um dos inseticidas mais usados nas culturas de café, citrus, algodão e cana-de-açúcar é o imidaclopride, que apresenta ação neurotóxica para os insetos. Seus metabólitos circulam por todo o organismo e entram em contato com diversos órgãos. A exposição a doses subletais deste inseticida pode provocar mudanças na fisiologia e no comportamento das abelhas, sendo que tais alterações podem ser mais intensas ou não, dependendo do período de exposição. Dessa maneira, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da exposição crônica a doses subletais (DL50/100, DL50/50 e DL50/10) do inseticida imidaclopride, no cérebro, ventrículo e túbulo de Malpighi de Apis mellifera africanizada. Para isso os órgãos estudados das abelhas expostas e dos controles foram submetidos a análises morfológica, histoquímicas e imunocitoquímica, após 1, 3, 5, 7 e 10 dias de exposição. No cérebro das abelhas expostas foi possível observar alterações morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímicas nos lobos ópticos de todos os grupos expostos, enquanto que nos corpos pedunculados observou-se tais alterações apenas no grupo exposto à DL50/10. Já nos lobos antenais as alterações não foram observadas. No ventrículo das abelhas de todos os grupos expostos ao inseticida, a análise morfológica permitiu observar de uma maneira geral um aumento na quantidade de células eliminadas no lúmen, na quantidade de secreção apócrina eliminada no lúmen e na quantidade de halos pericromatínicos nas células digestivas. As análises histoquímicas permitiram confirmar a presença de núcleos picnóticos, mostrar a presença de fragmentos e indicar áreas degeneradas nas células digestivas. A técnica imunocitoquímica não evidenciou a presença de núcleos positivos à reação de Tunel. No túbulo de Malpighi de todos os grupos expostos foi possível observar na análise morfológica, de uma maneira geral, um aumento na quantidade de células com núcleo picnótico, na eliminação de parte da célula para o lúmen e da homogeneização da coloração do citoplasma. Além disso, foi possível observar a presença de vacuolização citoplasmática, de células eliminadas no lúmen e acúmulo de material amorfo no lúmen. As técnicas histoquímicas permitiram confirmar ocorrência de núcleos picnóticos e observar uma intensificação na coloração do núcleo e uma coloração mais uniforme do citoplasma. A técnica de imunocitoquímica empregada mostrou núcleos positivos ao Tunel nos órgãos das abelhas expostas ao imidaclopride. Logo, é possível concluir a partir dos resultados obtidos, que o imidaclopride é citotóxico para o cérebro, ventrículo e túbulo de Malpighi, de abelhas expostas a doses subletais deste inseticida. O lobo óptico mostrou ser mais sensível ao inseticida, uma vez que as alterações ocorreram em todas as doses testadas.
ABSTRACT
The indiscriminate use of synthetic chemicals to control pests in agriculture is not a new concern. Recent studies indicate that some of these substances are involved in cases of poisoning bees, which are fundamental in many cultures due to the activity of pollination. In Brazil, an insecticide widely used on crops of coffee, citrus, cotton and sugar cane, is imidacloprid, which is neurotoxic to insects. However, its metabolites circulate throughout the body and come into contacting with another organs. Exposure to sublethal doses of this insecticides causes changes in physiology and behavior of bees, and these changes can be more intense depending on exposure period. Therefore, this study aimed to evaluate the effects of chronic exposure to sublethal doses (DL50/100, DL50/50 and DL50/10) of imidacloprid in the brain, midgut and the Malpighian tubules of africanized bees (Apis mellifera). For this, the organs of treated and untreated bees were subjected to morphological, histochemical and immunocytochemical techniques, dissecting the bees after 1, 3, 5, 7 and 10 days. In the brains of exposed bees it was possible to observe morphological, histochemical and immunocytochemical alterations on optic lobes of all bees, whereas in the mushroom bodies, alterations was observed only in the group exposed to DL50/10. The antennal lobe presented no alterations after the treatment in all doses. In the midgut of all exposed groups of bees, morphological analysis showed in general an increase in the number of digestive cells and apocrine secretion eliminated in the lumen and in the number of peripherical chromatin halos were also increased. The histochemical techiniques confirmed the presence of pyknotic nuclei, showing the presence of nuclear fragments and degenerated areas in cytoplasm of digestive cells. The immunocytochemical technique showed no presence of positive nuclei for Tunel reaction in digestsive cells. In Malpighian tubules of exposed bees was observed in general, through morphological analysis, an increase in the number of cells with a picnotic nucleus, eliminating part of the cell into the lumen and the homogenization of staining of the cytoplasm. Moreover, it was observed the presence of vacuolization of cells and amorphous material accumulated in the lumen. Histochemical techniques allow confirming the occurrence of pyknotic nuclei, observed through the increase staining of the nucleus besides the uniform staining of the cytoplasm. The immunocytochemical technique showed positive nuclei in honeybees exposed to imidacloprid. Based on results obtained it is possible to conclude that imidacloprid is cytotoxic to the brain, midgut and the Malpighian tubule of bees exposed to sublethal doses of insecticide. The optic lobe was the most sensitive to the insecticide, once the alterations occurred for all concentrations.
1. INTRODUÇÃO GERAL
Apis mellifera, abelha pertencente à família Apidae, foi introduzida no Brasil em 1839,
e hoje é um poli-híbrido resultante do cruzamento das subespécies A. mellifera scutellata (oriunda da África), A. mellifera mellifera (vinda do norte da Europa), A. mellifera ligustica (originária da Itália e norte da Ioguslávia) e A. mellifera iberica (provinda da Europa Ocidental) (RUTTNER, 1988). A. mellifera encontra-se no grupo das abelhas eussociais, no qual há divisão de trabalho por castas de acordo com as tarefas desempenhadas na colônia. Dessa forma, enquanto a rainha e o zangão têm função reprodutiva, as operárias têm a tarefa de realizar toda a manutenção da colônia, desde construção, limpeza e defesa até a alimentação da rainha e da cria. Estas atividades são desempenhadas de acordo com a faixa etária das operárias (CRUZ-LANDIM; MELLO, 1981). As operárias recém-emergidas, por exemplo, inicialmente fazem a limpeza de si mesmas e posteriormente limpam células que contiveram cria. As operárias nutridoras alimentam a cria e as operárias forrageiras saem para o campo à procura de pólen e néctar (FREE, 1980).
As forrageiras são excelentes insetos polinizadores e, portanto, contribuem para a manutenção da biodiversidade das espécies vegetais no nicho ecológico onde vivem. Sugere-se que um terço da alimentação humana dependa direta ou indiretamente da polinização por abelhas (WILLIANS,1995; KLEIN et al., 2007).
Os polinizadores e a polinização são cruciais para quase todos os ecossistemas terrestres, incluindo aqueles dominados pela agricultura (KEVAN, 1999). As abelhas são importantes como polinizadores e devido ao desmatamento de seus hábitats naturais, elas tem aumentado suas atividades de forrageamento em áreas agrícolas. Entretanto, o aumento dessa atividade, está levando a uma redução no número de espécies desses insetos, devido ao contato com inseticidas normalmente utilizados no controle de insetos-praga (MALASPINA; SILVA-ZACARIN, 2006).
Porrini et al. (2003) monitoraram colônias de abelhas em áreas próximas a Bologna, Itália. Uma vez por semana o número de abelhas mortas era registrado. Caso esse número fosse superior a 250 abelhas/semana/lugar, eram realizadas as análises em laboratórios. O monitoramento e as análises feitas permitiram caracterizar áreas, indicar a época de maior risco de envenenamento, identificar os inseticidas mais utilizados, como melationa e dimetoato, e também, identificar moléculas de uso não permitido, como parationa e metidationa. Nessa mesma área e com a mesma metodologia de monitoramento e coleta dos autores anteriores, Ghini et al. (2004) detectaram também a presença de 35 inseticidas em culturas, principalmente de cereais, batatas e beterraba.
No ano de 2002, foi observada uma elevada mortalidade de colônias de abelhas, em apiários localizados no leste da Romênia. Foram realizadas análises bacteriológicas, parasitológicas e testes de toxicidade para detectar níveis de inseticidas em amostras de abelhas e no pasto apícola das áreas afetadas. As análises (bacteriológicas e parasitológicas) apresentaram-se negativas. Nos testes de toxicidade, identificou-se o inseticida deltametrina como responsável pela mortalidade das abelhas (NICA et al., 2004).
Na França, Chauzat et al. (2006) também realizaram um monitoramento de colônias de abelhas. Durante três anos as colônias foram visitadas quatro vezes por ano. Em cada visita amostras de pólen foram coletadas e submetidas a análises específicas de cromatografia líquida e espectrometria de massa. Foram identificados 19 compostos, sendo o imidaclopride o mais freqüente nas amostras. Os resíduos mais concentrados foram coumafos e tau-fluvalinate.
Em alguns casos os efeitos do inseticida nas abelhas não são imediatamente notados. De fato, pequenas doses da molécula não causam a morte das abelhas, porém podem induzir mudanças no comportamento, além da diminuição na atividade de forrageamento ou desorientação, afetando temporariamente toda a colônia (GUEZ; ZHANG; SRINIVASAN, 2005; vanENGELSDORP; MEIXNER, 2010). Essas doses que provocam tais efeitos são conhecidas como doses subletais, ou seja, doses abaixo da dose letal média (DL50).
Entre os pesticidas mais utilizados na atualidade, os neonicotinóides – inseticidas neurotóxicos – possuem considerável representatividade, devido a sua grande eficiência no combate aos insetos praga, substituindo os compostos organofosforados e metilcarbamatos, que tiveram seu uso diminuído devido à toxicidade e à diminuição de sua eficiência (TOMIZAWA; CASIDA, 2003).
dividido em dois outros: (i) um formado por aqueles que possuem o radical Nnitroguanidina (imidaclopride, tiametoxam, clothianidin e dinotefuram); (ii) e outro com Nciano- amidina (acetamipride e tiaclopride).
No Brasil, o inseticida imidaclopride é usado como defensivo agrícola, no controle de pragas aéreas e do solo, nas culturas de cana-de-açúcar, citros, algodão e café, e é conhecido comercialmente como Gaucho, Confidor, Premier, Provado, Evidence, Connect, Cropstar, Winner, Kohinor e Warrant (BRASIL, 2008). No entanto, o uso desse produto já está proibido na França desde 1999, por representar a intoxicação para abelhas e outros animais (GODOY, 2004).
Estudos realizados com abelhas européias (A. mellifera) verificaram para o inseticida imidaclopride a DL50 oral de 3,7 ηg/abelha (SCHMUCK et al., 2001). Suchail, Guez, e Belzunces (2000) verificaram a DL50 oral e tópica do imidaclopride para A. mellifera mellifera e A. mellifera caucasica. Para ambas as subespécies, encontrou-se uma DL50 oral de 24 h e 48 h no valor de 5 ηg/abelha. Para a DL50 tópica, os valores foram de 24 ηg/abelha para A. mellifera mellifera e 14 ηg/abelha A. mellifera caucasica.
Decourtye et al. (2004b) compararam os efeitos de doses subletais dos inseticidas imidaclopride e deltametrina em abelhas A. mellifera ligustica. Uma solução de açúcar contendo 24 Pg Kg –1 de imidaclopride ou 500 Pg Kg –1 de deltametrina foi oferecida às abelhas. A contaminação do xarope por imidaclopride e deltametrina induziu um menor forrageamento e menor atividade de entrada na colônia por parte das operárias.
Bortolotti et al. (2003) verificaram os efeitos das doses subletais do imidaclopride no forrageamento e no retorno à colônia para abelhas A. mellifera. As abelhas eram treinadas para forragear em um campo artificial, e era oferecido xarope como alimento. Foram testadas três concentrações da substância: 100 ppb, 500 ppb e 1000 ppb, sendo que as duas últimas apresentaram efeito repelente para as abelhas. Os resultados mostraram que as abelhas do controle voltavam à colônia, retornando ao alimentador em até 5 horas. Aquelas tratadas com a solução de 100 ppb também retornaram à colônia, no entanto só retornaram ao alimentador após 24 horas. Já as abelhas tratadas com 500 ppb e 1000 ppb, desapareceram por 24 horas, sem voltar a colônia ou ao alimentador.
Medrzycki et al. (2003) também avaliaram o efeito das doses subletais do imidaclopride, nas concentrações de 100 ppb e 500 ppb, no comportamento de abelhas A. mellifera. Para ambos os tratamentos, foram observadas diminuição da mobilidade e da
mostraram que houve toxicidade do imidaclopride em relação à atividade das abelhas adultas, à freqüência de condução de pólen durante o forrageamento e ao número de células operculadas (FAUCON et al., 2005).
Rossi (2008) estabeleceu a DL50 oral do imidaclopride e verificou os efeitos de doses subletais associados às possíveis alterações morfológicas no cérebro de A. mellifera africanizada. A DL50 oral aguda estabelecida para o imidaclopride foi de 80,9 ηg/abelha. Para verificar os efeitos das doses subletais, os grupos de abelhas foram tratados com xarope nas concentrações 25, 50 e 80,9 ηg/abelha por um período de 24 horas. No entanto,
comparando-se os cérebros de abelhas tratadas e não tratadas com o incomparando-seticida, não foram verificadas alterações morfológicas.
Suchail, Debrauwer e Belzunces (2003) verificaram o metabolismo do imidaclopride em A. mellifera. As abelhas foram tratadas com soluções de 20 e 50 μg Kg –1 de abelha. O imidaclopride apresentou uma meia-vida de 4,5 a 5 horas e foi rapidamente metabolizado em 5-hidroxiimidaclopride e olefin. Os dois metabólitos apresentaram uma concentração máxima após 4 horas da ingestão, exceto para o 5- hidroxiimidaclopride no tratamento de 20 μg Kg –1. Essa concentração máxima coincidiu com o aparecimento da mortalidade induzida pelo imidaclopride.
Bendahou, Fleche e Bounias (1999), verificaram efeitos biológicos e bioquímicos da exposição crônica à uma dieta contendo baixas doses de cipermetrina em colônias de A. mellifera. O inseticida foi adicionado ao xarope na concentração de 12,5 µg/L e oferecido às
colônias por 5 meses. Durante o período em que o estudo foi realizado, verificaram muitas perturbações dos grupos tratados comparados ao grupo controle, como a taxa de mortalidade na colônia, a área de cria e o comportamento das abelhas.
Outro estudo avaliando o efeito da exposição ao inseticida imidaclopride, em dieta crônica para A. mellifera, foi realizado por Schmuck (2004), com o inseticida imidaclopride. O alimento foi oferecido às abelhas nas concentrações de 0,1, 1 e 10 µg de inseticida / L de xarope, durante 10 dias. Não se verificou mortalidade mais elevada nos grupos tratados com o inseticida comparado ao controle.
2005). Utilizando-se esse método, Decourtye et al. (2004a) verificaram uma deficiência no aprendizado olfatório das abelhas, após trinta minutos do tratamento oral com imidaclopride. Este resultado, que mostra deficiência de aprendizado, pode ser explicado levando-se em consideração o modo de ação do imidaclopride. Este inseticida atua inibindo a ação de receptores nicotínicos acetilcolina dos insetos, agindo mais especificamente nas subunidades α do receptor nicotínico (BUCKINGHAM et al., 1997). Esses receptores são encontrados em
muitas regiões do cérebro das abelhas, incluindo as áreas envolvidas nos processos de aprendizagem e memória, como os cálices do corpo pedunculado (BICKER, 1999).
O sistema nervoso central das abelhas é um sistema de condução e processamento de informações que assegura uma coordenação rápida da função dos efetores, produzindo ou modificando respostas aos estímulos percebidos pelos órgãos sensoriais. Os elementos característicos são os neurônios, que percebem e transmitem estímulos informacionais; e as glias, que são células de sustentação. O sistema nervoso central é constituído pelo cordão nervoso ventral e pelo cérebro.
O cérebro é o principal centro de associação, recebendo estímulos dos órgãos sensoriais da cabeça e da parte posterior do corpo. Apresenta regiões que contém corpos celulares de neurônios, chamadas de somata, e regiões de prolongamento, chamada neurópila. Ele é constituído pela fusão de três gânglios: protocérebro, deutocérebro e tritocérebro. O protocérebro é composto pela ponte cerebral, corpo central, pars intercerebralis, corpos pedunculados e lobos ópticos. Os corpos pedunculados são estruturas pares localizadas dorsalmente e são mais volumosas e apresentam mais células e sinapses, nos insetos com o comportamento e o aprendizado mais complexo, uma vez que esse é o centro mais importante de memória (DALY; DOYEN; PURCELL III; 1998; CRUZ-LANDIN, 2009). Cada corpo pedunculado é constituído de uma neurópila em forma de cálice e são preenchidos com corpos celulares chamados de células de Kenyon (FARRIS, 2005; FAHRBACH, 2006). Os lobos ópticos contêm os elementos nervosos dos olhos compostos e projetam-se lateralmente ao protocérebro.
O deutocérebro é constituído por dois lobos antenais, que contém axônios motores e sensoriais que chegam às antenas (CRUZ-LANDIN, 2009).
O tritocérebro é reduzido e dele partem os conectivos que ligam o cérebro ao gânglio subesofageano (DALY; DOYEN; PURCELL III, 1998; CRUZ-LANDIM, 2009).
porcentagem da área ocupada pelos corpos pedunculados e glomérulos. A. mellifera apresentou maior desenvolvimento dos corpos pedunculados e dos glomérulos, evidenciando a relação dessas áreas com o alto desenvolvimento social dessa espécie.
Roat e Cruz-Landim (2005) estudaram as diferenças morfológicas do cérebro de operárias, rainhas e zangões de A. mellifera, associadas com as diferenças comportamentais de cada casta e sexo. Os cérebros foram dissecados e preparados de acordo com rotina histológica. Nos zangões, o protocérebro é mais desenvolvido, devido ao maior desenvolvimento dos lobos ópticos, uma vez que eles não participam da organização social, mas precisam de uma visão exata para o acasalamento e sua própria sobrevivência. Nas operárias, entretanto, as partes mais desenvolvidas são os corpos pedunculados, onde se verifica um cálice mais profundo com grande número de pontos convergentes para o pedúnculo, indicando a presença de mais sinapses. Essa maior quantidade de sinapses é necessária para que as operárias possam desenvolver todas as suas funções na colônia, como defesa, forrageamento e cuidado e alimentação das abelhas jovens.
O inseticida imidaclopride age no sistema nervoso dos insetos e pode interferir no processo de aprendizagem das abelhas. No entanto, há poucos estudos relacionados à citoxicidade de órgãos não-alvo, como intestino e túbulos de Malpighi, responsáveis pela digestão e absorção, e excreção, respectivamente. A avaliação da morfologia dos mesmos pode revelar alterações ultra-estruturais induzidas por agentes tóxicos (BRAECKMAN; RAES, 1999; BRAECKMAN et al., 1999; SOROUR, 2001).
Além de verificar o efeito do imidaclopride no sistema nervoso da abelha, é importante analisar a toxicidade deste inseticida para tecidos não alvos, que são atingidos durante a rota de metabolização e excreção deste composto.
Um dos órgãos chave para análise da toxicidade é o intestino, já que é responsável pela digestão e absorção do alimento. Além disso, é uma das primeiras fontes de contato na administração oral do inseticida
O canal alimentar das abelhas é dividido em três regiões: estomodeo ou intestino anterior; mesêntero ou intestino médio, também chamado de ventrículo; proctodeo ou intestino posterior.
No epitélio são encontrados quatro tipos celulares, sendo que dois são de células prismáticas, situadas na membrana basal e emergem no lúmen com o ápice coberto por microvilosidades, e outros dois são de células basais, sem que seu pólo apical alcance o lúmen. Entre as células prismáticas estão aquelas que sintetizam a membrana peritrófica, e as que secretam enzimas digestivas e absorvem os produtos da digestão, sendo essas últimas chamadas de células digestivas. Já entre as células basais estão as células regenerativas e as endócrinas. As células regenerativas são células indiferenciadas, agrupadas em ninhos, que substituem as células digestivas eliminadas no lúmen por desgaste (BOWEN, I.; BOWEN, S.; JONES, 1998; CAVALCANTE; CRUZ-LANDIM, 1999; CRUZ-LANDIM, 2009).
Quando as células digestivas estão maduras, é possível observar três zonas distintas: basal, com muitas invaginações da membrana plasmática; mediana, com núcleo, retículo endoplasmático granular e Golgi; e apical, com grânulos de secreção, além de mitocôndrias e microvilosidades. Os grânulos pequenos e elétrons-densos localizados logo abaixo da membrana plasmática, provavelmente correspondem à secreção, enquanto outros com organização em camadas concêntricas representam material de excreção, e outros ainda são vacúolos auto ou heterofágicos (CRUZ-LANDIM, 2009).
Outro órgão chave para análise da toxicidade é o túbulo de Malpighi, responsável pela excreção de substâncias do organismo. Dessa forma, esse órgão entra em contato com o imidaclopride e seus metabólitos presentes na hemolinfa.
O sistema excretório é o responsável primário pela manutenção da homeostase. Nos insetos, é composto, na maioria das vezes, por um número variável de túbulos de Malpighi, os quais têm seu ponto de desembocadura no intestino, onde terminam em fundo cego (HABIB, 2003; CRUZ-LANDIM, 2009).
Os túbulos produzem um filtrado a partir da hemolinfa, chamado de urina primária, que se apresenta inicialmente como um fluido iso-osmótico, que serve como carreador dos produtos de excreção, como compostos tóxicos e excesso de íons. A medida que passa pelo interior do túbulo, vai sendo modificado, através da reabsorção de água e outras substâncias indispensáveis ao organismo, até se transformar na urina que será eliminada.
Os túbulos são constituídos por uma camada células epiteliais que repousam sobre uma lâmina basal. A forma das células e conteúdo do lúmen mudam ao longo do comprimento do túbulo, que apresenta a extremidade apical mais fina, e a basal mais alargada (CRUZ-LANDIM, 2009).
morte celular. Essa indução pode ocorrer a partir da ativação das vias sinalizadoras intracelulares, por diversos agentes exógenos e/ou endógenos, que culminam na ativação do programa de morte celular (MEYER; SILVA, 1999).
Os processos de morte celular podem ser classificados em três tipos de acordo com suas características morfológicas: apoptose, autofagia e necrose (KERR; WYLLIE; CURRIE, 1972). Nesse primeiro tipo de classificação, as duas primeiras são consideradas “Morte Celular Programada”, enquanto que a necrose seria uma morte celular patológica e não
programada geneticamente. Contudo, estudos recentes mostram que há uma regulação fisiológica em células necróticas e que a necrose não ocorre somente em situações patológicas, mas é também um componente de alguns processos fisiológicos (PROSKURYAKOV; KONOPLYANNIKOV; GABAI, 2003).
Os três tipos de morte celular podem ser classificados com base nas características morfológicas distintas que as diferem uma das outras. Na apoptose, o núcleo e o citoplasma se condensam, a célula morre e fragmenta-se em corpos apoptóticos delimitados por membrana, os quais são fagocitados e digeridos por macrófagos ou células vizinhas, portanto não há vazamento do conteúdo celular. A autofagia tem como principal característica o acúmulo de vacúolos autofágicos no citoplasma. Já na necrose as células incham, a membrana plasmática é rompida e ocorre extravasamento do conteúdo citoplasmático (BOWEN, I.; BOWEN, S.; JONES, 1998).
Em tecidos de insetos, a classificação do tipo de morte celular gera controvérsias, pois exibe tanto características de apoptose como de autofagia. Silva-Zacarin (2007) demonstrou que a apoptose e a morte celular autofágica contribuem para a degeneração da porção secretora das glândulas salivares de Apis mellifera no final do estágio larval.
A morte celular programada em insetos está relacionada com a reorganização tecidual que ocorre durante a metamorfose ou com a involução natural de algum órgão na fase adulta (GREGORC; POGACNIK; BOWEN, 2004).
mellifera africanizada, principalmente no que tange o efeito deste composto em sua rota de
2. OBJETIVOS GERAIS
3. ARTIGO 1
COMPARAÇÃO DO EFEITO DE DOSES SUBLETAIS DO INSETICIDA
IMIDACLOPRIDE NO LOBO ÓPTICO, CORPO PEDUNCULADO E LOBO
Resumo
Atualmente diversas substâncias sintéticas são utilizadas nas áreas de cultivo para o combate de insetos-praga. No entanto, o uso indiscriminado desses produtos pode afetar insetos não-alvo, como as abelhas que são essenciais nessas áreas devido à polinização. Além disso, como esses insetos estão expostos continuamente a esses compostos, devido ao forrageamento, foram relatados muitos casos de intoxicação em diversos países. Como conseqüência, pode-se verificar mudanças fisiológicas e comportamentais induzidas pela exposição a doses subletais, ou ainda a morte desses insetos. Tais alterações podem estar ou não relacionadas ao tempo de exposição a esses compostos. No Brasil, um dos inseticidas mais utilizados nas culturas de cana-de-açúcar, café e citrus é o imidaclopride, embora já tenha sido proibido em outros países devido à intoxicação das abelhas e outros seres vivos. Esse princípio ativo tem ação no sistema nervoso do inseto. Assim, esse estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da exposição crônica a doses subletais do inseticida imidaclopride, no cérebro de Apis mellifera africanizada. Para isso o órgão estudado das abelhas expostas e do controle foram submetidos à análises morfológica, histoquímicas e imunocitoquímica. A partir dos resultados obtidos na comparação do cérebro das abelhas dos grupos controles e expostos, foi possível observar algumas alterações celulares. Nos corpos pedunculados do grupo exposto à DL50/10 por 3 dias ou mais, e nos lobos ópticos de abelhas expostas a DL50/10 em todos os períodos de exposição e também nos lobos ópticos das abelhas dos grupos submetidos à DL50/100 e DL50/50, com 5, 7 e 10 dias de exposição, foi possível observar com a coloração H.E. a presença de células compactadas Com a reação de Feulgen, observou-se a presença de algumas células com núcleos picnóticos, enquanto que com a técnica de Xilidine Ponceau foi possível observar células com núcleos fortemente corados. Todas essas características indicam a ocorrência de morte celular. Além disso, nos corpos pedunculados das abelhas expostas à DL50/10 por 10 dias, também se observou a presença de células com aspecto inchado. A partir da técnica imunocitoquímica empregada, foi possível confirmar a ocorrência de morte celular, além de verificar tais mortes também no corpo pedunculado das abelhas expostas a DL50/10 por 1 dia e nos lobos ópticos de todos os grupos e períodos de exposição. Já nos lobos antenais, não foi observada qualquer alteração morfológica, histoquímica ou imunocitoquímica. Dessa maneira, foi possível concluir que doses subletais do imidaclopride tem ação citotóxica no cérebro das abelhas expostas e que o lobo óptico foi a estrutura mais sensível ao inseticida.
1. Introdução
Os polinizadores e a polinização são cruciais para quase todos os ecossistemas terrestres, incluindo aqueles dominados pela agricultura (KEVAN, 1999), e contribuem para a manutenção da biodiversidade das espécies vegetais no nicho ecológico onde vivem (WILLIANS, 1995).
Globalmente, o valor da polinização por insetos tem sido estimada em 212 bilhões de dólares, o que representa cerca de 9,5% do valor total da produção agronômica (GALLAI et al., 2009). Entre os principais polinizadores estão as abelhas, que são tidas como as mais eficientes em muitas culturas (NRC, 2006) e as mais importantes para a maioria das monoculturas mundiais (MCGREGOR, 1976; DELAPLANE; MAYER, 2000). Sugere-se que 35% da alimentação humana dependa direta ou indiretamente da polinização por esses insetos (KLEIN et al., 2007; WILLIANS, 1995).
Embora o crescimento do número de colônias seja evidente, em algumas localidades como Europa e Estados Unidos da América a perda de colônias está sendo um grande problema aos apicultores. Tal fato é conhecido como Distúrbio do Colapso das Colônias e ainda não tem causas definidas, embora se especule que possa haver a interação de alguns fatores que afetam a saúde da colônia. Entre eles temos as doenças bacterianas e infestações por ácaro. Além das doenças, um fator preocupante é o envenenamento das abelhas por substâncias químicas presentes no ambiente. Isso porque, devido ao desmatamento de seus hábitats naturais, elas têm aumentado suas atividades de forrageamento em áreas agrícolas. A agricultura moderna depende cada vez mais do uso de substâncias químicas para controlar ervas daninhas, fungos e artrópodes pragas nas áreas de cultivo. No entanto, como conseqüência da atividade de forrageamento as abelhas ficam mais expostas a esses químicos lançados no ambiente, o que está pode estar levando a uma redução no número de espécies desses insetos (CROFT, 1990; THOMPSON, 2003; MALASPINA; SILVA-ZACARIN, 2006; DESNEUX; DECOURTYE; DELPUECH, 2007).
Este inseticida atua inibindo a ação de receptores nicotínicos de acetilcolina dos insetos, agindo mais especificamente nas subunidades α do receptor (BUCKINGHAM et al.,
1997). Esses receptores são encontrados em muitas regiões do cérebro das abelhas, incluindo as áreas envolvidas nos processos de aprendizagem e memória (BICKER, 1999).
O sistema nervoso das abelhas inclui o cérebro e o cordão nervoso ventral. O cérebro de uma abelha adulta apresenta três massas ganglionares: protocérebro, deutocérebro e tritocérebro.
O protocérebro é composto pela ponte cerebral, corpo central, pars intercerebralis, corpos pedunculados e lobos ópticos. Os corpos pedunculados são estruturas pares localizadas dorsalmente e são mais volumosas e apresentam mais células e sinapses, nos insetos com o comportamento e o aprendizado mais complexo, uma vez que esse é o centro mais importante de memória (DALY; DOYEN; PURCELL III; 1998; CRUZ-LANDIN, 2009). Cada corpo pedunculado é constituído de uma neurópila em forma de cálice e são preenchidos com corpos celulares chamados de células de Kenyon. O cálice é dividido em anéis de neurópila em torno dos corpos celulares: a borda, que corresponde ao lábio; o colar, que corresponde às paredes; e a base, que corresponde ao fundo do cálice, do qual parte o pedúnculo. As células de Kenyon estão diferenciadas em compactas internas, não compactas e compactas externas, de acordo com a quantidade de citoplasma em relação ao núcleo (FARRIS, 2005; FAHRBACH, 2006). Os lobos ópticos são extensões do protocérebro em direção aos olhos compostos. Cada lobo é constituído por três massas de neurópilas denominadas lobo, medula e lâmina. Entre duas massas de neurópila, os axônios se cruzam produzindo regiões de quiasma. Entre o lobo e a medula está o localizado o quiasma interno e entre a medula e a lâminas está o quiasma externo.
O deutocérebro é constituído por dois lobos antenais, que contém as arborizações terminais dos axônios dos neurônios sensoriais das antenas e os corpos celulares dos nervos motores dos apêndices. Cada lobo está relacionado a uma das antenas e dele parte um nervo antenal, que contém axônios motores e sensoriais que chegam às antenas. Os lobos são basicamente constituídos por neurópila, organizada sob a forma de uma região central menos compacta e vários glomérulos periféricos de neurópila compacta (CRUZ-LANDIN, 2009).
Diversos substâncias xenobióticas podem promover a indução da morte celular pela ativação das vias sinalizadoras intracelulares, de forma direta ou indireta. O trabalho desenvolvido por Braeckman et al. (1999) é um exemplo dessa ativação de morte celular em resposta a tais compostos. Esses autores detectaram alterações ultra-estruturais em cultura de células de insetos expostas à doses subletais de cádmio, que podem estar relacionadas à alterações na maquinaria de síntese protéica, de proteínas envolvidas na ativação do programa de morte celular em resposta ao agente químico testado.
Várias técnicas têm sido utilizadas para estudar a morte celular. Aspectos morfológicos deste processo podem ser visualizados por microscopia de luz, já que as manifestações de morte celular incluem mudanças no aspecto do núcleo e na morfologia celular como: redução do volume nuclear e condensação da cromatina (picnose), mudança no volume celular, perda de regiões especializadas da membrana plasmática, tais como microvilosidades e complexos juncionais provocando mudanças de forma, com tendência para a esfericidade (ALBERTS et al., 2010).
Assim, técnicas morfológicas associadas a técnicas histoquímicas para detecção de proteínas e que permitam análise da compactação da cromatina podem ser ferramentas valiosas para verificação de alterações estruturais, que podem levar à morte celular, provocada por agentes xenobióticos.
Além disso, como a característica que tem sido considerada mais marcante nas modificações do material nuclear durante a morte celular é a fragmentação do DNA, que ocorre em conseqüência da ativação de endonucleases (WYLLIE, 1981), a presença de células em processo de morte pode ser confirmada pela utilização de técnicas que a detectem. As endonucleases cortam a cadeia dupla de DNA em regiões inter-nucleossômicas, dando origem a nucleotídeos com número de pares de base múltiplos de 180 que podem ser detectadas por técnicas imunocitoquímicas, como a técnica de TUNEL, que marca as novas extremidades 3’-OH geradas pela fragmentação.
imidaclopride (BORTOLOTTI et al., 2003; MEDRZYCKI et al., 2003; DECOURTYE et al., 2004b). Dessa maneira, o presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos de doses subletais do imidaclopride no cérebro de operárias de Apis mellifera africanizada.
2. Materiais e Métodos
2.1. Teste de toxicidade crônica
2.1.1. Coleta das abelhas
Abelhas adultas recém-emergidas da espécie A. mellifera africanizada foram coletadas diretamente dos favos, no apiário do Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro. Foram verificadas as condições de saúde da colônia e o estado fisiológico, de acordo com as diretrizes para testes químicos em abelhas da OECD (Organização para Cooperação e o Desenvolvimento Econômico, 1998).
2.1.2. Bioensaios de intoxicação de abelhas
As abelhas foram acondicionadas em potes plásticos (10 abelhas por caixa), previamente forrados com papel-filtro. Os experimentos foram conduzidos à estufa B.O.D., com temperatura a 32oC r 1°C e umidade relativa de 70%. Todos os grupos, experimentais e controles, receberam os mesmos suprimentos de água, que consistiu em algodão embebido em água, e de alimento (10 PL/abelha). Foram realizados dois grupos controle: controle sem solvente, alimentado apenas com xarope (1 água: 1 açúcar invertido), e controle do solvente, alimentado com xarope contendo 1% acetona (solvente utilizado para dissolver o inseticida). Para a contaminação do alimento oferecido aos grupos experimentais, foi preparada uma solução mãe, para o qual o inseticida foi dissolvido em acetona e misturado ao xarope. A partir da solução mãe, foram realizadas 3 diluições em xarope, obtendo-se as concentrações 0,809 (DL50/100), 1,618 (DL50/50) e 8,09 (DL50/10) ηg/abelha do inseticida. As doses subletais utilizadas foram calculadas a partir do estudo realizado por Rossi (2008) que estabeleceu a DL50 do imidaclopride como sendo 80,9 ηg/abelha. Os períodos de exposição ao inseticida foram de 1, 3, 5, 7 e 10 dias.
2.2. Coleta das abelhas após os períodos de intoxicação
2.3. Processamento do material
Para cada grupo do bioensaio, foram dissecadas 6 abelhas após 1, 3, 5, 7 e 10 dias de tratamento. A dissecção foi realizada em solução salina para insetos tamponada (NaCl 7,5g/L, Na2HPO4 2,38g/L e KH2PO4 2,72g/L) e os cérebros fixados em paraformaldeído 4% em tampão fosfato de sódio 0,1M e pH 7,4. Posteriormente, o material foi desidratado nos seguintes banhos de álcool: 15, 30, 50, 70, 85, 90, 95 e 100% (duração de 2 horas cada) (SILVA-ZACARIN et al., 2010 – informação pessoal).
2.3.1. Inclusão em resina: análises morfológicas e histoquímicas
Após a desidratação, o material foi transferido para a resina de embebição, e posteriormente, foi incluído em moldes plásticos contendo historesina Leica. Os blocos foram mantidos em estufa a 37°C e depois de polimerizados, foram colocados em suportes de madeira para a secção (5 μm de espessura) em micrótomo. As secções foram recolhidas em
lâminas de vidro, previamente limpas, e submetidas às técnicas de análises morfológica e histoquímicas.
2.3.2. Inclusão em paraplast: análise imunocitoquímica
Após a desidratação, material foi submetido a um banho de álcool e xilol (1:1) por 10 minutos e dois banhos de xilol, de 5 minutos cada. Em seguida, o material foi submetido a 3 banhos de paraplast, de 2 horas cada, em estufa à 57°C, para posteriormente ser incluído em paraplast em blocos de papel. Os blocos foram mantidos sob refrigeração e seccionados em micrótomo (7 μm de espessura). As secções foram recolhidas em lâminas de vidro previamente limpas e tratadas com polilisina. Logo antes do uso das lâminas, foi realizada a remoção do paraplast, utilizando 3 banhos de xilol (2 de 20 minutos e 1 de 10 minutos), 1 banho de xilol +álcool (2:1), 1 banho de xilol + álcool (1:1), 1 banho de xilol + álcool (1:2) e 3 banhos de álcool, de 5 minutos cada.
2.4. Análise Morfológica
Técnica de coloração pela H. E. (JUNQUEIRA, L. C.; JUNQUEIRA, L. M., 1983).
As lâminas foram coradas com hematoxilina por 10 minutos, lavadas em água por 4 minutos, e coradas com eosina por 5 minutos. As lâminas foram lavadas em água corrente para a retirada do excesso do corante. Posteriormente, foram secas, montadas em Bálsamo do Canadá e fotografadas.
2.5.1. Reação de Feulgen para análise do nível de compactação cromatínica (FEULGEN,
ROSSENBECK, 1924).
As lâminas foram colocadas em HCL 4N por 45 minutos. Em seguida, foram deixadas em água destilada por 5 minutos. Foram submetidas então, ao reativo de Schiff por 1 hora no escuro. As lâminas foram lavadas em água sulfurosa por 2 minutos e lavadas em água corrente por 20 minutos. Foi feita a contra-coloração com fast Green 1% por 30 segundos. Posteriormente, foram secas, montadas em Bálsamo do Canadá e fotografadas.
2.5.2. Xilidine Ponceau para detecção de proteínas totais (JUNQUEIRA, L. C.;
JUNQUEIRA, L. M., 1983).
As lâminas foram coradas por 30 minutos em Xilidine Ponceau e em seguida, submetidas a tampão acetato de sódio (pH = 2,5 a 3,5) por 1 minuto. Depois, foram lavadas em água destilada. Posteriormente, foram secas, montadas em Bálsamo do Canadá e fotografadas.
2.6. Análise imunocitoquímica para detecção de fragmentação do DNA por
endonucleases
Os cortes obtidos através da inclusão em paraplast (item 2.3.2) foram submetidos por 30 minutos a peróxido de hidrogênio 30% em metanol, para bloquear a peroxidase endógena. O processo foi realizado segundo o protocolo descrito pelo fabricante (Roche Molecular Biochemicals), para detecção imunocitoquímica de quebras no DNA, utilizando o Kit ISCDDK (im situ Cell Death Detectetion Kit). Os cortes foram recobertos com solução de proteinase K (20μg/mL em Tris-HCl, pH 7,5), por 15 minutos, à 37ºC em câmara úmida. Após esta permeabilização, as lâminas, contendo as secções histológicas, foram lavadas em água destilada e PBS (10 mM, pH = 7,4). Em seguida, 50μL da solução de Tunel recém
preparada, foram colocados sobre as secções histológicas. As secções foram incubadas por 60 minutos em câmara úmida, à 37ºC. Foram feitos controles negativos e positivos para a reação Tunel. Após a incubação, as lâminas analisadas e fotografadas em microscópio de fluorescência Olympus BX-51, utilizando comprimento de onda de 450-500nm.
3. Resultados
Além da análise morfológica realizada por meio da técnica coloração por H.E., foi possível verificar a ocorrência do aumento ou não da síntese protéica no cérebro, decorrente da exposição das abelhas ao inseticida, com a técnica de Xilidine Ponceau que cora proteínas totais nas células. O aumento de síntese protéica pode estar relacionado à ativação das vias sinalizadoras intracelulares que desencadeiam a morte celular, como as caspases. Já a reação de Feulgen permitiu analisar a ocorrência de compactação da cromatina que é um processo característico de morte celular. Estas técnicas, morfológica e histoquímicas, aliadas a análise imunocitoquímica com a reação de Tunel, permitiram a verificação dos efeitos citotóxicos do imidaclopride, que podem desencadear o processo de morte celular.
Os grupos controle sem solvente e controle do solvente apresentaram as estruturas cerebrais sem alterações morfológicas. Assim, nos copos pedunculados, as células de Kenyon apresentaram-se íntegras, com coloração normal (Figuras 1A, 1B), assim como nos lobos ópticos (Figura 4A) e nos lobos antenais (Figura 6A). Na reação de Feulgen, os neurônios presentes nos corpos pedunculados (Figuras 2A, 2B), nos lobos ópticos (Figura 4C) e nos lobos antenais (Figura 6C) apresentaram núcleos levemente corados, evidenciando uma cromatina descondensada e uniformemente distribuída. Na detecção de proteínas pela técnica de Xilidine Ponceau, as células das estruturas cerebrais analisadas apresentaram uma distribuição homogênea no citoplasma. Os núcleos são positivos à Xilidine Ponceau devido à marcação das proteínas nucleares (histonas) e nucleolares (Figuras 2E, 2F, 4E, 6E).
A ocorrência de morte celular, indicada pela presença de núcleos picnóticos e aumento da síntese protéica, visualizadas pelas análises morfológicas e histoquímicas foi confirmada pela técnica de imunocitoquímica empregada. A partir dessa técnica, além de núcleos positivos à reação de Tunel a partir do 3º dia de exposição à DL50/10, também foi possível verificar a ocorrência de morte celular nos corpos pedunculados do cérebro das abelhas expostas ao inseticida por 1 dia (Figura 3B).
No corpo pedunculado de abelhas expostas imidaclopride na dose de DL50/10 por 10 dias (Figuras 1E e 1F), verificou-se, além da presença de células condensadas, alterações no aspecto de algumas células de Kenyon dos subtipos compactas interna e não compactas. Essas células apresentaram-se maiores e menos coradas, o que confere um aspecto de inchaço à célula.
A tabela 2 mostra os resultados obtidos pelas técnicas empregadas para os lobos ópticos. Pode-se observar que nos lobos ópticos de abelhas expostas a DL50/10 em todos os períodos de exposição e também nos lobos ópticos das abelhas dos grupos submetidos à DL50/100 e DL50/50, com 5, 7 e 10 dias de exposição (Figura 4B), a técnica morfológica utilizada mostrou a presença de células condensadas que foram caracterizadas por estarem fortemente coradas e com diminuição do volume celular. Nestas mesmas doses e períodos de exposição, através da reação de Feulgen, foi possível observar células com núcleo fortemente corados, apresentando compactação cromatínica (Figura 4D) e células positivas ao Xilidine Ponceau, coradas com maior intensidade que as dos grupos controles, o que pode ser um indício de aumento na síntese de proteínas ou devido a compactação celular. (Figura 4E). No entanto, através da técnica imunocitoquímica empregada foi possível observar núcleos positivos à reação de Tunel, e, portanto em processo de morte celular, não apenas nestas idades e doses, mas em todos os grupos e em todos os períodos de exposição analisados (Figuras 5B e 5C).
Tabela 1. Resultados das análises morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímica realizada
nos corpos pedunculados A. mellifera expostas ou não com imidaclopride.
Células Condensadas1
Núcleos com Compactação da Cromatina2
Aumento na intensidade da coloração3 Núcleos positivos à reação de Tunel Células com aspecto inchado no corpo pedunculado Tipo de
Exposição Dias
Controle sem solvente
1 - - - - -
3 - - - - -
5 - - - - -
7 - - - - -
10 - - - - -
Controle do solvente
1 - - - - -
3 - - - - -
5 - - - - -
7 - - - - -
10 - - - - -
DL50/100
1 - - - - -
3 - - - - -
5 - - - - -
7 - - - - -
10 - - - - -
DL50/50
1 - - - - -
3 - - - - -
5 - - - - -
7 - - - - -
10 - - - - -
DL50/10
1 - - - + -
3 + + + + -
5 + + + + -
7 + + + + -
10 + + + + +
( - ) Ausência; ( + ) Presença
1
visualizadas através da coloração com H.E. 2
visualizados através da reação de Feulgen 3
Tabela 2. Resultados das análises morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímica realizada
nos lobos ópticos A. mellifera expostas ou não com imidaclopride.
Células Condensadas1 Núcleos com Compactação da Cromatina2 Aumento na intensidade da coloração3 Núcleos positivos à reação de Tunel
Tipo de
Exposição Dias
Controle sem solvente
1 - - - -
3 - - - -
5 - - - -
7 - - - -
10 - - - -
Controle do solvente
1 - - - -
3 - - - -
5 - - - -
7 - - - -
10 - - - -
DL50/100
1 - - - +
3 - - - +
5 + + + +
7 + + + +
10 + + + +
DL50/50
1 - - - +
3 - - - +
5 + + + +
7 + + + +
10 + + + +
DL50/10
1 + + + +
3 + + + +
5 + + + +
7 + + + +
10 + + + +
( - ) Ausência; ( + ) Presença
1
visualizadas através da coloração com H.E. 2
visualizados através da reação de Feulgen 3
visualizada através da técnica de Xilidine Ponceau
Tabela 3. Resultados das análises morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímica realizada
nos lobos antenais A. mellifera expostas ou não com imidaclopride.
Células Condensadas1 Núcleos com Compactação da Cromatina2 Aumento na intensidade da coloração3 Núcleos positivos à reação de Tunel
Tipo de
Exposição Dias
Controle sem solvente
1 - - - -
3 - - - -
5 - - - -
7 - - - -
10 - - - -
Controle do solvente
1 - - - -
3 - - - -
5 - - - -
7 - - - -
10 - - - -
DL50/100
1 - - - -
3 - - - -
5 - - - -
7 - - - -
10 - - - -
DL50/50
1 - - - -
3 - - - -
5 - - - -
7 - - - -
10 - - - -
DL50/10
1 - - - -
3 - - - -
5 - - - -
7 - - - -
10 - - - -
( - ) Ausência; ( + ) Presença
1
visualizadas através da coloração com H.E. 2
visualizados através da reação de Feulgen 3
Figura 1. Fotomicrografias do corpo pedunculado, corados com H.E, de Apis mellifera submetidas ou não ao
imidaclopride. A e B – visão geral e detalhe do corpo pedunculado do grupo controle sem alterações morfológicas; C e D – visão geral e detalhe do corpo pedunculado de abelha exposta DL50/10 por 7 dias,
mostrando a presença de algumas células fortemente coradas (seta). E e F – visão geral e detalhe do corpo pedunculado de abelhas expostas à DL50/10 por 10 dias. Notar células no interior do cálice com aspecto inchado
Figura 2. Fotomicrografias do corpo pedunculado submetidos à reação de Feulgen e à técnica de Xilidine
Ponceau, de Apis mellifera expostas ou não ao inseticida. A e B – visão geral e detalhe do corpo pedunculado do grupo controle, submetido à reação de Feulgen, mostrando núcleos levemente corados com cromatina descondensada. C e D – visão geral e detalhe do corpo pedunculado de abelha exposta à DL50/10 por 10 dias,
submetido à reação de Feulgen. Notar a presença de núcleos fortemente corados (seta). E e F – visão geral e detalhe do corpo pedunculado do grupo controle, submetido à técnica de Xilidine Ponceau, com células . G e H – visão geral e detalhada do corpo pedunculado submetido à reação com Xilidine Ponceau de abelha exposta à DL50/50 por 3 e 7 dias, respectivamente. Observar aumento na intensidade da coloração de algumas células
Figura 3. Fotomicrografias do corpo pedunculado submetidos à reação de Tunel de Apis mellifera expostas ou
não a doses subletais de imidaclopride A – corpo pedunculado de abelhas do grupo controle, com ausência de núcleos positivos. B – corpo pedunculado de abelha exposta à DL50/10 por 1 dia. Notar a presença de núcleos
Figura 4. Fotomicrografias do lobo óptico de Apis mellifera expostas ou não ao inseticida e A – lobo óptico, corado com H.E., do grupo controle sem alteração morfológica. B – lobo óptico, corado com H.E., de abelha exposta à DL50/50 por 7 dias apresentando células fortemente coradas (seta). C – lobo óptico submetido à reação
de Feulgen do grupo controle sem alteração histoquímica. D – lobo óptico submetido à reação de Feulgen de abelha exposta à DL50/100 por 10 dias. Notar a presença de núcleos corados intensamente (cabeça de seta). E –
lobo óptico submetido à reação com Xilidine Ponceau do grupo controle sem alteração histoquímica. F – lobo óptico submetido à reação com Xilidine Ponceau de abelha exposta à DL50/10 por 7 dias onde. É possível
Figura 5. Fotomicrografias do lobo óptico submetidos à reação de Tunel de Apis mellifera expostas ou não ao
inseticida. A – lobo óptico do grupo controle com ausência de núcleos positivos. B e C – lobo óptico de abelhas expostas à DL50/10 por 7 dias e DL50/10 por 3 dias, respectivamente. Notar a presença de núcleos positivos à
Figura 6. Fotomicrografias do lobo antenal de Apis mellifera corados com H.E. e submetidos a reação de
Feulgen e com Xilidine Ponceau. A, C e E – lobos antenais de abelhas do grupo controle, coradas com H.E., submetidas à reação de Feulgen e com Xilidine Ponceau, respectivamente, sem alteração morfológica e histoquímica. B, D e F – lobos antenais de abelhas do grupo exposto coradas com H.E., submetidas à reação de Feulgen e com Xilidine Ponceau, respectivamente, sem alteração morfológica e histoquímica. G = glomérulo; N = neurópila; Ne = neurônios.
4. Discussão e Conclusão
A partir dos resultados obtidos pode-se verificar que ocorreram alterações morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímicas nos corpos pedunculados e nos lobos ópticos, das abelhas expostas ao imidaclopride quando comparadas as do grupo controle.
Nos lobos ópticos das abelhas dos grupos DL50/100 e DL50/50, expostas por 1 e 3 dias, e nos corpos pedunculados do grupo DL50/10, expostas por 10 dias ao inseticida foi possível observar uma diferença nos resultados obtidos por meio das técnicas morfológicas e histoquímicas, comparadas a técnica de detecção de morte celular. Nessas estruturas não foram observadas, por meio das técnicas morfológicas e histoquímicas, a presença de células condensadas, células com núcleos picnóticos e com aumento de síntese protéica, que, como discutido acima, caracterizam células em processo de morte celular. Já a reação de Tunel, mostrou reações positivas em alguns núcleos nos corpos pedunculados e lobos ópticos de abelhas expostas à estas doses e por estes períodos. Tais diferenças podem ter ocorrido devido ao estágio do processo de morte que a célula se encontra. Quando os núcleos são marcados apenas pela reação Tunel pode ser que estes estejam em estágio inicial da morte celular, enquanto que a condensação celular e cromatínica, evidenciado pelas técnicas morfológica e histoquímicas podem ocorrer no estágio final do processo de morte, ou então, ser característica de células apoptóticas e autofágicas, em que o DNA não sofre fragmentação por endonucleases.
Além disso, comparando os grupos expostos entre si, foi possível observar que o lobo óptico foi a estrutura mais sensível ao inseticida, já que as alterações foram observadas em todas as doses e períodos testados, enquanto que nos corpos pedunculados as alterações foram exclusivas do grupo DL50/10. Já, em relação aos lobos antenais, não foi verificado qualquer tipo de alteração morfológica comparando-se os grupos expostos e controles.
A alteração morfológica mais marcante observada foi em relação à coloração mais intensa que algumas células apresentaram com a técnica de H.E., evidenciando a presença de células condensadas. Através da reação de Feulgen foi possível observar que estas estruturas cerebrais também apresentaram células com núcleos com condensação cromatínica.
A condensação da célula pode indicar morte celular por apoptose (BOWEN, I.; BOWEN, S.; JONES, 1998). A presença de células com núcleos com compactação cromatínica pode resultar em baixa atividade transcricional, sugerindo tratar-se de células sofrendo o processo de morte celular (WYLLIE, 1981; HÄCKER, 2000; SILVA-ZACARIN;
Na morte celular por apoptose, a homeostasia é mantida pelo controle da quantidade de proteínas antiapoptóticas e pró-apoptóticas. Estímulos, como dano ao DNA, levam ao aumento na expressão das proteínas pró-apoptóticas e esse desequilíbrio induz a apoptose (PETROS; OLEJNICZAK; FESIK, 2004). No presente estudo a técnica para de detecção de proteínas totais mostrou células positivas ao Xilidine Ponceau, mais intensamente coradas que as dos controles, nos corpos pedunculados e lobos ópticos de abelhas expostas ao imidaclopride, o que pode ser um indício do aumento de síntese protéica que pode ser decorrente do desencadeamento da maquinaria de sinalização de morte celular, ou ainda pode ser resultado da condensação celular.
Dessa forma, embora a morte celular programada em insetos esteja relacionada com a reorganização tecidual que ocorre durante a metamorfose ou com a involução natural de algum órgão na fase adulta (GREGORC et al., 2004), esse tipo de morte celular também pode ser observado nos órgãos de animais submetidos à exposição com substâncias tóxicas, que conduzem a um alto nível de estresse nas células, como observado no presente estudo.
Alguns trabalhos mostraram as alterações ultra-estruturais ocasionadas pela exposição de células de inseto de origem embrionária em cultura a doses subletais ao mercúrio orgânico e inorgânico (BRAECKMAN; RAES, 1999) e, também, ao cádmio (BRAECKMAN et al., 1999). Os resultados dessas pesquisas revelam alterações ultra-estruturais que não são características de necrose, mas da ativação da morte celular apoptótica. De acordo com estes autores a manutenção da maquinaria de síntese protéica está relacionada com a síntese de proteínas de estresse (HSPs), em resposta aos agentes químicos testados nestas células. Silva-Zacarin, Gregorc e Silva de Moraes (2006) também detectaram a ativação das HSPs em glândulas salivares de larvas de abelhas tratadas com acaricidas em apiários comerciais.
Deglise et al. (2003) e Armengaud et al. (2000), trabalhando com este mesmo inseticida, utilizaram a atividade da enzima citocromo oxidase para avaliar os efeitos de curta duração de ligantes colinérgicos no metabolismo de diferentes estruturas cerebrais, focando suas investigações nas regiões dos lobos antenais e corpos pedunculados. Esses autores verificaram que o imidaclopride ativou o metabolismo celular nos corpos pedunculados e em menor intensidade nos lobos antenais.
direção aos lóbulos ópticos formando sinapses na lâmina e, eventualmente, na medula. Neurônios da lâmina por sua vez projetam axônios para dentro da medula e esta projeta para a lóbula (HORRIDGE, 1965). Assim, mortes celulares nos lobos ópticos podem causar diminuição de neurônios e, conseqüentemente diminuição do número de sinapses entre esta estrutura e os olhos compostos. Portanto, o imidaclopride administrado em doses subletais provoca alterações estruturais nos lobos ópticos que podem levar ao surgimento de problemas na acuidade visual dos indivíduos, prejudicando diversas atividades desenvolvidas pelas operárias, como a atividade de forrageamento.
Os resultados obtidos por Bortolotti et al. (2003), durante a avaliação dos efeitos das doses subletais do imidaclopride no forrageamento e retorno à colônia por A. mellifera, podem ser explicados devido as alterações morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímicas observadas nos lobos ópticos. As abelhas do controle voltavam à colônia, retornando ao alimentador em até 5 horas. Aquelas alimentadas com xarope contendo 100 ppb do inseticida também retornaram à colônia, no entanto só retornaram ao alimentador após 24 horas. Já as abelhas expostas aos alimentadores com 500 e 1000 ppb, não retornaram à colônia ou ao alimentador. É possível que nesses indivíduos também tenha ocorrido a morte celular evidenciada pela reação de Tunel, o que pode ter comprometido a acuidade visual deles.
Outra estrutura cerebral que mereceu atenção foram os corpos pedunculados por estarem relacionados à aprendizagem e memória (DALY; DOYEN; PURCELL III; 1998; CRUZ-LANDIN, 2009). Assim, no cérebro das abelhas expostas do grupo DL50/10, verificou-se a presença de núcleos picnóticos nos corpos pedunculados das abelhas submetidas a 3, 5, 7 e 10 dias de tratamento. No corpo pedunculado da abelha exposta por maior período, foi possível observar além de núcleos picnóticos, um aspecto de inchaço dos corpos celulares. Dessa maneira, é possível afirmar que o dano causado no cérebro foi mais intenso nas abelhas expostas à maior concentração de inseticida e ao maior período de tratamento.
Como os corpos pedunculados estão associados aos processos de memória e aprendizagem, os danos nessas estruturas podem provocar desorientação e prejudicar a atividade de forrageamento das abelhas, o que pode comprometer temporariamente toda a colônia.
Rossi (2008) avaliou os efeitos agudos da dose letal média do imidaclopride na morfologia do cérebro de A. mellifera africanizada. Nesse estudo, não foram verificadas nenhuma alteração morfológica. Assim, podemos verificar que é provável que a exposição a doses subletais por um período maior de tempo, como testado no presente estudo, contribuiu para as alterações morfológicas observadas. Isso pode ser explicado, possivelmente, pela ação e exposição prolongada ao inseticida e seus metabólitos. Além disso, os resultados indicam que os as alterações morfológicas, histoquímicas e imunocitoquímicas observadas nos corpos pedunculados e lobos ópticos das abelhas expostas ao inseticida, pode afetar as atividades realizadas pelas abelhas, como o forrageamento, e afetar temporariamente toda a colônia.
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