Estudos "in vitro" dos níveis de resistência do Plasmodium falciparum a drogas, de 1983 a 1986.

Rev. Inst, Med. trop, Sãb Paulo

29(6) :346-353, novembro-dezembro, 1987

ESTUDOS "IN VITRO' DOS NIVEIS DE RESISTÊNGIA DO PLASMODIUM FALCI'PARUM

A

DROGAS, DE 1983

A

1986

M. A. V. SÂNr10S (1), A, A. COUIIO (1), S. G, Or,rVErRA (1) e V, E. ROSÁßrO (Z)

RESUMO

Foram realizados 171 testes de sensibilidade (microtécnica) Gom cepas de

PlasnodÍum falciparurn da Região Amazônica brasileira para cloroquina, meflo quina, amodiaquina e

quinino.

Os testes tiveram duração de 24 horas com as drogas preparadas na hora da realizaçáo de cada teste. Os resultados mostraram elevada resistência a cloroquina (83Vo\ e sensibilidade em quase a totalidade das amostras testadas para mefloquina í97,7%). Para amodiaquina e quinino obser-vóu-se sensibilidade em ít,OVo

e

56,57o das cepas, respectivamente.

Este estudo demonstra a emergência de um possível foco de resistência do

Plasmodiun falciparum a mefloquina, em Trrcrrruf.

IINITERII{OS: Malária; P. fa,lciparum; Resistência; Mefloquina.

Os problemas de sarfde existentes na

Ama-zônia, apresentam

a

mal¡ír.ia como

líder

de

uma lista de doenças infecciosas parasitárias que atinge

o

homem

da

região em todo seu

potencial

produtivo.

A

epidemiologia desta doença é influenciada pelo grande número de

pessoas que circulam

na

região, decorrentes

da

implantação

_de

projetos

agropecuários,

agroindustriais e de mineração 11,10,fÌ,1e.

O grave problema da ex¡lansão da malária, àssociada ao aumento de casos de resistência

dos plasmód.ios aos quimioterápisos utilízados nos esquemas clássicos de tratamento, tem

si-do

freqüentemente referido em vários traba. lþes 9,J.0,13,16;19,22.

Diante deste quadro, v¿írios grupos de

pes-quisadores, com

o

objetivo de uma.avaliação da sensibilidade

e

resistência do Plasmodium falciparum, desenvolveram estudos

"in

vivo" e

"in

vitro", comprovando

a

existência de

ce-pas de Plasmodium falcipanrn resistentes a

INTRODUçÄO

irþr.rns antimaláricos como amodiaquina, qul' nino, pirimetamina

*

sulfadoxina ou associa.

çáo

destes,

e,

principalmente,

à

cloroquina

r,8,4,8,1..8,23,2,4.

A existência de cepas resistentes às drogas usuais, em múitas partes do mundo, vem

esti-mulando a pesquisa para a obtenção de novas

drogas antimaláricas mais eficazes contra as

cepas resistentes 2,8,12,%. _{Por .outro lado, es}

tudos são tarnbém desenvolvidos

no

sentido da utilização de combinações de drogas alter-nativas paÌa a prevenção e tratamento da ma" lf,¡jg.t+,ts.

O Programa Malária do Instituto tvand¡o Chagas

_-

FSE,SP, desenvolvendo estudos de caractertzação do Plasmodium falcþairum, rea.

lizou no período de 1983 a 1986, microtestes de sensibilidade

a

drogas em cepas coletadas em diversas localidades da Região Amazônica bra.

sileira, com

base

na

técnica descrit4 pon

(1) Instituto Eva,ûdro Chagas (FSBSP) _- Prograr¡a lila.l¿hia,

.å,v. Almirante B¿rroso, 492. Caixa Postal 621. Gtr 66050 Belém, PA., Brastl.

(2) Biomedical Research Institute, RocJrvitte, It'lf¿tyland, USA.

SåIIIOS, _{ci8 do} M. A. _Pl¡sEodtum V.; COIIIL, _lalct)8n¡m A. A.; _{s drogss'} OLMIR¡A, S. c. & ROS/¡RIO, V. E. _ Estudos ..in vitro,, dos Dfveis ds resist8n ale 1g8s.8 1086. _{ßev. rnst. Med. trop. são peulo, 29:34&353, 1986,}

RITCKMANN

et

al. 1?, _{teve como objetivo}

ini-cial urria avaliação globa,l da rcgião.

O presente trabalho descreve

o

esttrd.o de 171 cepas de Plas¡nodir¡m fafci¡nnum, incluin do 65 testeg os quais fora,m pu,blictdos ante

r¡o¡mente2z.

MAIEBIIIL

E

IIIÊIIDIX)S

As

a,mostras sangüiner6 infectadas com Plasmodft¡m falcipa,rum (cepas), fora,m cols tadas de pacientes em diversas localidades

_d¡

Rêgião Amazônica

(Fig.

_l)

registrand.ose _a

histói''ia clínica de cada

um.

tstas

infoma,

ções foram obtidas pela _{entrevistâ com os par} cientes no momento da colétaÞ ou a parüir _dos dados do prontuário _hospitalar,

As amostras

(5

_ml

de sangue infectado) foram transportados

à

temlreratura a,urbiente,

ern seringas heparinizadas, ou, se pronenien-tes de localidades distanpronenien-tes do labo,ratório, em

tubos de 15

ml

_{com igual volume de.ueio ds}

sultivo RPMI

1640

(cIB@),

Bdicionado dó bica¡bOnato de sódio e sôro hu¡nano tipo .,A"

a lÙVo. .As amostras nessas cÓndiçæs mantém os parasitas vivos até ?2 horas. Nas localidades

RORAITA

ANAZONAS

lt

13

ATAPA

01 _- ÍrAIruDA (PÂ)

- 36 02

- MACAPá. (ÁP) - 26 0!t _- PAfr,ÂC,oMINÁS (PA) _ 22 04. _- TUgtrRUf (PA)

- 21 05 _- ACAR.Á (PA) _- 15 06 _- .åRrQrru![Es (Ro) - r3 0'I _- Mân.aB.á. fPA) _- 12 08 _- MOirú (PA) _- 05 09 _ MARAJÓ (PA) _ (}2 10 _ IMPE,AT,R,TZ (MÂ) _ dl

rl _ PINHEIROS TMA) _ OI

Fig. I - I¡caliação .læ óroas de _.coleta d"s cepss

TT.

DO

SUL

12 _- rruMAIrÁ. (.1Ð

- 02

13 _- CONC. DO ÁR.AcIrArA (PA) _ 02 14

- sÁ¡flrÁnÉM (PA) _ Or 15 _- JTTMAS (AM) * 0r

16 _ TÂIIJINDIA (PA) _ 01

r? _- c.âMErÁ. (PA) _- 01 18 _- TOiltrÍ-.Açú (PA) _- 0l 19 _ IGåN,ÁPIi-MIRI (PÂ) _- OI

20, _ .âI,TAMIR,A (PA) _- Or 2T _{..- -} R'IO JACTINDÁ (PA) _ 01

OR,IGnI DTSCCINEECIDA (PA) _ 05

GOIAS

\t'

sANtrlCS, M. .q.. V.; COIITO, A. A.; OLMIRA,. S. G. & RGS¡$IO, V. E. _{- EËtudos} dos Dfveis do rcsrsth-cia do PlasmoaliüE l¡lcipan¡m a drogas, de 1983 s 1986. Rev. Inst. Med. trop. São Psuto, 29:346-353, 1986.

de difÍcil asesso e distâ,ntes do laboratório em

Belém (PA), as mostras após colhidas, fora,ñt eriopresenrada,s em Dimetilsufóxido (DMSO) a 20,Vo, pata posterior processamento

(desconge-lãmento e cultivo contínuo) para

a

rca}:zaçio dos microtestes.

Para

a

realização do microteste, a

parasi-temia adequada é de O,l a L,AVo. Em presença

de parasitemias elevadas, procedeu-se

à

dilui-ção utilizando-se hemácias lavadas

(tipo

"O'), enq-uanto que para parasitemias mais baixas, r-ealizou-se

o

strltivo continuo

"in

vitro",

de

acofdo com a técnica de TRAGER E¿ JENSEN,

até obtenção da parasitemia ideal2o.

Das 171 cepas testadas, 145 foram mantidas em cultivo

por

períodos que variaram entre 3-15 dias, e as 26 resta¡¡tes foram testadas logo

epós

a

coleta

e

chegada

do

sangu.e dos pa. cientes ao laboratório, sendo

a

origem da

Ín-fecção

e

história clÍnica

por

vezes descritas de acordo com a informação verbal do pacien:

te.

O

sultivo contínuo não apresentou

mar-cante multiplicidade morfológica das foqmas

eritrocitárias,

su

seja,,

a

presença simultânea de anéis; trofozoitos e esquizontes, pelo que os

microtestes foram realizados com as amostras contendo predominância du anéis.

Todas as amostras de sangue foram

lava-das em meio RPMI-1640 (GIBCO), adicionado

de bicarbônato de sódio a.10%1 Após 2 lava. gens (3.000 r.p.m./5 min), o sangue

foi

diluído em igual volume de meio de cultivo completo:

88 ml de RPMI-1640 (GIBCO)

₊

_{2 ml de} bicar-bonato de sódio

e

soro hunano ,rÆ,

a

lOVo,

utilizou-se microplacas de titulação de polieti-leno (petécil), de fundo raso, colocandese 0,01

ml

da suspensão de sangue nos orifícios da

placa, aos quais adicionou-se 0,1

ml

do meio completo RPMI com diversas eoncentrações rta droga,

tal

como se segue:

r)

0

_-

10

_-

2,0

_-

4,0

_-

6,0

_{- 9,0-}

16.0

-

32x10-sM (Difosfato de Cloroquina)

Ð

0

_-

0,5

_-

1,0

_-

2,0

_4,0 _

6,0

_-

g,0

-

16,0x10q\4 (I\[efloquina)

.A.s amostras foram preparadas a partir de soluções "stock" (OMSGeneve) e as dosagens

foram preparadas no momento em que se ini-ciou

o

teste.

Em trabalho aJrteriorz?, foram utilizadas cepas controle testadas pelo mesmo

mtitodo

no fn$ituto

Animal Genetics, EdÍn burgh, Grã-Bretanha. Para os restantes testes

foram usadas cepas controles padronizadas pe.

lo

Programa Malária

do

Instituto

Evand¡o Chagas, somo IEC.50/83

e

IEC-132/83.

Nem todas as amostras fora¡n submetirlas

a

testes com todas as drogas porque, inicial. mente, este trabalho consistiu

na

análise de testes realizados apenas com cloroquina e

me-floquina

RESI]LTIIIXN

Na tabela

I

apresentamos

o

número td,tat

de amostras testadas por localidade

e

ano da

coleta. Nas tabelas

II

e

III

os resultados rios

microtestes estão distribuidos

na

forma

de MIC (Goncentração _{Mfnima Inibidora) por ano}

e nas rlirerentes dosageas testadas para cada dîoga:

TABTI,A I

Nümero de microtestes, .realizados por sno o por locÁUdsdo de or¡goE .laq celras

3)

Loc¿lidådê

0.-

0,25

_-

0,5

_-

1,0

_-

2o

_-

4,0

_

s,0

-

16,oxr(}8M (.4modiaquina)

0

_-

3,9

_-

?,g

_-

15,7

_-

Sl25

_-62,5

-

125

-

250x10{M (Sulfato de euinino)

Ita.itubB (PÀ) Ma,capó (AP) Paragominas (PA) Tucuruf (PA)

Âca,rá IPA)

Ariquemes (RO) lÍarabó (PA) Mojú (P.d) Marajó (PA) Impe¡atriz (.MA) Pinheiros (Må.) Ilum¿itó (AM)

Conc. do .Araguaia lpA) Santa¡ém (PA) Jumas (AM) Tailândia (PA) Ca¡netá (PA) Tom6Açú (PA) Igalapé-Miri (PA) AltîmiÎa (P.A)

Rio Jacunüi lPá,)

4',)

848

1983 1984 1985 . 1986 Total

I 4 l5

j

2 2 1 I

:

1 I 4 l6 7 2 6 1l c 4

:

_

1 I

j

I 6 6 5 7 3 I 2 I 1 I 2

_

;

j

5

j

I

j

:

38 26

n

2t 15 13 t2 5 2 I I 2 ?-I 1 t I L I 1 I 5

'cepas cuJos træientes não soub€f,a,m l¡lotra¡ o locsl do infecç6o, E[¡¡ sfirmâm que DEo .sal¡a¡n _do E.stsdo do Paú.

sArvllos' _{cia do} M' _{Pl¡smodlum faiciparum} A'

v';

cÐuro' A' A'; orrvErRA' s.

c.

& Ros.6RIo,.v.

E..-

_{Estudos..in vitro,, doq níveis de} resistên-a drogas, de lgg:t a lgg6. Rev. Inst. Med.. tiop. São pauto, Z9:346-A5J, tggö.

TABELA II

CaracterizagÉo de cepas de p. falciparun através d.e testes de sensibilidade

Distribuição dos resulta.doF de março/83 a junho/S6 MIC+ 1983 l9B4 1985 1986 Totst de amos.

l0

Totel de Cepas

20000 41010

611 853

861283

16 72 16 1S t0

32 19 2t 15 5

Metloquinr

x 10-EM

Portanto, para clóroquina, detectou-se gBVo

de resistência ..in vitro"¡

b)

Mefloquina! Das 16g amostras testadas, e

nrl ¡rresmo peX_íode _{de 19g8-1996, 142 foram}

ini-bidas

a

doses até 4x10sM. Acima d.esta d.osa,

gem 3 amostras _{(Tucuruí, Marajó e Acar¡ipA)} foram Ínibidas a 6x10sM e 4 amostras (todas de TucuruÍ-PA) _{foram inibidas a} gxl0.sM, _num

total

de

?

exibindo resistência

.,in

_{vitro,, a} esta droga"

c)

Amodiaquina

_e

_{euinino: Grand.e va¡iação} na resposta aos testes

foi

observada pârê _afl1 bas as

drogas.

Das 10 amostras inibidas. à

mais elevada dose (16x10+M) _{de amodiaquina,}

4

eràm provenientes de ltaituba,

¿

de tr¡cu_

ruÍ-PA

e 2

de

Macapá-Ap. para quÍhino 5

amostras (3 de Tucu¡uí,

I

de ltaituba_pA

e

1

de Ariquemes-R0) foram inibidas apenas¡ na

dose mais elevada (250x10-8M), _{mas também}

de Itaituba

e

TucuruÍ-p encontram-se

amos-tras sensÍveis

à

doses baixas (?,gx10+M).

DISCUSSAO

E

coNC:I¡UsÕEs

Estes estudos efetuados

no

perÍodo de 1983-1986 cobriram

20

localidades, send,o a

maioria no Estado do pará e as restantes em

Macapá (Território Federal d.o Amapá), I{u-maitá (Estado do.q,ma,zonas).e Ariquemes (Es tado de Rondônia).

O

nrlmero de amssÊas soletadas

foi

variado

e irregular. por

exem.

plo: de apenas B tocalid.ades, ftaituba, Macapá

e

Marabá -foi coletado material continuamen-te, num total, res¡rectivernente, de 86, 26

e

lZ

amostras.

Em grande nrlmero de. localidades apenas

um reduzido nrirnero de amostras

foi

analisa_

dg

mas nenhuma apresentou elevada

resistên-cia

a

qualquer das drogas testadas. r{pesar

do nrimero de amostras

ter

sido reduzido,

se-ria

sempre de interesse

a

observaçáo de-uma rinica amostra, com elevada resistência, que pudesse indicar ser aquela tocalidade posslvel

foco de parasitas não susceptfveis a da.da dro.

ga.

Sobre todas as cepas testadas, observamos

que sempre que uma cepa apresentou resis. têneia ao quinino ou apresentou resistência a amodiaquina, esta mesma cepa apresentou tam. bém resistência

a

cloroquina. porém, nem

?49

tras tnibidas

0,5 30

49 57 44 2t

Total de Cepas

r112629.6 2814410 40713 60t20 8,0130 160000 Amodtaqulng x 10.8M

0 0 2 2T æ 5:¡ 60

0,25 I

49 55r. 4 2l

Total de Cepss

t7t 0,50452 138124 21t484 44m07 87683 16252.L {I 6t 36 Ð 4 0

3,9 0

1857442t

Tot¿l de Cepss 7,8 15,6 3t,25 62,5 t25 2û 4 11 27 27 3? ?A i0

' Concentração Mfnima Inibidor¿ <rq ùroga, capaz de

inr-bir o.c¡escLnelrto do pBrasito.

'e Dois têstes de Mefloquina forarn perdtdos por deficiêtr-cia ds colo¡ação daq lâminÊs.

a)

Cloroquina: Das 1?l amostras testadas 142

foram inibidas acima de gxl0.rùI, sendo que a,penas

2

foram inibidas

_a

4xl(}sM

(l

de Ma. capá, e 1 de Ariquemes-R0) e 2? foram inibidas

a

6x10+M (7 de Paragorninas-p¿{,

4

de

ltaitu-ba-På,,

3

de Tr¡curuí-pA, B de Ariquemes-R0,

2 de AcarflPA, 2 de'Macap6-Ap, 1 de MoJrl-pA,

I

de Santarém-P-A, 1 de Tailândi+på,, 1 de Ma. rabá.PA,

I

de ImperatrizhllvfA e 1 de ptnheiros. MA.).

0020

111 92

ÍtÂNlIros..M..A. v.; couno, Â. Â,; oLnrtIRA, A. G. & ROSARIO, V.

t. -

tÊtuilo8

"l¡

vlt'O" atJos DIf€r8 tto ¡cslstb

O¡ ioin¡sûrilt¡m fafi¡p¡n¡n a d¡ogas, als 1983 s 1986. n€v. In6t. ![.e.f. ftop" são Br¡¡lo' 29¡341Ê353, 1986'

TABTLâ,III

.Dbhibltfèão crdfics de 1?1 Etcrot¿st€s resuzrdos r¡(rs anos ds 1903, 1984, 1985 e ßm, I¡8¡8 quEtro dsogas

CLOROQUINA

o

x 10

14

o o

17

Ì'lEFLOQUINA

-8

x 10

t't

27

2

53

cõ

29

1

GO

6

36

o,5

AIlODIAQUINA

-8

x 10

H

I

16

1¿1

32

1

31

--r¡

QU]NINO

o

x 10

ll

o

ffi

cia do Plasmo'lium fâIciPar.un _a drogas, de 19BB a 1986. Rev. rnst. Med. ¿"op. sõo paulo, z9:a46.85a, 19g6.

sempre para ambos

os

casos

o

_{inverso foi}

verdadeiro.

Em

fbituba

e Tucuruí-pA,, encontrou-se o

maior número

de

amostras mais resistentes

às drogas testadas, isto é, apena.s inibÍd.as por doses mais elevadas _{utilizadas nos testes. A} existência de focos de resistência à mefloquina em T\¡curuÍ-p.d, numa r,egião de elevado

mo-vimento migratririo, e onde existe apenas um vetor de transmissão (ARR,UDA _et

_al

_{1986), é} causa de preocupaçáo, _{sobretudo porque esta} droganão é ainda de uso generalizado _no pais;

neste caso atuaria _{como agente seletiyo de} disseminação

de

resistência, com d¡amá,ticas conseqtiências.

Em relação

a

mefloquina, outros autores indicaram respostas _{distintas ,,in vivo,', como}

souzA

(tr993), _cujos pacientes _responde¡am

com sucesso

ao

tra,tamento, BOULOS

_et

_al.

(1985) e DI SANTI et al. 0986) que mensionarn fracasso no uso desta

droga.

O intervalo tte

tempo na obtenção de uns

e

outros resulta.

dos, bem como

a

distinta or.igem dos

pacien-tes pode justificar _{esta variação. Grande par.}

te

dos pacientes envolvidos _{no Frojeto} Meflo-quina _{(SOUZA, lggg), er&m provenientes <le}

Paragominas-p,q,, eriquanto que

os

t¡abalhos realizados por BOULGS

et

al. e

DI

SÂlillfl et

al., eram de Rondônia

e

Amazonas, respecti-Vamente ?,8/21.

Em testes .,in

vitro"

com

a

mefloquina e

outras drogas, elevados nÍveis

de

resistência

têm sido .observados (ALECRIM

_et

_{al., 1986)}

tLJZ jsÊ..

Os microtestes devem ser utilizados para estudos longitudinais que permitam, para uma

maior amostragern" _{detectar se nos} peúod.os

de menor transmisão existe, por exemplo,

re-lação com presença _{de paræitas de maior ou} menor resistência

a

alguma droga, ou se, no caso de Capanema, onde plasmodiun

falcipa-rum

pode

_ser

transmitido por.

_A.

osvaldoi, (ARRUDA

_et

_{al., 1986), existe}

_um

_{padrão de} resistência

e

mesmo caracterização dos

para-sitas, sendo estes, diferentes do resto da Re.

gião Amazônica. A longo Ê.naz.o, e caso a clo

roquina deixe de ser utilizada na região, estes microtesJes permitirão avalia¡ uma diminuição do nÍvel de resistência

a

esta .droga como fol descrito paira

o

Sudoeste Ásitltico 1110.

O

elevado _{movimento migratório identifi.} cado nas áreas de desenvolvimento

_do

paÍs;

sobretudo _{na região acima citad", up"rru"}

_f*

vorece

_a

_expansão

_da

_resistência

_às

_drogas na presença do vetor.

Torna¡se importante estudos mais regula.

res e periódicos em um número mais reduzi.

do de localidades distintas para se

compreen-der melhor o problema de instalação u ãræ*-são de resistência na região amazônica.

SUMMARY

"fn

vitro" studies on the leyels of plasmodium falciparum drug resistrnce from lgg3

to

19g6.

Drug resistance tests were performed qvith 1?1 strains of p. falciparum obtained from the

Amazon Region, using chloroquine, mefloqui-ne; amodiaquine _and

_quinine.

_{Tests lasted} about 24 hours and

the

drug solutions were prepared

just

before

_use.

_{Results show high}

percentage

_of

_resistance

_to

_{chloroquine (g}Vol} whereàs nearly

all

_{strains were shown}

_to

_be sensitive

to

mefloquine

(97!t%). For

_both amodiaquine

_and

_{quinine sensitivities were}

of. 5t.0,% and 56.5lo respectively,

The present study demonstfates

_that

_re

sistance

_to

mefloquine _{m4y be starti4g}

_in

_{nr_} curuí, ParÉ.

AGRIIDECIMEI\ITOS

Este úrabalho contou

com

o

apoio do CIIPq,

FINEB

SUC.AM

e

OMS-TDR. Agrada, cemos também ao Dr. José Ma¡ia de Souza

_

Projeto Mefloquina

-

Hospitat Barros Barre

to

_-

Betém (pA), _{pelo envio de cepas de} ar-gumas localidades do Estado do par¡í.

n'EFERÊNüÁS BIBLIOGNÁTTCAS

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