UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
Irish Coffee: Efeitos de álcool e cafeína no comportamento
e aprendizagem do peixe paulistinha
LUANA CARLA DOS SANTOS
Orientadora: Ana Carolina Luchiari
LUANA CARLA DOS SANTOS
Irish Coffee: Efeitos de álcool e cafeína no comportamento
e aprendizagem do peixe paulistinha
Dissertação apresentada ao programa de pós-graduação em psicobiologia como requisito para obtenção de título de Mestre em Psicobiologia
Área de concentração: Comportamento Animal
Orientadora: Ana Carolina Luchiari
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências
Santos, Luana Carla dos.
Irish Coffee: efeitos de álcool e cafeína no comportamento e aprendizagem do peixe paulistinha / Luana Carla dos Santos. – Natal, RN, 2016.
77 f.: il.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Carolina Luchiari.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia.
1. Atividade locomotora e memória. – Dissertação. 2. Substâncias psicoativas – Dissertação. 3. Peixe paulistinha. – Dissertação. I. Luchiari, Ana Carolina. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
TITULO: Irish Coffee: Efeitos de álcool e cafeína no comportamento e aprendizagem do
peixe paulistinha
AUTOR: Luana Carla dos Santos
DATA DA DEFESA: 04 de março de 2016
BANCA EXAMINADORA:
__________________________________________
Dr. Rodrigo Egydio Barreto
UNESP – Botucatu, SP
__________________________________________
Dr. Rámon Hipolyto Lima
UFRN - Natal, RN
__________________________________________
Dra. Ana Carolina Luchiari (orientadora)
AGRADECIMENTOS
Após mais uma jornada acadêmica chega o momento de olharmos para trás e analisarmos todos os caminhos que percorremos até a conclusão desse ciclo. Dedicarmos-nos a pesquisar o que apreciamos, achamos pertinente e gratificante, mas como em toda caminhada há inúmeros desafios, frustrações e êxitos.
Como em todos os momentos da minha vida, compartilho todas essas fases com pessoas fundamentais nesse processo, que estão ou estiveram comigo no dia a dia, que “abraçaram a causa”, que me fizeram refletir e amadurecer pessoalmente e profissionalmente, enfim, que através de incentivos e críticas construtivas influenciaram no resultado final desse trabalho no qual me dediquei integralmente durante esses dois anos.
Assim, inicio meus agradecimentos referenciando as pessoas mais importantes na minha vida, a minha família, que sempre me apoiam, dão incentivo e amor incondicional. Pessoas que compreendem minhas mudanças de humor (não é fácil!), respeitaram meus momentos de isolamento quando precisava ficar um final de semana inteiro diante do computador, em silêncio, escrevendo sobre ela, elaborando apresentações. Pessoas prontas para acolher minha angustias e vibrar a cada vitória, não importando a hora do dia.
À minha orientadora Ana Carolina Luchiari, pela orientação, pelos conselhos que só me ajudaram nesses nossos quase seis anos de convivência, essa jornada que teve início no comecinho da graduação. Agradeço a paciência, a compreensão, ao tempo dedicado mesmo quando estava tão longe do Brasil.
Agradeço as colegas de laboratório: Jéssica Polyana e Júlia Ruiz que foram meus braços direito, esquerdo, pernas e corpo todo. Por toda dedicação e empenho, pelas horas gasta analisando vídeos, trocando água dos peixes, limpando vazamento, pesando cafeína, fazendo mil planilhas, escrevendo resumo para congressos, enfim, sem vocês este trabalho não seria possível.
Continuando aos agradecimentos as colegas do laboratório: Adrielly Marcela, Diana Chacon, Jaquelinne Pinheiro, Jéssica Janine e Priscila Fernandes, pelo auxílio na realização dos experimentos, pela colaboração na revisão da dissertação, pelas ideias, conselhos e discussões sobre o trabalho que ajudaram e muito no andamento dele. Agradeço pelo empenho, apoio e amizade. Sem dúvidas, essa pesquisa carrega um pouco de cada uma.
RESUMO
Substâncias psicoestimulantes vêm sendo utilizadas de forma indiscriminada há muitos anos, e pouco se sabe os efeitos que elas causam a curto e longo prazo no comportamento geral, na aprendizagem e na memória. Essas substâncias são bastante usadas por jovens e adultos e elas possuem efeitos diferentes. Essas substâncias são dose dependente, caso consumidas em baixa quantidade agem como estimulante, aumentando a atividade locomotora, caso consumidas em alta quantidade, causam efeito depressor, diminuindo a atividade locomotora e/ou causando ansiedade. Poucos estudos vêm investigando os efeitos dessas substâncias na atividade locomotora, aprendizagem e memória e grande parte desses estudos são realizados em roedores. Peixe paulistinha é um modelo animal promissor para estudos comportamentais, cognitivos, ontogenéticos, dentre outros. Nossos objetivos foram determinar os efeitos do álcool, cafeína e de seu uso combinado com álcool, na atividade locomotora desses animais, usando para isso doses crônicas durante 27 dias e doses agudas durante um dia. Visto que pouco se sabe sobre os efeitos dessa exposição prolongada. Também investigamos os efeitos das substâncias em teste de reconhecimento de objetos, que se baseia na memória de único evento. Essas memórias são mais vulneráveis que memórias baseadas em várias repetições de eventos. Sendo assim, um teste adequado para utilizar com uso de substâncias psicoativas. Observamos que o uso crônico de cafeína provoca alteração na atividade locomotora dos animais, do mesmo modo, abstinência de álcool combinada com cafeína em dose aguda (dose média) provoca aumento de atividade locomotora. Quando submetidos a testes de memória, os animais exposto a doses altas agudas de álcool e em abstinência dessa droga têm prejuízo na formação e/ou resgate da memória. No entanto, tratamento com cafeína não prejudica a formação de memória. Animais expostos a tratamento com dose crônica moderada de álcool e dose aguda moderada de cafeína tem melhor desempenho na tarefa, indicando que dose aguda moderada de cafeína pode evitar os efeitos deletérios ocasionados pela abstinência do álcool. Em termos do comportamento geral, doses agudas de cafeína aumentam a locomoção, enquanto doses elevadas e a abstinência de cafeína induzem a comportamentos tipo-ansioso. A combinação álcool crônico e cafeína aguda induzem a alto comportamento tipo-ansiedade, enquanto a combinação cafeína crônica e álcool agudo diminuem tanto a locomoção quanto a ansiedade.
ABSTRACT
Psychostimulant substances are being used in an indiscriminate way for many years and little is known about the effects they cause in short and long term in learning and memory. These substances are highly used by young people and adults and they present different effects. The substances are dose dependent, if consumed in lower quantity they act as a stimulant, increasing locomotor activity, if consumed on higher doses, they cause a depressor effect, lowering the locomotor activity. Few studies investigate the effects of these substances on the locomotor activity, learning and memory and most of these studies are on rodents. The zebrafish is a good animal model for behavioral, cognitive, ontogenetic and other studies. Our objectives were to determine the effects of alcohol, caffeine and its combined use with alcohol on the locomotor activity of the animals, using chronic doses during 27 days and acute doses during one day, since little is known about the effects of the prolonged exposition. As also, investigate the effects of the substances on a one trial learning test of objects discrimination, which is based on a memory of one single event. This type of memory is more vulnerable than the memories based on many repetitions. Therefore, an adequate test to use with the psychoactive substances. We found that the chronic use of caffeine provokes an alteration on the locomotors activity of the animals. In the same way, alcohol withdrawal combined with acute caffeine (moderate dose) provokes an increase on locomotors activity. When submitted to the discrimination tests the animals exposed to higher acute doses of alcohol and withdrawal of this drug have impairment on memory. However, the caffeine treatment does not harm memory. Animals exposed to a treatment with moderate chronic alcohol dose and moderate acute caffeine dose learned the task, indicating that moderate acute
caffeine doses may prevent deleterious effects caused by alcohol withdrawal. In terms of the
general behavior, acute doses of caffeine increase the mobility, while high doses of caffeine
and its abstinence induce anxiety-like behavior. The combination of chronic alcohol and acute
caffeine induces high anxiety-like behavior, while chronic caffeine combined with acute
alcohol decrease both locomotion as anxiety.
SUMÁRIO
Introdução geral... 7
Breve histórico do uso de substâncias psicoativas... 7
O álcool... 8
Metabolismo... 8
Ação do álcool no sistema nervoso central... 9
Efeitos do álcool no comportamento – estudos com peixe paulistinha... 11
Cafeína... 12
Metabolismo... 12
Ação da cafeína no sistema nervoso central... 13
Efeitos da cafeína no comportamento – estudos com peixe paulistinha... 14
O uso combinado de álcool e cafeína... 15
Peixe paulistinha como modelo animal... 17
Objetivos... 18 -19 Capítulo 1 Irish coffee: Behavioral changes induced by alcohol and caffeine in zebrafish Resumo... 20
1. Introdução... 21
2. Materiais e métodos... 23
3. Resultados... 27
4. Discussão... 41
Agradecimentos... 40
5. Referências... 47
Figura 1... 29
Figura 2... 31
Figura 3... 32
Figura 4... 33
Figura 5... 35
Figura 6... 37
Figura 7... 38
Figura 8... 39
Figura 9... 40
Capitulo 2 Irish coffee: Effects of alcohol and caffeine on object discrimination in zebrafish Resumo... 56
1. Introdução... 56
2. Materiais e métodos... 57
3. Resultados... 58
4. Discussão... 60
Agradecimentos... 64
5. Referências... 64
Tabela 1... 57
Figura 1... 59
Figura 2... 60
Figura 3... 61
Figura 4... 62
Figura 5... 63
Figura 6... 64
Conclusões gerais... 66
Referências... 67
7
Introdução geral
Breve histórico do uso de substâncias psicoativas
O uso de substâncias psicoativas é um hábito humano milenar (Seidl, Costa &
Sudbrack, 1999) e pode ser correlacionado com diferentes contextos sociais, como lazer,
rituais religiosos e fins terapêuticos (Merlin, 2003). Na América, Europa e Ásia antiga, o
homem já utilizava plantas como a papoula do ópio, também chamada planta da felicidade,
pelo seu efeito alucinógeno (MacRae, 2001; Seibel & Toscano, 2001) e ansiolítico (Seibel &
Toscano, 2001). Ao longo do tempo, diferentes substâncias psicoativas passaram a ser
consumidas pelo homem, como álcool, maconha, cocaína, cafeína, nicotina, dentre outras
(Seidl et al., 1999) na busca pela atenuação de sensações desprazerosas e promoção de
bem-estar.
O álcool foi bastante consumido na forma de vinho por egípcios, gregos e hebreus, sendo considerado uma “dádiva dos deuses” (Amouretti et al., 1999; Carneiro, 2005; Purcell,
2003; Rosenzweig, 1998). A maconha foi comumente utilizada pela medicina chinesa como
anestésico em cirurgias e ainda como hipnótico, analgésico e espasmolítico (Murad, 1996). Os
nativos da América do Sul, ainda hoje possuem o hábito de mascar folhas de coca para tolerar
o trabalho em altitudes, somado à pobre dieta alimentar (Bahls & Bahls, 2002; Gold, 1993).
Esse hábito de mascar folha da coca garante efeito estimulatório, semelhante ao efeito da
ingestão de cafeína, proporcionando maior rendimento aos trabalhadores (Bucher &
Olievenstein, 1992), sendo utilizada também como anestésico local (Seidl et al., 1999). Os
chineses utilizavam plantas com cafeína para preparação de chás, hábito esse difundido
mundialmente (Trevisanato & Kim, 2000). Com o passar dos séculos, os efeitos prejudiciais
destas substâncias tornaram-se conhecidos e atualmente a maconha, a heroína e a cocaína são
8 drogas lícitas que estão incorporadas aos hábitos sociais de homens e mulheres (Pratta &
Santos, 2009).
Dentre as substâncias mencionadas, destacamos o álcool e a cafeína que são
largamente consumidas pela sociedade atual (Fredholm, Bättig, Holmén, Nehlig, & Zvartau,
1999; WHO, 2014). Apesar de ser uma droga lícita, o álcool pode causar dependência e é
considerado o segundo maior causador de complicações neuropsiquiátricas, perdendo apenas
para depressão (Brundtland, 2000). No ano de 2012, 3,3 milhões de pessoas chegaram a óbito
em decorrência do uso de álcool, devido à síndrome alcoólica fetal, cirrose hepática, câncer de
boca, câncer da faringe, câncer do esôfago, câncer da laringe, pancreatite, violência
interpessoal, acidentes de trânsito, dentre outros (WHO, 2014). Já a cafeína age de maneira
menos evidente, podendo levar também à dependência física de forma mais branda que o
álcool (Griffiths & Woodson, 1988), e, se consumida de forma desregulada, pode ocasionar
quadros de dor de cabeça, enjoo, letargia, dentre outros.
O álcool
Metabolismo
Após a ingestão, o álcool é rapidamente absorvido no estômago e intestino delgado,
sendo levado até a corrente sanguínea, e distribuído nos líquidos corporais totais (Cuppari,
2002; Dutra de Oliveira & Marchini, 2003). A concentração de álcool no sangue é máxima
em aproximadamente 30 min após o consumo, se o indivíduo estiver com o estômago cheio
esse processo tende a ser mais longo (Norberg, Jones, Hahn, & Gabrielsson, 2003). O
metabolismo gástrico do álcool é menor nas mulheres do que nos homens, o que contribui
para maior sensibilidade das mulheres a essa substância (Lieber, 2000; Schuckit, 2006a,
9 O álcool é principalmente metabolizado no fígado, pela oxidação hepática.
Inicialmente, o álcool é transformado em acetaldeído pela ação da enzima ADH (álcool
desidrogenase), depois a enzima ALDH (aldeído desidrogenase) age e transforma o
acetaldeído em ácido acético e na coenzima NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo). Por
fim, o ácido acético é oxidado em dióxido de carbono. O ADH também é encontrado no
estômago, intestino, musculatura esquelética e tecido cerebral (Baraona, 2000; Duester et al.,
1999; Lim et al., 1993; Zakhari, 2006).
O álcool também pode ser metabolizado por vias extra-hepáticas, quando mantido
em grandes concentrações no organismo. Esse processo ocorre em grande parte no cérebro,
local com baixa atividade de ADH, por ação da enzima citocromo P450 (Zakhari, 2006).
Outra enzima que também realiza metabolismo extra-hepático é a catalase, encontrada nos
peroxissomos, e é utilizada em menor escala (Zimatkin & Deitrich, 1997). Independente da
enzima, o metabolismo do álcool tem como principal subproduto o acetaldeído, uma
substância tóxica, cujo acúmulo leva a reações adversas como tontura, náusea, vômito,
taquicardia e taquipnéia (Edenberg, 2007; Tuma, 2002).
Pequenas quantidades de álcool são excretadas na urina, no suor e no ar expirado,
enquanto o metabolismo do álcool é responsável pela excreção de 90-98% do álcool ingerido
principalmente devido à função hepática do ADH e ADLH (Brunton, Chabner, & Knollman,
2012). É necessário certo cuidado com o consumo, visto que o álcool atravessa a barreira
hematoencefálica e placentária facilmente (Gilman et al., 1996).
Ação do álcool no sistema nervoso central
Segundo a WHO (2014), drogas são substâncias capazes de alterar a função dos
10 (estimulantes) ou diminuir (depressoras) sua atividade, ou ainda alterar a capacidade
perceptiva (perturbadoras); e dessa forma geram mudanças fisiológicas e comportamentais.
Apesar de ser considerado uma droga de forma geral depressora, o efeito inicial do álcool é
excitatório. Assim que entra no sistema nervoso central, o álcool causa o aumento dos níveis
de serotonina (Forman, Chou, & Strichartz, 2009) e ativação da via de recompensa, mediando
pelo sistema dopaminérgico mesocórticolímbico a sensação de prazer que é gerada durante
esta fase do consumo. É devido à excitação desta via que o álcool pode causar o
comportamento de busca pela substância (Moreau, 1996; Samson & Harris, 1992). Após o
quadro inicial de euforia, surge o efeito depressor do álcool (Rang, Dale, Ritter, & Flower,
2007), que se dá pela ação sobre a neurotransmissão GABAérgica, que é inibitória (SMITH;
OLSEN, 1995). Esse neurotransmissor (GABA) possui dois tipos de receptores, GABAA e
GABAB, apenas GABAA é estimulado pelo álcool e nesse momento, ocorre aumento no
tempo de abertura do canal e maior influxo de Cl- (Forman et al., 2009).
O consumo de álcool de forma crônica reduz o número de receptores GABAA, sendo
esse um dos efeitos que promove a tolerância à droga (Sanna et al., 1993). A decorrente busca
pela dose que continue causando os mesmos efeitos anteriores pode levar o indivíduo à
dependência. Caso o indivíduo interrompa o consumo de álcool no estágio da dependência,
ele pode apresentar sintomas da crise de abstinência, derivados da perda dos efeitos inibitórios
da droga e deficiência de receptores GABAA (Devaud, Fritschy, Sieghart, & Morrow, 1997).
Além de estimular a atividade dos receptores GABAA, o etanol também atua sobre o
receptor do glutamato, funcionando como um antagonista. O glutamato possui três receptores:
NMDA, cainato e AMPA, e embora todos sejam inibidos na presença do álcool, os receptores
NMDA são mais afetados (DeLucia, Cruz, Marin, & Planeta, 2006). O consumo crônico de
11 Anderson, 1996; Hoffman, Lorio, Snell, & Tabakoff, 1995), o que está relacionado com a
hiperestimulação deste sistema durante a abstinência do álcool, podendo ocasionar crises
convulsivas e acidentes vasculares cerebrais (Lovinger, 1993).
Efeitos do álcool no comportamento – estudos com peixe paulistinha
O álcool afeta vários aspectos funcionais do organismo, como memória (Luchiari,
Chacon, & Oliveira, 2015), aprendizagem (Santos, Oliveira, Oliveira, Silva, & Luchiari,
2016), ansiedade (Maximino, da Silva, Gouveia, & Herculano, 2011) e locomoção (Tran &
Gerlai, 2013). Daremos ênfase ao seu efeito na função cognitiva e locomotora.
A aprendizagem é um processo contínuo, que ocorre por meio de interações com
outros sujeitos ou objetos ao longo do tempo de vida do indivíduo (Kandel & Schwartz,
2001). Aprender e lembrar o que foi aprendido é essencial para a sobrevivência em muitas
espécies. Uma vez que o animal vive uma dada experiência, o indivíduo pode alterar seu
comportamento e responder de forma mais eficiente quando enfrentar aquela mesma situação
novamente.
Roedores expostos a etanol na fase pré-natal submetidos a tarefas cognitivas de medo
condicionado demonstram atraso na resposta quando expostos ao risco (Brady, Allan, &
Caldwell, 2013). Peixes pauslistinhas expostos a altas doses de álcool apresentam prejuízo na
realização de tarefas cognitivas como tarefas de aprendizagem associativa, enquanto que
peixes sob efeito de baixas doses apresentam melhora na realização dessa mesma tarefa
(Chacon & Luchiari, 2014). Nessa mesma linha, já foi visto que doses baixas e moderada de
álcool administradas de forma aguda alteram a preferência de local de peixe paulistinha,
passando a preferir o local onde o animal foi inicialmente submetido ao álcool, mostrando o
12 É sabido que o álcool tem efeito dose-dependente, doses intermediárias de álcool
(0,25% e 0,50%) aumentam a atividade locomotora de peixe paulistinha, enquanto que doses
elevadas diminuem a atividade locomotora desses animais (Gerlai, Lahav, Guo, & Rosenthal,
2000). No entanto, durante a abstinência de álcool, esses mesmos animais apresentam altos
índices de freezing, passam mais tempo no fundo do aquário e sua latência para chegar à
superfície do aquário é maior, o que caracteriza um comportamento tipo-ansioso (Egan et al.,
2009). De forma similar, roedores expostos a doses médias (1.g/Kg, 10% e 35%) de álcool,
aumentam a atividade locomotora (Brys, Pupe, & Bizarro, 2014; Jerlhag, Landgren,
Egecioglu & Dickson, 2011).
Cafeína
Metabolismo
Após o consumo, a metabolização da cafeína se inicia no trato gastrointestinal, e
após 20-30 min do seu consumo, a substância atinge níveis máximos no organismo e pode
levar de 2,5 à 10 h para total eliminação. No entanto, sua total eliminação pode variar de
acordo com diversos fatores como idade, peso corporal, ingestão de medicamentos, dentre
outros (Magkos & Kavouras, 2005).
Aproximadamente 5% da quantidade ingerida é eliminada através da urina (Kumar,
2013). Assim como no álcool, a enzima citocromo P450 atua metabolizando a cafeína, mas
nesse caso, essa ação ocorre em sua maior parte no fígado, e não no cérebro. A enzima
citocromo P450 metaboliza a cafeína em três dimetilxantinas: paraxantina, que pode aumentar
as taxas sanguíneas de glicerol e gorduras; teobromina, que provoca dilatação dos vasos
sanguíneos causando efeito diurético; e teofilina, responsável pela dilatação das vias aéreas
13
Ação da cafeína no sistema nervoso central
No cérebro, a cafeína interfere na atividade da adesonina, neurotransmissor com
efeitos inibitórios e de normalização da homeostase de diversas células (Longhi, Robson,
Bernstein, Serra, & Deaglio, 2013; Purves et al., 2010). A cafeína possui conformação
estrutural semelhante à adenosina, e uma vez que ocorre a ligação entre a cafeína e o receptor
adenosinérgico, ela inibe o receptor e bloqueia a ação inibitória da adenosina, fazendo
prevalecer os efeitos estimulantes da cafeína, como aumento da disposição, alerta e
concentração (Griffiths & Woodson, 1988; Griffiths et al., 1986).
A cafeína liga-se apenas a dois receptores de adenosina, receptor A1 e receptor A2A
(Fredholm, Ijzerman, Jacobson, Klotz, & Linden, 2001). O receptor A1 está presente em
diversas regiões do cérebro como hipocampo, córtex cerebral, cerebelo e núcleos
hipotalâmicos; e estimula a liberação de neurotransmissores como o glutamato, dopamina,
acetilcolina e serotonina, que são excitatórios e aumentam o estado de vigília e atenção
(Sheth, Brito, Mukherjea, Rybak, & Ramkumar, 2014). O receptor A2A está distribuído pelos
oligodendrócitos, microglia, bulbo olfatório, gânglios basais e regiões pré-sinápticas no
hipocampo, região onde também ocorre liberação de glutamato, noradrenalina e acetilcolina
(Sheth et al., 2014). Somada à ação nos receptores de adenosina, outras vias de atuação da
cafeína também são responsáveis por seu efeito estimulante como o bloqueio dos receptores
GABAA (receptores de ação inibitória) e mobilização do cálcio intracelular (responsável pelo
aumento de atividade locomotora).
O consumo da cafeína ativa áreas relativas ao prazer, busca pela substância, alerta,
concentração, dentre outros, mediados pelos neurônios dopaminérgicos, adrenérgicos,
14 Recentemente tem se noticiado uma possível ação neuroprotetora do consumo do café
orgânico, o que pode estar relacionado a menores taxas de mal de Alzheimer e Parkinson nas
sociedades da América do Sul, nas quais se consomem esse tipo de café.
Semelhante ao consumo de álcool, a cafeína também pode levar ao desenvolvimento
de dependência decorrente de seu consumo crônico (Heishman & Henningfield, 1992), no
entanto, a abstinência da cafeína é bem mais branda que a do álcool, sendo associada a dores
de cabeça, fadiga, irritação e sonolência (Kenneth Silverman, Suzette M. Evans, Eric C. Strain, 1994; Richardson, Rogers, Elliman, & O’Dell, 1995). O consumo crônico e agudo
parece não ocasionar prejuízos à saúde (Abreu, Silva-Oliveira, Moraes, Pereira, &
Moraes-Santos, 2011), sendo este o provável motivo de não existirem restrições quanto a seu consumo
(Aguiar, Turnes, Cardoso, Vasconcelos, & Caputo, 2011; Killer, Blannin, & Jeukendrup,
2014).
Efeitos da cafeína no comportamento – estudos com peixe paulistinha
Quando comparadas as informações sobre o efeito do álcool no comportamento do
peixe paulistinha com os dados até então existentes sobre a cafeína, podemos afirmar que
pouco se sabe sobre o efeito da cafeína nesta espécie. Entretanto, os estudos realizados têm
mostrado que a cafeína pode alterar o comportamento dos animais, embora de forma mais
branda que o álcool.
A cafeína é dita uma substância benéfica para a memória. De acordo com Cunha e
Agostinho (2010), essa característica benéfica se deve não a uma melhora direta da memória,
mas à habilidade normalizadora da cafeína, ou seja, de prevenir prejuízos a memória. Animais
15 substância que prejudica a formação de memória, não apresentaram alteração nesta função
(Nazario et al., 2015), confirmando o papel normalizador da cafeína.
A cafeína também apresenta efeito dependente da dose consumida. A exposição à
dose aguda média (50mg/L) ocasiona alteração na atividade locomotora do peixe paulistinha,
diminuindo a velocidade média, indicando certo grau de ansiedade conferido pela
administração da substância (Ladu, Mwaffo, Li, Macrì, & Porfiri, 2015). De modo
semelhante, animais expostos à dose alta (85mg/L) de cafeína passam mais tempo no lado
escuro do aquário que os indivíduos controle, indicando grau de ansiedade devido à
administração da substância (Steenbergen, Richardson, & Champagne, 2011). De acordo com
Egan et al. (2009), peixes paulistinha expostos a dose aguda alta de cafeína (100 mg/L)
tiveram o desenvolvimento de comportamento tipo-ansioso, caracterizado pelo aumento na latência para explorar o topo da coluna d’água, somada a diminuição do tempo nessa área.
Quando peixes paulistinha receberam doses de 1μM de cafeína demonstraram
aumento da atividade locomotora (velocidade e distância percorrida), já animais expostos a dose alta de 100μM diminuíram a atividade locomotora (Gupta, Khobragade, Shingatgeri, &
Rajaram, 2014). A abstinência da cafeína é mais branda do que a do álcool, muitas vezes não
indicando fatores relacionados à sua administração. Cachat et al. (2010) demonstraram que
peixe paulistinha em abstinência de cafeína (50 mg/L), não apresenta alteração na sua
atividade locomotora e nem em seus níveis de cortisol. Diferente do álcool que é considerado
uma forte recompensa, Collier et al. (2014) testaram o paradigma de preferência por local
com diferentes doses de cafeína, e observaram que o paulistinha não apresenta
comportamento de busca pela substância, indicando a ausência de um efeito de recompensa
16
O uso combinado de álcool e cafeína
A combinação do consumo de álcool e cafeína tem se tornado cada vez mais popular,
principalmente entre os jovens (Sionaldo E. Ferreira et al., 2004; Marczinski, 2011; O’Brien,
McCoy, Rhodes, Wagoner, & Wolfson, 2008). Esse consumo tem sido feito muitas vezes de
forma desenfreada, podendo acarretar prejuízos para o indivíduo, como diminuição no
julgamento em tomada de decisões, comportamento de risco (violência, comportamento
sexual arriscado), e maior propensão a acidentes (Marczinski, 2011; Oteri, Salvo, Caputi, &
Calapai, 2007; Thombs et al., 2010). Pouco se sabe da ação combinada dessas duas
substâncias no metabolismo, no entanto, cafeína não exerce nenhum efeito sobre o
metabolismo hepático do álcool, consequentemente, não reduz a concentração de álcool no
sangue (Sionaldo Eduardo Ferreira, de Mello, Pompeia, & Souza-Formigoni, 2006). Não
existem estudos que investiguem a ação combinada dessas substâncias no sistema nervoso
central.
Poucos estudos investigam o comportamento sob efeito dessas substâncias e a
maioria desses estudos é desenvolvido em roedores. Com relação ao afeito da combinação na
atividade locomotora, estudos indicam que esse uso pode aumentar os efeitos estimulatórios
iniciais do álcool ou reduzir efeitos depressores posteriores (Heinz, de Wit, Lilje, & Kassel,
2013; Spinetta et al., 2008), podendo levar o indivíduo a consumir mais álcool (Sionaldo
Eduardo Ferreira et al., 2006; Spinetta et al., 2008). Spinetta et al. (2008) observaram que
roedores conseguem reconhecer o odor de outros indivíduos mesmo sob efeito combinado
dessas substâncias, indicando efeito positivo dessa combinação, sugerindo que a cafeína
consegue reverter os efeitos prejudiciais ocasionados pelo álcool. Outro estudo aponta que
roedores machos submetidos à combinação dessas substâncias tiveram aumento do número de
17 Não existem investigações acerca da mistura dessas substâncias no comportamento
do peixe paulistinha, importante modelo em neuroetologia.
Peixe paulistinha como modelo animal
O peixe paulistinha (Danio rerio) é um vertebrado pertencente à classe dos
teleósteos, que surgiu a aproximadamente 350 milhões de anos (Metscher & Ahlberg, 1999).
Esses indivíduos são encontrados em riachos de águas doces e lentas no sul e leste da Ásia,
habitando águas rasas, com temperaturas que variam entre 24ºC a 38ºC (Engeszer, Patterson,
Rao, & Parichy, 2007). Os indivíduos possuem organização do sistema nervoso central
semelhante aos outros vertebrados, tendo o sistema nervoso divido em quatro partes: a medula
espinhal, que está protegida pela coluna vertebral e está localizada na parte mais caudal do
sistema nervoso central, o rombencéfalo, correspondente à parte mais caudal do encéfalo
dentro do crânio, o prosencéfalo, mais rostral e ocupando a maior área no cérebro, e o
mesencéfalo.
Diversos estudos evidenciam o peixe paulistinha como excelente modelo em estudos
translacionais de diversas áreas, por possuírem similaridade significativa com humanos, em
torno de 60-80% (Reimers, Hahn, & Tanguay, 2004; Renier et al., 2007), fazendo dele muitas
vezes um modelo alternativo ao uso de roedores. Esses indivíduos possuem o genoma
totalmente sequenciado (Howe et al., 2013; Silveira et al., 2002; Woods et al., 2000) e
compartilham diversos sistemas de neurotransmissores com mamíferos, como exemplo o
serotonérgico (Rink & Guo, 2004), dopaminérgico (Ma, 2003), glutamatérgico (Edwards &
Michel, 2002), GABAérgico (Nam, Kim, & Lee, 2004), dentre outros. Esses indivíduos
18 (Kimmel, Ballard, Kimmel, Ullmann, & Schilling, 1995). São também considerados modelo
importantes para estudos com drogas, por apresentarem rápida absorção das drogas pelo
sistema nervoso central (Goldsmith, 2004), sem a necessidade de metodologias invasivas e
altamente manipulativas.
Existem hoje cerca de 46.000 estudos realizados com o peixe paulistinha como modelo, de acordo com a plataforma de pesquisa “web of knowledge”
(https://apps.webofknowledge.com/UA_GeneralSearch_input.do?product=UA&SID=4BSQA
XhN9rynOCvHn7b&search_mode=GeneralSearch). Dentre as diversas publicações voltadas
para esse modelo, encontramos abordagem em diversas áreas como biologia do
desenvolvimento (Kimmel et al., 1995; Kishi, 2011; Peng, Zhang, & Meng, 2012), genética
(Hu et al., 2015; Nishimura et al., 2015; Shah, Davey, Whitebirch, Miller, & Moens, 2015),
comportamento (Hu et al., 2015; Niihori et al., 2015; Santos et al., 2016), toxicologia
(Gebauer et al., 2011; Santos et al., 2016; Wu et al., 2009), doenças degenerativas (De Groef,
Dekeyster, & Moons, 2015; Lu et al., 2015; Seto et al., 2015), e desenvolvimento de drogas
terapêuticas (Rubinstein, 2003, 2006)
Objetivo Geral
O objetivo geral desse estudo foi verificar a ação do álcool, cafeína e da combinação
dessas substâncias no comportamento locomotor e no desempenho em tarefa discriminativa
19
Objetivos específicos
Caracterizar o comportamento locomotor ao longo do tempo de exposição do peixe
paulistinha às doses crônicas e agudas de álcool, cafeína e da combinação dessas
substâncias (capítulo 1).
Avaliar os efeitos ansiolíticos e ansiogênicos de doses crônicas e agudas de álcool,
cafeína e da combinação dessas substâncias (capítulo 1).
Averiguar o desempenho do peixe paulistinha em tarefa de reconhecimento de objetos
quando sob efeito crônico e agudo de álcool, cafeína e da combinação dessas
20
(Artigo a ser submetido para a revista Pharmacology, Biochemistry and Behavior) 1
2
Irish Coffee: Behavioral changes induced by alcohol and caffeine in zebrafish
3
Santos, L.C., Oliveira J.R., Oliveira, J.J., Silva, P.F., Luchiari A.C. 4
Departamento de Fisiologia, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio 5
Grande do Norte, PO BOX 1510, 59078-970 Natal, Rio Grande do Norte, Brazil. 6
Phone: +55 84 32153409, Fax: +55 84 32119206, E-mail: [email protected] 7
8
Resumo 9
Enquanto a cafeína é conhecida por estimular o estado de alerta e diminuir a fadiga e 10
a sonolência, o álcool é um grande inibidor do sistema nervosa central. O uso combinado 11
dessas duas substâncias vem crescendo nas últimas décadas, mas pouco se sabe sobre os 12
efeitos desta combinação. Neste sentido, este estudo objetivou caracterizar o efeito de 13
diferentes doses de cafeína e do uso combinado dessas substâncias sobre o comportamento 14
do peixe paulistinha, um modelo animal estabelecido para investigações 15
neurocomportamentais por apresentar respostas comportamentais sólidas e semelhança 16
neuroquímica e fisiológica com mamíferos. Avaliamos a atividade locomotora em termos de 17
velocidade média, distância total percorrida, tempo de freezing e tempo no fundo do tanque 18
durante o período de 60 min do peixe paulistinha sob tratamento agudo, crônico e 19
abstinência de álcool e cafeína. Observamos que a dose média aguda de cafeína e seu uso 20
crônico aumentam a atividade locomotora e diminuem o comportamento tipo-ansioso, 21
enquanto a dose aguda elevada e a cessação do uso continuado provocam elevado 22
comportamento tipo-ansioso. Por outro lado, o uso de dose média de cafeína durante a 23
21
provoca aumento acentuado da ansiedade. O uso de dose aguda de álcool durante a 25
abstinência de cafeína tem papel inverso, aumentando a atividade locomotora conforme a 26
dose, embora o comportamento tipo-ansioso seja ausente. Concluímos que a análise 27
temporal do comportamento é bastante sensível em permitir o estudo de alterações 28
comportamentais decorrentes da exposição ao álcool e à cafeína, e que o peixe paulistinha 29
oferece a oportunidade de estudos comportamentais e neurofisiológicos mais aprofundados 30
para o entendimento dos mecanismos de ação de drogas de uso indiscriminado pela 31
sociedade. 32
33
Palavras-chave: Atividade locomotora, álcool, cafeína, peixe paulistinha.
34
22
1. Introdução 36
Álcool e cafeína são substâncias psicoativas largamente consumidas pela população 37
(Fredholm et al., 1999; Goetzel et al., 2003; Gerlai, 2010). Ambas as drogas têm efeitos 38
sobre o sistema nervoso central pela interferência em uma gama de vias moleculares (Nehlig 39
et al., 1992; Hyman e Malenka, 2001; Vengeliene et al., 2008); o consumo excessivo de 40
qualquer destas substâncias pode levar ao desenvolvimento de tolerância, que pode ser 41
observada comportamentalmente (Ocakçioglu et al., 1998; Arias et al., 2012; Tran e Gerlai, 42
2013). Atualmente, estas drogas vêm sendo usadas em associação, e mais comumente o 43
consumo de cafeína é feito em busca de suas ações estimulantes para minimizar os efeitos 44
depressores do álcool após consumo excessivo. 45
O álcool é a droga de abuso legalmente comercializada mais difundidas em nossa 46
sociedade (Ferreira e Willoughby, 2008; National Institute on Alcohol Abuse and 47
Alcoholism, 2008), com alto potencial aditivo. Sabe-se que sua ingestão em doses baixas 48
está associada com a boa saúde física e mental (Weyerer et al., 2011; Chacon e Luchiari, 49
2014), ao contrário, o uso agudo ou crônico de altas doses pode provocar grandes prejuízos 50
às funções fisiológicas e cognitivas (Obernier et al., 2002; Rosenbloom e Pfefferbaum, 51
2004; Crews e Nixon, 2009; Beveridge et al., 2013; Spinello et al., 2013; Luchiari et al., 52
2015). Já a cafeína, muito menos associada a danos sistêmicos, quando usada em baixas 53
doses aumenta a frequência cardiorespiratória, acelera o metabolismo e o estado de alerta, e 54
diminui o cansaço e a fadiga (Braga e Alves, 2000; De Luca et al., 2007). No entanto, seu 55
uso indiscriminado pode causar problemas cardiovasculares, insônia e transtornos de 56
ansiedade (Striley et al., 2011). 57
As duas drogas apresentam efeito bifásico: por exemplo, doses baixas de álcool e 58
23
aumentam a agressividade (Wilson et al., 2000; Gerlai et al., 2000), aceleram a tomada de 60
decisão (Killgore et al., 2007; Anderson et al., 2011) e melhoram o desempenho em tarefas 61
cognitivas (Angelucci et al., 2002; Chacon e Luchiari, 2014; Luchiari et al., 2015), enquanto 62
doses altas diminuem a locomoção (Tran e Gerlai, 2013; Halldner et al., 2004), causam 63
efeitos gerais depressores (Marin et al., 2011; Rosemberg et al., 2012), prejudicam a 64
formação de memoria (Santos et al., 2016) e o desenvolvimento normal do animal 65
(Rodriguez et al., 2014). Entretanto, esses efeitos dependem do tempo de exposição à droga: 66
o consumo diário e por longos períodos ocasiona o desenvolvimento de tolerância (Tran e 67
Gerlai, 2013; Tran et al., 2015; Luchiari et al., 2015), e a exposição aguda provoca 68
sensibilização, ou seja, doses menores passam a provocar efeitos similares àqueles de doses 69
elevadas nos próximos contatos com a droga (Blaser et al., 2010). Neste sentido, o estudo 70
dos efeitos do álcool e da cafeína no comportamento, tanto em separado quanto em 71
associação, permitirá a investigação dos mecanismos que embasam a ação destas drogas. 72
O peixe paulistinha é considerado modelo para estudos com drogas pela facilidade de 73
administração (Gerlai et al., 2000), alta homologia genética com seres humanos (Crollius e 74
Weissenbach, 2005) e similaridade do sistema nervoso central com mamíferos (Barbazuk et 75
al., 2000; Collier e Echevarria, 2013), o que permite que os resultados de pesquisas sejam 76
translacionais para doenças humanas (Kolb e Whishaw, 1998; Klee et al., 2012). O estudo 77
de Tran e Gerlai (2013) utilizou o paulistinha para caracterizar os efeitos do álcool em 78
diversas doses e tempos de exposição, mostrando mudanças temporais nos padrões de 79
natação avaliados. Embora diversos estudos sobre os efeitos do álcool no comportamento 80
tenham sido conduzidos, não há relatos sobre a caracterização comportamental dos efeito de 81
cafeína ou da combinação álcool-cafeína. Além disso, não se sabe o quanto doses elevadas 82
24
da tolerância ou sensibilização. A combinação dessas duas drogas é amplamente utilizada 84
pela sociedade, e o presente estudo avalia esta questão. Apresentamos a caracterização 85
temporal detalhada das alterações comportamentais durante a fase aguda de contato com as 86
drogas, concomitante ou não com o uso crônico prévio tanto de álcool quanto de cafeína. 87
Abordamos também a cessação do uso das drogas, visando observar as principais alterações 88
da primeira fase da abstinência. 89
90
2. Materiais e métodos 91
2.1. Procedimentos gerais 92
Peixes paulistinha (Danio rerio) adultos (4 a 5 meses) adquiridos em fazenda de 93
criação local (Natal-RN) foram transferidos para o biotério do Laboratório de Peixes 94
Ornamentais (Departamento de Fisiologia da UFRN) e estocados em tanques (80x25x40cm, 95
50 L) dispostos em sistema de recirculação de água com filtragem mecânica, biológica e 96
química e desinfecção através de luz UV. A temperatura da água permaneceu em 28ºC, o pH 97
em 7,1 e o fotoperíodo adotado foi 12C:12E (claro: escuro). A alimentação ocorreu duas 98
vezes ao dia com Artêmia salina e ração comercial peletizada (38% proteína e 4% lipídeo, 99
Nutricom Pet). 100
Para o tratamento com as drogas, os animais foram transferidos para aquários 101
(50x30x30cm; 30L) sem filtração e recirculação, e a água foi trocada diariamente para 102
assegurar sua qualidade e manter as concentrações desejadas das drogas. A aeração de cada 103
aquário foi mantida com pedras porosas. A qualidade da água, composição química e 104
temperatura foram mantidas as mesmas das condições de estoque, tanto na fase de exposição 105
às drogas quanto na fase de avaliação comportamental. 106
25
aprovadas pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA n° 045/2015) da UFRN. 108
2.2. Administração de drogas 109
Após a transferência para aquários de 30L, dos animais foram mantidos sem drogas 110
por 5 dias para aclimatação as condições dos aquários. Nesse período, apenas 50% da água 111
foi trocada diariamente. Em seguida, a submissão às drogas teve inicio e foi feita de forma 112
contínua (24h/dia). Empregamos o protocolo 2x3 baseado em Tran e Gerlai (2013), com 113
duas doses crônicas (0mg/L e 50mg/L) e três doses agudas (0mg/L, 50mg/L e 100mg/L) 114
para os tratamentos exclusivos com cafeína. Para os grupos que receberam a combinação de 115
álcool e cafeína, modificamos o protocolo para 2X2, duas doses crônicas e duas agudas, nas 116
quais dois grupos receberam cafeína crônica e álcool agudo e outros dois grupos receberam 117
álcool crônico e cafeína aguda. As doses de cafeína e de álcool foram ministradas de forma 118
gradual para evitar mortalidade dos animais e lentamente tornar o peixe aclimatado às 119
concentrações finais das drogas (Tran e Gerlai, 2013). 120
A administração crônica durou 27 dias e a concentração final foi mantida em 50mg/L 121
de cafeína e 0,50% de álcool. Assim, inicialmente os peixes foram alojados em 12mg/L de 122
cafeína ou 0,125% de álcool durante os dias 1-4, em seguida a dose foi aumentada para 123
25mg/L de cafeína ou 0,250% de álcool para os dias 5-8, foi novamente aumentada para 124
35mg/L de cafeína ou 0,375% de álcool nos dias 9-12, e subsequentemente foi aumentada 125
para 50mg/L de cafeína ou 0,50% de álcool e mantida pelo restante do período de exposição 126
crônica (dias 13-27). 127
No 28º dia, os peixes foram individualmente expostos a uma das doses de cafeína 128
aguda (00, 50 ou 100 mg/L) ou álcool agudo (0.00, 0.50 ou 1.00%) em um tanque de 30L, 129
durante 60 min. Nesse período, o comportamento dos peixes foi registrado individualmente. 130
26
quais nos referimos considerando C para a concentração crônica e A para a concentração 132
aguda, como se segue: C00A00 (n=10), C00A50 (n=11), C00A100 (n=11), C50A00 (n=12), 133
C50A50 (n=10), C50A100 (n=7). 134
O delineamento 2×2 com álcool e cafeína permitiu a formação de 4 grupos 135
experimentais, aos quais nos referimos considerando C para a concentração crônica (Cc
136
concentração crônica de cafeína e Ca concentração crônica de álcool) e A para a
137
concentração aguda (Ac concentração aguda de cafeína e Aa concentração aguda de álcool),
138
como se segue: Cc50Aa0.50 (n=10), Cc50Aa1.00 (n=13), Ca0.5Ac50 (n=10), Ca0.5Ac100
139
(n=10). 140
2.3. Registro do comportamento 141
No 28º dia de submissão às drogas, os peixes foram individualmente expostos à dose 142
aguda de cafeína ou álcool (acima descrito) durante 1 hora e o comportamento dos animais 143
foi registrado em vídeo (Sony Digital Vídeo Câmera Recorder; DCR-SX45). Os arquivos de 144
vídeo foram transferidos e analisados utilizando o software ZebTrack desenvolvido em 145
MatLab (Pinheiro-da-Silva et al., unpublished results). Para caracterização dos efeitos das 146
drogas nos indivíduos, foram considerados os seguintes parâmetros: velocidade média de 147
natação, distância total percorrida, tempo em freezing. ocupação da região do fundo do 148
aquário (entre 0 e 6 cm da base do tanque). 149
2.4. Análises estatísticas 150
Foram realizadas análises iniciais de normalidade e homoscedasticidade dos dados. A 151
análise temporal, ao longo dos 60 min, foi realizada utilizando Anova para medidas 152
repetidas (RM Anova) para cada grupo experimental. Todos os parâmetros locomotores 153
(velocidade média, distância total percorrida, freezing e tempo de permanência no fundo do 154
27
seguida de Teste post hoc Tukey HSD para identificar diferenças entre os grupos. RM 156
Anova foi utilizada para comparar os três blocos de tempo (0-20, 21-40, 41-60 min) dentro 157
de cada grupo. Realizamos Anova Two Way para comparar o efeito das substâncias ao 158
longo dos três blocos de tempos. Para todos os testes, adotamos o nível de significância de 159
5%. 160
161
3. Resultados 162
3.1. Tratamento com cafeína 163
A análise da velocidade média sugere que a cafeína tem efeito temporal neste 164
comportamento (Fig. 1). Houve efeito dos grupos (Anova Two Way, F=31,54; p<0,001) sob 165
os comportamentos. Não houve efeito do tempo (Anova Two Way, F=0,62; p=0,54), nem do 166
tempo sob os grupos (Anova Two Way, F=0,47; p=0,87). A análise por RM Anova 167
confirmou estas observações e mostrou efeito significativo do tratamento com dose média 168
aguda de cafeína - C00A50 (F=2.66, p<0.001) e do tratamento crônico com cafeína - 169
C50A50 (F=1.83, p<0.001). O grupo controle teve resultado inverso àquele do grupo sob 170
tratamento crônico (RM Anova, F=3.54, p<0.001). A trajetória temporal dos grupos sob 171
tratamento agudo alto de cafeína (C00A100), abstinência (C50A00) e aumento agudo da 172
dose (C50A100) não foi significativo (RM Anova, C00A100: F=0.90, p=0.62; C50A00: 173
F=0.94 p=0.60; C50A100: F=1.09, p=0.31). A análise das médias dos intervalos de 20 min 174
mostrou que o tratamento agudo de 50mg/l (C00A50) tem efeito significativo no aumento da 175
velocidade média entre 20 e 40 min da exposição (RM Anova, F=4.17, p=0.03) e o efeito do 176
uso continuado de cafeína foi inverso ao grupo controle, com menor velocidade nos 20 min 177
iniciais da observação (RM Anova, C00A00: F=9.55, p=0.002; C50A50: F= 7.27, p=0.006). 178
28
F=0.06, p=0.94; C50A00: F=1.88, p=0.18; C50A100: F=0.46, p=0.64). O teste post hoc de 180
Tukey HSD feito em busca de diferenças entre os grupos indicou que houve diferença 181
significativa (p<0.05) entre C50A100 em relação a C00A50, C00A100 e C50A00, e o grupo 182
C50A50 diferiu significativamente dos grupos C00A50 e C00A100. 183
Nós também avaliamos a distância total percorrida nos 60 min de análise (Fig. 2). 184
Este parâmetro é calculado a partir da localização central do animal em relação à amostra 185
imediatamente anterior, e indica a quantidade de deslocamento do indivíduo. O padrão geral 186
de variação de deslocamento parece similar aos resultados encontrados para velocidade 187
média. Houve efeito dos grupos (Anova Two Way, F=22,69; p<0,001) sob os 188
comportamentos. Não houve efeito do tempo (Anova Two Way, F=0,49; p=0,62), nem do 189
tempo sob os grupos (Anova Two Way, F=0,30; p=0,96). A RM Anova detectou efeito 190
temporal significativo nos grupos tratados com cafeína aguda 50mg/L (F=2.46, p<0.001) e 191
cafeína crônica (F=1.84, p<0.001). O grupo controle apresentou maior distância percorrida 192
nos 20 min iniciais e diminuição deste comportamento no restante do tempo (RM Anova, 193
F=3.40, p<0.001). A mesma análise não indicou diferença temporal para os outros grupos 194
(C00A100: F= 0.91, p=0.67; C50A00: F=1.16, p=0.20; C50A100: F=0.96, p=0.56). 195
A comparação entre os blocos de 20 min indicou haver diferença significativa no 196
grupo controle (RM Anova, F=10.02, p=0.002) e no tratamento crônico com cafeína (RM 197
Anova, F=7.27, p=0.006), o controle com maior distancia percorrida nos 20 min iniciais e o 198
grupo crônico com decréscimo do deslocamento no tempo. Os outros grupos não mostraram 199
diferença entre intervalos de tempo (RM Anova, C00A50: F=3.39, p=0.056; C0A100: 200
F=0.08, p=0.92; C50A00: F=1.43, p=0.26; C50A100: F=0.46, p=0.64). O teste post hoc de 201
Tukey HSD entre os grupos mostrou que apenas o grupo C50A100 diferiu do grupo controle 202
29
Fig. 1. Velocidade média dos grupos expostos a tratamento com cafeína ao longo de intervalo de 60
204
min. A letra C representa exposição crônica e os valores que seguem são as concentrações da cafeína utilizadas
205
(00 e 50mg/L). A letra A representa exposição aguda de cafeína e os valores que seguem são as concentrações
206
de cafeína usadas (00, 50 e 100mg/L). Os gráficos (a) C00A00 (n=9), (c) C00A50 (n=10), (e) C00A100
207
(n=10), (g) C50A00 (n=11), (i) C50A50 (n=9) e (k) C50A100 (n=9) apresentam velocidade média minuto a
208
minuto ± SEM (RM Anova, resultados estatísticos vide texto). Os gráficos (b), (d), (f), (h), (j) e (l)
209
representam a comparação entre os três blocos de tempo de velocidade média ± SEM (0-20, 21-40, 41-60min).
210
Letras minúsculas indicam diferença estatística entre os blocos de tempo (Rm Anova, p<0.05).
211 212
0 10 20
30 (a) C00A00 (b) C00A00
b
a a
0 10 20
30 (c) C00A50 (d) C00A50
b a
a
0 10 20
30 (e) C00A100 (f) C00A100
0 10 20
30 (g) C50A00 (h) C50A00
(i)C50A50 (j) C50A50
a b b
0 10 20 30
1 min - time intervals (k)C50A100
0 10 20 30 40 50
60 0-20min 21-40min 41-60min
20 min - time intervals (l) C50A100
Ave
ra
g
e spee
d
(c
m/
30
(p<0.001). Já o grupo C50A50 diferiu dos grupos C00A50 (p<0.001) e do grupo 213
C00A100 (p=0.01). 214
O comportamento de freezing foi avaliado como indicador de estresse/ansiedade. 215
Este parâmetro parece ser afetado pelo tratamento com cafeína (Fig. 3). Houve efeito dos 216
grupos (Anova Two Way, F=22,04; p<0,001) sob os comportamentos. Não houve efeito do 217
tempo (Anova Two Way, F=0,41; p=0,66), nem do tempo sob os grupos (Anova Two Way, 218
F=0,47; p=0,87). A RM Anova da trajetória temporal minuto a minuto demonstrou efeito 219
significativo da dose aguda média (50mg/L) e alta (100mg/L) de cafeína (C00A50: F=1.80, 220
p<0.001; C00A100: F=2.67, p<0.001), do pré-tratamento com cafeína e retirada da droga 221
(F=1.65, p<0.002) e do pré-tratamento com aumento da dose de forma aguda (F=2.32, 222
p<0.001). A análise dos outros grupos não indicou diferença significativa na trajetória 223
temporal (C00A00: F=0.63, p=0.99; C50A50: F=0.98, p=0.51). Quando analisamos as 224
médias de blocos de 20 min para o comportamento de freezing, a RM Anova mostrou haver 225
diferença significativa com alto freezing nos 20 min iniciais do grupo que recebeu dose 226
crônica de cafeína (F=6.14, p=0.01) e aumento progressivo do freezing nos 3 blocos de 227
tempo para o grupo em abstinência de cafeína (F=4.28, p=0.02). Os outros grupos não 228
apresentaram diferença entre os blocos de 20 min (RM Anova, C00A00: F=0.21, p=0.81; 229
C00A50: F=2.75, p=0.09; C00A100: F=0.19, p=0.83; C50A100: F=0.11, p=0.89). O teste 230
post hoc de Tukey HSD em busca de diferenças entre os grupos para cada intervalo de 20 231
min demonstrou que o grupo em abstinência de cafeína difere dos grupos controle e 232
tratamento crônico com cafeína nos intervalos de 20 a 40 min (p<0.05) e 40 a 60 min 233
(p<0.05), mas não ha diferença entre os grupos nos 20 min inicias da observação (p>0.05). 234
235
31
Fig. 2. Distância total percorrida dos grupos expostos à cafeína ao longo de intervalo de 60 min. A
237
letra C representa exposição crônica a cafeína e os valores que segue são as concentrações utilizadas (00 e
238
50mg/L). A letra A representa exposição aguda de cafeína e os valores que seguem são as concentrações
239
utilizadas (00, 50 e 100mg/L). Os gráficos (a) C00A00 (n=9), (c) C00A50 (n=10), (e) C00A100 (n=10), (g)
240
C50A00 (n=11), (i) C50A50 (n=9) e (k) C50A100 (n=9) apresentam distância total percorrida minuto a minuto
241
± SEM (RM Anova, Resultados estatísticos vide texto). Os gráficos (b) C00A00 (n=9), (d) C00A50 (n=10), (f)
242
C00A100 (n=10), (h) C50A00 (n=11), (j) C50A50 (n=9) e (l) C50A100 (n=9) representam comparação entre
243
os três blocos de tempo de distância total percorrida ± SEM (0-20, 21-40, 41-60min). Letras minúsculas
244
indicam diferença estatística entre os blocos de tempo RM Anova, p<0.05).
245
0 500 1000
1500 (a) C00A00 (b) C00A00
b a a
0 500 1000
1500 (c) C00A50 (d) C00A50
0 500 1000
1500 (e) C00A100 (f) C00A100
0 500 1000
1500 (g) C50A00 (h) C50A00
0 500 1000
1500 (i) C50A50 (j) C50A50
a
b b
0 500 1000 1500
1min - time intervals (k) C50A100
0 10 20 30 40 50 60
0-20min 21-40min 41-60min 20 min- time intervals (l) C50A100
Tota
l di
stanc
e tra
v
eled (
32 246
Fig. 3. Tempo de freezing dos grupos expostos à cafeína ao longo de intervalo de 60 min. A letra C
247
representa exposição crônica e os valores que seguem são as concentrações da cafeína utilizadas (00 e
248
50mg/L). A letra A representa exposição aguda de cafeína e os valores que seguem são as concentrações da
249
cafeína utilizadas (00, 50 e 100mg/L). Os gráficos (a) C00A00 (n=9), (c) C00A50 (n=10), (e) C00A100
250
(n=10), (g) C50A00 (n=11), (i) C50A50 (n=9) e (k) C50A100 (n=9) apresentam freezing minuto a minuto ±
251
SEM (RM Anova, Resultados estatísticos vide texto). Os gráficos (b), (d), (f), (h), (j) e (l) representam
252
comparação entre os três blocos de tempo de freezing ± SEM (0-20, 21-40, 41-60 min). Letras minúsculas
253
indicam diferença estatística entre os blocos de tempo (RM Anova, p<0.05).
254 255
0 20
40 (a) C00A00 (b) C00A00
0 20
40 (c) C00A50 (d)C00A50
0 20
40 (e) C00A100 (f)C00A100
0 20
40 (g) C50A00 (h)C50A00
b a
c
0 20
40 (i) C50A50 (j)C50A50
a a b
0 20 40
1 min - time intervals (k) C50A100
0 10 20 30 40 50 60
0-20min 21-40min 41-60min 20 min - time intervals (l)C50A100
F
re
ez
33
Adicionalmente, medimos também o tempo que os animais de cada grupo 256
experimental permaneceram próximos ao fundo do tanque. Este tempo pode também ser um 257
parâmetro comportamental sensível aos efeitos da cafeína, pois depende do nível de medo e 258
da função motora dos animais (Rosemberg et al. 2012). A RM Anova demonstrou que 259
apenas os grupos C00A50 e C50A50 apresentaram diferença ao longo dos 60 minutos de 260
observação (C00A00: F=1.33, p=0.06; C00A50: F=3.24, p<0.001; C00A100: F=1.28, 261
p=0.09; C50A00: F=0.76, p=0.91; C50A50: F=2.95, p<0.001; C50A100: F=1.06, p=0.38). 262
A comparação do tempo médio total de permanência na parte inferior do tanque através de 263
Anova identificou diferença entre os grupos (F=11.44, p<0.001), sendo os grupos de 264
tratamento agudo alto (100mg/l) e pré-tratamento com aumento da dose (C50A100) que 265
tiveram os maiores tempos na área do fundo, e o grupo controle o menor tempo (Fig. 4). 266
267
268
Fig 4. Tempo médio ±SEM de permanência no fundo do tanque pelos grupos expostos à cafeína. A
269
letra C representa exposição crônica e os valores que seguem são as concentrações da cafeína utilizadas (00 e
270
50mg/L). A letra A representa exposição aguda de cafeína e os valores que seguem são as concentrações da
271
cafeína usadas (00, 50 e 100mg/L). Letras minúsculas indicam diferença estatística entre os grupos (One Way
272 Anova, p<0.05). 273 274 275 276 0 10 20 30 40 50
C00A00 C00A50 C00A100 C50A00 C50A50 C50A100
34
3.2. Tratamento com álcool e cafeína 277
A análise de velocidade média indicou que o tratamento com combinação das 278
substâncias (álcool e cafeína) exerce efeito temporal neste comportamento (Fig. 5). Houve 279
efeito dos grupos (F=9,74; p<0,001) e dos grupos sob o tempo (F=4,20; p<0,001) nos 280
comportamentos. Não houve efeito do tempo (F=0,08; p=0,92). A análise por RM Anova 281
mostrou que o grupo Ca0.50Ac50 (F=2.66, p<0.001) apresentou variação significativa da
282
velocidade média ao longo dos 60min de análise. Os grupos Ca0.50Ac100, Cc50Aa0.50 e
283
Cc50Aa1.00 não apresentaram diferença de velocidade média na trajetória temporal (RM
284
Anova, Ca0.50Ac100: F=1.13, p=0.26; Cc50Aa0.50: F=0.90, p=0.68; Cc50Aa1.00: F=0.94,
285
p=0.60). Houve diferença significativa entre as médias de blocos de 20 min para a 286
velocidade média apenas no grupo Ca0.50Ac50 (RM Anova, F=3.58, p=0.04; Fig. 5b),
287
enquanto os outros grupos não tiveram diferenças significativas (RM Anova, Ca0.50Ac100:
288
F=0.36, p=0.70; Cc50Aa0.50: F=0.82, p=0.45; Cc50Aa1.00: F=0.34, p=0.72). O teste post
289
hoc de Tukey HSD entre os grupos mostrou que apenas o grupo Ca0.50Ac50 diferiu
290
significantemente (p<0.05) de todos os outros grupos. 291
Para a distância total percorrida, houve efeito dos grupos (Anova Two Way, F=9,67; 292
p<0,001) e dos grupos sob o tempo (Anova Two Way, F=3,98; p<0,001) nos 293
comportamentos. Não houve efeito do tempo (Anova Two Way, F=0,18; p=0,84). 294
Novamente apenas o grupo Ca0.50Ac50 apresentou diferença ao longo dos 60 minutos (RM
295
Anova, Ca0.50Ac50 F=1.44, p=0.002, Fig.6a). Os grupos Ca0.50Ac100, Cc50Aa0.50 e
296
Cc50Aa1.00 não apresentaram diferença significativa na trajetória temporal (RM Anova,
297
Ca0.50Ac100: F=1.12, p=0.28; Cc50Aa0.50: F=0.94, p=0.6; Cc50Aa1.00: F=0.99, p=0.51).
298
Apenas o grupo Ca0.50Ac50: mostrou diminuição da distância percorrida nos 20 min
299
35
Fig. 5. Velocidade média dos grupos expostos a tratamento com álcool e cafeína ao longo de intervalo
301
de 60 min. A letra C representa exposição crônica ao álcool (Ca) ou cafeína (Cc) e os valores que seguem são as
302
concentrações de álcool (0.50%) ou cafeína (50mg/L) utilizadas. A letra A representa exposição aguda ao
303
álcool (Aa) ou cafeína (Ac) e os valores que seguem correspondem as concentrações de álcool (0.50% e 1.00%)
304
ou cafeína (50 mg/L e 100 mg/L) usadas. Os gráficos (a) Ca0.50Ac50 (n=9), (c) Ca0.50Ac100 (n=7), (e)
305
Cc50Aa0.50 (n=10), e (g) Cc50Aa1.00 (n=10) apresentam a velocidade média minuto a minuto ± SEM (RM
306
Anova, Resultados estatísticos vide texto). Os gráficos (b) Ca0.50Ac50, (d) Ca0.50Ac100, (f) Cc50Aa0.50, (h)
307
Cc50Aa1.00 representam comparação entre os três blocos de tempo de velocidade média ± SEM (0-20, 21-40,
308
41-60 min). Letras minúsculas indicam diferença estatística entre os blocos de tempo (RM Anova, p<0.05).
309 310
Não houve diferença significativa entre os grupos Ca0.50Ac100, Cc50Aa0.50 e
311
Cc50Aa1.00 na comparação entre os intervalos de 20min de observação (RM Anova,
312
Ca0.50Ac100: F=0.16, p=0.84; Cc50Aa0.50: F=1.10, p=0.35; Cc50Aa1.00: F=0.46, p=0.64).
313
O teste post hoc de Tukey HSD entre os grupos mostrou que o grupo Ca0.50Ac50 diferiu
314
0 30
60 (a) Ca0.5Ac50 (b) Ca0.5Ac50
b b
a
0 30
60 (c) Ca0.5Ac100 (d) Ca0.5Ac100
0 30
60 (e) Cc50Aa0.50 (f) Cc50Aa0.50
0 30 60
1min - time intervals (g) Cc50Aa1.00
0 10 20 30 40 50 60
0-20min 21-40min 41-60min 20 min - time intervals (h) Cc50Aa1.00
Ave
ra
g
e spee
d
(c
m/
36
significantemente (p<0.05) de todos os outros grupos, sendo os outros grupos (Ca0.50Ac100,
315
Cc50Aa0.50 e Cc50Aa1.00) semelhantes entre si (p<0.05).
316
Nos resultados de freezing, houve efeito dos grupos (Anova Two Way, F=2,55; 317
p=0,04) e dos grupos sob o tempo (Anova Two Way, F=4,18; p<0,001) nos 318
comportamentos. Não houve efeito do tempo (Anova Two Way, F=0,33; p=0,72). Os grupos 319
Ca0.50Ac50, Ca0.50Ac100 e Cc50Aa1.00 apresentaram diferença significativa ao longo dos
320
60min de observação (RM Anova, Ca0.50Ac50: F=1.44, p=0.02; Ca0.50Ac100: F=1.77,
321
p<0.001; Cc50Aa1.00 F=1.55, p=0.007, Fig. 7). O grupo Cc50Aa0.50 não apresentou
322
diferença significativa na trajetória temporal (RM Anova, F=1.01, p=0.46). Não houve 323
diferença significativa entre os grupos nos intervalos de 20min de observação (RM Anova, 324
Ca0.50Ac50: F=13.41, p=0.29; Ca0.50Ac100: F=0.62, p=0.56; Cc50Aa0.50: F=4.20, p=0.12;
325
Cc50Aa1.00: F=0.09, p=0.91). O teste post hoc de Tukey HSD entre os grupos mostrou que
326
o grupo Ca0.50Ac100 diferiu significantemente (p<0.05) dos outros grupos.
327
Quanto ao tempo de permanência no fundo do tanque, a RM Anova indicou que o 328
grupo Ca0.50Ac50 diferiu significativamente durante a trajetória temporal, enquanto os
329
outros grupos não diferiram (Ca0.50Ac50: F=1.95, p<0.001; Ca0.50Ac100: F=1.28, p=0.95;
330
Cc50Aa0.50: F=0.74, p=0.93; Cc50Aa1.00: F=0.73, p=0.93). O tempo médio total de
331
permanência na parte inferior do tanque não diferiu entre os grupos (Anova, F=0.57, 332
p=0.69). 333
334
37
Fig. 6. Distância total percorrida dos grupos expostos a tratamento com álcool e cafeína ao longo de
336
intervalo de 60 min. A letra C representa exposição crônica ao álcool (Ca) ou cafeína (Cc) e os valores que
337
seguem são as concentrações de álcool (0.50%) ou cafeína (50mg/L) utilizadas. A letra A representa exposição
338
aguda ao álcool (Aa) ou cafeína (Ac) e os valores que seguem correspondem as concentrações de álcool (0.50%
339
e 1.00%) ou cafeína (50 mg/L e 100 mg/L) usadas. Os gráficos (a) Ca0.50Ac50 (n=9), (c) Ca0.50Ac100 (n=7),
340
(e) Cc50Aa0.50 (n=10), e (g) Cc50Aa1.00 (n=10) apresentam a distância total percorrida minuto a minuto ±
341
SEM (RM Anova, Resultados estatísticos vide texto). Os gráficos (b) Ca0.50Ac50, (d) Ca0.50Ac100, (f) 342
Cc50Aa0.50, (h) Cc50Aa1.00 representam comparação entre os três blocos de tempo da distância total 343
percorrida ± SEM (0-20, 21-40, 41-60min). Letras minúsculas indicam diferença estatística (p<0.05) entre os
344
blocos de tempo (RM Anova, p<0.05).
345 346
0 1000 2000
3000 (a) Ca0.5Ac50 (b) Ca0.5Ac50
b b
a
0 1000 2000
3000 (c) Ca0.5Ac100 (d) Ca0.5Ac100
0 1000 2000
3000 (e) Cc50Aa0.5 (f) Cc50Aa0.50
0 1000 2000 3000
1min - time intervals (g) Cc50Aa1.0
0 10 20 30 40 50 60 0-20min 21-40min 41-60min
20 min - time intervals (h) Cc50Aa1.00
Tota
l di
stanc
e tra
v
eled (
