INFILTRADO INFLAMATÓRIO EM GLÂNDULAS SALIVARES MENORES E AMOSTRAS HEPÁTICAS DE PACIENTES COM HEPATITE C CRÔNICA: PADRÃO DE DISTRIBUIÇÃO
E IMUNOFENÓTIPO.
FACULDADE DE ODONTOLOGIA UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INFILTRADO INFLAMATÓRIO EM GLÂNDULAS SALIVARES MENORES E AMOSTRAS HEPÁTICAS DE PACIENTES COM HEPATITE C CRÔNICA: PADRÃO DE DISTRIBUIÇÃO
E IMUNOFENÓTIPO.
Tese apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Odontologia - área de concentração em Patologia Bucal.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Maria Auxiliadora Vieira do Carmo.
FACULDADE DE ODONTOLOGIA UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
Este trabalho é dedicado aos meus pais, Cida e Antônio, ao meu irmão, Antônio Jr.
Aos meus pais, por serem as fontes incessantes de amor e de exemplos a seguir. Ao meu irmão, pelo carinho, cuidado e pelo exemplo de determinação e coragem.
Ao meu marido, por me ensinar amorosamente o dom da paciência e da bondade cotidianas. À família e amigos, sempre presentes, companheiros indispensáveis.
À Professora Dorinha, pela amizade, por todos os momentos partilhados, pelos valiosos ensinamentos, pelo apoio, incentivo e compreensão.
À Professora Cássia, pelo exemplo de dedicação, pela amizade e apoio.
À Professora Tarcília pela parceria, convivência, ensinamentos e pela valiosa contribuição no exame de Qualificação.
Aos Professores Ricardo Mesquita, Ricardo Gomez e Vagner Santos, pelos ensinamentos. Ao Professor Paulo Alencar, pelas considerações pertinentes e relevantes no exame de Qualificação.
Às Professoras Paula Vidigal (Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais) e Aline Batista (Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Goiás), pela contribuição no trabalho.
À aluna Karla, pela participação na pesquisa e pelos bons momentos partilhados. Às funcionárias do CPC, pelos anos de convivência agradável.
Aos alunos para os quais pude lecionar durante os dois anos como professora substituta, por me inspirarem e por me tornarem uma profissional mais madura e completa.
Aos pacientes, razão de nossa busca constante pelo conhecimento.
“A verdadeira excitação do que você está fazendo é o ato de fazê-lo. Não é o que você vai conseguir fazer no final – não é a cortina final – é realmente o fazer e amar o que está fazendo”.
responsável por cirrose e transplante hepático no mundo Ocidental. É causada pelo vírus da hepatite C, sendo a inflamação hepática uma das consequências da infecção. Dentre as alterações consideradas extra-hepáticas ligadas às glândulas salivares, a síndrome sicca afeta 4 a 57% dos pacientes. No entanto, poucos estudos buscaram esclarecer a composição do infiltrado inflamatório glandular e sua possível relação com outras características da doença. O presente estudo objetivou caracterizar a composição e a distribuição do infiltrado inflamatório presente em glândulas salivares menores de pacientes portadores de hepatite C crônica, comparando com o infiltrado presente em fígado e com dados laboratoriais dos pacientes. Foi realizada técnica de imunoistoquímica para CD3 (linfócitos T), CD20 (linfócitos B), CD8 (linfócitos T citotóxicos), CD4 (linfócitos T helper), CD57 (células natural killer), CD68 (macrófagos) e S100 (células dendríticas) em 61 amostras de glândulas salivares e 59 de fígado. Os resultados foram expressos em porcentagem de células positivas. Quanto ao padrão de distribuição, o infiltrado inflamatório foi classificado em focal ou difuso. Testes estatísticos Kruskal-Wallis, Mann-Whitney, ANOVA e “t” de Student foram empregados e valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significantes. O infiltrado inflamatório apresentou distribuição difusa em 57,4% das glândulas e 13,6% de fígado. Células CD3+ e CD20+ foram as mais frequentes em ambos os tecidos, com razão CD3/CD20 de 1,17 em glândula e 1,90 em fígado. A razão CD4/CD8 em glândula foi 0,30 e em fígado, 1,06. Células CD57+, CD68+ e S100+ representaram baixa porcentagem em ambos os tecidos. Índices maiores de CD3+, CD20+ e CD8+ (p<0,05) foram encontrados no infiltrado glandular focal, quando comparado com difuso. Comparações entre todos os índices em glândula salivar e grau METAVIR (A0, A1 ou A2), genótipo viral (1a, 1b ou 3a), carga viral (baixa ou alta) e presença de HCV RNA na glândula (presente ou ausente) não revelaram significância estatística (p>0,05). Todas as comparações entre os índices de glândula salivar e fígado mostraram significância estatística (p<0,05), com todos os marcadores, exceto S100+, apresentando índices maiores em fígado. Concluiu-se que o infiltrado inflamatório presente em glândulas salivares de pacientes com hepatite C crônica é composto principalmente por linfócitos T e B, destacando-se os linfócitos T citotóxicos. A porcentagem dos subtipos leucocitários presentes em glândula salivar está relacionada ao seu padrão de distribuição, mas não ao grau METAVIR, genótipo, carga viral e presença local do vírus. Os mesmos tipos celulares observados no infiltrado inflamatório do fígado podem ser visualizados nas glândulas, exceto os linfócitos T helper, que são escassos neste tecido, porém o fígado apresenta maior proporção de células.
Chronic hepatitis C affects over 3% of global population and has become the major cause of cirrhosis and hepatic transplantation in Occidental world. It is caused by the hepatitis C virus and hepatic inflammation is one of the consequences of the infection. Among extra-hepatic alterations related to salivary glands, sicca syndrome affects between 4 and 57% of patients. Nevertheless, few studies intended to elucidate the composition of the inflammatory infiltrate and its possible relation to other features of the disease. The present study aimed to characterize the composition and distribution of the inflammatory infiltrate seen in minor salivary glands of patients with chronic hepatitis C, comparing with liver inflammation and laboratorial data of patients. Immunohistochemistry was performed to CD3 (T lymphocytes), CD20 (B lymphocytes), CD8 (cytotoxic T lymphocytes), CD4 (helper T lymphocytes), CD57 (natural killer cells), CD68 (macrophages), and S100 (dendritic cells) in 61 samples of salivary glands and 59 of liver. Results were expressed in percentage of positive cells. The pattern of distribution of the inflammatory infiltrate was classified as focal or diffuse. Kruskal-Wallis, Mann-Whitney, ANOVA e “t” de Student statistical tests were used and p values lower than 0.05 were considered statistically significant. Diffuse inflammatory infiltrate was present in 57.4% of salivary glands and in 13.6% of liver biopsies. CD3+ and CD20+ were the most frequent cells in both tissues, with a CD3/CD20 ratio of 1.17 in salivary glands and 1.90 in liver. CD4+/CD8+ ratio in salivary glands was 0.30 and 1.06 in liver. CD57+, CD68+, and S100+ were found in a low percentage in both tissues. Higher CD3+, CD20+, and CD8+ indexes (p<0.05) were seen in SG with focal infiltrate than with diffuse infiltrate. Comparisons of all markers in salivary glands and METAVIR grade (A0, A1 or A2), viral genotype (1a, 1b or 3a), viral load (low or high), and presence of HCV RNA in salivary gland (present or absent) were not statistically significant (p>0.05). Comparison between all salivary glands and liver indexes revealed statistically significant differences (p<0.05), with higher indexes found in liver, except S100+. We concluded that T and B lymphocytes were the most common leucocytes found in salivary glands of patients with chronic hepatitis C, especially cytotoxic T cells. The percentage of leucocyte subtypes detected in salivary glands is related to the distribution pattern of inflammation, but not to METAVIR grade, viral genotype, viral load, and local presence of HCV RNA. The same inflammatory cells found in liver can be seen in salivary glands, except CD4+, which were scarce in this tissue, but liver reveals a higher proportion of cells.
–
HCV-RNA – ácido ribonucleico do vírus da hepatite C IFN – interferon
IL – interleucina LB – linfócito B LT – linfócito T
MHC – complexo maior de histocompatibilidade NK – natural killer
PCR – reação em cadeia da polimerase TNF – fator de necrose tumoral
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 14
2.1. Hepatite C crônica e vírus da hepatite C ... 15
2.2. Resposta imune-inflamatória à infecção pelo HCV... 16
2.2.1. Resposta imune inata ... 16
2.2.2. Resposta imune adaptativa ... 19
2.3. Alterações hepáticas na infecção pelo HCV ... 22
2.4. Afecções das glândulas salivares na hepatite C crônica ... 24
3. OBJETIVOS ... 28
3.1. Objetivo Geral ... 29
3.2. Objetivos Específicos ... 29
4. METODOLOGIA... 30
4.1. Amostras ... 31
4.2. Análise do padrão de distribuição do infiltrado inflamatório... 32
4.3. Reações imunoistoquímicas ... 32
4.4. Análise da imunomarcação ... 33
4.5. Análise estatística ... 34
4.6. Aspectos éticos e legais ... 34
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 36
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 47
6.1. Parte I: Artigo científico ... 48
6.2. Parte II: Análise global do infiltrado inflamatório das glândulas salivares e fígado de pacientes com hepatite C crônica ... 55
7. CONCLUSÕES ... 58
8. ANEXOS ... 60
2.1 Hepatite C crônica e vírus da hepatite C
A hepatite C manifesta-se geralmente de maneira crônica, silenciosa e grave, com altas taxas de mortalidade e morbidade, representando um grave problema de saúde pública no Brasil e no mundo (BRASIL, 2008). Apesar de existir uma variação geográfica na prevalência de infecção pelo vírus da hepatite C (HCV), estima-se que 3% da população mundial seja afetada, o que representa aproximadamente 180 milhões de pessoas infectadas (HOUGHTON, 2009; GHANY et al., 2009). No Brasil, a prevalência estimada é de 2,5 a 10,0%, sendo que a infecção pelo HCV se tornou a maior responsável por cirrose e transplante hepático no mundo Ocidental (BRASIL, 2011).
O HCV é o agente etiológico da hepatite C e sua transmissão se dá pelo contato com sangue contaminado, como em transfusões sanguíneas, exposições percutâneas, uso de drogas injetáveis e/ou inaláveis e tratamento de hemodiálise (BRASIL, 2011). Existem também relatos de transmissão vertical e sexual, além de grande número de portadores (10 a 43%) cuja forma de contágio não é identificada (HERMIDA et al., 2002; DE ARAÚJO et al., 2007; BRASIL, 2011). Em 70 a 85% dos casos a doença se cronifica, geralmente de forma assintomática, sendo que um quarto a um terço evolui para formas histológicas graves ao longo de 20 anos (LAUER e WALKER, 2001; BRASIL, 2008).
O diagnóstico da hepatite C é feito pela identificação sorológica de anticorpos anti-HCV através do teste de ELISA, seguida por detecção do RNA viral no sangue (POYNARD et al., 2003; BRASIL, 2011). Como não há vacina para a hepatite C, grande enfoque deve ser dado na prevenção da doença (DE ARAÚJO et al., 2007; BRASIL, 2008).
e biológica observada nos pacientes, como a resposta ao tratamento (LAUER e WALKER, 2001; ALI e ZEIN, 2005; REHERMANN e NASCIMBENI, 2005; LE GUILLOU-GUILLEMETTE et al., 2007; HOUGHTON, 2009).
Além da infecção principal nas células hepáticas, são relatados o sialotropismo e o linfotropismo do HCV (RAMOS-CASALS et al., 2001; ALI e ZEIN, 2005; BLACKARD, et al., 2006; GALOSSI et al., 2007; GROSSMANN et al., 2009). Estudos buscam identificar células não hepáticas nas quais a replicação viral poderia ocorrer, tais como células sanguíneas periféricas, pâncreas, tireoide, glândula adrenal, mucosa bucal e pele, entre outras (DE VITA et al., 2000; LASKUS et al., 2000; NAGAO et al., 2000; BLACKARD, et al., 2006).
2.2 Resposta imune-inflamatória à infecção pelo HCV
2.2.1 Resposta imune inata
entanto, o HCV parece ser resistente a estes efeitos, frequentemente progredindo para a infecção crônica (REHERMANN e NASCIMBENI, 2005).
Os macrófagos estão envolvidos na defesa do hospedeiro, cicatrização de feridas e na regulação da resposta imune (MOSSER e EDWARDS, 2008). Os macrófagos encontrados no fígado podem ser residentes, também chamados de células de Kupffer, ou infiltrantes. Ambos são CD68+, porém os residentes tendem a apresentar formato estrelado ou alongado, enquanto os infiltrantes apresentam morfologia arredondada (McGUINNESS et al., 2000). Foi demonstrado que a densidade de células CD68+ é maior em fígados infectados cronicamente pelo HCV, quando comparado a fígados sem esta infecção (McGUINNESS et al., 2000). Os macrófagos residentes do fígado infectado por HCV são capazes de endocitar antígenos virais, processá-los e apresentá-los a outras células imunes (SZABO e DOLGANIUC, 2006; PROTZER et al., 2012). Além disso, os macrófagos ativados podem assumir um perfil citotóxico e destruir diretamente os hepatócitos infectados através da produção de ânions superóxido e radicais de oxigênio e nitrogênio, contribuindo para o dano tecidual (McGUINNESS et al., 2000; SZABO e DOLGANIUC, 2006; MOSSER e EDWARDS, 2008). Outra função importante destas células na infecção pelo HCV é a produção de citocinas, destacando-se o fator de necrose tumoral (TNF)- e a interleucina (IL)-10, sendo esta última de função inibitória de LT e células NK (McGUINNESS et al., 2000; HOSOMURA et al., 2011; PROTZER et al., 2012). Esta produção pode ser estimulada por proteínas virais ou por outras citocinas, como o IFN- (McGUINNESS et al., 2000; HOSOMURA et al., 2011).
As células NK são as principais células efetoras da resposta imune inata, sendo capazes de reagir contra seus alvos sem necessidade de uma ligação prévia. As principais funções das células NK são a citotoxicidade direta e a produção de citocinas, principalmente IFN- e TNF-(LUNEMANN et al., 2012; SPENGLER et al., 2013). O fígado sadio é
de células NK (AHMAD e ALVAREZ, 2004; SPAAN et al., 2012). No entanto, foi relatado que proteínas do HCV podem interferir na função destas células, as quais passam a apresentam menor ativação, menor produção de citocinas e menor capacidade de ativar células dendríticas (REHERMANN e NASCIMBENI, 2005; PROTZER et al., 2012). A função efetora das células NK está relacionada à sua capacidade de eliminar hepatócitos infectados por HCV. Esta eliminação pode ocorrer diretamente, através de moléculas citotóxicas como granzima e perforina, e indiretamente, pela secreção de citocinas como IFN- e TNF-, que levam à
supressão da replicação viral, além da ativação de respostas imunes adaptativas subsequentes (AHMAD e ALVAREZ, 2004; IRSHAD et al., 2008; BOZZANO et al., 2012; MONDELLI et al., 2012; SPAAN et al., 2012). Assim, as células NK ativadas têm um papel importante na ativação de outras células NK, macrófagos e linfócitos B, além de participarem do recrutamento de linfócitos T vírus-específicos (TEIXEIRA, 2005; SZABO e DOLGANIUC, 2006; IRSHAD et al., 2008). Além disso, estas citocinas participam na indução do estado antiviral nas células hepáticas adjacentes às infectadas, explicado anteriormente (IRSHAD et al., 2008).
As células dendríticas representam importantes células apresentadoras de antígenos e tem papel importante na ligação entre as respostas inata e adaptativa, pois quando estimuladas por patógenos, são capazes de induzir a ativação de linfócitos T antígeno-específicos (RYAN e O’FARRELLY, 2011; LOSIKOFF et al., 2012; SPAAN et al., 2012). Após encontrar o patógeno, as células dendríticas são ativadas, ou seja, apresentam maior expressão do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) e produção de quimiocinas e citocinas como o IFN-, IFN- e IL-12. Após a migração das células dendríticas ativadas para
passam a apresentar um aumento de expressão de moléculas de superfície, capacidade aumentada de estimular proliferação de linfócitos T e produção de IFN- (IRSHAD et al., 2008).
Além disso, são capazes de influenciar a polarização da resposta dos linfócitos T auxiliares em Th1, pela secreção de IL-12, ou T regulatórias, pela secreção de IL-10 (SZABO e DOLGANIUC, 2006; RYAN e O’FARRELLY, 2011). Desta forma, a resposta precoce das
células dendríticas à infecção pelo HCV é crítica na determinação do curso e desfecho - resolução ou cronificação - da doença (IRSHAD et al., 2008). Como muitas proteínas HCV são capazes de inibir as funções de células dendríticas, as funções dos linfócitos T auxiliares e citotóxicos são consequentemente debilitadas em pacientes portadores crônicos do HCV, sendo este um dos mecanismos que o HCV usa para enfraquecer a resposta imune do hospedeiro contra o vírus (SZABO e DOLGANIUC, 2006; IRSHAD et al., 2008).
2.2.2 Resposta imune adaptativa
A resposta imune adaptativa é mais tardia e especializada, sendo seus principais componentes efetores os linfócitos T (LT) e B (LB) (VOLTARELLI, 2009).
Os LT reconhecem antígenos apenas se estes forem previamente processados pelas células apresentadoras de antígenos e apresentados em associação às moléculas do MHC tipo I ou tipo II. Sinais positivos e negativos trocados entre as células apresentadoras de antígenos e LT são necessários para promover uma resposta eficiente contra antígenos exógenos, mas também para limitar esta ativação a fim de evitar um dano imune adicional ou autoimunidade (CIUFFREDA e KIM, 2011).
através de secreção de citocinas como IFN-, IFN-/ e TNF-, tornando as células não infectadas resistentes à infecção e paralisando a replicação viral nas células infectadas (LLOYD et al., 2007; IRSHAD et al., 2008).
Na infecção aguda pelo HCV, a eliminação espontânea do vírus é associada a uma resposta de LT CD8+ precoce, vigorosa e multiespecífica (LI e SCHWARZ, 2002; REHERMANN e NASCIMBENI, 2005; LLOYD et al., 2007). No entanto, na maioria dos pacientes as respostas CD8+ específicas são fracas, com poucas células reconhecendo poucos epítopos e, portanto, incapazes de eliminar o vírus completamente, resultando na infecção crônica pelo HCV (LI e SCHWARZ, 2002; SZABO e DOLGANIUC, 2006; REHERMANN, 2009).
Já os LT auxiliares (CD4+) são restritos ao reconhecimento via MHC tipo II, que é expresso por uma população restrita de células, como as células dendríticas, macrófagos ativados e LB (LI e SCHWARZ, 2002; VOLTARELLI, 2009; CIUFFREDA e KIM, 2011). Uma vez estimulados, os LT CD4+ podem apresentar padrões de resposta distintos, Th1 e Th2, entre outros, dependendo das citocinas que secretam (LI e SCHWARZ, 2002;VOLTARELLI, 2009; SWAIN et al., 2012). No padrão de resposta Th1, as células secretam IL-12, IFN- e
TNF-, e em geral estimulam LT CD8+, macrófagos e células NK (LI e SCHWARZ, 2002; FOCACCIA, 2003; SZABO e DOLGANIUC, 2006; SWAIN et al., 2012). Já na resposta Th2 são secretadas IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13, as quais estimulam os LB e, consequentemente, a produção de anticorpos (LI e SCHWARZ, 2002; FOCACCIA, 2003; SZABO e DOLGANIUC, 2006; SWAIN et al., 2012). Vale ressaltar que as respostas Th1 e Th2 têm efeito inibitório entre si (LI e SCHWARZ, 2002).
HCV-positivos contém um alto índice de LT CD4+ regulatórios, que são capazes de inibir a função de LT CD8+ e CD4+ e células NK (REHERMANN e NASCIMBENI, 2005; PROTZER et al., 2012). Também foi relatado que os LT CD4+ estão em menor número que os LT CD8+ no fígado infectado cronicamente (PROTZER et al., 2012). Apesar dos LT CD4+ não mediarem diretamente a injúria aos hepatócitos na infecção pelo HCV, eles são cruciais na facilitação de outros mecanismos imunes antivirais, como o aumento nas funções efetoras de LT CD8+ (SZABO e DOLGANIUC, 2006). Ainda não está claro como uma intensa resposta de LT CD4+ leva ao clearance viral, porém é aceito que uma resposta precoce, intensa, multiespecífica e com perfil Th1 é associada a clearance viral e resolução da doença, ao passo que uma resposta estritamente focada, tardia e com perfil Th2 é associada à infecção crônica (LI e SCHWARZ, 2002; FOCACCIA, 2003; LLOYD et al., 2007; SEMMO e KLENERMAN, 2007; IRSHAD et al., 2008). Uma hipótese sobre a ocorrência da resposta Th2 na infecção crônica pelo HCV estaria na função deficitária das células dendríticas, possivelmente pela inibição da IL-12. Desta forma, haveria inibição da resposta Th1, favorecendo a resposta Th2 (SEMMO e KLENERMAN, 2007).
Existe evidência limitada para um papel significante dos anticorpos anti-HCV no clearance viral e na proteção contra a reinfecção pelo HCV (LI e SCHWARZ, 2002; LLOYD et
al., 2007). Uma possível explicação é o fato de estes anticorpos parecerem ter como alvo a região hipervariável 1 da proteína E2 do HCV que, com mutações, leva ao surgimento de quasispecies que escapam da neutralização (LLOYD et al., 2007; PROTZER et al., 2012). Não obstante, os anticorpos anti-HCV podem estar envolvidos nos aspectos imunológicos das manifestações extra-hepáticas do HCV (LI e SCHWARZ, 2002).
surgimento de variantes virais de escape, como resultado da alta taxa de mutação do HCV; apresentação comprometida de antígeno pelas células dendríticas; capacidade do HCV de favorecer a resposta Th2 a despeito da Th1; diminuição da produção de citocinas antivirais; deleção, disfunção, inativação ou exaustão de células T; potencial citolítico comprometido dos LT CD8+; participação de células T regulatórias na supressão da resposta de LT CD8+ e de células NK (LI e SCHWARZ, 2002; REHERMANN e NASCIMBENI, 2005; THIMME et al., 2006; LLOYD et al., 2007; IRSHAD et al., 2008; REHERMANN, 2009; PROTZER et al., 2012; SPENGLER et al., 2013).
2.3 Alterações hepáticas na infecção pelo HCV
A patogenicidade do HCV está relacionada ao dano ao hepatócito e à persistência viral. Frente à infecção persistente no fígado, é disparada continuamente uma resposta imune que induz a destruição do hepatócito. Assim, o sistema imune parece desempenhar um papel duplo: a limitação da replicação do HCV e estabelecimento da lesão tecidual, já que o HCV não é diretamente citopático (LI e SCHWARZ, 2002; FOCACCIA, 2003; BRASIL, 2011; ZAMPINO et al., 2013).
As características histológicas desta infecção hepática crônica incluem a presença de inflamação, fibrose e alterações hepatocelulares (degeneração balonizante e apoptose). Uma característica típica da hepatite C é o infiltrado de uma coleção de linfócitos no tecido conjuntivo do espaço portal, onde folículos linfoides com centros germinativos também podem estar presentes, embora mais raramente (LEFKOWITCH, 2007).
nos folículos linfoides primários observados no fígado destes pacientes, as células T representavam 28 a 68% do infiltrado, sendo que as CD4+ eram localizadas mais ao centro e CD8+ na periferia do folículo. As células B representaram 36 a 73%; macrófagos e células NK eram escassos. Os autores destacam a alta prevalência dos folículos linfoides em fígado na hepatite C e que a composição celular dos mesmos é, de maneira geral, bem definida e constante, assemelhando-se aos folículos linfoides primários dos linfonodos. No entanto, a função destes folículos não é bem esclarecida.
FREEMAN e colaboradores (2001) também afirmam que existe uma predominância de LT CD8+ sobre LT CD4+ no infiltrado inflamatório hepático característico da hepatite C crônica. Estes autores relataram que os LT CD4+ são confinados às áreas portais e periportais, enquanto os LT CD8+ são vistos também no infiltrado lobular, sugerindo que estas células podem contribuir para o dano hepatocelular.
Entretanto, VISO e colaboradores (2007) demonstraram predomínio de células CD4+ sobre CD8+ em amostras hepáticas de pacientes portadores de HCV. Posteriormente, o mesmo grupo de pesquisadores (VISO et al., 2010) comparou a imunoexpressão de CD4+, CD8+, CD68+, S100+, CD57+ e CD45RO+ em amostras de fígado HCV positivas e negativas. Nos casos HCV positivos, houve maior número de células CD4+ e CD8+ e menor de S100+, além de predomínio de células CD4+ sobre CD8+.
imunofluorescência. Entretanto, a presença de antígenos HCV era frequentemente acompanhada por infiltrado inflamatório.
NGUYEN e colaboradores (2013) demonstraram que o número de leucócitos identificados foi menor nos lóbulos que nos espaços-porta. Em relação aos subtipos leucocitários identificados, no espaço porta houve predomínio de LT CD4+, com presença de CD8+. As células CD20+ foram encontradas comumente em agregados linfoides e as CD68+ estavam dispersas uniformemente. Já nos lóbulos, houve predomínio de CD8+, com poucas CD4+, ausência de CD20+ e numerosas células CD68+.
2.4 Afecções das glândulas salivares na hepatite C crônica
Aproximadamente 40-75% dos pacientes infectados pelo HCV apresentam uma manifestação extra-hepática durante o curso da doença (CACOUB et al., 1999; PALEKAR e HARRISON, 2005; BLACKARD et al., 2006; GALOSSI et al., 2007; KO et al., 2012), sendo que a maioria delas parece ser mediada imunologicamente, representando efeito secundário da resposta imune do hospedeiro e não efeito citopático viral direto (ROY e BAGG, 1999; BONKOVSKY e MEHTA, 2001; LAUER e WALKER, 2001; RAMOS-CASALS et al., 2002; OHOKA et al., 2003; CARROZZO, 2008a; KO et al., 2012; ZAMPINO et al., 2013). Além disso, uma possível participação do linfotropismo atribuído ao HCV na patogênese das manifestações extra-hepáticas também é discutido (BLACKARD et al., 2006).
2005; GROSSMANN et al., 2007; GALOSSI et al., 2007; CARROZZO, 2008b; JACOBSON et al., 2010).
Dentre as alterações relacionadas às glândulas salivares, podem ser citadas a hiposalivação, xerostomia e sialoadenite (HADDAD et al., 1992; GROSSMANN et al., 2010 a; GROSSMANN et al., 2010 b; VITALI, 2011).
GROSSMANN e colaboradores (2010) relataram uma incidência de hiposalivação de 19,1% e xerostomia de 35,3% em pacientes com hepatite C crônica. Estes autores também observaram que o HCV-RNA foi detectado mais frequentemente na saliva (39,0%) que em amostras de glândulas salivares (18,5%). No entanto, a detecção do HCV-RNA na saliva e em glândulas salivares não apresentou correlação com fluxo salivar e xerostomia. De forma similar, FERREIRO e colaboradores (2002) mostraram que o fluxo salivar total não está relacionado à presença do vírus na saliva.
As investigações sobre a presença do HCV-RNA em saliva de pacientes portadores de HCV apresentam resultados que variam de 0 à 100% (JORGENSEN et al., 1996; TALIANI
et al., 1997; HERMIDA et al., 2002; GONÇALVES et al., 2005; SHAFIQUE et al., 2009; GROSSMANN et al., 2010). Esta grande variabilidade de resultados pode estar associada a diferenças metodológicas empregadas. Estudos da presença de HCV na glândula salivar também revelam resultados conflitantes. Utilizando imunoistoquímica, DE VITA e colaboradores (1995) e ARRIETA e colaboradores (2001) identificaram o HCV neste tecido, enquanto VERBAAN e colaboradores (1999) obtiveram resultados negativos e OHOKA e colaboradores (2003) resultados falso positivos. Além disso, estudos acerca da identificação de HCV-RNA em glândulas salivares através de hibridização in situ e PCR também demonstram resultados controversos (TAKAMATSU et al., 1992; BIASI et al., 1995; TALIANI et al., 1997; ARRIETA et al., 2001; OHOKA et al., 2003; GROSSMANN et al., 2010).
2013). Foi demonstrada ausência de correlação entre a detecção de anticorpos anti-HCV em saliva e a presença do HCV-RNA em saliva e em glândulas salivares de pacientes com hepatite C crônica (CALDEIRA et al., 2013).
A sialoadenite encontrada em pacientes HCV-positivos comumente se apresenta histologicamente semelhante à síndrome de Sjögren. O exame histopatológico de glândulas salivares menores labiais de pacientes com síndrome de Sjögren caracteriza-se pela presença de sialoadenite linfocítica focal, com mais de um foco (50 ou mais células) por 4mm² de tecido glandular. Além deste achado, a identificação de outras características é necessária para o diagnóstico da síndrome de Sjögren e a infecção pelo HCV é considerada um critério de exclusão para este diagnóstico (VITALI et al., 2002). Portanto, a sialoadenite presente em pacientes portadores do HCV é chamada de sialoadenite associada ao HCV ou síndrome Sjögren-like (SCOTT et al., 1997; ROY e BAGG, 1999).
A ocorrência de síndrome de Sjögren-like nos pacientes portadores crônicos do HCV varia de 4 a 57% (KO et al., 2012). KOIKE e colaboradores (1997) relatam que animais transgênicos que expressavam genes do envelope de HCV desenvolviam sialoadenite. O mecanismo pelo qual a infecção pelo HCV leva à síndrome Sjögren-like não é esclarecido, porém acredita-se ser um efeito da resposta imune do hospedeiro, mais que um efeito direto do vírus (KO et al., 2012).
Poucas investigações buscaram elucidar os componentes inflamatórios encontrados em glândulas salivares de pacientes HCV positivos (VITALI, 2011). SCOTT e colaboradores (1997) demonstraram que este infiltrado inflamatório é predominantemente de LT, com poucos LB. COLL e colaboradores (1997) estudaram três amostras de glândulas salivares menores e relataram que, no infiltrado difuso, encontrou-se predominância de linfócitos CD3+ e uma proporção de 2:1 entre linfócitos CD4+ e CD8+. Já no infiltrado focal houve predominância de linfócitos CD20+.
3.1 Objetivo geral
Caracterizar comparativamente o infiltrado inflamatório presente em glândulas salivares menores e fígado de pacientes com hepatite C crônica.
3.2 Objetivos específicos
1. Caracterizar o padrão de distribuição e o imunofenótipo do infiltrado inflamatório presente nas glândulas salivares menores de pacientes com hepatite C crônica, comparando com amostras de fígado.
4.1 Amostras
As amostras de glândulas salivares foram resgatadas de material previamente coletado e arquivado (GROSSMANN et al., 2010). À época da coleta, glândulas salivares menores foram obtidas através de biópsia em lábio inferior clinicamente sem alterações, fixadas em formol e incluídas em blocos de parafina. Os pacientes foram voluntários do ambulatório de Hepatites Virais do Instituto Alfa de Gastroenterologia do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) que assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Todos apresentavam diagnóstico comprovado de hepatite C crônica (anti-HCV sorológico positivo, Elisa III, teste qualitativo para (anti-HCV-RNA positivo, Amplicor Roche®), além de não terem recebido nenhum tratamento prévio para a doença. Os pacientes não apresentavam nenhuma outra doença hepática nem coinfecção pelo vírus da imunodeficiência humana. Também não apresentavam sintomas sugestivos de Síndrome de Sjögren. Para o presente estudo, foram utilizados 61 casos que apresentavam material suficiente para as análises propostas. Os dados clínicos coletados também foram arquivados em banco de dados (GROSSMANN et al., 2010b).
Os arquivos do Laboratório de Patologia Hepática do Departamento de Anatomia Patológica da Faculdade de Medicina da UFMG foram revisados para amostras de fígado de pacientes com hepatite C crônica. Estas amostras foram obtidas por biópsia por agulha, fixadas em formol e incluídas em bloco de parafina. Cinquenta e nove casos foram incluídos no estudo e apresentavam grau A2 segundo o sistema METAVIR de graduação. De acordo com este sistema, a atividade necroinflamatória é graduada em quatro parâmetros: A0 = nenhuma; A1 = leve; A2 = moderada; A3 = severa (BEDOSSA e POYNARD, 1996). As amostras de fígado não pertenciam aos mesmos pacientes dos quais foram obtidas glândulas salivares.
carga, utilizados para as reações imunoistoquímicas descritas no item 4.3.
4.2 Análise do padrão de distribuição do infiltrado inflamatório
Esta análise foi feita nas amostras teciduais de glândula salivar e fígado. Todos os campos da lâmina corada em hematoxilina e eosina foram avaliados em um microscópio ótico (Carl Zeiss – Axiostar 1122-100). O infiltrado inflamatório foi classificado de acordo com seu padrão de distribuição no tecido em focal, quando as células inflamatórias formaram agregados de 50 ou mais células inflamatórias, ou difuso, quando um padrão focal de distribuição não pôde ser observado (VITALI, 2011).
4.3 Reações imunoistoquímicas
Foram realizadas reações imunoistoquímicas para os marcadores CD3 (linfócitos T); CD20 (linfócitos B); CD4 (linfócito T helper); CD8 (linfócito T citotóxico); S-100 (células dendríticas); CD68 (macrófagos) e CD57 (células natural killer), seguindo o protocolo a seguir. 1. Desparafinização dos cortes histológicos em xilol seguidos por hidratação em banhos
decrescentes de etanol (exceto para CD4, ver quadro 1). 2. Recuperação antigênica, conforme descrito no quadro 1.
3. Bloqueio da atividade de ligação à biotina endógena, segundo o protocolo e MILLER e colaboradores (1999).
4. Bloqueio da peroxidase endógena, solução de peróxido de hidrogênio 10 volumes. 5. Incubação com anticorpo primário, conforme especificações descritas no quadro 1,
por 60 minutos, à temperatura ambiente.
6. Incubação com sistema de detecção, conforme descrito no quadro 1. Para os casos de fígado, para todos os anticorpos foi utilizado o sistema Advance (Dako Cytomation, Carpinteria, CA, EUA, código K4068).
7. Revelação da reação utilizando-se solução cromógena de 3,3’ diaminobenzidina - DAB (Dako Cytomation, Carpinteria, CA, EUA, código K3468).
9. Desidratação em soluções de etanol em concentrações crescentes; diafanização em xilol e montagem com lamínulas de vidro e Permount (Fisher Scientific, Fair Lawn, EUA, código SP15-500).
Quadro 1 – Especificações das reações imunoistoquímicas.
Anticorpo
primário Clone / fabricante Recuperação antigênica Diluição
Sistema de detecção
Anti-CD3 F7.2.38, Dako Cytomation, Dinamarca, código M7254 TRIS-EDTA, pH 9.0, 96°C, 30 minutos steamer 1:200 Advance
Anti-CD20cy Dinamarca, código M0755 L26, Dako Cytomation, Ácido cítrico, pH 6.0, banho maria 96°C, 30 minutos 1:200 LSAB1
Anti-CD4 Dinamarca, código M7310 4B12, Dako Cytomation, Trilogy2, panela de pressão 1:100 Advance
Anti-CD8 C8/144B, Dako Cytomation, Dinamarca, código M7103 TRIS-EDTA, pH 9.0, banho maria 96°C, 30 minutos 1:500 LSAB
Anti-S100 Policlonal, Dako Cytomation, Dinamarca, código Z0311 Sem tratamento 1:500 LSAB
Anti-CD68 KP1, Diagnostic BioSystems, EUA, código Mob167 Ácido cítrico, pH 6.0, banho maria 96°C, 30 minutos 1:1500 Advance
Anti-CD57 Dinamarca, código M7271 TB01, Dako Cytomation, TRIS-EDTA, pH 9.0, banho maria 96°C, 30 minutos 1:100 LSAB
1 Dako Cytomation, Carpinteria, CA, EUA, código K0690 2 Cell Marque, Rocklin, CA, EUA, código 920P-07
4.4 Análise da imunomarcação
A análise da imunomarcação foi realizada por dois observadores calibrados (coeficiente de correlação intraclasse = 0,862), utilizando-se microscópio óptico, em aumento de 400 vezes, com retículo de contagem acoplado (Carl Zeiss – Axiostar 1122-100). Foram consideradas imunopositivas as células que apresentaram coloração marrom, independente da intensidade da marcação. Para a avaliação de S100, apenas células com morfologia dendrítica foram consideradas.
os casos com infiltrado inflamatório difuso, foram contadas 50 células em cada campo de maior aumento (400x), entre positivas e negativas. Seis campos foram avaliados, totalizando 300 células. Naqueles casos onde toda a extensão do tecido não permitia totalizar a contagem de seis focos / campos, todos os focos / campos presentes foram avaliados. Os resultados foram expressos em porcentagem de células positivas.
Posteriormente, foram obtidas as médias de marcação de cada proteína (CD3, CD20, CD4, CD8, CD57, CD68, S100) em cada grupo estudado (glândula total, fígado total, glândula foco, glândula difuso, fígado foco, fígado difuso). O valor da média foi então convertido, de acordo com um sistema de gradação semi-quantitativa (adaptado de COLL et al., 1997) (quadro 2).
Quadro 2: Gradação semi-quantitativa para conversão das médias de marcação.
Média de marcação (%) Graduação
0 a 10,0 +
10,1 a 25,0 ++
25,1 a 50,0 +++
50,1 a 75,0 ++++
75,1 a 100,0 +++++
4.5 Análise estatística
A análise estatística foi realizada utilizando-se os programas Minitab® (Minitab Inc., State College, PA, EUA) e SPSS® para Windows, versão 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Foram realizados testes de normalidade e, posteriormente, foram empregados testes não-paramétricos (Kruskal-Wallis e Mann-Whitney) e paramétricos (ANOVA e “t” de Student). Valores de p abaixo de 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
4.6 Aspectos éticos e legais
1. Abbas, Abul K; Lichtman, Andrew H; Pillai, Shiv. Imunologia Celular e Molecular. Rio de Janeiro: Elsevier, 2011. Tradução da 7ª edição.
2. Açıkgöz G, Cengiz MI, Keskiner I, Açıkgöz S, Can M, Açıkgöz A. Correlation of hepatitis C antibody levels in gingival crevicular fluid and saliva of hepatitis C seropositive hemodialysis patients. Int J Dent. 2009;2009:247121.
3. Ahmad A, Alvarez F. Role of NK and NKT cells in the immunopathogenesis of HCV-induced hepatitis. J Leukoc Biol. 2004 Oct;76(4):743-59.
4. Ali A, Zein NN. Hepatitis C infection: a systemic disease with extrahepatic manifestations. Cleve Clin J Med. 2005 Nov;72(11):1005-8, 1010-4, 1016 passim. 5. Arrieta JJ, Rodríguez-Iñigo E, Ortiz-Movilla N, Bartolomé J, Pardo M, Manzarbeitia F,
Oliva H, Macías DM, Carreño V. In situ detection of hepatitis C virus RNA in salivary glands. Am J Pathol. 2001 Jan;158(1):259-64.
6. Bedossa P, Poynard T. An algorithm for the grading of activity in chronic hepatitis C. The METAVIR Cooperative Study Group. Hepatology. 1996 Aug;24(2):289-93.
7. Biasi D, Colombari R, Achille A, Carletto A, Caramashi P, Corrocher R, Bambara LM. HCV RNA detection in parotid gland biopsy in a patient with chronic hepatitis C virus liver disease. Acta Gastroenterol Belg. 1995 Sep-Dec;58(5-6):465-9.
8. Blackard JT, Kemmer N, Sherman KE. Extrahepatic replication of HCV: insights into clinical manifestations and biological consequences. Hepatology. 2006 Jul;44(1):15-22.
9. Bonkovsky HL, Mehta S. Hepatitis C: a review and update. J Am Acad Dermatol. 2001 Feb;44(2):159-82.
10. Bozzano F, Marras F, Biassoni R, De Maria A. Natural killer cells in hepatitis C virus infection. Expert Rev Clin Immunol. 2012 Nov;8(8):775-88.
Secretaria de Vigilância em Saúde, Departamento de Vigilância Epidemiológica. – 3. ed. - Brasília: Ministério da Saúde, 2008.
12. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais. Protocolo clínico e diretrizes terapêuticas para hepatite viral C e coinfecções. – Brasília: Ministério da Saúde, 2011.
13. Cacoub P, Poynard T, Ghillani P, Charlotte F, Olivi M, Piette JC, Opolon P. Extrahepatic manifestations of chronic hepatitis C. MULTIVIRC Group. Multidepartment Virus C. Arthritis Rheum. 1999 Oct;42(10):2204-12.
14. Caldeira PC, Oliveira E Silva KR, Silva TA, de Mattos Camargo Grossmann S, Teixeira R, Carmo MA. Correlation between salivary anti-HCV antibodies and HCV RNA in saliva and salivary glands of patients with chronic hepatitis C. J Oral Pathol Med. 2013 Mar;42(3):222-8.
15. Carrozzo M, Gandolfo S. Oral diseases possibly associated with hepatitis C virus. Crit Rev Oral Biol Med. 2003;14(2):115-27.
16. Carrozzo M. Oral diseases associated with hepatitis C virus infection. Part 1. sialadenitis and salivary glands lymphoma. Oral Dis. 2008a Mar;14(2):123-30.
17. Carrozzo M. Oral diseases associated with hepatitis C virus infection. Part 2: lichen planus and other diseases. Oral Dis. 2008b Apr;14(3):217-28.
18. Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 1989 Apr 21;244(4902):359-62.
19. Ciuffreda D, Kim AY. Update on hepatitis C virus-specific immunity. Curr Opin HIV AIDS. 2011 Nov;6(6):559-65.
20. Coll J, Gambús G, Corominas J, Tomás S, Esteban JI, Guardia J. Immunohistochemistry of minor salivary gland biopsy specimens from patients with Sjögren's syndrome with and without hepatitis C virus infection. Ann Rheum Dis. 1997 Jun;56(6):390-2.
Pawlotsky JM. Consensus of the Brazilian Society of Infectious Diseases on the management and treatment of hepatitis C. Braz J Infect Dis. 2007 Oct;11(5):446-50. 22. De Vita S, De Re V, Sansonno D, Sorrentino D, Corte RL, Pivetta B, Gasparotto D,
Racanelli V, Marzotto A, Labombarda A, Gloghini A, Ferraccioli G, Monteverde A, Carbone A, Dammacco F, Boiocchi M. Gastric mucosa as an additional extrahepatic localization of hepatitis C virus: viral detection in gastric low-grade lymphoma associated with autoimmune disease and in chronic gastritis. Hepatology. 2000 Jan;31(1):182-9.
23. De Vita S, Sansonno D, Dolcetti R, Ferraccioli G, Carbone A, Cornacchiulo V, Santini G, Crovatto M, Gloghini A, Dammacco F, Boiocchi M. Hepatitis C virus within a malignant lymphoma lesion in the course of type II mixed cryoglobulinemia. Blood. 1995 Sep 1;86(5):1887-92.
24. Dubuisson J. Hepatitis C virus proteins. World J Gastroenterol. 2007 May 7;13(17):2406-15.
25. Ferreiro MC, Prieto MH, Rodríguez SB, Vázquez RL, Iglesias AC, Dios PD. Whole stimulated salivary flow in patients with chronic hepatitis C virus infection. J Oral Pathol Med. 2002 Feb;31(2):117-20.
26. Focaccia, Roberto. Tratado de hepatites virais. São Paulo: Atheneu, 2003.
27. Freeman AJ, Marinos G, Ffrench RA, Lloyd AR. Immunopathogenesis of hepatitis C virus infection. Immunol Cell Biol. 2001 Dec;79(6):515-36.
28. Freni MA, Artuso D, Gerken G, Spanti C, Marafioti T, Alessi N, Spadaro A, Ajello A, Ferraù O. Focal lymphocytic aggregates in chronic hepatitis C: occurrence, immunohistochemical characterization, and relation to markers of autoimmunity. Hepatology. 1995 Aug;22(2):389-94.
29. Galossi A, Guarisco R, Bellis L, Puoti C. Extrahepatic manifestations of chronic HCV infection. J Gastrointestin Liver Dis. 2007 Mar;16(1):65-73.
update. Hepatology 2009; 49:1335-74.
31. Gonçalves PL, Cunha CB, Busek SC, Oliveira GC, Ribeiro-Rodrigues R, Pereira FE. Detection of hepatitis C virus RNA in saliva samples from patients with seric anti-HCV antibodies. Braz J Infect Dis. 2005 Feb;9(1):28-34.
32. Grossmann S de M, Teixeira R, de Aguiar MC, de Moura MD, do Carmo MA. Oral mucosal conditions in chronic hepatitis C Brazilian patients: a cross-sectional study. J Public Health Dent. 2009 Summer;69(3):168-75.
33. Grossmann Sde M, Teixeira R, Oliveira GC, Gleber-Netto FO, Araújo FM, Araújo FM, Carmo MA. Xerostomia, hyposalivation and sialadenitis in patients with chronic hepatitis C are not associated with the detection of HCV RNA in saliva or salivary glands. J Clin Pathol. 2010 (a) Nov;63(11):1002-7.
34. Grossmann SMC, de Aguiar MC, Teixeira R, do Carmo MA. Oral lichen planus and chronic hepatitis C: a controversial association. Am J Clin Pathol. 2007 May;127(5):800-4.
35. Grossmann SMC, Teixeira R, de Oliveira GC, do Carmo MA. Detection of HCV RNA in saliva does not correlate with salivary flow or xerostomia in patients with chronic hepatitis C. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2010 (b) Jun;109(6):851-6.
36. Grossmann, SM. Universidade Federal de Minas Gerais. Alterações de glândulas salivares em pacientes com hepatite C crônica. 2010. Tese (Doutorado em Odontologia).
37. Haddad J, Deny P, Munz-Gotheil C, Ambrosini JC, Trinchet JC, Pateron D, Mal F, Callard P, Beaugrand M. Lymphocytic sialadenitis of Sjögren's syndrome associated with chronic hepatitis C virus liver disease. Lancet. 1992 Feb 8;339(8789):321-3. 38. Hermida M, Ferreiro MC, Barral S, Laredo R, Castro A, Diz Dios P. Detection of HCV
RNA in saliva of patients with hepatitis C virus infection by using a highly sensitive test. J Virol Methods. 2002 Mar;101(1-2):29-35.
proteins activate Kupffer cells isolated from human liver tissues. Dig Dis Sci. 2011 Apr;56(4):1057-64.
40. Houghton M. The long and winding road leading to the identification of the hepatitis C virus. J Hepatol. 2009 Nov;51(5):939-48.
41. Irshad M, Khushboo I, Singh S, Singh S. Hepatitis C virus (HCV): a review of immunological aspects. Int Rev Immunol. 2008;27(6):497-517.
42. Jacobson IM, Cacoub P, Dal Maso L, Harrison SA, Younossi ZM. Manifestations of chronic hepatitis C virus infection beyond the liver. Clin Gastroenterol Hepatol. 2010 Dec;8(12):1017-29.
43. Jorgensen C, Legouffe MC, Perney P, Coste J, Tissot B, Segarra C, Bologna C, Bourrat L, Combe B, Blanc F, Sany J. Sicca syndrome associated with hepatitis C virus infection. Arthritis Rheum. 1996 Jul;39(7):1166-71.
44. Ko HM, Hernandez-Prera JC, Zhu H, Dikman SH, Sidhu HK, Ward SC, Thung SN. Morphologic features of extrahepatic manifestations of hepatitis C virus infection. Clin Dev Immunol. 2012;2012:740138.
45. Koike K, Moriya K, Ishibashi K, Yotsuyanagi H, Shintani Y, Fujie H, Kurokawa K, Matsuura Y, Miyamura T. Sialadenitis histologically resembling Sjogren syndrome in mice transgenic for hepatitis C virus envelope genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Jan 7;94(1):233-6.
46. Laskus T, Radkowski M, Wang LF, Nowicki M, Rakela J. Uneven distribution of hepatitis C virus quasispecies in tissues from subjects with end-stage liver disease: confounding effect of viral adsorption and mounting evidence for the presence of low-level extrahepatic replication. J Virol. 2000 Jan;74(2):1014-7.
47. Lauer GM, Walker BD. Hepatitis C virus infection. N Engl J Med. 2001 Jul 5;345(1):41-52
49. Lefkowitch JH. Liver biopsy assessment in chronic hepatitis. Arch Med Res. 2007 Aug;38(6):634-43.
50. Li DY, Schwarz KB. Immunopathogenesis of chronic hepatitis C virus infection. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2002 Sep;35(3):260-7.
51. Lloyd AR, Jagger E, Post JJ, Crooks LA, Rawlinson WD, Hahn YS, Ffrench RA. Host and viral factors in the immunopathogenesis of primary hepatitis C virus infection. Immunol Cell Biol. 2007 Jan;85(1):24-32.
52. Losikoff PT, Self AA, Gregory SH. Dendritic cells, regulatory T cells and the pathogenesis of chronic hepatitis C. Virulence. 2012 Oct 17;3(7). [Epub ahead of print] 53. Lunemann S, Schlaphoff V, Cornberg M, Wedemeyer H. NK cells in hepatitis C: role in
disease susceptibility and therapy. Dig Dis. 2012;30 Suppl 1:48-54.
54. Major ME, Feinstone SM. The molecular virology of hepatitis C. Hepatology. 1997 Jun;25(6):1527-38.
55. Mayo MJ. Extrahepatic manifestations of hepatitis C infection. Am J Med Sci. 2003 Mar;325(3):135-48.
56. McGuinness PH, Painter D, Davies S, McCaughan GW. Increases in intrahepatic CD68 positive cells, MAC387 positive cells, and proinflammatory cytokines (particularly interleukin 18) in chronic hepatitis C infection. Gut. 2000 Feb;46(2):260-9.
57. Medina J, García-Buey L, Moreno-Otero R. Hepatitis C virus-related extra-hepatic disease--aetiopathogenesis and management. Aliment Pharmacol Ther. 2004 Jul 15;20(2):129-41.
58. Miller RT, Kubier PH, Reynolds, BH, Henry, TB, Turnbow HB. Blocking of Endogenous Avidin-Binding Activity in Immunohistochemistry: The Use of Skim Milk as an Economical and Effective Substitute for Commercial Biotin Solutions. Appl Imm Mol Morphol. 1999; 7(1):63-65.
60. Mosser DM, Edwards JP. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 2008 Dec;8(12):958-69.
61. Nagao Y, Sata M, Noguchi S, Seno'o T, Kinoshita M, Kameyama T, Ueno T. Detection of hepatitis C virus RNA in oral lichen planus and oral cancer tissues. J Oral Pathol Med. 2000 Jul;29(6):259-66.
62. Nguyen N, de Esch C, Cameron B, Kumar RK, Zekry A, Lloyd AR. Positioning of leukocyte subsets in the portal and lobular compartments of HCV-infected liver correlates with local chemokine expression. J Gastroenterol Hepatol. 2013 Nov 15. doi: 10.1111/jgh.12462. [Epub ahead of print]
63. Ohoka S, Tanaka Y, Amako Y, Kohara M, Ishidate K, Watanabe M, Takahashi Y, Sato C. Sialadenitis in patients with chronic hepatitis C is not directly related to hepatitis C virus. Hepatol Res. 2003 Sep;27(1):23-29.
64. Palekar NA, Harrison SA. Extrahepatic manifestations of hepatitis C. South Med J. 2005 Oct;98(10):1019-23.
65. Poynard T, Yuen MF, Ratziu V, Lai CL. Viral hepatitis C. Lancet. 2003 Dec 20;362(9401):2095-100.
66. Protzer U, Maini MK, Knolle PA. Living in the liver: hepatic infections. Nat Rev Immunol. 2012 Feb 24;12(3):201-13.
67. Ramos-Casals M, García-Carrasco M, Brito Zerón MP, Cervera R, Font J. Viral etiopathogenesis of Sjögren's syndrome: role of the hepatitis C virus. Autoimmun Rev. 2002 Aug;1(4):238-43.
68. Ramos-Casals M, Garcia-Carrasco M, Cervera R, Font J. Is hepatitis C virus a sialotropic virus? Am J Pathol. 2001 Oct;159(4):1593-4.
69. Rehermann B, Nascimbeni M. Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection. Nat Rev Immunol. 2005 Mar;5(3):215-29.
70. Rehermann B. Hepatitis C virus versus innate and adaptive immune responses: a tale of coevolution and coexistence. J Clin Invest. 2009 Jul;119(7):1745-54.
2013 Oct 1;123(10):4121-30.
72. Roy K, Bagg J. Hepatitis C virus and oral disease: a critical review. Oral Dis. 1999 Oct;5(4):270-7.
73. Ryan EJ, O'Farrelly C. The affect of chronic hepatitis C infection on dendritic cell function: a summary of the experimental evidence. J Viral Hepat. 2011 Sep;18(9):601-7.
74. Scott CA, Avellini C, Desinan L, Pirisi M, Ferraccioli GF, Bardus P, Fabris C, Casatta L, Bartoli E, Beltrami CA. Chronic lymphocytic sialoadenitis in HCV-related chronic liver disease: comparison of Sjögren's syndrome. Histopathology. 1997 Jan;30(1):41-8. 75. Semmo N, Klenerman P. CD4+ T cell responses in hepatitis C virus infection. World J
Gastroenterol. 2007 Sep 28;13(36):4831-8.
76. Shafique M, Ahmad N, Awan FR, Mustafa T, Ullah M, Qureshi JA. Investigating the concurrent presence of HCV in serum, oral fluid and urine samples from chronic HCV patients in Faisalabad, Pakistan. Arch Virol. 2009;154(9):1523-7.
77. Spaan M, Janssen HL, Boonstra A. Immunology of hepatitis C virus infections. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2012 Aug;26(4):391-400.
78. Spengler U, Nischalke HD, Nattermann J, Strassburg CP. Between Scylla and Charybdis: the role of the human immune system in the pathogenesis of hepatitis C. World J Gastroenterol. 2013 Nov 28;19(44):7852-66.
79. Swain SL, McKinstry KK, Strutt TM. Expanding roles for CD4⁺ T cells in immunity to
viruses. Nat Rev Immunol. 2012 Jan 20;12(2):136-48.
80. Szabo G, Dolganiuc A. HCV immunopathogenesis: virus-induced strategies against host immunity. Clin Liver Dis. 2006 Nov;10(4):753-71.
81. Takamatsu K, Okayasu I, Koyanagi Y, Yamamoto N. Hepatitis C virus propagates in salivary glands. J Infect Dis.1992, 165: 973–974.
83. Teixeira, Rosângela. Hepatite C: aspectos críticos de uma epidemia silenciosa. Belo Horizonte: Coopmed, 2005.
84. Thimme R, Lohmann V, Weber F. A target on the move: innate and adaptive immune escape strategies of hepatitis C virus. Antiviral Res. 2006 Mar;69(3):129-41.
85. Verbaan H, Carlson J, Eriksson S, Larsson A, Liedholm R, Manthorpe R, Tabery H, Widell A, Lindgren S. Extrahepatic manifestations of chronic hepatitis C infection and the interrelationship between primary Sjögren's syndrome and hepatitis C in Swedish patients. J Intern Med. 1999 Feb;245(2):127-32.
86. Viso AT, de Castro Barbosa T, Yamamoto L, Pagliari C, Fernandes ER, Brasil RA, Andrade Jr HF Jr, Duarte MI, Barone AA. Portal CD4+ and CD8+ T lymphocyte correlate to intensity of interface hepatitis in chronic hepatitis C. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 2007 Nov-Dec;49(6):371-8.
87. Viso AT, Duarte MI, Pagliari C, Fernandes ER, Brasil RA, Benard G, Romano CC, Ogusuku S, Cavalheiro NP, Melo CE, Barone AA. Tissue and serum immune response in chronic hepatitis C with mild histological lesions. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2010 Feb;105(1):25-32.
88. Vitali C, Bombardieri S, Jonsson R, Moutsopoulos HM, Alexander EL, Carsons SE, Daniels TE, Fox PC, Fox RI, Kassan SS, Pillemer SR, Talal N, Weisman MH; European Study Group on Classification Criteria for Sjögren's Syndrome. Classification criteria for Sjögren's syndrome: a revised version of the European criteria proposed by the American-European Consensus Group. Ann Rheum Dis. 2002 Jun;61(6):554-8. 89. Vitali C. Immunopathologic differences of Sjögren's syndrome versus sicca syndrome
in HCV and HIV infection. Arthritis Res Ther. 2011 Aug 19;13(4):233.
90. Voltarelli, Júlio C. Imunologia clínica na prática médica. São Paulo: Atheneu, 2009. 91. Walewska-Zielecka B, Madalinski K, Jablonska J, Godzik P, Cielecka-Kuszyk J,
Litwinska B. Composition of inflammatory infiltrate and its correlation with HBV/HCV antigen expression. World J Gastroenterol. 2008 Jul 7;14(25):4040-6.
6.2 Parte II: Análise global do infiltrado inflamatório das glândulas salivares e fígado de pacientes com hepatite C crônica.
Quadro 3: Perfil imunoistoquímico do infiltrado inflamatório de glândulas salivares e fígado de
pacientes com hepatite C crônica.
Grupo
Marcador Glândula
salivar, total (n=61) Fígado, total (n=59) Glândula salivar, focal (n=26) Glândula salivar, difuso (n=35) Fígado, focal (n=51) Fígado, difuso (n=8)
CD20 ++ +++ +++ ++ +++ ++
CD3 ++ +++ +++ ++ +++ +++
CD8 ++ ++ ++ ++ ++ ++
CD4 + ++ + + ++ ++
CD57 + + + + + +
CD68 + + + + + +
S100 + + + + + +
O quadro acima demonstra os resultados globais encontrados no estudo. Podemos observar que, comparando os grupos glândula salivar total e fígado total, o infiltrado de células CD3+ e CD20+ foi mais intenso no fígado que na glândula salivar. Estes marcadores foram utilizados para identificação dos dois tipos principais de linfócitos, T e B respectivamente, que representariam uma proporção relevante das células inflamatórias encontradas nos tecidos. Além disto, sendo o fígado o órgão-alvo e primário do HCV, é esperado que neste órgão o infiltrado inflamatório seja mais intenso, como encontrado no estudo (LI e SCHWARZ, 2002; FOCACCIA, 2003). Podemos perceber, ainda, que a quantidade de CD3+ e CD20+ em cada um dos dois grupos apresentou a mesma graduação, ou seja, “++” para glândula e “+++” para fígado. Este resultado parece indicar que na fase crônica da hepatite C, tanto a resposta humoral (mediada por células B), quanto a celular (mediada por células T) estão presentes, tanto na glândula salivar quanto no fígado.
CD8+ foram encontradas na mesma proporção em ambos os tecidos. Vale lembrar que células CD4+ apenas reconhecem antígenos apresentados via MHC II, o qual é expresso por um número restrito de células, com as células dendríticas e macrófagos. Já as células CD8+ reconhecem antígenos via MHC I, expresso por uma gama maior de células no organismo. Foi previamente relatado que a resposta de LT CD4+ HCV-específicos é fraca ou ausente na hepatite C crônica (SZABO e DOLGANUIC, 2006; SEMMO e KLENERMAN, 2007; REHERMANN, 2009). No presente estudo, a razão CD4/CD8 foi de 1,06 no fígado e 0,30 na glândula. Os estudos que avaliaram esta razão em fígado trazem resultados conflitantes, de 0,3 (FRENI et al., 1995) e >1,5 (WALEWSKA-ZIELECKA et al., 2008). Já em glândula salivar, um único estudo avaliou três amostras relatou uma razão entre CD4+: CD8+ de 2:1 (COLL et al., 1997).
As células CD57+, CD68+ e S100+ puderam ser detectadas na maioria dos casos, porém em quantidades muito pequenas. Estes três tipos celulares, células NK, macrófagos e células dendríticas, estão relacionados à imunidade inata do hospedeiro, a qual é a primeira a ser ativada frente a uma infecção. Portanto, podemos supor que estas células, embora importantes na fase aguda da infecção pelo HCV, possam ter função prejudicada, ou não estejam em concentração suficiente, levando à cronificação da doença. Por outro lado, apesar de poucas, estas células ainda são encontradas tanto no fígado quanto na glândula, indicando que possivelmente continuam a processar e apresentar antígenos, o que pode contribuir para a manutenção do infiltrado inflamatório crônico nos tecidos.
Ao comparar os grupos de glândula salivar apresentando infiltrado em foco com difuso, observa-se que há uma presença maior de células CD3+ e CD20+ no infiltrado organizado em focos, sendo os resultados para glândula com infiltrado em foco similar ao encontrado para fígado com infiltrado em foco.
corroborar com a literatura, que relata que os anticorpos seriam importantes no desenvolvimento das manifestações extra-hepáticas da hepatite C crônica (LI e SCHWARZ, 2002).
1. Assim como nas amostras hepáticas, o padrão de distribuição focal visto em glândulas salivares apresentou maior proporção de células inflamatórias. Desta forma, este padrão de distribuição parece ser o mais representativo da infecção pelo HCV.
2. O infiltrado inflamatório presente em glândulas salivares de pacientes com hepatite C crônica é composto principalmente por células CD3+ e CD20+. Células CD8+ são mais numerosas que as CD4+, sugerindo uma resposta mediada tanto por linfócitos T quanto linfócitos B, com atividade citotóxica mais proeminente.
3. Apesar do fígado apresentar maior proporção de células inflamatórias, os subtipos leucocitários são essencialmente os mesmos vistos em glândulas salivares, exceto as células CD4+.
