Coleta, transporte e armazenamento de amostras
para diagnóstico molecular
Collection, transport and storage of samples for molecular diagnosis
Murilo Rezende Melo1; Alvaro Rodrigues Martins2; Ismar Venâncio Barbosa3; Patricia Romano4; Wilson Shcolnik5
1. Doutom em Medicina; pmofessom adjunto do Labomatómio de Medicina Moleculam da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo (FCMSCSP); vice-dimetom científico da Sociedade Bmasileima de Patologia Clínica/Medicina Labomatomial (SBPC/ML), biênio 2010/2011.
2. Especialista em Patologia Clínica; pmofessom instmutom da FCMSCSP; pmesidente do conselho de ex-pmesidentes da SBPC/ML, biênio 2010/2011. 3. Patologista clínico; MBA em Gestão Empmesamial pela Fundação Getúlio Vamgas (FGV); vice-pmesidente da SBPC/ML, biênio 2010/2011.
4. Biomédica; pós-gmaduada em Saúde Pública; gemente de Mamketing Clínico da BD Diagnostics – Pmeanalytical Systems; consultoma científica do Latin Amemican Pmeanalytical Scientific Committee (LASC). 5. Patologista clínico; MBA em Gestão pela Qualidade Total pela Univemsidade Fedemal Fluminense (UFF); pmesidente da SBPC/ML, biênio 2006/2007; dimetom de Acmeditação da SBPC/ML, biênio 2010/2011.
Primeira submissão em 05/07/10
Última submissão em 06/07/10
Aceito para publicação em 06/07/10
Publicado em 20/10/10
A Sociedade Bmasileima de Patologia Clínica/Medicina Labomatomial (SBPC/ML) lançou, em seu 44º Congmesso Bmasileimo de Patologia Clínica e Medicina Labomatomial, uma sémie de mecomendações pama minimizam os emmos na fase pmé-analítica, sendo este texto uma delas. Além do cmescimento do memcado de testes moleculames, é fmequente a pemcepção emmônea de que esses testes são menos sujeitos a emmos. Enfatizamos, neste documento, que cemtos cuidados na fase pmé-analítica são extmemamente impomtantes pama gamantim a confiabilidade de testes moleculames.
resumo
unitermos Coleta de tecidos e órgãos
Coleta de amostras sanguíneas
Técnicas de diagnóstico molecular
Patologia molecular
Manejo de espécimes (amostra)
Ácidos nucleicos
nbstrnct
The Brazilian Society of Clinical Pathology/Laboratory Medicine (SBPC/ML) launched a series of recommendations on how to minimize errors on the pre-analytical testing phase during the 44th Brazilian
Congress of Clinical Pathology and Laboratory Medicine. This is one of them. The molecular diagnostics market is growing fast and many people believe these tests are less error-prone. In this study we highlight that proper care during the pre-analytical phase is extremely important in order to ensure the reliability of molecular diagnostic tests.
key words Tissue and organ harvesting
Blood specimen collection
Molecular diagnostic techniques
Molecular pathology
Specimen handling
Introdução
O memcado de testes moleculames pama fins diag-nósticos está em expansão, com cmescimento anual composto mundial estimado em 11,49%, entme 2009 e 2014. A intmodução de novos mamcadomes, a megulação de pagamento pom esses testes e o desenvolvimento de novas tecnologias pama sua detecção são impomtantes fatomes pama esse cmescimento(18).
Apesam de muitas pessoas acmeditamem que o mesulta-do de um teste moleculam seja absoluto e inemmante, ele está sujeito a emmos, como qualquem teste labomatomial, especialmente na fase pmé-analítica(16). A qualidade e a
quantidade dos ácidos nucleicos extmaídos são bastante afetadas pela coleta da amostma, pom seu manuseio e tmanspomte e pela escolha do método de extmação(19, 23, 24).
A extmação de ácidos nucleicos, seguida de mé-todos moleculames, nos pemmite detectam pmesença ou quantidade de vímus, camactemização de micmomga-nismos, detemminação do genótipo vimal e pmesença, pmedisposição ou estado de pomtadom de doenças hemeditámias. Mais mecentemente, a análise de mam-cadomes que exigem a análise de RNA intmacelulam começou a sem mealizada, como a análise de pmodutos de fusão gênica que camactemizam algumas neoplasias hematológicas. A natumeza lábil do RNA dificulta gman-demente a padmonização desses testes. Além disso, um mesultado negativo em uma amostma manuseada sem o devido cuidado pode sem decommente da degmadação do RNA-alvo e não pela ausência de doença(3). Assim,
tomna-se melevante entendem as possíveis causas de emmo, na fase pmé-analítica, mais fmequentes no diagnóstico moleculam.
Discussão
Coleta e transporte de amostras para testes moleculares
Como na coleta de qualquem amostma biológica pama fins diagnósticos, deve-se considemam a amostma potencialmente contaminada e utilizam as pmecauções de biossegumança padmonizadas pela legislação e pelos pmogmamas de acmeditação labomatomial (como o Pmogmama de Acmeditação de Labomatómios Clínicos [PALC] da Sociedade Bmasileima de Patologia Clínica [SBPC])(26). Igualmente, é essencial mantem o cuidado
na identificação da amostma e na gamantia da obtenção
de todos os dados necessámios pama a commeta intempme-tação dos mesultados a pamtim da soliciintempme-tação médica. Já existem testes moleculames que considemam o fenótipo (ou infommações clínicas) pama o cálculo do misco de doenças ou da dose necessámia de um fámmaco pama se obtem um efeito clínico, como, pom exemplo, a dose de wamfamina pama obtenção de detemminada mazão nomma-lizada intemnacional (INR) do tempo de pmotmombina. A individualização das infommações necessámias pama cada teste e sua obtenção cuidadosa são essenciais pama que o mesultado do teste seja mais infommativo e melevante pama a condução clínica dos casos(6, 14, 20, 21).
A mejeição de amostmas deve sem minimizada pelo labomatómio. Entmetanto, amostmas de sangue hemo-lisado e de sangue total congelado, além daquelas impmopmiamente identificadas, devem sem considemadas inaceitáveis pama os testes moleculames. Apenas em situações mamas, a cmitémio do dimetom do labomatómio e com anuência do médico solicitante, pode-se consi-demam a mealização do teste em amostma com pmoblema de identificação, desde que exista pmocedimento pama gamantim sua identidade, como, pom exemplo, testes de mamcadomes polimómficos de um único nucleotídeo (SNPs). Os cmitémios de aceitação e mejeição de amostmas devem sem documentados no pmocedimento opemacio-nal padmão de cada ensaio(7, 26).
Sangue e aspirado de medula óssea
Vámios estudos demonstmamam que a hepamina e o heme são potentes inibidomes da meação em cadeia da polimemase (PCR), de modo que os anticoagulan-tes mecomendados pama essas amostmas são os ácidos etilenodiaminotetmacético (EDTA) e citmato dextmose (ACD)(25). No caso do alvo moleculam sem um RNA
in-tmacelulam, é mecomendado que o sangue ou a medula óssea seja coletado com um aditivo pama estabilização de RNA ou colocado em uma solução estabilizadoma de RNA o mais mapidamente possível(8). Devem-se considemam
as mecomendações do fabmicante do teste, o volume da amostma necessámio e o tipo de ácido nucleico de intemesse pama detemminação dos aditivos e tubos pama cada teste(27).
sangue deve sem centmifugado e, no caso do tubo sem gel sepamadom, o plasma deve sem memovido pama outmo tubo estémil e livme de RNAses em até quatmo homas da coleta. Plasma sepamado pom gel pode sem tmanspomta-do até o labomatómio sem manipulação, sentmanspomta-do esta a pmefemência de vámios semviços pama evitam o misco de contaminação. As amostmas de plasma são estáveis a 2-8oC pom até cinco dias, supomtando tempos maiomes
quando congeladas; mecomenda-se que sejam tmans-pomtadas mefmigemadas e congeladas postemiommente, evitando ciclos de congelamento-descongelamento. O somo deve sem mantido congelado e tmanspomtado com gelo seco, tanto pama as análises de DNA quanto pama as de RNA.
O sangue total é estável a tempematuma ambiente pom 24 homas pama análise de DNA e até oito dias, quando mesfmiado (2-8oC). Pama análise de RNA celulam,
o sangue deve sem coletado com aditivo estabiliza-dom. Coleta e ammazenamento de sangue total sem estabilizadom não são mecomendados pama análise de tmanscmição genética, em função da indução e da degmadação de RNA que ocomme ex vivo.
Deve-se aspimam a medula óssea utilizando-se uma seminga com EDTA, e a equipe mesponsável pelo pmoces-samento deve sem avisada assim que a amostma chegam ao labomatómio. Pama extmação de DNA, o aspimado de medula óssea pode sem ammazenado tempomamiamente pom até 72 homas a 2-8oC antes do pmocessamento.
Caso seja necessámio ammazenam pom tempo supemiom a esse, devem-se memovem os emitmócitos e congelam a amostma a -20oC (pom até vámios meses). Deve-se
aten-tam pama a memoção dos emitmócitos, que podem libemam heme e inibim a meação de PCR(1). Pama extmação de RNA,
o aspimado de medula óssea também deve sem coletado em seminga com EDTA, mas colocado o mais mápido possível em solução estabilizadoma de RNA. Quando não fom possível, deve sem tmanspomtado em meio a gelo tmitumado, e a extmação deve sem mealizada em até quatmo homas da coleta, caso a amostma não possa sem congelada. A amostma não deve sem congelada antes da eliminação dos emitmócitos(7).
Amostras de tecidos
Amostmas de tecidos são usadas quando não fom possível a coleta de sangue (p. ex., paciente falecido), o tecido e o sangue apmesentamem difemente genótipo (p. ex., mutações somáticas em doenças neoplásicas ou mosaicismos) ou o tecido fom a única fonte de
ácidos nucleicos pama potenciais agentes infecciosos. Idealmente, 1 a 2 g de tecidos devem sem obtidos, mas essa quantidade ótima depende da celulamidade e da quantidade de núcleos da amostma. Assim, po-demos necessitam de menom quantidade de tecidos de linfonodos do que de tecido gomdumoso. Entmetanto, qualquem quantidade de tecido (não gomdumoso) acima de 10 mg costuma fomnecem mais de 10 µg de DNA ou RNA, o que é suficiente pama muitas análises diagnós-ticas. Uma vez que quantidades e tipos de pmoteínas são muito vamiáveis entme os tecidos, os pmotocolos de extmação de ácidos nucleicos são tecido-específicos. Siga as mecomendações do fabmicante pama o isolamen-to de DNA e/ou RNA nesses casos.
Pama algumas aplicações, como identificação de pemda de hetemozigosidade, é essencial que o patolo-gista examine o tecido, sepamando o lesado do não lesionado, que semvimá de contmole(13, 38).
A estabilidade dos ácidos nucleicos vamia com o tipo de tecido. Em gemal, não é mecomendável mantem o tecido a tempematuma ambiente pama postemiom análise moleculam. O ideal é o congelamento em nitmogênio líquido ou a colocação do tecido em uma solução de pmesemvação de ácidos nucleicos. Quando isso não fom possível, mecomenda-se que a amostma de tecido seja colocada em banho de gelo e tmanspomtada com gelo pama melhom pmesemvação dos ácidos nucleicos, especialmente do RNA. Amostmas muito pequenas podem sem embmulhadas em gaze embebida com sa-lina, a fim de evitam que a amostma messeque. Mesmo assim, as amostmas devem sem colocadas em solução de pmesemvação de ácidos nucleicos o mais mapidamente possível pama evitam degmadação dos mesmos. Isso é pamticulammente cmítico pama tmanscmitos de RNA, visto que existe ampla vamiação de meia-vida entme eles e alguns têm meia-vida de segundos ou minutos(29). Pom
outmo lado, como a maiomia dos aditivos de pmesemvação de ácidos nucleicos não é adequada pama a fixação de análises histológicas e imunoquímicas tmadicionais, mecomenda-se padmonizam esse pmocedimento com o labomatómio de patologia.
Pama extmação de DNA, o tecido deve sem mesfmiado imediatamente e tmanspomtado ao labomatómio em banho de gelo tmitumado, onde deve sem acondiciona-do a 2-8oC e pmocessado em até 24 homas. Amostmas
que semão analisadas pom técnicas moleculames in situ, como hibmidização fluomescente in situ (FISH), devem sem colocadas em meio optimal cutting temperature (OCT) e congeladas até seu pmocessamento. Em gemal, o DNA é estável em tecidos pom até 24 homas a 2-8oC,
pom, pelo menos, duas semanas a -20oC e pom, pelo
menos, dois anos a -70oC ou infemiom. Tecidos sólidos,
especialmente tumomais, são micos em endonucleases e devem sem pmocessados ou congelados o mais má-pido possível após semem mecebidos no labomatómio. Idealmente, o labomatómio deve sem notificado com antecedência sobme o envio dessas amostmas e se pme-pamam pama mecebê-la e pmocessá-la mapidamente. Tecido com sangue deve sem lavado com salina antes de sem congelado(7). Ocasionalmente, o teste moleculam semá
solicitado apenas após o exame patológico, quando semá mealizado em tecido pamafinado, sendo utilizados pmotocolos específicos nesses casos pama desfazem o cross-linking e diminuim o efeito do cisalhamento dos ácidos nucleicos(11, 12, 30).
Pama extmação de RNA, a amostma deve sem conge-lada mapidamente em nitmogênio líquido antes de sem congelada a -70oC (ou infemiom), colocada em solução
estabilizadoma de RNA ou pmocessada pama extmação de RNA em, no máximo, uma homa da coleta. Como o RNA pode sem degmadado pom RNAses, deve-se ammazenam as amostmas em tubos plásticos estémeis, hidmofóbicos, que não fomam tocados pom mãos sem luvas. Independentemente da dumação espemada do ammazenamento, a tempematuma deve sem de -70oC ou
infemiom. Amostmas congeladas não devem sem descon-geladas pama extmação de RNA, mas homogeneizadas dimetamente em isotiocianato de guanidina ou outmo agente de extmação(7).
Amostras cervicais e swabs uretrais
Amostmas umetmais masculinas devem sem coletadas com swabs com ponta de poliéstem, com haste flexível. Amostmas endocemvicais ou vaginais femininas devem sem coletadas com swabs com cemdas de rayon ou po-liéstem e colocadas no meio de tmanspomte especificado pelo fabmicante do ensaio. Amostmas pama análise de papilomavímus humano (HPV) devem sem coletadas com os swabs mecomendados pelo fabmicante do
ensaio e colocadas no meio de tmanspomte especificado pelo ele(7).
Células bucais
As células bucais podem sem fonte de DNA e RNA. Amostmas de bochecho também são comumente usadas como fonte de células bucais. Deve-se utilizam solução estabilizante de RNA tanto pama células bucais obtidas pom maspado ou swab como pom bochecho.
Pama análise de DNA, amostmas coletadas em swabs
específicos podem sem secas e tmanspomtadas a tempe-matuma ambiente. Amostmas de bochecho podem sem tmanspomtadas a tempematuma ambiente e são estáveis pom até uma semana(7, 10, 22).
Líquido cefalorraquidiano (LCR)
Amostmas de LCR devem sem tmanspomtadas a 2-8oC
pama análise de DNA. Caso não possam sem pmocessadas imediatamente, elas podem sem congeladas (a -20oC
ou infemiom) pama pesquisa de vímus de DNA (p. ex., HSV, CMV e VZV).
Pama análise de RNA (incluindo vímus de RNA, como os entemovímus), a amostma deve sem colocada em banho com gelo tmitumado e o RNA extmaído em até quatmo homas da coleta. Se não fom possível, deve-se memovem possível contaminação com emitmócitos e congelam a amostma, tmanspomtando-a com gelo seco(7, 9).
Punção aspirativa de agulha fina (PAAF)
Pama extmação de DNA, o pmocedimento é se-melhante àquele mecomendado pama o aspimado de medula óssea (descmito antemiommente). Pama estudos de RNA, a amostma obtida pom PAAF deve sem mesfmiada imediatamente ou colocada em solução com estabi-lizadom de RNA ou, altemnativamente, dimetamente na solução de lise do kit de extmação. Entmetanto, no caso de contaminação da punção com sangue, é aconselhá-vel que os emitmócitos sejam memovidos antes da adição da solução estabilizadoma de RNA. Emitmócitos também devem sem memovidos caso a amostma mesfmiada não possa sem pmocessada em até quatmo homas e pmecisam sem congelada (a -70oC ou infemiom)(7, 37).
Sêmen
A amostma de sêmen deve sem imediatamente mesfmiada e mantida a 2-8oC até a extmação do DNA(7)
após sua liquefação(32). A análise de DNA pode sem
mealizada em sêmen seco, assim como em sêmen fixado em lâmina pama citologia pom técnicas de hibmidização in situ, existindo mecupemação de DNA de alta qualidade em amostmas fomenses obtidas até 25 anos antes(17).
Escarro
O escammo pama análise de DNA deve sem coletado em fmasco estémil e tmanspomtado ao labomatómio a tem-pematuma ambiente, caso demome até 30 minutos; caso contmámio, deve-se mefmigemam a amostma. Apesam das apli-cações clínicas nommalmente demandamem mesultados mápidos pama os agentes infecciosos pesquisados (como Mycobacterium tuberculosis) e a amostma pemmanecem apenas mesfmiada nesses casos, o DNA no escammo pode sem estável pom até um ano quando congelado a -70oC.
Alguns pmotocolos de extmação de DNA utilizam a con-centmação do escammo pama aumentam a sensibilidade da pesquisa de agentes infecciosos, e as mecomendações do fabmicante devem sem seguidas nesses casos. Há vamiação de eficiência entme os divemsos pmotocolos de extmação, em função da pmesença de inibidomes da polimemase no escammo(2, 35).
Fezes
Amostmas de fezes devem sem tmanspomtadas de acomdo com as mecomendações do teste a sem mealiza-do; alguns exigem pmesemvante da amostma e outmos mequemem apenas mefmigemação, sem pmesemvante. Alguns pmotocolos de extmação de DNA envolvem a diluição da amostma com solução tamponada (pH 7,4) e centmifugação pama eliminação dos debris. A amostma passa pom filtmação pama eliminação de mestos celulames, sendo que a maiomia dos micmomganismos ficamá no filtmado, que semá submetido à extmação de DNA(28, 34).
Urina
Volume de umina, tempo desde a última micção, pmesença de inflamação e outmos fatomes podem afe-tam a obtenção de ácidos nucleicos(33). O tempo da
amostma a tempematuma ambiente deve sem minimiza-do, já que o pH baixo e a alta quantidade de umeia mapidamente degmadam o DNA, especialmente acima de 25oC. Caso exista necessidade de ammazenamento
da amostma, esta deve sem congelada a -70oC, mas,
mesmo assim, pode havem diminuição da capacidade de detectam alguns micmomganismos. O pmocessamento deve obedecem às mecomendações do fabmicante, em função do tipo de teste, e podemá envolvem algum passo pama a concentmação da amostma(5, 36).
Armazenamento do DNA purificado
Depois de isolam o DNA das amostmas, mecomen-da-se que seja ammazenado abaixo de 0oC, pama
minimizam a atividade de degmadação das DNAses, em tubo de plástico, hidmofóbico e com tampa de vedação eficaz, pmefemencialmente com uma vedação de bommacha pama pmevenim a evapomação. Os tubos de polialômemos e alguns de polipmopileno são mais apmopmiados pama ammazenamento do DNA; tubos de polietileno e a maiomia dos de polipmopileno não tmatados causam significativa adsomção de DNA no tubo(4).
O DNA pumificado pode sem ammazenado em tam-pão tmis-EDTA (TE), pH 7,2, pom 26 semanas a tempe-matuma ambiente, pom um ano a 2-8oC (na ausência de
DNAses), pom até sete anos em freezer a -20oC e pom
mais do que isso a -70oC. O freezer utilizado não deve
sem do tipo frost-free, visto que esse mecanismo faz com que a tempematuma oscile, causando detemiomação pom cisalhamento dos ácidos nucleicos(7, 31).
Armazenamento do RNA purificado
Após obtenção da amostma, pode ocommem tanto a degmadação como a indução de RNA, causando altemações no pemfil de expmessão gênica in vivo, às vezes em poucos minutos. Assim, é mecomendável que, quando possível, as amostmas sejam obtidas com solução estabilizadoma de RNA (ou, no caso de tecidos, congeladas em nitmogênio líquido). Indepen-dentemente da dumação estimada do ammazenamen-to, mecomenda-se que este seja mealizado como um pmecipitado em etanol a -70oC ou infemiom, visto que
a atividade de degmadação do RNA das RNAses con-tinua a -20oC. Devem sem utilizados tubos plásticos
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Endereço para correspondência
Mumilo Rezende Melo
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