PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E
ENGENHARIA DE MATERIAIS - PPGCEM
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
PROCESSAMENTO E ANÁLISE DE IMAGENS
APLICADOS NA CARACTERIZAÇÃO DA
SUPERFICIE DO TITÂNIO SUBMETIDO A
UM ENSAIO DE CULTURA DE CÉLULAS
Franciéric Alves de Araújo
Orientador:
Prof. Dr. Clodomiro Alves Júnior
Co-orientador:
Prof. Dr. Rômulo Ribeiro Magalhães de Sousa
Dissertação nº 047/PPGCEM
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E
ENGENHARIA DE MATERIAIS - PPGCEM
PROCESSAMENTO E ANÁLISE DE IMAGENS
APLICADOS NA CARACTERIZAÇÃO DA
SUPERFICIE DO TITÂNIO SUBMETIDO A
UM ENSAIO DE CULTURA DE CÉLULAS
Franciéric Alves de Araújo
Orientador:
Prof. Dr. Clodomiro Alves Júnior
Co-orientador:
Prof. Dr. Rômulo Ribeiro Magalhães de Sousa
Março de 2009 Natal / RN
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciência e
Engenharia
de
Materiais
da
Dedico este trabalho á minha mãe (in memorian), meus avós e minha esposa, aos
meus familiares e meus amigos que sempre estiveram ao meu lado acreditando e
A Deus por ter me dado a oportunidade de estar no mundo e por estar sempre do meu lado me guiando e protegendo.
Ao professor Dr. Clodomiro Alves Júnior, orientador desta dissertação, pelo empenho e orientação prestada. Por compreender e ajudar, através de revisões e discussões, para que concluísse este trabalho.
Aos professores Dr. Ayrton de Sá Brandim, e Dr. Rômulo Ribeiro Magalhães de Sousa, pelo estímulo.
Aos amigos Sávio, Bruno, Haroldo e Marina, pelo incentivo e imensa ajuda na pesquisa deste trabalho.
Ao CEFET-PI e á UFRN pelo apoio, oportunidade e principalmente, pelo financiamento deste trabalho.
O presente trabalho tem como objetivo desenvolver uma metodologia de
análise de imagens, utilizando sobreposições, que auxilie na identificação de
características microestruturais, em superfícies de titânio, que possam estar
associadas com a sua resposta biológica. Desse modo, superfícies de titânio
tratadas termicamente de 08(oito) diferentes maneiras foram submetidas a um
ensaio de cultura de células. Buscou-se uma relação entre os grãos, textura e
contornos de grãos da superfície de titânio (atacada) procurando relacionar com o
processo de proliferação e adesão. Foi utilizado um software open source para a
contagem das células aderidas à superfície do titânio. A justaposição das imagens
antes e após a cultura de células foi obtida com o auxílio de impressões de
micro-dureza feita sobre a superfície das amostras. A partir desta imagem onde há a
sobreposição, é possível o estudo de uma possível relação entre o crescimento
celular com as características microestruturais da superfície de titânio. Essa
metodologia se mostrou eficiente ao descrever um conjunto de procedimentos que
são úteis na analise de superfícies de titânio submetidos a uma cultura de células.
Palavras-chave: Titânio, Processamento e Análise de Imagens.
This work aims to develop a methodology for analysis of images using
overlapping, which assists in identification of microstructural features in areas of
titanium, which may be associated with its biological response. That way, surfaces of
titanium heat treated for 08 (eight) different ways have been subjected to a test
culture of cells. It was a relationship between the grain, texture and shape of grains
of surface of titanium (attacked) trying to relate to the process of proliferation and
adhesion. We used an open source software for cell counting adhered to the surface
of titanium. The juxtaposition of images before and after cell culture was obtained
with the aid of micro-hardness of impressions made on the surface of samples. From
this image where there is overlap, it is possible to study a possible relationship
between cell growth with microstructural characteristics of the surface of titanium.
This methodology was efficient to describe a set of procedures that are useful in the
analysis of surfaces of titanium subjected to a culture of cells.
___________________________________________________________________
1. Introdução ... 11
2. Aspectos Teóricos ... 15
2.1. Biomateriais ... 15
2.2. Titânio ... 16
2.2.1. Resistência do Titânio à Corrosão. ... 20
2.2.2. Titânio e Biocompatibilidade ... 20
2.2.3. Titânio e Osseointegração ... 20
2.3. Padi ... 27
3. Materiais e Métodos ... 46
4. Resultados e discussão ... 55
5. Conclusões e Sugestões ... 67
5.1. Conclusões ... 67
5.2. Sugestões ... 67
6. Referências ... 69
Figura 2.1 Amostra de ilmenita, FeTiO3, mais importante minério de titânio
(www.cdcc.sc.usp.br). ... 17
Figura 2.2 Amostra de quartzo enfumaçado com estrela de rutilo (TiO2) (www.cdcc.sc.usp.br). ... 17
Figura 2.3 Representação da estrutura cristalina do titânio pelo método das esferas (A) fase α (B) fase β (CALLISTER, W. D., 2000). ... 18
Figura 2.4 Aspecto macroscópico da liga de titânio comercialmente puro(XAVIER, S.P.,2002). ... 19
Figura 2.5 Micrografias por microscopia ótica com: (A) 200x e (B) 500x evidenciam a microestrutura do titânio comercialmente puro(XAVIER, S.P.,2002). ... 19
Figura 2.6 (a) Imagem bidimensional em tons de cinza. Os eixos x e y são as coordenados espaciais e f(x,y) é a função que representa a intensidade ou brilho naquele ponto (BASTOS, 2001). (b) escala em tons de cinza com valores atribuídos ao brilho em cada ponto. ... 33
Figura 2.7 Digitalização de uma imagem. O pixel com coordenadas [x=10, y=3] tem o valor inteiro proporcional ao brilho médio naquele elemento de matriz(HTTP://www.ph.tn.tudelft.nl/Courses/FIP/frames/fip.html). ... 34
Figura 2.8 Exemplo de uma imagem em tons de cinza com duas fases (a) e o resultado da segmentação (b) no limiar mostrado na Figura 2.9 (HTTP://www.ph.tn.tudelft.nl/Courses/FIP/frames/fip-segmenta.html). ... 38
Figura 2.9 Histograma da imagem da Figura 2.8(a). A linha tracejada indica o limiar de tom de cinza escolhido para detectar os objetos, conforme ilustrado na Figura 2.8 (b) (HTTP://www.ph.tn.tudelft.nl/Courses/FIP/frames/fip-segmenta.html). ... 38
Figura 2.10 (a) Imagem editada a partir de imagens de elétrons retroespalhados de resina fenólica (fase mais escura à esquerda) e de borracha (fase mais clara à direita). (b) A mesma imagem segmentada por limiar de tom de cinza(BORGER DA COSTA, 2003). ... 40
Figura 3.1 Photoshop 9 CS2 ... 49
Figura 3.2 Camadas sobrepostas no Photoshop. ... 50
Figura 3.3 Aplicação de filtros para determinar o grau de transparência. ... 51
Figura 3.4 Figuras sobrepostas com os filtros aplicados. ... 51
Figura 3.5 Sobreposição exata usando as marcações de microdureza. ... 52
Tabela 3.2 Titânio com têmpera sem revenimento – Amostra 01 ... 48
Tabela 4.1 Titânio com têmpera sem revenimento - Sobreposição ... 56
Tabela 4.2 Titânio com têmpera revenido a 200ºC - Sobreposição ... 57
Tabela 4.3 Titânio com têmpera revenido a 300ºC - Sobreposição ... 58
Tabela 4.4 Titânio com têmpera revenido a 500ºC - Sobreposição ... 59
Tabela 4.5 Titânio revenido a 300ºC - Sobreposição ... 60
Tabela 4.6 Titânio revenido a 300ºC - Sobreposição ... 61
Tabela 4.7 Titânio sem tratamento - Sobreposição ... 62
Tabela 4.8 Titânio revenido a 200ºC - Sobreposição ... 63
Capítulo 1
1.
Introdução
As propriedades biológicas de um determinado material, tais como atoxidade,
resistência à corrosão ou controle de degradabilidade, módulo de elasticidade e
resistência à fadiga, têm sido amplamente estudadas e pesquisadas devido à alta
relevância em termos de seleção para a utilização como biomateriais numa
aplicação biomédica específica (LIU, X., et al., 2004).
Dentre os diversos materiais utilizados para esse fim, atualmente o titânio e
suas ligas têm tido aplicações crescentes e é objeto de estudo de muitos grupos
acadêmicos no Brasil e no mundo.
A superfície do material é a principal responsável pela resposta satisfatória do
ambiente biológico em relação aos dispositivos médicos artificiais. As superfícies
nativas (originais dos materiais) após várias pesquisas, não se mostraram
apropriadas para aplicações biomédicas e alguns tratamentos superficiais precisam
ser realizados. Outra razão importante para a realização da modificação superficial
de modo a deixar o material apto para a produção de dispositivos médicos à base de
titânio é o fato de que, após a modificação, a superfície apresentar propriedades
específicas que são diferentes daquelas originais. Por exemplo, uma boa formação
óssea pode ser obtida com uma superfície corretamente modificada.
Na busca por superfícies que supram a necessidade de obter uma rápida
osseointegração, várias pesquisas têm sido desenvolvidas, modificando estas
superfícies pelos processos mais variados (SILVA, 2005) que envolvem métodos
mecânicos, químicos e físicos de tratamento de superfície, obtendo assim, os mais
Uma das formas de prevenir as falhas primárias dos implantes seria a de
otimizar o comportamento osseointegrador do Ti (Castellani et al., 1999). Isto
poderia ser alcançado pela compreensão das características de superfície dos
implantes, como a determinação dos efeitos da energia de superfície, composição,
rugosidade e topografia sobre as respostas biológicas iniciais, como a proliferação
celular, diferenciação, produção de matriz extracelular, maturação e calcificação
óssea (Kieswetter et al., 1996).
Na tentativa de melhorar a quantidade e qualidade da interface osso-implante,
numerosas modificações de superfície têm sido propostas, sendo muitas destas
baseadas na teoria de que uma melhor e mais rápida osseointegração pode ser
alcançada por alguma alteração da topografia ou rugosidade do implante
(Klokkevold et al., 1997). Embora vários trabalhos apresentem relações entre as
características da superfície e a adesão celular, pouco se conhece sobre o
mecanismo dessa adesão. O presente trabalho tem o intuito de contribuir na
identificação da relação entre os aspectos topográficos e microestruturais sobre o
crescimento e a adesão celular. Nesse sentido o presente trabalho realiza análises
de imagens de superfícies com células aderidas que foram realizadas e comparadas
com as mesmas superfícies antes da adesão.
Para um melhor entendimento, dividiu-se este trabalho em mais 4 capítulos. O
segundo capítulo aborda uma revisão de literatura sobre Biomateriais, além de um
maior entendimento sobre Processamento e Análise Digital de Imagens. O terceiro
capítulo descreve a confecção dos corpos-de-prova, os tratamentos térmicos
dos resultados e discussões baseados na metodologia utilizada, e por fim, no quinto
Capítulo 2
2.
Aspectos Teóricos
2.1. Biomateriais
Biomaterial é definido como qualquer substância ou combinação de
substâncias, que não sejam drogas ou fármacos, de origem natural ou sintética,
podendo ser utilizadas por qualquer período de tempo, aumentando ou substituindo
parcial ou totalmente qualquer tecido, órgão ou função do corpo, com a finalidade de
manter e/ou alterar a qualidade de vida do paciente (HELMUS E TWEDEN,1995).
Os implantes metálicos e as próteses foram utilizados efetivamente a partir da
década de 30, e alguns dos fatos responsáveis pelo desenvolvimento desses
biomateriais foram: o surgimento do conceito de cirurgia asséptica por Joseph Lister
em 1865 e a descoberta da penicilina por Alexandre Fleming na segunda década do
século XX. Antes dessa época não era possível assegurar ao paciente a
recuperação de qualquer tipo de trauma ou procedimento cirúrgico por causa dos
elevados riscos de infecção a que o mesmo estava exposto. Sendo assim, também
não era factível avaliar de forma exata o comportamento de um material utilizado
como implante(WILLIAMS, 1981).
Quando Branemark, na década de 1950, descobriu o processo de
osseointegração do titânio através da realização de criteriosos estudos de micro
circulação sanguínea, as pesquisas se concentravam na capacidade desse material
ser utilizado na manufatura de implantes e elementos de regeneração óssea.
Inicialmente, a seleção do titânio como elemento metálico para inclusão no corpo
humano foi impulsionado pela capacidade do material em resistir à corrosão, pois o
em metais ou materiais não adequados. Além dessa característica, o titânio
comercialmente puro e as ligas de titânio são freqüentemente utilizados em
implantes dentários devido à sua excelente resistência mecânica, estabilidade
química e biocompatibilidade.
No Brasil, devido ao menor custo do implante, muitas cirurgias ainda são
realizadas com implantes à base de aço inoxidável. Esse material apresenta índices
elevados de toxicidade, e eventual degeneração nos tecidos ao redor do implante,
ou seja, pequena biotolerância. Uma das principais vantagens da utilização da
hidroxiapatita e do titânio está no tempo de fixação do implante no organismo
humano. O titânio em termos de matéria-prima apresenta maior custo em relação ao
aço inoxidável, ou seja, maior investimento inicial. A economia está na sua maior
biocompatibilidade e durabilidade, pois o paciente pode ficar muitos anos sem
precisar fazer cirurgias de revisão. O titânio é mais leve, não possui elementos
tóxicos e se fixa por cerca de 20 anos no organismo humano. Já com o aço
inoxidável, além de componentes tóxicos como o níquel e o cromo, o paciente
precisa passar por constantes cirurgias para a manutenção do material, o que
aumenta os custos do tratamento (AGÊNCIA FAPESP, 2005).
2.2. Titânio
Foi descoberto em 1791 por W. Gregor em pesquisas com a areia magnética.
Mais tarde M. H. Klaproth o encontrou no rutilo e em 1825 foi isolado por J. J.
Berzelius (LIU, X., et al., 2004). O titânio é nono elemento mais abundante, em peso,
na crosta terrestre. Os principais minérios são a ilmenita (FeTiO3), o rutilo e o
anatásio (LEE, J. D., 1991). A figura 2.1 mostra o minério ilmenita que é encontrado
Figura 2.1 Amostra de ilmenita, FeTiO3, mais importante minério de titânio (www.cdcc.sc.usp.br).
O titânio na forma impura foi obtido por Nilson e Pettersson em 1887. O metal
puro (99,9%) foi preparado em 1910 por Hunter, através do aquecimento do cloreto
com sódio. Não é encontrado na forma elementar (figura 2.2), mas sim ligado a
outros metais e substâncias, e está amplamente distribuído na natureza nessa forma
(LEE, J. D., 1991).
O titânio é um elemento alotrópico, ou seja, existe em mais de uma forma
cristalina. Em temperatura ambiente o titânio apresenta uma estrutura cristalina tipo
hexagonal compacta (HC) que é a fase α. Esta estrutura transforma-se em cúbica de
corpo centrado (CCC), denominada de fase ß, na temperatura de 882,5ºC (LIU, X.,
et al., 2004). Ambas as estruturas podem ser observadas na figura 2.3.
Figura 2.3 Representação da estrutura cristalina do titânio pelo método das esferas (A) fase α (B) fase β (CALLISTER, W. D., 2000).
A figura 2.4 mostra o aspecto macroscópico onde se observa a cor cinza
escuro do titânio comercialmente puro e a figura 2.5 exibe as características
aos contornos dos grãos por uma solução metalográfica composta de ácido
fluorídrico e nítrico (HF:HNO3 – 1:3).
Figura 2.4 Aspecto macroscópico da liga de titânio comercialmente puro(XAVIER, S.P.,2002).
Figura 2.5 Micrografias por microscopia ótica com: (A) 200x e (B) 500x evidenciam a microestrutura do titânio comercialmente puro(XAVIER, S.P.,2002).
A resistência mecânica de um material está associada a características como
a porosidade e microestrutura que, por sua vez, estão associadas ao tipo de
processamento utilizado na fabricação do produto. Ou seja, de acordo com o
propriedades mecânicas. No caso dos implantes de titânio após avaliação da
resistência mecânica dos filmes foi comprovado do que a porosidade desejada está
em torno de 40%. É importante considerar o fato de que elevada porosidade implica
necessariamente em perda de resistência mecânica (TAKEMOTO, M., et al., 2005).
Deve-se, portanto, encontrar uma forma de processamento, tal que a relação
porosidade/resistência resulte em um implante que cumpra com sucesso a sua
função.
2.2.1. Resistência do Titânio à Corrosão.
O titânio é um dos materiais de engenharia mais resistentes à corrosão. Esse
metal apresenta excelente resistência à corrosão devido à presença de uma camada
de óxido superficial natural que cresce espontaneamente quando a superfície do
titânio é exposta ao ar (LIU, X., et al., 2004).
2.2.2. Titânio e Biocompatibilidade
A capacidade de o material produzir uma resposta apropriada no hospedeiro,
em uma aplicação específica é denominada biocompatibilidade, ou no caso de um
implante ósseo, é a capacidade de o material induzir a formação de um novo tecido
ósseo pela diferenciação de células osteoprogenitoras (ZAFFE, D., 2005).
2.2.3. Titânio e Osseointegração
Nos anos 70 Branemark introduziu o conceito de osseointegração: é a união
anatômica e funcional direta entre o osso vivo remodelado e a superfície do implante
capaz de receber cargas funcionais. Pesquisas em microscopia ótica e eletrônica em
espaçamento entre o tecido vivo e o implante de titânio comercialmente puro,
sugerindo a possibilidade da existência de ligações químicas diretas na superfície do
implante (implante bioativo). Esta osseointegração permite uma transmissão
eficiente de tensão entre o osso e o implante, causando a ausência de movimento
relativo nesta interface, diminuindo desta forma a perda óssea por parte do
organismo (ZAFFE, D., 2005).
2.2.3.1. Cultura de Células
Dentre os fatores importantes para a obtenção de sucesso na
osseointegração, as superfícies do implante têm sido relatadas com destaque sobre
as demais. Superfícies com textura são conhecidas por acelerar a fase de
cicatrização inicial, devido a maior adsorção de proteínas, acúmulo e ativação de
plaquetas e retenção de fibras, promovendo aposição óssea em menores períodos
de tempo (KASEMO, 2002).
A compreensão da relação existente entre os fatores mecânicos e biológicos
relacionados à osseointegração é determinante do sucesso clínico no tratamento
com implantes ossoeintegrados. Estudos histológicos e histomorfométricos
demonstram que implantes com superfícies rugosas apresentam maior percentual
de contato ósseo, em períodos mais curtos de tempo, quando comparados aos
implantes de titânio com superfície lisa ou usinada (CORDIOLI, 2000).
2.2.3.2. Propriedades de superfícies de titânio
No Para ocorrer a formação de tecido ósseo é necessário que haja o
recrutamento e a proliferação de células precursoras de osteoblastos, que as
mesmas se diferenciem em osteoblastos e produzam matriz extracelular não
Estes eventos são bastante influenciados por algumas propriedades da superfície
dos implantes de Ti, tais como, a composição química, energia de superfície e a
textura da superfície, uma combinação entre topografia e rugosidade (Schwartz &
Boyan, 1994).
2.2.3.3. Composição Química
Em odontologia, o ti cp tem se tornado um dos materiais para a confecção do
corpo do implante mais usados pelo seu melhor comportamento biológico, enquanto
a liga de Ti-Al6-V4 encontra mais utilidade na ortopedia devido às suas
características de maior resistência mecânica (van Noort, 1987).
Taborelli et al. (1997) apresentaram um estudo físico-químico das
propriedades do ti cp submetido à vários tratamentos designados para otimizar sua
topografia para aplicação em implantologia oral. A rugosidade, composição química
da superfície e umectabilidade foram analisados em espécimes de Ti preparados por
polimento mecânico, ataque ácido (HCl / H2SO4), jateamento de areia e ataque
ácido e spray de plasma de Ti. A espectroscopia eletrônica mostrou que todas as
amostras possuíam TiO2 e quantidades menores de C, S, Si e Ca como impurezas.
Os espécimes que sofreram ataque ácido apresentaram uma camada contendo
hidrogênio abaixo da camada superficial de óxido. Os tratamentos realizados neste
estudo influenciaram essencialmente a rugosidade de superfície, mas preservaram a
composição química e as propriedades de umectabilidade da camada superficial de
óxido de Ti.
2.2.3.4. Energia de Superfície
Para Doundoulakis (1987) e den Braber et al. (1995), a aplicação de
umectabilidade (energia de superfície ou hidrofilia) e a performance biológica sobre
este, além de poder modificar a topografia de superfície (Kilpadi et al., 1998).
Segundo den Braber et al. (1995), vários estudos têm sido realizados para se
tentar explicar a influência da energia de superfície de um material de implante sobre
o comportamento celular. A teoria mais amplamente aceita é a de que estas
propriedades têm um efeito seletivo sobre a configuração e conformação das
proteínas que são adsorvidas sobre um substrato.
2.2.3.5. Textura de superfície
A morfologia (textura) da superfície de um implante, incluindo a
microtopografia e rugosidade, tem sido relatada por influenciar o sucesso de
cicatrização dos implantes endósseos (Rich & Harris, 1981; Thomas & Cook, 1985).
Uma superfície mais rugosa aumenta a área de superfície e melhora o potencial de
embricamento mecânico do osso à superfície do implante (Klokkevold et al., 1997).
Os experimentos com cultura de células in vitro parecem ser uma maneira de
preencher a existente falta de conhecimento à respeito desses aspectos (Castellani
et al., 1999).
A rugosidade de superfície tem se mostrado em diversos estudos in vitro
como um importante parâmetro que influencia a resposta biológica básica (Bowers
et al., 1992; Keller et al., 1990; Castellani et al., 1999).
Porém, a influência final da configuração microgeométrica e textura de
superfície final sobre a resposta óssea ainda não é completamente compreendida
Segundo Black (1992), as células tendem a responder mais fortemente aos
padrões de textura de superfície com dimensões aproximadas da ordem do tamanho
de uma célula, o que corresponde em geral em alguns micrometros.
Anselme et al. (2000) avaliaram quantitativamente a adesão de osteoblastos
humanos sobre substratos metálicos (TiAl6V4) com várias rugosidades de superfície
em diferentes períodos após a inoculação, e estudaram sua correlação com
mudanças qualitativas na expressão de proteínas de adesão. As células se
orientavam de maneira paralela nas superfícies polidas. Esta orientação não foi
afetada pelos sulcos residuais após o polimento. Nas superfícies jateadas as células
nunca chegaram à confluência e tinham um formato estrelado, e a camada celular
não apresentava organização. A orientação da matriz extracelular (fibronectina,
colágeno tipo I, osteopontina) e proteínas do citoesqueleto (actina e vinculina)
refletiam a orientação da camada de células. Os autores observaram uma menor
adesão e proliferação celulares nas superfícies mais rugosas e menos organizadas
(jateadas). Tais resultados seriam explicados pela formação de número e tamanho
reduzidos das placas de adesão sobre as superfícies mais caóticas.
Outros trabalhos relatam a influência da morfologia da superfície do implante
de Ti sobre as células osteoblásticas in vitro. As células parecem se orientar pelos
sulcos de superfícies micro-usinadas. Dependendo do grau de rugosidade, as
células podem se comportar nos sulcos como se as superfícies fossem lisas. Além
do mais, nas superfícies rugosas criadas sem padronização, como aquelas
originadas a partir de jateamentos ou ataques ácidos, as células formam diferentes
focos de adesão, o que resulta em um fenótipo distinto daquelas observadas em
2.2.3.6. Tratamentos Térmicos do Titânio
A resposta do titânio e de suas ligas ao tratamento térmico depende da
composição química do material bem como da presença das diferentes
microestruturas (fases alfa, beta ou alfa-beta).
Qualquer tratamento térmico em temperaturas da ordem de 427 ºC deve
prover ao titânio a formação de uma atmosfera protetora que evita a absorção de
oxigênio ou nitrogênio e a formação de camadas de óxidos indesejáveis.
Alívio de Tensões
O titânio e suas ligas podem ser submetidos a tratamentos térmicos de alívio
de tensões sem efeitos adversos à resistência mecânica e à dutilidade. Esse tipo de
tratamento reduz as tensões residuais indesejáveis que resultam de:
a) Deformação não uniforme de forjamento a partir da conformação a frio e
endireitamento;
b) Usinagem assimétrica de placas ou peças forjadas;
c) Soldagem de artigos fundidos ou trabalhados e resfriamento de peças
fundidas.
A remoção dessas tensões ajuda a manter a estabilidade de forma e elimina
condições desfavoráveis como a perda de resistência ao escoamento em
compressão, comumente conhecida como efeito Bauschinger.
O alívio de tensões pode ser incorporado a outros tipos de tratamentos
térmicos, como o recozimento, por exemplo. O envelhecimento também pode aliviar
No titânio comercialmente puro(todos os graus) o alivio de tensão ocorre nas
temperaturas de 480 a 595 ºC entre 25 minutos e 04 horas.
Recozimento
O termo “recozimento” é bastante genérico e deste modo às vezes é aplicado
no caso de solubilização, assim como no caso de recozimento para recristalização,
geralmente após operações de conformação mecânica. Até mesmo o alívio de
tensões por vezes é denominado recozimento para alívio de tensões. Por este
motivo, neste texto será utilizado o termo recozimento de processo, encurtado para
recozimento, para designar os tratamentos térmicos que têm por objetivo aumentar a
tenacidade, a dutilidade à temperatura ambiente, e a estabilidade térmica e
dimensional, e, em alguns casos, a resistência à fluência.
O Ti Comercialmente Puro (todos os graus) tem seu recozimento entre 650ºC
e 760ºC.
Tratamento de Solubilização
Devido ao fato de que o tratamento de solubilização no campo alfa-beta
envolve aquecimento em temperaturas apenas ligeiramente inferiores à temperatura
beta transus, um controle adequado de temperatura é essencial. Se a temperatura
sobe acima da temperatura beta transus, as propriedades de tração, principalmente
a dutilidade são reduzidas e não podem ser completamente restauradas por um
tratamento térmico subseqüente. As temperaturas beta transus para Ti
Comercialmente Puro com 0,25% de Oxigênio no máximo é entre 895ºC e 925ºC e
as temperaturas beta transus para Ti Comercialmente Puro com 0,40% de Oxigênio
no máximo é entre 930ºC e 960ºC
A taxa de resfriamento a partir da temperatura de solubilização apresenta um
importante efeito sobre a resistência mecânica para ligas alfa-beta. Se esta taxa for
muito baixa, ocorrerá considerável difusão durante o resfriamento, e a
decomposição da fase beta alterada, durante o envelhecimento, pode não resultar
em ganho de resistência mecânica. Para ligas com teor relativamente alto de
elementos estabilizadores da fase beta e para produtos com pequeno tamanho de
seção o resfriamento ao ar ou com ventiladores pode ser adequado. Este
resfriamento mais lento, quando permitido de acordo com propriedades mecânicas
especificadas, é preferível, pois minimiza qualquer tipo de distorção. De um modo
geral, as ligas beta são temperáveis ao ar a partir da temperatura de solubilização.
Envelhecimento
A etapa final no tratamento térmico de ligas de titânio para obter máxima
resistência mecânica consiste no reaquecimento a uma temperatura de
envelhecimento entre 425 e 650 ºC. O envelhecimento provoca a decomposição da
fase beta supersaturada retida à temperatura ambiente devido à têmpera, assim
como a transformação de qualquer tipo de martensita em fase alfa.
2.3. Padi
2.3.1. Formação e aquisição de imagens
Muitas técnicas de microscopia têm sido desenvolvidas e aplicadas à análise
de materiais. Em princípio, feixes de radiação ou de partículas podem ser usadas
para sondar o material, desde que se tenha como resultado da interação do feixe
com a amostra um sinal adequado que possa ser adquirido por um sensor.
Na microscopia ótica, a amostra é iluminada com radiação eletromagnética de
microscopia eletrônica, um feixe de elétrons varre a superfície da amostra. Em
ambos os casos, o sinal detectado pode ser proveniente da superfície irradiada ou
aquele que atravessa a amostra. No primeiro caso a microscopia é denominada de
reflexão ou de varredura e no segundo de transmissão.
A cada um desses sistemas são acoplados diferentes tipos de sensores ou
detectores capazes de coletar algum sinal que resultará na formação de uma
imagem. No caso da microscopia ótica, o sensor pode ser uma câmara de vídeo ou
de TV ou uma câmara CCD. A natureza do sensor e da imagem que ele produz são
determinadas pelo tipo de análise pretendida. O próximo passo é realizado por um
conversor A/D capaz de digitalizar o sinal produzido.
A resolução de um sistema de formação de imagens é a capacidade de
distinguir entre duas fontes pontuais. O limite de resolução ótica é dado pelo critério
de Rayleigh (DAVIDSON, 1999), onde a distância mínima que separa dois pontos é
proporcional ao comprimento de onda da sonda utilizada.
No começo do século XX, a microscopia ótica já havia atingido o seu limite de
resolução. A qualidade das lentes não oferecia mais espaço para progresso e,
portanto, o único caminho para conseguir maior resolução seria através da utilização
de radiações com comprimento de onda cada vez menor.
Em 1924 de Broglie formulou sua postulação da dualidade onda-partícula
para elétrons, que lhes atribuía um comprimento de onda.
A possibilidade de construção de um microscópio eletrônico foi imediatamente
instrumento a ponto de superarem, pela primeira vez em 1931, a resolução do
microscópio ótico. A partir de então, vários modos de formação de imagens foram
desenvolvidos pela detecção e processamento dos diferentes sinais produzidos pela
interação do feixe de elétrons com o material. O evento a ser observado é
selecionado em função da informação que se deseja obter da amostra (JAVORSKY,
2001).
2.3.2. Microscopia ótica
A microscopia ótica utiliza um feixe de luz focalizado, por meio de um
conjunto de lentes, sobre uma amostra. A microscopia de luz transmitida é utilizada
quando a amostra a ser analisada é transparente à luz utilizada pelo microscópio. Se
o material for opaco, a melhor técnica a ser utilizada é a microscopia de luz refletida.
O contraste é produzido pela absorção, reflexão, refração, difração,
fluorescência ou espalhamento da luz incidente. Estes fenômenos dependem tanto
das propriedades dos constituintes da amostra, respectivamente a absorbância,
refletância, índice de refração, composição química e dispersão das partículas,
como das propriedades da luz incidente, a saber, o comprimento de onda e direção
de polarização.
As propriedades da amostra podem ser alteradas por técnicas de preparação,
tais como a ação química diferenciada de determinadas substâncias sobre os
constituintes que revelam a microestrutura do material. O desenvolvimento de
técnicas, aplicada ao estudo dos metais, recebeu o nome de metalografia.
O comprimento de onda da luz incidente ou detectada pode ser selecionado
muito utilizada por geólogos e mineralogistas para o estudo das características
naturais de rochas e minerais e na indústria para a caracterização de materiais
cerâmicos. A técnica é também empregada no estudo de transições de fase e
texturas exibidas por cristais líquidos.
As lentes comuns, baseadas em elementos esféricos, estão sujeitas a
defeitos que independem a qualidade de sua fabricação, denominados de
aberrações. Dentre estas, as mais importantes são a aberração esférica e a
aberração cromática (HALLIDAY, 1980).
A aberração esférica determina que, raios axiais que atravessam a lente,
próximos de seu eixo ótico, são focalizados em um ponto diferente daquele dos raios
que passam pelas bordas. Este defeito é inerente a uma lente esférica, e para uma
lente isolada, só pode ser minimizado através da diminuição de seu diâmetro, ou
seja, utilizando apenas raios paraxiais.
A aberração cromática refere-se ao comportamento da luz branca que, como
se sabe, é constituída da soma de todas as cores do espectro luminoso. Uma vez
que o índice de refração e, portanto, a distância focal de uma lente depende do
comprimento de onda da luz, raios de cores diferentes serão focalizados em pontos
diferentes. Este problema é parcialmente reduzido com o uso de lentes acromáticas,
desenvolvidas a partir da metade do século XX.
Outras limitações da microscopia ótica são a resolução limitada pelo
comprimento de onda da luz e a pequena profundidade de campo que dificulta a
Defeitos de iluminação da amostra não são importantes quando a
identificação das fases é feita visualmente e as contagens executadas
manualmente. Entretanto, no caso de imagens que se destinam ao processamento e
análise por métodos automáticos a iluminação irregular pode ser o fator
determinante da possibilidade de execução desses métodos, uma vez que a
identificação das fases é feita, na maioria das vezes, justamente com base na
intensidade da luz proveniente de cada ponto da amostra.
2.3.3. Processamento e análise de imagens digitais
A área de processamento e análise de imagens digitais tem atraído grande
interesse nas últimas décadas. A evolução da tecnologia de computação digital, bem
como o desenvolvimento de novos algoritmos para lidar com sinais bidimensionais
está permitindo um número de aplicações cada vez maior de diversas áreas da
ciência possibilitando assim, obtenção de informações e características da estrutura
de vários materiais.
A evolução e popularização dos sistemas de digitalização e processamento
de imagens em computadores gerou uma expectativa muito grande quanto ao seu
impacto sobre os métodos de microscopia quantitativa. Atualmente, a maioria dos
microscópios eletrônicos disponíveis no mercado já vem com um programa de
análise de imagens acoplado.
A rapidez das análises feitas em computador tem sido um forte motivador
para a substituição dos métodos manuais de identificação e medida por aqueles que
utilizam imagens digitais (RUSS, 1992). Para uma imagem digital típica adquirida por
amostrados pode variar entre 105 e 107, muito maior que o número de pontos de
uma grade de contagem, que é de cerca de 102 (VIEIRA, 2001). Este campo é
processado em tempos da ordem de segundos comparado aos muitos minutos em
contagem manual.
A identificação de padrões por semelhança permanece como a principal
barreira para a construção de analisadores de imagem totalmente automatizados. Já
existem há algum tempo sistemas analisadores de imagens semi-automáticos para
tratar uma variedade limitada de tipos de imagens e analisadores plenamente
automáticos para tratar de tipos bem determinados de imagens. As abordagens
propostas incluem técnicas de morfologia matemática, equações diferenciais
parciais, geometria fractal, “wavelets” e redes neurais entre outras. Não há uma
solução geral para este problema, sendo necessário o desenvolvimento de técnicas
específicas para cada situação (RUSS, 1992).
2.3.4. Propriedades básicas das imagens digitais
Uma imagem bidimensional pode ser representada por uma função de
intensidade da luz f(x,y), onde x e y denotam as coordenadas espaciais e o valor de
f em qualquer ponto (x,y) é proporcional ao brilho (ou níveis de cinza) da imagem
naquele ponto. Na Figura 2.6 está representado o sentido dos eixos coordenados
(a) (b)
Figura 2.6 (a) Imagem bidimensional em tons de cinza. Os eixos x e y são as coordenados espaciais e f(x,y) é a função que representa a intensidade ou brilho naquele ponto (BASTOS, 2001). (b) escala em tons de cinza com valores atribuídos ao brilho em cada ponto.
A imagem é digitalizada quando a função f(x,y) é discretizada tanto em
coordenadas espaciais quanto em brilho. A discretização é o processo de mapear
valores contínuos de uma variável em valores discretos, usualmente inteiros, e pode
ser descrito como uma classificação dos valores de uma variável em faixas
pré-definidas. Na Figura 2.7 exemplificamos como uma imagem monocromática pode
Figura 2.7 Digitalização de uma imagem. O pixel com coordenadas [x=10, y=3] tem o valor inteiro proporcional ao brilho médio naquele elemento de matriz(HTTP://www.ph.tn.tudelft.nl/Courses/FIP/frames/fip.html).
Uma imagem digital monocromática pode ser considerada como sendo uma
matriz cujos índices de linhas e de colunas identificam um ponto na imagem. O valor
correspondente do elemento da matriz identifica o nível de intensidade ou de brilho
do sinal naquele ponto (RUSS, 1992). Os elementos dessa matriz são chamados de
elementos da imagem ou pixels. Quanto maior o número de pixels de uma imagem
melhor é a sua resolução. Quanto maior o número de níveis de brilho que um pixel
pode assumir maior a discriminação da intensidade de sinal. A intensidade de
imagens monocromáticas é usualmente representada em uma escala de cinza de
modo que também se usa a expressão nível de cinza para representar o nível de
brilho.
O número de pixels e o número de tons de cinza que se pode atribuir a cada
pixel determinam a quantidade de informação de uma imagem. O número de pixels
é em geral expresso em termos das dimensões da matriz que forma a imagem
1024x768, etc. O número de tons de cinza é expresso em termos do número de bits
por pixel, b. Conhecendo b, o número de tons é calculado como 2b. Assim, uma
imagem com n = 8 bits admite 256 tons de cinza. Quanto maior o número de pixels e
quanto maior o número tons, maior o tamanho do arquivo que contém a imagem e,
portanto, maior o espaço em disco necessário para armazená-la em um computador
e maior a quantidade de memória necessária para o seu processamento.
Uma imagem pode ser representada por um histograma que descreve a
fração de área ocupada pelos pixels de cada tom de cinza. Na literatura o
histograma de uma imagem é muitas vezes denominado como perfil de intensidade,
distribuição de tons de cinza ou, quando o autor se refere especificamente a um tipo
de técnica de aquisição de imagem pode ser denominado de perfil de elétrons
retroespalhados (BOYCE, 1990; SKEDROS, 1993a; VAJDA, 1995).
Se uma imagem monocromática de P pixels tem P(g) pixels em cada nível de
intensidade g, então, somando P(g) sobre todos os possíveis valores de intensidade,
g=0,1,2,...,G-1, obtém-se o número total de pixels da imagem, isto é,
O histograma normalizado de intensidade, ou simplesmente histograma, de
O histograma de uma imagem não contém informação sobre correlação
espacial entre os pixels. Entretanto, a presença na imagem de objetos que exibem
grande contraste, isto é, grande diferença entre os tons de cinza dos pixels que
formam esses objetos, é quase sempre manifestada no histograma pela presença
de picos bem distintos.
O modo como a informação é codificada no arquivo de dados que contém a
imagem, também conhecido como o formato da imagem, é identificado pela sua
extensão. Formatos típicos como BMP, TIF, GIF, JPG são utilizados pela ampla
maioria dos editores e processadores de imagens, ainda que existam algumas
diferenças, ou sub-formatos, que eventualmente impeçam que uma imagem gravada
por um programa possa ser lida por outro. Formatos como GIF e JPG têm seus
arquivos compactados para reduzirem seu tamanho, facilitando a sua armazenagem
e transmissão. Existem diferentes regras de compactação, que podem ser
classificadas conforme haja ou não perda de informação durante a compactação.
Assim, por exemplo, o formato JPG compacta a imagem com perda de informação,
enquanto o formato GIF utiliza o algoritmo LZW que compacta a imagem sem perda
de informação original. Para fins de análise quantitativa de imagens por métodos
automáticos ou semiautomáticos, deve-se evitar o uso de imagens compactadas
com perda de informação.
2.3.5. Processamento de imagens digitais
O processamento de imagens corresponde à transformação da imagem
original, adquirida por diferentes sistemas de formação e digitalização de imagens,
processamento pode ser dividido em pré-processamento, segmentação e,
eventualmente, pós-processamento.
O pré-processamento tipicamente envolve técnicas para remoção de ruído e
realce de contrastes. A função desta etapa é melhorar a imagem de forma a
aumentar as chances para o sucesso dos processos seguintes. O trabalho do
pré-processamento pode ser substancialmente reduzido se cuidados adequados forem
tomados durante a aquisição das imagens.
A segmentação é considerada uma das etapas mais difíceis do
processamento de imagens. É nesta etapa que se identifica os pontos pertencentes
a cada objeto de interesse para posterior análise. Existem várias técnicas de
segmentação e nenhuma é de aplicabilidade geral. Algumas revisões sobre o
assunto podem ser encontradas na literatura (EGMONT-PETERSEN, 2002;
MACHADO, 2002; MUÑOZ, 2003). Muitas técnicas envolvem a separação dos
objetos por limiar de tom de cinza, isto é, os objetos de interesse são identificados
pela a faixa de tom de cinza predominante dos seus pixels.
Na Figura 2.8(a) apresentamos uma imagem em tons de cinza composta por
duas fases, identificadas como objetos e fundo. Na Figura 2.8 (b) é apresentado o
resultado da segmentação por limiar de tom de cinza. Na Figura 2.9 apresentamos o
histograma da imagem, no qual a linha tracejada representa o limiar aplicado na
(a) (b)
Figura 2.8 Exemplo de uma imagem em tons de cinza com duas fases (a) e o resultado da segmentação (b) no limiar mostrado na Figura 2.9
(HTTP://www.ph.tn.tudelft.nl/Courses/FIP/frames/fip-segmenta.html).
Figura 2.9 Histograma da imagem da Figura 2.8(a). A linha tracejada indica o limiar de tom de cinza escolhido para detectar os objetos, conforme ilustrado na Figura 2.8 (b) (HTTP://www.ph.tn.tudelft.nl/Courses/FIP/frames/fip-segmenta.html).
Existem vários algoritmos utilizados para determinar qual é o melhor valor do
limiar a ser aplicado como, por exemplo, o critério de Otsu (OTSU, 1979). Outros
Observando a Figura 2.8(b) verificamos pontos dispersos sobre o fundo que
estão sendo contados como pertencentes aos objetos. Isto ocorre devido à
superposição dos tons de cinza das duas fases, conforme mostrado no histograma
da imagem na Figura 2.9. Este resultado obtido é típico de imagens ruidosas.
A etapa do pós-processamento tem como função corrigir esses defeitos da
segmentação. Um procedimento amplamente adotado para tratar esses pontos mal
classificados, dispersos fora da fase de interesse ou identificados como buracos no
seu interior é a busca de correlação espacial. Para realizar essa tarefa, filtros
morfológicos de fechamento e abertura têm sido usados. A aplicação desses filtros,
entretanto, exige algum conhecimento prévio sobre o sistema estudado e das
condições de aquisição, uma vez que a escolha de parâmetros como tamanho e
forma do elemento estruturante, bem como a ordem das operações, podem alterar
significativamente o resultado de uma análise quantitativa mesmo quando aplicado
criteriosamente (YANG, 2001).
Em algumas situações, entretanto, o uso desses filtros pode não resolver o
problema satisfatoriamente. Esse é o caso quando as fases apresentam texturas
complexas com uma superposição importante dos tons de cinza. Um exemplo desse
tipo de situação é mostrado naFigura 2.10(BORGES DA COSTA, 2003).
A Figura 2.10 (a) mostra uma imagem editada e processada de microscopia
eletrônica de varredura contendo uma resina fenólica (fase mais escura à esquerda)
e borracha (fase mais clara à direita). A Figura 2.10 (b) mostra a mesma imagem
(a) (b)
Figura 2.10 (a) Imagem editada a partir de imagens de elétrons retroespalhados de resina fenólica (fase mais escura à esquerda) e de borracha (fase mais clara à direita). (b) A mesma imagem segmentada por limiar de tom de cinza(BORGER DA COSTA, 2003).
Os pontos brancos deveriam identificar a borracha e os pretos a resina. Como
se vê, vários pontos sobre a borracha são considerados por este critério como
pertencentes à resina e vice-versa.
A diferença da situação ilustrada na Figura 2.10(a) em relação àquela
ilustrada na Figura 2.10(b) é o alto grau de correlação entre os pixels mal
classificados no segundo caso. Portanto, a reclassificação desses pixels com base
em um critério de correlação espacial fica prejudicado.
A situação é ainda mais complicada quando o sistema é composto por um
satisfatório, todas as medidas de tamanho, forma, posição são feitas na imagem
pós-processada. No caso em que apenas uma fase é segmentada, a imagem
resultante é binária. Para analisar muitas fases simultaneamente é comum a
utilização de pseudo-cores para identificar cada uma delas.
Análise de imagens digitais
A análise de imagens é a etapa onde são feitas todas as medidas de
interesse (distâncias, perímetros ou áreas), o tratamento dos dados obtidos sua
classificação e a interpretação dos resultados. Essas medidas são em geral
realizadas diretamente sobre as imagens, isto é, a informação de intensidade e
posição de cada pixel é utilizada como entrada na obtenção das grandezas de
interesse.
Condições ideais de aquisição das imagens incluem a preparação adequada
das amostras, sob iluminação uniforme e controlada e com um sistema ótico ou
eletrônico de boa qualidade, utilizando os melhores filtros e contrastes para cada
situação. A quantidade de informação contida em uma imagem determina a exatidão
e a precisão com que as medidas podem ser feitas.
Em problemas reais é freqüentemente necessária alguma intervenção
humana para a tomada de decisões durante a análise de imagens. Por isso, muitos
pesquisadores têm se voltado para o desenvolvimento de técnicas interativas, em
que uma parte do trabalho, especialmente a identificação de objetos de interesse, é
feita pelo especialista humano e outra parte, especialmente a quantificação de
abordagem, adotada no presente trabalho, é importante o desenvolvimento de uma
interface gráfica intuitiva e amigável.
Na técnica de análise linear de histogramas, as imagens são analisadas
indiretamente com base na informação reduzida contida nos histogramas da imagem
completa e das fases constituintes. Os histogramas não contêm informação sobre a
intensidade de cada pixel individualmente, mas, apenas sobre o conjunto dos pixels
que formam uma imagem ou um constituinte. As fases são distinguidas visualmente
pelos seus tons de cinza e texturas, e são identificadas por microanálise com base
nos espectros de raios-X característicos dos elementos presentes. Uma vez feita a
identificação, o método prossegue com a intervenção do usuário para selecionar
amostras representativas dos histogramas de cada uma das fases.
O programa ImageJ, tem uma interface gráfica amigável na qual são
disponibilizadas ferramentas de processamento de imagens para facilitar a
identificação dos componentes e seleção de amostras dos respectivos histogramas.
IMAGEJ
O ImageJ é um programa processador de imagens de domínio público
escrito em Java, inspirado no NIH Image para o Macintosh. Funciona, tanto
como uma applet em linha ou como uma aplicação carregável, em qualquer o
computador com máquina virtual Java 1.1 ou mais recente.
Pode apresentar, editar, analisar, processar, salvar e imprimir imagens em
8-bits, 16-bits e 32-bits. Pode ler muitos formatos da imagem incluindo TIFF, GIF
que compartilham uma única janela. É multithreaded, isto é, executa várias
tarefas em paralelo, de forma que operações lentas tais como a leitura de um
arquivo de imagem possam ser executadas simultaneamente a outras operações.
Pode calcular valores de áreas e estatísticas em regiões de seleção de pixels
definidas pelo usuário. Pode medir distâncias e ângulos. Pode criar histogramas de
densidade e plotar perfis de linhas. Suporta funções padronizadas de
processamento de imagem tais como a manipulação de contraste, realce,
suavização, detecção de borda e filtro de mediana.
Faz transformações geométricas tais como escalonamento, rotação e
inversão. A imagem pode ser ampliada até 32:1 e reduzida até 1:32 Todas as
análises e funções de processamento estão disponíveis para qualquer fator de
ampliação. O programa suporta qualquer número de janelas (windows)
simultaneamente, sendo limitado somente pela quantidade de memória
disponível.
A calibração espacial está disponível para fornecer medidas dimensionais no
mundo real em unidades como milímetros. A escala de calibração de densidade ou
cinza também está disponível.
O ImageJ foi projetado com uma arquitetura aberta que fornece o
extensibilidade através de plugins em Java. Plugins para aquisição, análise e
processamento de acordo com as necessidades podem ser desenvolvidos
utilizando-se do editor e o compilador Java embutidos no ImageJ. Os plugins
escritos pelos usuários possibilitam solucionar quase todos os problemas de
O ImageJ está sendo desenvolvido utilizando-se de seu editor e seu
compilador Java, assim como a IDE da Metrowerks CodeWarrior. O código de
fonte está disponível livremente. O autor, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov),
trabalha no Research Services Branch, National Institute of Mental Health,
Capítulo 3
3.
Materiais e Métodos
Foram utilizados 16 discos de titânio puro(ti cp), com 15mm X 3mm (diâmetro
X espessura), divididos em 08 conjuntos de 02 amostras, cada conjunto de amostra
foi submetido a diferentes tratamentos térmicos em forno resistivos, os tratamentos
utilizados são:
I) Titânio com têmpera sem revenimento
II) Titânio com têmpera revenido a 200ºC
III) Titânio com têmpera revenido a 300ºC
IV) Titânio com têmpera revenido a 500ºC
V) Titânio sem têmpera revenido a 200ºC
VI) Titânio sem têmpera revenido a 300ºC
VII) Titânio sem têmpera revenido a 500ºC
VIII) Titânio sem tratamento
Para lixar foram utilizadas lixas com as seguintes granulometrias: 100, 220, 360, 400, 600, 1200, 1500.
No polimento foi utilizada uma politriz com a seguinte solução: 60% de sílica coloidal + 40 % de peróxido de hidrogênio(h2o2).
Esse conjunto de amostras foi colocado em cultura de células
pré-osteoblásticas. Após o ensaio de cultura de células os discos foram retirados para
verificação no microscópio óptico com uma câmera digital acoplada, foram
Em seguida, agora com as células extraídas e a superfície polida e atacada
quimicamente, foi obtido um segundo conjunto de imagens diante do mesmo campo
de visão. Nas tabelas 3.1 e 3.2 é possível visualizar as imagens das etapas de
polimento, ataque químico e ensaio de cultura de células. Essas etapas foram
realizadas para todos os conjuntos de amostras de cada tipo de tratamento térmico.
Tabela 3.1Titânio sem Tratamento - Amostra 01 TITÂNIO SEM TRATAMENTO (AMOSTRA 01)
Amostra/local BORDA CENTRO
polida
Atacada
quimicamente
Tabela 3.2 Titânio com têmpera sem revenimento – Amostra 01 TITÂNIO COM TÊMPERA SEM REVENIMENTO (AMOSTRA 01)
Amostra/local BORDA CENTRO
polida
Atacada
quimicamente
Com células
Utilizou-se um microdurômetro com a carga de 200g por um período de 15
segundos para a criação de marcações de micro-dureza que serviram de orientação
Foi utilizado um software gratuito de código aberto, chamado ImageJ, para
fazer a contagem das células.
Uma das análises feitas foi a sobreposição das imagens obtidas das
superfícies de titânio com células aderidas e as imagens das superfícies atacadas
quimicamente, para tentar encontrar alguma similaridade da organização celular em
relação a forma da superfície, utilizou-se o software adobe photoshop cs2 versão 9.0
fig. 3.1.
Figura 3.1 Photoshop 9 CS2 .
São abertos os arquivos da imagem da superfície atacada quimicamente e a
imagem da superfície com células aderidas. Utilizando a ferramenta de seleção é
possível se copiar e colar uma imagem sobre a outra. Ficando visível apenas uma
das camadas. O que pode ser selecionado alterando algumas propriedades das
Figura 3.2 Camadas sobrepostas no Photoshop.
Através do filtro DARKEN, que compara as cores base e de mesclagem, a
que for mais escura será a cor resultante. Os pixels da cor base que forem mais
claros que os da cor de mesclagem serão substituídos. Os pixels mais escuros
permanecerão inalterados, e do índice de opacidade, que define o grau de
Figura 3.3 Aplicação de filtros para determinar o grau de transparência.
É necessário tomar cuidado com a sobreposição, visto que as marcações de
microdureza servirão como ponto de sobreposição. No final se tem a sobreposição,
onde é possível analisar a disposição das células em relação a superfície do
material (fig 3.5).
Figura 3.5 Sobreposição exata usando as marcações de microdureza.
Outra analise feita foi a contagem das células presentes em cada amostra.
Capítulo 4
4.
Resultados e discussão
Serão apresentadas fotomicrografias das amostras de titânio (Centro e Borda)
e o tratamento realizado nelas para visualização da dependência do crescimento
celular com a microestrutura da superfície. Grande parte destas células possui
aspecto aleatório, mas nota-se que há algumas com forma arredondada e algumas
com aspecto alongado. Isolando algumas estruturas celulares após tratamento da
imagem com o software de edição, obtêm-se uma imagem que posteriormente é
sobreposta sobre a superfície de titânio atacada. As imagens foram sobrepostas
respeitando a coincidência da marca da micro-dureza que é usada como referência,
e mais uma vez tratada de forma que haja uma transparência e um bom contraste,
da imagem com as células, para a imagem da superfície atacada. A partir desta
imagem onde há a sobreposição, é possível o estudo de uma possível relação entre
Franciéric Alves de Araújo, 2009
Tabela 4.1 Titânio com têmpera sem revenimento - Sobreposição
BORDA CENTRO
Sobreposição Amostra 01
Sobreposição Amostra 02
Na Tabela 4.1 é possível verificar que houve uma maior adesão celular no
centro das amostras. É possível verificar também que na borda da amostra 01
Tabela 4.2 Titânio com têmpera revenido a 200ºC - Sobreposição
BORDA CENTRO
Sobreposição Amostra 01
Sobreposição Amostra 02
A Tabela 4.2 mostra que as células continuaram tendo preferência por aderir
Franciéric Alves de Araújo, 2009
Tabela 4.3 Titânio com têmpera revenido a 300ºC - Sobreposição
BORDA CENTRO
Sobreposição Amostra 01
Sobreposição Amostra 02
A Tabela 4.3 mostra imagens do tratamento térmico onde a diferença do
número de células, entre o centro e a borda das amostras, diminuiu. E a adesão das
Tabela 4.4 Titânio com têmpera revenido a 500ºC - Sobreposição
BORDA CENTRO
Sobreposição Amostra 01
Sobreposição Amostra 02
A Tabela 4.4 apresenta o tratamento térmico, têmpera seguido de
revenimento a 500ºC, com resultados semelhantes ao do tratamento térmico
anterior(Têmpera seguido do revenimento a 300ºC), continuando as células a terem
Franciéric Alves de Araújo, 2009
Tabela 4.5 Titânio revenido a 300ºC - Sobreposição
BORDA CENTRO
Sobreposição Amostra 01
Sobreposição Amostra 02
A Tabela 4.5 apresenta imagens de um tratamento onde a quantidade de
células aderidas diminuiu, continuando, as mesmas, tendo preferência de aderir no
Tabela 4.6 Titânio revenido a 300ºC - Sobreposição
BORDA CENTRO
Sobreposição Amostra 01
Sobreposição Amostra 02
Na Tabela 4.6 pode se visualizar que na amostra 01, houve uma diminuição
da quantidade de células aderidas e da diferença entre a quantidade de células
aderidas no centro e na borda da amostra. Já a amostra 02 apresenta um aumento
Franciéric Alves de Araújo, 2009
Tabela 4.7 Titânio sem tratamento - Sobreposição
BORDA CENTRO
Sobreposição Amostra 01
Sobreposição Amostra 02
Na tabela 4.7 pode se visualizar que a amostra 01 apresentou no centro uma
maior quantidade de células aderidas. Enquanto que na amostra 02 a quantidade de
Tabela 4.8 Titânio revenido a 200ºC - Sobreposição
BORDA CENTRO
Sobreposição Amostra 01
Sobreposição Amostra 02
Na Tabela 4.8 é possível se verificar que as amostras apresentaram
comportamentos contrários. Enquanto que na amostra 01 as células continuaram
tendo preferência de adesão no centro da amostra. Na amostra 02, que foi a única
Franciéric Alves de Araújo, 2009
Além da análise utilizando a técnica de sobreposição, também foi realizada a
contagem das células, utilizando um software gratuito ImageJ. A Tabela 4.9
apresenta a contagem de células aderias em cada uma das amostras em cada um
dos tratamentos térmicos.
Tabela 4.9 Contagem de Células aderidas em cada amostra.
amostras 01 amostras 02
Ti temp. sem rev
borda 24 5
centro 81 83
Ti tem. rev. 200°C
borda 32 20
centro 84 85
Temp. rev. 300°C
borda 35 23
centro 52 65
Ti temp. rev 500C
borda 12 27
centro 66 69
Sem Temp. rev. 300°C
borda 9 23
centro 54 41
Sem Temp. rev. 500°C
borda 21 15
centro 44 119
Ti sem trat
borda 25 24
centro 60 22
Sem Temp. rev. 200°C
borda 24 81
Com relação à proliferação celular, verificamos que a literatura apresenta
resultados controversos. Alguns estudos mostraram que superfícies lisas favorecem
a proliferação celular (Stanford et al., 1994; Martin et al., 1995; Kieswetter et
al.,1996). Entretanto, enquanto De Santis et al. (1996) e Hatano et al. (1999)
observaram maior proliferação celular em células cultivadas sobre superfícies
rugosas, Rosa & Beloti (2002a), não verificaram diferença na proliferação celular sob
diferentes condições de rugosidade. Em nosso experimento foi possível se verificar
que apenas na amostra 02 do Titânio revenido a 200ºC, a quantidade maior de
células aderidas ocorreu na borda, já no restante das amostras ocorreu do centro ter
tido um maior número de células aderidas. É possível se observar também a partir
da sobreposição das imagens, que as células não tiveram um comportamento de
adesão influenciado pela disposição da superfície, mas pode se notar que no
tratamento utilizando Titânio com têmpera revenido a 200ºC, em ambas as amostras
5.
Conclusões e Sugestões
5.1. Conclusões
Esse trabalho atingiu seu objetivo, visto que foi possível se descrever um
conjunto de procedimentos que seguidos são úteis na analise de superfícies de
titânio submetidos a uma cultura de células. Essa metodologia se mostrou eficiente
para várias amostras submetidas aos mais variados tipos de tratamentos térmicos.
Outro ponto positivo do trabalho foi a utilização de um software open source
para a contagem de células, o software se mostrou capaz de realizar tal atividade
com uma eficiência bem próxima da conseguida com softwares proprietários.
5.2. Sugestões
Contudo que foi visto ficam alguns questionamentos para trabalhos futuros,
como:
- Explicar como os tratamentos térmicos no titânio influenciam a adesão e
proliferação celular.
- Explicar o porque da preferência das células aderirem no centro e não na
![Figura 2.7 Digitalização de uma imagem. O pixel com coordenadas [x=10, y=3] tem o valor inteiro proporcional ao brilho médio naquele elemento de matriz(HTTP://www.ph.tn.tudelft.nl/Courses/FIP/frames/fip.html)](https://thumb-eu.123doks.com/thumbv2/123dok_br/15609219.106151/34.892.282.662.124.372/figura-digitalização-coordenadas-inteiro-proporcional-elemento-tudelft-courses.webp)
