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Biossíntese de glicosaminoglicanos sulfatados: novos enfoques para o estudo de atividades e interações das enzimas do Golgi

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Academic year: 2017

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Tarsis Gesteira Ferreira

Biossíntese de glicosaminoglicanos sulfatados:

novos enfoques para o estudo de atividades e

interações das enzimas do Golgi

Tese apresentada à Universidade Federal

de São Paulo para obtenção do Título de

Doutor em Ciências.

(2)

Gesteira, Tarsis Ferreira

Biossíntese de glicosaminoglicanos sulfatados: novos enfoques para o estudo de atividades e interações das enzimas do Golgi. São Paulo, 2011. 105p.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo, Escola Paulista de Medicina.

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Tese preparada no Departamento de Bioquímica durante o Curso de Pós-Graduação em Biologia Molecular e apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Doutor em Ciências.

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Resumo

Heparam sulfato (HS) é um glicosaminoglicano altamente modificados

(GAGs) ligados a um core proteíco, formando os proteoglicanos de heparam

sulfato (HSPGs). A estrutura do HS é caracterizada por padrões de

modificações específicas, dependendo do tipo celular, da idade e do

organismo. A estrutura das cadeias de açúcar do HS são importantes na

modulação da atividade dos HSPGs. A biossíntese do HS é conservada a partir

de nematóides até o homem, iniciando no sistema retículo endoplasmático /

cis-Golgi, onde uma ligação de tetrassacarídeo é adicionado a um resíduo de

serina do core proteíco do proteoglicano. Após a adição covalente de um

resíduo de xilose pela xilosil transferase, três diferentes enzimas adicionam os

resíduos de galactose-galactose-ácido glucurônico, constituindo assim a região

de ligação, sendo este último passo essencial para o complexo de polimerases

EXT1 e EXT2 acrescentarem unidades alternadas de ácido glucurônico (GlcA)

e glucosamina N-acetilada (GlcNAc) na região não-reduzida da cadeia. Após

esta etapa de polimerização, um conjunto de modificações ocorrem:

N-desacetilação / N-sulfatação da GlcNAc pela enzima bifuncional, glucosaminil

N-desacetilase / N-sulfotransferase, epimerização do ácido glucurônico

adjacente ao recente domínio N-sulfatado pela glucuronosil C5 epimerase, e

por fim, 2, 3 e 6-O sulfatação por diferentes sulfotransferases com distribuição

tecido e isoformas específicas. A regulação dessas reações, bem como o

mecanismo de sulfatação, são mal compreendidos. Além da evidência

fragmentada, existe uma interrogação sobre a sistemática das interações

bioquímicas da maquinaria biossintética do HS.

N-Desacetilase-N-sulfotransferase 1 (Ndst1) promove a catálise inicial das modificações do HS e

Heparina (Hep), removendo os grupos acetil das unidades de

N-acetiglucosamina com subseqüente sulfatação dos amino grupos livres.

Utilizando uma biblioteca de Phage Display, selecionamos com sucesso dois

peptídeos que interagem especificamente com a Ndst1, inibindo sua atividade

de sulfatação. Inibidores da maquinaria biossintética dos GAGs são

importantes ferramentas para o estudo deste evento, bem como, na alteração

da composição das cadeias de açúcar do HS em modelos in vitro. Ainda,

(9)

capazes de estudar com detalhe o sítio catalítico da NDST de origem humana

e decifrar a relevância da precisão catalítica dos resíduos limitantes através da

fenda hidrofóbica, bem como, a sua significância para o reconhecimento e

sulfatação do glicano. Além disso, nós determinamos o resíduo de aminoácido

essencial para a ligação ao hNDST, Finalmente, utilizando ambas tecnologias

de identificação multidimensional da proteína e imunohistoquímica, fomos

capazes de demonstrar inicialmente a presença e a localização tecidual dos

diferentes proteoglicanos em diferentes órgãos do gastrópode Achatina fulica.

A. Fulica é um modelo vital para a caracterização da especificidade e o modo

de ação das enzimas envolvidas na biossíntese dos GAGs, pois a estrutura do

GAG acaram sulfato, encontrado somente neste organismo, contradiz a atual

teoria biossintética. Além disso, pela análise proteômica das proteínas isoladas

do Golgi da A. fulica, bem como, a imunohistoquímica das secções dos tecidos,

detectamos a presença da maquinaria de biossíntese dos glicosaminoglicanos.

Portanto, este estudo busca elucidar a atividade da NDST, além de, fornecer

(10)

Abstract

Heparan sulfates (HS) are highly modified glycosaminoglycans (GAGs)

bound to a core protein to form Heparan sulfate proteoglycans (HSPGs). The

fine structure of HS is characterized by specific modification patterns that are

cell-specific, age-specific and dependent on the organism. The fine structure of

the sugar chains modulates the activity of HSPGs. The biosynthesis of HS is

conserved from nematodes to man and starts in the Endoplasmatic

Reticulum/cis-Golgi network, where a linkage tetrasaccharide is attached to a

serine residue of a proteoglycan core protein. After the covalent addition of a

xylose residue by xylosyl transferase, three different enzymes add the

remaining – galactose–galactose–glucuronic acid residues that constitute the

linker region. This last step commits the proteins downstream through the

polymerase complex composed of EXT1 and EXT2, adding alternating units of

glucuronic acid (GlcA) and GlcNAc to the nonreducing end of the chain. After

this polymerization step, a set of modifications occurs: deacetylation/

N-sulfation of N-acetyl-glucosamine by a bifunctional enzyme, glucosaminyl

Ndeacetylase/N-sulfotransferase, epimerization of the glucuronic acid adjacent

to the recently N-sulfated domain by C5-glucuronosyl epimerase and 2, 3 a 6-O

sulfation by different sulfotransferases with specific tissue distribution and

isoforms. The regulation of these reactions as well as the sulfation mechanism

are poorly understood. Beyond the fragmentary evidence a systematic

interrogation of the biochemical interactions of the HS biosynthetic machinery is

missing. Therefore, this project aims to further elucidate key features of the

glycosaminoglycan biosynthesis. N-Deacetylase-N-sulfotransferase 1 (Ndst1)

catalyzes the initial modification of heparan sulfate and heparin removing acetyl

groups from subsets of N-acetylglucosamine units and the subsequent sulfation

of the resulting free amino groups. Using a Phage display library we

successfully selected two peptides which interact and specifically inhibit the

sulfation activity of Ndst1. Inhibitors of the GAG biosynthetic machinery are

valuable tools for studying the downstream events, as well as, a means of

altering the HS sugar chain composition in in vitro models. Moreover, using a

molecular docking and molecular dynamics approach we were able to study in

(11)

relevance of the boundaries residues through the hydrophobic cleft, as well as

the significance of this to the glycan recognition and sulfation. In addition we

were able to determine critical amino acid residues for ligand binding to hNDST.

Finally, using both multidimensional protein identification technology and

immunohistochemistry, we were able to demonstrate for the first time the

presence and tissue localization of different proteoglycans in the organs of the

gastropoda Achatina fulica. A. fulica is a vital model for further characterizing

the specificity and means of action of the enzymes involved in GAG

biosynthesis since the structure of acharan sulfate, a GAG only found in the

tissues of this organism, contradicts the current biosynthetic theory. Moreover,

through a proteomic analysis of Golgi proteins isolated from A. fulica, as well as,

immunohistochemistry of tissue sections, we detected the machinery involved in

glycosaminoglycan biosynthesis. Therefore, this study further elucidates the

activity of NDST, as well as, provides new techniques and original approaches

(12)

Índice

1. Introdução ... 1

1.1. Glicosaminoglicanos (GAGs) ... 2

1.2. Proteoglicanos ... 5

1.3. Biossíntese dos glicosaminoglicanos (GAGs) ... 6

1.3.1. Localização da síntese de GAGs ... 6

1.3.2. Determinação do destino da cadeia nascente de GAG ... 10

1.3.3. Características das sequências de aminoácidos que flanqueiam o resíduo de serina ... 11

1.3.4. Polimerização das cadeias de GAGs ... 12

1.3.5. Modificações nas cadeias dos HS ... 15

1.3.6. Sulfotransferases ... 20

1.4. Considerações sobre a corrente hipótese sobre a biossíntese de HS/Heparina ... 25

1.5. Caracterização conformacional da ligação ao dissacarídeo e transferência de sulfato através de dinâmica molecular (DM) ... 27

2. Objetivos ... 30

3. Artigos Publicados/Submetidos ... Error! Bookmark not defined. 4. Discussão ... 92

5. Concluão ... 95

(13)

Índice de Figuras

Figura 1. Estrutura geral da cadeia de glicosaminoglicanas. 2

Figura 2. Diagrama representando a disposição das cadeias de GAG em uma cadeia de proteoglicano (chama de core protéico). 4

Figura 3. Modificações da região de ligação. 9

Figura 4. Representação esquemática da biossíntese do HS. 13

Figura 5. Epimerização de resíduos de ácido urônico. 19

Figura 6. Biossíntese de Glicosaminoglicanos: modificações poliméricas. 23

Figura 7. Alinhamento múltiplo das sulfotransferases. 24

Figura 8. O mecanismo proposto de reação para a transferência do sulforil

catalizada pelas STs. 25

Figura 9. Estrutura do dissacarídeo repetitivo de acaram sulfato. 26

Figura 10. Funções de energia que compõe campos de força. 28

Índice de Tabelas

Tabela 1. Principais tipos de dissacarídeos presentes em glicosaminoglicanos. 3

(14)
(15)

1.

Introdução

Os glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs) são polímeros lineares

covalentemente ligados a um esqueleto protéico. Dentre os GAGs, heparam

sulfato (HS), heparina (Hep), condroitim sulfato (CS) e dermatam sulfato (DS)

são polimerizados a partir de unidades monossacarídicas e a estrutura

polimérica modificada por enzimas codificadas por mais de 40 genes nas

células animais. Assim, em função do repertório de expressão das enzimas

responsáveis pelas modificações poliméricas, cada glicosaminoglicano possui

um padrão de sulfatação, tamanho de cadeia e estrutura específicos para cada

célula animal. Essas modificações distinguem sua interação com diferentes

moléculas, como fatores de crescimento, quimiocinas, citocinas, proteases (ex.

trombina), seus inibidores (ex. serpinas) e regulam vias de sinalização

envolvendo fatores de crescimento e seus receptores (FGF/FGFR, fator de

crescimento de hepatócito (HGF)/c-Met, fator neurotrófico derivado de

linhagem de célula glial (GDNF/c-Ret/GFRa1), fator vascular endotelial

(VEGF/VEGRF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF/PDGFR,

BAFF/TACI) e vias de sinalização por Indian hedgehog, Wnt e BMP. Ainda, a

agregação anormal de complexos proteína/GAG está associada com uma

variedade de doenças humanas, incluindo Alzheimer, diabetes, encefalopatia

espongiforme, Lúpus, trombocitopenia/trombose induzida por heparina e alguns

tipos de câncer.

Assim, o estudo dos carboidratos complexos tem sido descritos como

uma fronteira em biologia celular e molecular (Stone, 2002). Devido ao

repertório de expressão das enzimas que modificam as cadeias de GAGs, cada

cadeia de HS ou CS possui um padrão de sulfatação, tamanho de cadeia e

estrutura fina que é único para cada tipo celular (Nader et al., 1987; Pinhal et

al., 2001b). O turnover de GAGs de superfície celular é de 1/8 a 1/3 do ciclo

celular (Yanagishita and Hascall, 1992), o que determina uma resposta rápida

em relação a fatores externos. Ainda, diferentemente de RNA e proteínas, os

GAGs não são codificados a partir de um molde, mas por uma variedade de

fatores reguladores da biossíntese e enzimas modificadoras expressas de

modo diferente nas células. De fato, algumas interações proteína-GAG

(16)

onde as cadeias de GAG estão ligadas covalentemente (Tersariol et al., 1992;

Sanderson et al., 1994; Franco et al., 2009), tornando o entendimento da

regulação molecular dessas interações a chave para a cura de certas doenças.

1.1. Glicosaminoglicanos (GAGs)

Glicosaminoglicanos (GAGs) são polissacarídeos lineares compostos

por dissacarídeos repetitivos contendo glucosamina ou galactosamina (Dietrich,

1968; Nader et al., 1974; Dietrich et al., 1975; Dietrich et al., 1977a; Dietrich et

al., 1977b; Esko and Zhang, 1996). Devido ao seu grau de sulfatação, estes

polissacarídeos lineares são os biopolímeros com maior densidade de

informações encontrados na natureza. Os glicosaminoglicanos diferem entre si

quanto ao tipo de hexosamina e açúcar não nitrogenado, quanto ao grau de

sulfatação e à posição em que são sulfatados, bem como quanto ao tipo de

ligação glicosídica inter- e intradissacarídica (Figura 1, Tabela 1). Esses

polissacarídeos, com exceção do ácido hialurônico, são sintetizados na forma

de proteoglicanos (Figura 2), nos quais cadeias sacarídicas estão ligadas

covalentementes ao core protéico (Kjellen and Lindahl, 1991). Os

proteoglicanos são, portanto, compostos de alta massa molecular formados por

um esqueleto protéico ao qual ligam-se, covalentemente, cadeias de

glicosaminoglicanos e oligossacarídeos N- e/ou O-ligados (Sweet et al., 1977).

 

Figura 1: Estrutura geral da cadeia de glicosaminoglicanos. UA, ácido urônico; HexN, hexosamina; GlcA, ácido D-glucurônico; IdoA, ácido L-idurônico; GlcN, D-glucosamina; GalN, D-galactosamina.

(17)

Tabela 1. Principais tipos de dissacarídeos presentes em glicosaminoglicanos

*(Sampaio and Nader, 2006) (GlcN, glucosamina; GalN, galactosamina; S, sulfato; Ac, acetil;

GlcA, ácido glucurônico; IdoA, ácido idurônico). 

           

Glicosaminoglicanos Dissacarídeos

Condrosam D-GlcA [β13] D-GalN Ac

β [1  4] lig a ç ã o in te r-di s s a c a di c a ga la c tos a m inogl ic a nos Condroitim sulfato

D-GlcA [β13] D-GalN Ac

D-GlcA [β13] D-GalN Ac(4S)

D-GlcA [β13] D-GalN Ac(6S)

Dermatam sulfato

D-GlcA [β13] D-GalN Ac(4S)

D-GlcA [β13] D-GalN Ac(6S)

L-IdoA [α13] D-GalN Ac(4S)

L-IdoA (2S) [α13] D-GalN Ac(4S)

L-IdoA (2S) [α13] D-GalN Ac(6S)

Ácido Hialurônico D-GlcA [β13] D-GlcN Ac

gl uc os a m inogl ic a nos

Heparanosam D-GlcA [α14] D-GlcN Ac

α

[1

4]

Acaram sulfato L-IdoA (2S) [α14] D-GlcN Ac

Heparam sulfato

D-GlcA [β14] D-GlcN Ac

D-GlcA [β14] D-GlcN Ac (6S)

D-GlcA [β14] D-GlcN (S)

D-GlcA [β14] D-GlcN (S,6S)

L-IdoA [α14] D-GlcN (S)

L-IdoA (2S) [α14] D-GlcN (S)

Heparina

D-GlcA [α14] D-GlcN (S)

D-GlcA [α14] D-GlcN (S,6S)

L-IdoA (2S) [β14] D-GlcN (S)

(18)

 

Figura 2. Diagrama representando a disposição das cadeias de GAG em uma cadeia de proteoglicano (chama de core protéico). Ambos HS e CS são adicionados a resíduos

específicos de serina da proteína em um tetrassacarídeo de ligação em comum (GlcA (preto)-Gal (amarelo)-(preto)-Gal (amarelo)-Xil (rosa). A biossíntese inicia-se com a transferência de um resíduo de xilose de um UDP-xilose livre por duas xilosiltransferases a um resíduo de serina do proteoglicano. A região de ligação é então sintetizada pela adição sequencial de dois resíduos de galactose (pelas enzimas galactosiltransferases I e II), e de um resíduo de ácido glucurônico (por uma glucuronosiltransferase I), a partir de seus UDP-açúcares correspondentes. A adição do primeiro resíduo de N-acetil hexosamina - podendo ser um resíduo de GlcNAc (N-acetil-glucosamina, vermelho) adicionado pela enzima N-acetilglucosaminiltransferase I ou GalNAc (N-acetil-galactosamina, verde) adicionado pela enzima N-acetilgalactosaminil transferase I no terminal não redutor do resíduo de ácido glucurônico (GlcA) das cadeias de heparam sulfato/heparina e condroitim sulfato/dermatam sulfato, respectivamente, iniciam a síntese desses GAGs. Para o heparam sulfato e heparina, a adição alternada de resíduos de GlcA e GlcNAc é realizada por polimerases (EXT-1 e EXT-2), a partir dos UDP-açúcares correspondentes.

Cadeias de heparam sulfato e condroitim sulfato são produzidas em

abundância (~105-106 cópias na superfície celular, concentrações em torno de

mg/ml na matriz extracelular) por células animais (Marynen et al., 1989). Essa

síntese ocorre no aparelho de Golgi sob a forma de proteoglicanos de HS, CS

ou híbridos de HS/CS. Nos proteoglicanos podem existir de uma (ex., decorim)

a centenas de cadeias de GAGs (ex., agrecam), sendo o número de unidades

dissacarídicas repetitivas de HS e CS variável dependendo do tipo de tecido ou

células onde é expresso. Os GAGs adotam uma estrutura helicoidal estendida

(19)

1.2. Proteoglicanos

Todas as células animais produzem proteoglicanos, podendo secretá-los

na matriz extracelular, inseri-los na membrana plasmática ou armazená-los em

grânulos de secreção (Dietrich, 1984; Nader et al., 1989; Nader, 1991). As

funções biológicas do proteoglicanos são em grande parte determinadas pelas

cadeias de GAGs: o rápido turnover e diversidade estrutural gerados pela

biossíntese e modificações pós-traducionais (PTMs) permitem aos GAGs

regularem uma miríade de vias de sinalização (Dietrich et al., 1983; Esko and

Selleck, 2002). Mais de 50 cDNAs correspondentes a proteoglicanos foram

clonados, sendo comum a expressão de mais de um tipo de proteoglicano para

um tipo celular. Por exemplo, pelo menos 11 proteoglicanos diferentes são

expressos em fibroblastos do pulmão humano (David et al., 1990; David et al.,

1992; Lories et al., 1992), sendo 23 o número dessas cadeias expressas no

sistema nervoso humano (Hartmann and Maurer, 2001). O core protéico dos

proteoglicanos possuem domínios funcionais próprios, além de carregar a

cadeia de GAGs. O core protéico usualmente determina o número de cadeias

de GAGs a serem adicionados, o tipo e o destino final (apical, luminal, intra- ou

extracelular) do proteoglicano final. As cadeias de GAG dos proteoglicanos

podem ainda ser clivadas antes de exercerem suas funções biológicas.

Heparanases extracelulares - beta endoglucuronidases (Vlodavsky and

Friedmann, 2001), sulfatases (Dhoot et al., 2001; Morimoto-Tomita et al., 2002)

e cadeias de GAG livres foram descritas extensivamente (Piepkorn et al., 1988,

1989; Kosir et al., 2000; Mack et al., 2002).

A variação estrutural dos proteoglicanos em diferentes tecidos e tipos

celulares são devidos a inúmeros fatores, sendo a estequiometria das

substituições das cadeias de GAGs a principal delas. Por exemplo, o

proteoglicano sindecam-1 possui cinco domínios de ligação a GAG, sendo os

domínios adicionados em proporções diferentes, gerando populações.

Outro proteoglicanos, como a trombomodulina, pode ser um

“proteoglicano parcial”, existindo somente com uma cadeia truncada de açúcar.

Essas características criam a diversidade de formação de domínios de ligação

de densidade variável e afinidade por diferentes ligantes de modo célula- e

(20)

1.3. Biossíntese dos glicosaminoglicanos (GAGs)

1.3.1. Localização da síntese de GAGs

A biossíntese dos GAGs ocorre predominantemente no retículo

endoplasmático (RE) e no Aparelho de Golgi. Os açúcares e o sulfato são

primeiramente ativados no citosol na forma de UDP‐açúcares e 3´‐

fosfoadenosina 5´fosfosulfato (PAPS), respectivamente, sendo transportados

para o sítio de síntese por transportadores de nucleotídeo‐açúcar específicos.

Os nucleotídeoaçúcares são doadores de açúcares para enzimas chamadas

glicosiltransferases, que transferem esses resíduos para um carboidrato

nascente ou uma proteína (cadeias de oligossacarídeos N‐ e Oligados de

proteoglicanos, glicoproteínas, polissacarídeos de membrana,

lipopolissacarídeos) (Hirschberg and Snider, 1987; Mandon et al., 1994;

Hirschberg et al., 1998).

Os GAGs como condroitim sulfato, dermatam sulfato, heparam sulfato e

heparina estão ligados ao core protéico a um resíduo de serina por um

tetrassacarídeo comum composto por ácido glucurônico–galactose–galactose–

xilose– (D‐GlcAβ1, 3‐Galβ1, 3Galβ1, 4 Xyl‐D‐Glca‐β1, 3‐galactose‐β1, 3‐

galactose‐1, 4xilose‐) (Dietrich et al., 1988). A síntese dessa região é iniciada

pela adição de um resíduo de xilose a um resíduo de serina seguida da adição

de dois resíduos de galactose, sendo completada pela adição de um resíduo

de ácido glucurônico. As vias de síntese de HS/Hep e CS/DS divergem após a

formação da região de ligação. Apesar do lúmen do Aparelho de Golgi ser o

local principal para a síntese de GAGs, a formação do tetrassacarídeo de

ligação se inicia no lúmen do RE. A transferência inicial da D-xilose (Xyl) do

nucleotídeo açúcar UDP‐D‐xilose para resíduos específicos de serina da

proteína é catalisada por uma ou mais xilosiltransferases, sendo a

xilosiltransferase I (UDP‐D-xylose:proteoglycan core protein β‐D‐

xylosyltransferase I, EC 2.4.2.26, XT‐I) a enzima limitante na biossíntese das

cadeias de heparam sulfato (Seo et al., 2005). As XT‐I e II são proteínas

transmenbrânicas tipo II com uma pequena cauda Nterminal citoplasmática,

um único domínio transmembrânico, uma região variável e um grande domínio catalítico C‐terminal (Quentin et al., 1990; Rio et al., 1991). Todos os

(21)

sendo sua importância evidenciada pela observação de que mutações em seu

gene são fatores de risco para doenças caracterizadas pelo metabolismo

alterado de proteoglicanos, como Pseudoxantona elasticum, osteoartrite

(Schon et al., 2006) e nefropatia diabética. Entretanto, a mosca Drosophila

melanogaster e o nematoda Caenorhabditis elegans possuem somente a

primeira isoforma (Wilson, 2002; Hwang et al., 2003; Gotting et al., 2004). Foi

comprovado inicialmente que, em condrócitos de galinha, a transferência da

xilose ocorria em um compartimento pré‐Golgi (Kearns et al., 1993; Vertel et al.,

1993). A transferência da xilose foi catalisada com maior eficiência pelas

frações do aparelho de Golgi tratadas com detergente do que em frações do

RE de fígado de rato (Nuwayhid et al., 1986). Células de ovário de hamsters

(CHO) que não possuem isoformas da enzima xilosiltransferases (Esko et al.,

1985), galactosiltransferase I - GT I; (Esko and Zhang, 1996) ou

glucuronosiltransferase I - GlcAT I; (Bai et al., 1999) são incapazes de

sintetizar HS e CS, o que indica que ambas as vias de síntese do

tetrassacarídeo de ligação desses GAGs possuem as mesmas enzimas.

Posteriormente, um resíduo de D‐galactose é adicionado à cadeia em

formação pela ação da enzima galactosil‐transferase I, utilizando como

transportadores UDP‐β‐D‐galactose ainda no RE rugoso (Okajima et al., 1999; Pinhal et al., 2001a). A seguir, no Aparelho de Golgi, ocorre a adição de mais

uma galactose (Gal) e de um resíduo de ácido glucurônico (GlcA),

respectivamente pelas enzimas galactosil transferase II e glucuronosil

transferase I, formando assim a região de ligação, composta pelo

tetrassacarídeo GlcAβ1→3Galβ1→3Galβ1→4Xilβ1→3Ser, comum à maioria dos glicosaminoglicanos, com exceção do queratam sulfato. Entretanto, células

que não possuem galactosiltransferase‐I ainda são capazes de sintetizar GAGs

sobre xilosídeos (Esko et al., 1987), o que indica uma atividade alternativa de

GT na síntese de GAGs. Ainda, ambas as XTs utilizam aceptores similares

para a transferência da xilose, com diferentes afinidades pelo aceptor. A

presença de dois genes codificando para as xilosiltransferases em todos os

organismos superiores aponta para a importância dessas enzimas para as

funções celulares essenciais. Como já mencionado, devido às similaridades

estruturais, CS/DS e HS/Hep compartilham as mesmas enzimas que sintetizam

(22)

varredura genética para mutantes em C. elegans que possuíam como fenótipo

uma vulva de forma anormal, foram identificados mutantes nos quatro genes

codificantes para as enzimas responsáveis pela síntese do tetrassacarídeo de

ligação (Herman and Horvitz, 1999). Mutações nesses genes possuem efeito

letal; animais homozigotos derivados de uma mãe homozigota se tornam

adultos e possuem malformações na vulva, originando embriões não

desenvolvidos, provavelmente por defeitos na sinalização por citocinas.

Fenótipos de certas mutações no embrião, como sqv‐3 e sqv‐8, são diferentes,

provavelmente devido à variabilidade alélica ou redundância (Herman and

Horvitz, 1999). Em humanos, defeitos enzimáticos da galactosiltransferase I,

que cataliza a formação da ligação glicosídica β1,4 entre o primeiro resíduo de galactose e o resíduo de xilose ligado diretamente à serina, foram associados à

síndrome de Ehlers‐Danlos (Quentin et al., 1990), uma condição severa

caracterizada por retardo mental e defeitos relacionados ao tecido conjuntivo.

Por possuírem a mesma região de ligação, mutações nas enzimas que

sintetizam essa região não distinguem entre a síntese de CD/DS ou a síntese

de HS, ou ambas. Entretanto, é consenso que a ausência de

glicosaminoglicanos de CS/DS e HS não é compatível com a vida metazoária.

A influência na atividade das GalT‐I e GlcAT‐II da fosforilação dos

resíduos de Xyl e da sulfatação dos resíduos de Gal‐I/Gal‐II, as duas

modificações mais frequentes na sequência do tetrassacarídeo, foi

evidenciada pela verificação de que a GalT‐I não possui atividade sobre o

xilosídeo fosforilado em C‐2, sugerindo que a presença dessa modificação no

aceptor substrato impossibilita o reconhecimento e/ou transferência da Gal aos

xilosídeos. O xilosídeo fosforilado não serve como substrato para a GalT‐I,

sugerindo que a fosforilação pode inibir a biossíntese de algumas cadeias de

GAGs podendo representar um mecanismo regulatório na biossíntese de PGs.

De forma similar, a formação do “cap” de α‐N-acetilgalactosamina (α‐GalNac) do tetrassacarídeo (Salimath et al., 1995) e a 4,6‐O‐dissulfatação dos resíduos

de GalNAc das cadeias de CS têm sido postulados como mecanismos de

finalização de extensão da cadeia (Fransson et al., 2000). Além da fosforilação,

a sulfatação pode ocorrer nos resíduos de Gal da região do tetrassacarídeo de

(23)

1995; Cheng et al., 1996; Lauder et al., 2000; Lauder et al., 2001; Ueno et al.,

2001) (Figura 3). A eficiência da GlcAT‐I é notavelmente aumentada quando o

aceptor substrato Gal1 é sulfatado na posição C6, e a atividade da enzima

desaparece com sulfatação na posição C‐4 ou quando a Gal2 é sulfatado na

posição C‐4 ou C‐6 ou quando Gal1 e Gal2 estão sulfatados em C‐6.

Figura 3: Modificações da região de ligação. Durante a síntese de proteoglicanos, a região de ligação pode ser modificada em algumas posições: o resíduo de xilose pode ser fosforilado

na posição 2, enquanto cada resíduo de galactosamina pode ser sulfatado nas posições 4 e 6.

A elucidação da estrutura e função das glicosiltransferases envolvidas

na via biossintética dos GAGs é de suma importância por sua implicação em

inúmeras patologias e seu potencial como alvos farmacológicos. Os

precursores dos GAGs são frequentemente referidos como agentes anti‐

amilóides e antitrombóticos (Martin et al., 1996; Kisilevsky et al., 2004) e anti‐

tumorais (Belting et al., 2002). O cDNA codificante de uma GT nova foi

transfectado em células CHO deficientes em GTI, restaurando a síntese de

PGs (Okajima et al., 1999). Pacientes com a síndrome de Ehlers‐Danlos

exibem atividade reduzida de GT‐I (Quentin et al., 1990), sendo encontradas

duas substituições no gene GTI desses pacientes (Almeida et al., 1999). Uma

linhagem mutante de células tubulares distais caninas (MDCK) que exibe

transporte reduzido de UDP‐Gal para o lúmen do Aparelho de Golgi possui

redução dramática na síntese de queratam sulfato (KS), mas produção normal

(24)

a polimerização da cadeia de KS, enquanto em CD/DS e HS/Hep o resíduo de

Gal é encontrado somente no tetrassacarídeo de ligação. As GTs envolvidas

na polimerização da cadeia de KS (GT‐III e IV) e na síntese do tetrassacarídeo

de ligação (GT‐I e II) podem possuir Km diferentes para a UDP‐Gal, ou a

síntese do tetrassacarídeo de ligação é localizada em um compartimento

diferente nas frações do Aparelho de Golgi das células MDCK. Uma atividade

préGolgi de transportador de UDPGal ainda não foi demonstrada (Kawakita et

al., 1998). Estudos enzimáticos e estudos utilizando xilosídeos para iniciar a

síntese de GAG indicam que as GT‐I e II se localizam em diferentes

sub-regiões do Aparelho de Golgi de fígado de ratos (Sugumaran et al., 1992;

Etchison et al., 1995). A localização dupla das enzimas envolvidas na síntese

de GAGs pode ser interpretada no contexto do modelo de maturação das

cisternas do Golgi, onde uma fração das transferases está sendo

constantemente transportada retrogradamente nas vesículas em maturação

(Bonfanti et al., 1998; Glick and Malhotra, 1998; Mironov et al., 1998).

1.3.2. Determinação do destino da cadeia nascente de GAG

Após o término de adição do tetrassacarídeo de ligação, a adição de um

quinto sacarídeo determina se a cadeia de GAG se torna CS/DS ou HS/Hep.

Esse açúcar é o GlcNAc no caso de HS/Hep e GalNAc no caso de CS/DS. As

enzimas GlcNAcT‐I (Fritz et al., 1997) e GalNAcT‐I mediam a adição desses

açúcares (Sugumaran et al., 1998), sendo diferentes daquelas utilizadas no

elongamento das cadeias de GAGs em CS (Rohrmann et al., 1985) e HS (Fritz

et al., 1994). Foi demonstrado que uma α‐GalNAcT adiciona uma GalNAc ao tetrassacarídeo de ligação produzindo estruturas com pentassacarídeos

“improdutivos”, porque a ligação β é necessária para o elongamnto da cadeia de CS. O mesmo grupo demonstrou recentemente que essa enzima também

catalisa a adição de αGlcNAc (Kitagawa et al., 1998; Kitagawa et al., 1999a), o

açúcar correto na síntese das cadeias de HS, o que indica que essa enzima é a

GlcNAcT‐I ativa na síntese de HS e Hep. Essa enzima pode ser importante

para a regulação, realizando o capping de alguns tetrassacarídeos de ligação

(25)

1.3.3. Características das sequências de aminoácidos que flanqueiam o resíduo de serina

Existem diferenças nas sequências de aminoácido consenso para a

formação de cadeias de CS e HS. A maioria dos HSPGs contém segmentos

repetitivos de (Ser‐Gly)n>1, ladeados por resíduos acídicos (Zhang et al.,

1995), com composição e posição variáveis. A adição do resíduo de GlcNAc à

região de ligação determina o destino do proteoglicano para HS ou Hep.

Similarmente, a adição de GalNAc determina a síntese de CS ou DS. A adição

de cadeias de CS à região de ligação representa a via padrão (Zhang and

Esko, 1994, 1995; Zhang et al., 2005), sendo a adição de HS dependente de

aminoácidos determinantes na região proximal ao tetrassacarídeo de ligação. A

substituição desses resíduos acídicos no betaglicano (proteoglicano de

superfície híbrido de CS e HS, também conhecido como receptor III de TGF-I)

produz mais CS e menos HS (Zhang and Esko, 1994). Esses domínios Ser‐

GlyAsp aceitam principalmente HS se os resíduos acídicos estiverem

presentes no N‐terminal. A troca de resíduos acídicos por aminas aumenta a

proporção de CS em relação ao HS no proteoglicano, ou a deleção de uma ou

mais cadeias de GAGs (Dolan et al., 1997). Esses resíduos são necessários,

mas não suficientes, para a geraçao de HS, sendo encontrados também em

alguns CSPGs (Bourdon et al., 1987; Brinkmann et al., 1997). Resíduos de

triptofano também influenciam a escolha da adição de um GAG num domínio

particular. Para o betaglicano, a mutação Trp-Ala próximo a um para Ser‐Gly

causa uma mudança da produção de HS para CS, e a introdução de um

resíduo de triptofano próximo ao local de extensão dessa cadeia causa a

reversão da produção de HS (Zhang and Esko, 1994). Por exemplo, o único

proteoglicano de HS “absoluto”, contendo predominantemente cadeias de HS,

glipicam-1, possui 90% de HS e 10% de CS quando expresso em células COS;

e 80% de HS e 20% de CS quando expresso em células CHO. A remoção de

110 resíduos do HSPG perlecam de membrana basal reduz o conteúdo de HS

(Dolan et al., 1997). Muitas isoformas de CD44 são modificadas pela adição de

GAGs. A maioria dos domínios aceita somente CS, mas um domínio Ser‐Gly‐

Ser‐Gly no exon V3 também aceita HS. A incubação de diferentes tipos

(26)

padrão: xilosídeos em HS‐GAGs são raros (Moreira et al., 2004). Entretanto,

ainda não está claro se os “cores” protéicos possuem determinantes mais

estritos para a formação de CSGAGs do que outros.

A formação de CD/DS e HS/Hep requer UDP‐Xyl, UDP‐Gal, UDP‐GlcA,

UDP‐GlcNAc e UDP‐GalNAc nos compartimentos no Aparelho de Golgi e/ou

lúmen do RE. O “uptake” dos UPD‐açúcares, ATP e PAPS para as vesículas

do Aparelho de Golgi in vitro é cerca de 50 a 100 vezes maior em comparação

com células utilizando o mesmo meio contendo essas moléculas radioativas

(Hirschberg and Snider, 1987). Níveis reduzidos de UDPGal no lúmen do

Aparelho de Golgi em células MDCK intactas produzem níveis reduzidos de KS

(Toma et al., 1996). Em um sistema in vitro, o comprimento da cadeia dos

GAGs de heparina produzido é determinado pela razão de UDP‐GlcNAc a

UDP‐GlcA (Lidholt et al., 1988). De forma similar, a razão de UDP‐GalNAc e

UDPGlcNAc podem influenciar a extensão da síntese de CS/DS versus

HS/Hep. Normalmente, o UDP‐GalNAc é formado pela epimerização do UDP‐

GlcNAc, catalisado no citosol pela UDP‐GlcNAc‐4-epimerase, uma enzima que

também catalisa a epimerização da UDPglucose a UDPGal (Piller et al.,

1983). Uma linhagem celular renal deficiente nessa enzima possui defeitos na

síntese de glicolipídeos e nas cadeias de carboidratos N‐ e O‐ligados de

glicoproteínas. Esses defeitos podem ser correlacionados pela Gal exógena e

pela GalNAc (Kingsley et al., 1986). Interessantemente, uma UDP‐GlcNAc

pirofosforilase isolada de rim pode utilizar GalNAc1P e UTP para catalisar a

formação de UDP‐GalNAc (Szumilo et al., 1996). Os sistemas enzimáticos que

produzem diferentes UDP‐açúcares, e seus translocadores, podem influenciar

a concentração de UDPaçúcares no lúmen do aparelho de Golgi, controlando

assim a síntese das cadeias de GAGs.

1.3.4. Polimerização das cadeias de GAGs

A adição do sexto açúcar e dos açúcares subsequentes aos precursores

de HS/Hep foi primeiramente descrita como sendo realizada por uma enzima

de 70 kDa bifuncional, que catalisa a adição de unidades alternadas de GlcA e

GlcNAc (Lidholt and Lindahl, 1992). Recentemente, tornou‐se evidente que

(27)

et al., 1998; McCormick et al., 1998). Ambas as enzimas são produtos de

genes supressores de tumor (EXT1 e EXT2) da família gênica da exostose

hereditária múltipla – assim como a GlcNAc transferase I (EXTL2). As EXT1 e 2

formam complexos hetero‐oligoméricos na superfície interna no Aparelho de

Golgi (Figura 4). A superexpressão de somente uma das EXTs resulta em sua

localização no RE (McCormick et al., 2000). Recentemente, foram analisadas

mutações nos genes das EXTs no desenvolvimento do sistema nervoso. Após

a remoção da EXT1 no cérebro de ratos, foi comprovada a letalidade no início

do desenvolvimento e ausência de HS (Inatani et al., 2003). Similarmente,

mutações nos genes das EXTs em “zebrafish” (Dakel e Boxer) resultaram em

defeitos específicos na formação do trato axônico (Lee et al., 2004).

Figura 4: Representação esquemática da biossíntese do HS (Duncan et al., 2001).

Ser: serina; Xyl: xilose; Gal: galactose; GlcA: ácido D-glucurônico; GlcNAc:

N-acetilglucosamina: Xyl-T: xilosiltransferase; Gal-TI: galactosiltransferase I: Gal-TII:

galactosiltransferase II; GlcA-TI: glicosiltransferase; EXTL2: α

1,4-N-acetilhexasaminiltransferase; EXT1: exostosina-1; EXT2: exostosina-2.

As vias de síntese de HS e CS divergem após a formação da região de

ligação. A adição do resíduo de α4GlcNAc inicia o intermediário da cadeia de HS, enquanto a adição de β4GalNAc inicia o intermediário da cadeia de CS

(Esko and Zhang, 1996). Essas reações são catalisadas por HexNAc

transferases, que diferem das enzimas envolvidas na polimerização da cadeia

(Rohrmann et al., 1985; Fritz et al., 1994). A GlcNAc transferase age em

substratos contendo dois ou mais resíduos de açúcar ‐GlcAβ‐3Gal‐X, onde X = um aglicano hidrofóbico (Fritz et al., 1994; Fritz et al., 1997) ou um

tetrassacarídeo de ligação conjugado a uma serina (Kitagawa et al., 1999a). A

(28)

adição do primeiro resíduo de αGlcNAc, a formação do polímero se dá passo a passo, com a adição alternada de unidades GlcAβ4 and GlcNAcα4, o que

resulta em polímeros com comprimento variável. Derivados de xilosídeos

deslocam a síntese de HS e CS de células endoteliais em cultura, sendo os

aumentos na síntese de CS e HS de dez e três vezes para orto‐

nitrofenilxilosídeos (OX) em comparação com para‐nitrofenilxilosídeos (PX),

provavelmente pela maior afinidade do OX para micelas lipídicas do que o PX

(Moreira et al., 2004). Mutantes de células em cultura (EXT1) (Lidholt and

Lindahl, 1992; McCormick et al., 1998; Wei et al., 2000), moscas (ttv) (Bellaiche

et al., 1998; Toyoda et al., 2000), e em camundongos (EXT1) (Lin et al., 2000)

não possuem HS, sendo que os mutantes vertebrados parecem possuir

menores concentrações das enzimas associadas. Camundongos com uma

mutação no gene EXT2 foram isolados e possuem as mesmas anormalidades

no desenvolvimento do que o camundongo deficiente na EXT1, mas um defeito

na síntese de HS ainda não foi demonstrado. A co-expressão da EXT1 e EXT2

possui efeito sinérgico na atividade da enzima (McCormick et al., 2000; Senay

et al., 2000), o que sugere que ambas as EXT1 e EXT2 participam na formação

do HS.

EXTL1, EXTL2 and EXTL3 também são outra classe de GlcNAc

transferases envolvidas na biossíntese de HS (Kitagawa et al., 1999b). A

habilidade da EXTL1, e mais significativamente a EXTL3 em adicionar GlcNAc

aos oligossacarídeos de HS sugere que essas enzimas também podem

participar na formação do polímero (Kim et al., 2001). A comparação da

sequência dos vários EXTs sugere que elas podem ser consideradas uma

família de proteínas contendo dois domínios catalíticos, responsáveis

independentemente pelas atividades de transferência de GlcNAc ou GlcA. O

alinhamento dos aminoácidos de todos os membros da família das EXT mostra

que a identidade geral varia de 25% a 30%, sendo a maior diferença

encontrada na porção C‐terminal das proteínas em ~260 aminoácidos (30 a

50% de identidade). A EXTL2 é o menor membro da família (330 aminoácidos),

e a região envolvida na transferência de GlcNAc contém um domínio altamente

conservado, DXD, também encontrado nas EXT1, EXT2, EXTL2 e EXTL3,

(29)

de ligação divalentes de nucleotídeo‐açúcar encontrados em outras

glicosiltransferases (Breton and Imberty, 1999).

Uma suposição implícita desses estudos é que a polimerização das

cadeias continua na ausência de modificações das cadeias. Isso pode ser uma

artefato do modo como a via biossintética é frequentemente apresentada (Esko

and Lindahl, 2001) e com o fato de que o N‐acetilheparosan (GlcA‐GlcNAc)n é

um substrato disponível para essas enzimas (Lidholt and Lindahl, 1992). Em

microssomos, a inclusão de 3’‐fosfoadenosina‐5’¬fosfosulfato (PAPS) estimula

a polimerização de HS a partir de nucleotídeo‐açúcares, o que sugere que a

ação das EXTs é acoplada a N‐deacetilação e N‐sulfatação GlcNAc (Lidholt et

al., 1989). Após a polimerização, a cadeia nascente de GAG sofre inúmeras

modificações por enzimas localizadas no Aparelho de Golgi, criando domínios

que possuem um padrão comum, como os domínios HS contendo glucosamina

N‐sulfato, uma mistura de glucosamina N‐acetilada ou N‐sulfatada, ou

domínios meramente N‐acetilados. Ainda, foi demonstrada a inibição da

sulfatação e o bloqueio da adição de resíduos glucosamina e ácido urônico por

selenato, na cadeia polimérica nascente, sugerindo que a sulfatação dos

dissacarídeos é concomitante com a polimerização das cadeias de HS em

células de aorta de coelho e no hemíptero Rhodnius prolixus (Dietrich et al.,

1987; Dietrich et al., 1988).

1.3.5. Modificações nas cadeias dos HS

Ao contrário do que acontece com o CS, que possui cadeias

completamente modificadas de dissacarídeos, as modificações que ocorrem

nas cadeias de HS se dão em clusters, construindo regiões de sulfatação

separadas por regiões não modificadas. Essas modificações levam a

segmentos conhecidos como domínios N-acetilados (NA), N-sulfatados (NS) e

híbridos NA/NS. A expressão combinatória desses genes significa que a

estrutura do HS pode ser alterada, modulando sua ampla variedade de funções

tecido-específicas. De acordo com a atual teoria biosintética, a primeira

modificação na cadeia do HS envolve deacetilação e sulfatação do átomo de

nitrogênio da Nacetilglucosamina, reação catalisada pela classe de enzimas

N‐deacetilase‐N‐sulfotransferase (NDST). Essa modificação parece ser pré‐

(30)

Selleck, 2002). A N-sulfatação ocorre de modo não uniforme na cadeia, criando

domínios contendo resíduos de N‐acetil‐glucosamina não modificados,

domínios onde coexistem resíduos de Nacetil-glucosamina e N

sulfoglucosaminas e domínios onde o resíduo de N‐sulfoglucosaminas ocorrem

quase que exclusivamente (Dietrich et al., 1983; Dietrich et al., 1988; Nader et

al., 1989). Uma varredura para mutações letais em D. melanogaster levaram ao

isolamento do homólogo da HS polimerase – toutvelu, e do gene sulfateless,

que codifica para o homólogo da mosca para a NDST (Lin and Perrimon,

1999), representando a primeira análise in vivo de uma enzima que atua em

HS, determinando que as correlações entre os genes sulfateless e wingless na

sulfatação do HS são imprescindíveis para a correta sinalização de fatores de

crescimento (Lin and Perrimon, 1999).

Enquanto o polímero se forma, um ou mais membros da família das N‐

deacetilase/ N‐sulfotransferases (NDST) de GlcNAc agem nesses resíduos ao

longo da cadeia. Essa é a primeira reação envolvida na modificação dos

polímeros e pré‐requisito para todas as reações de modificação subsequentes,

de acordo com a teoria biosintética corrente. A família de NDSTs em

vertebrados consiste de quatro enzimas, mas somente uma isoforma é

encontrada em C. elegans e D. melanogaster. Todas as proteínas possuem

alto grau de identidade nas sequências (65‐80%) e a mesma estrutura geral

(Aikawa et al., 2001): proteínas transmembrana tipo II com uma cauda

citoplasmática curta de 12‐13 aminoácidos, uma região transmembrana de ~20

aminoácidos, uma pequena região que varia significativamente entre todas as

quatro NDSTs e um grande domínio globular contendo os sítios catalíticos. O

domínio sulfotransferase da NDST1 está na porção Cterminal da proteína

(Berninsone and Hirschberg, 1998; Wei et al., 2000). Os vertebrados contêm

quatro genes que codificam as NDSTs, sendo a perda de dois deles causadora

de fenótipos específicos (Forsberg et al., 1999; Humphries et al., 1999; Fan et

al., 2000; Ringvall et al., 2000). Lesões no gene NDST2 causam anormalidades

severas nos mastócitos, devido à ausência de heparina corretamente

modificada (existindo uma versão intracelular, hipersulfatada, do HS

extracelular) (Forsberg et al., 1999; Humphries et al., 1999). Ao contrário, os

(31)

provavelmente devido à malformação pulmonar (Fan et al., 2000; Ringvall et

al., 2000), anormalidades faciais e defeitos na migração de axônios. Essas

análises demonstraram que o desenvolvimento dos vertebrados, assim como o

desenvolvimento de D. melanogaster e de C. elegans, requerem a sulfatação

das cadeias dos GAGs (Dietrich et al., 1987). A estrutura da NDST mostra dois

grandes domínios altamente conservados que interagem com o PAPS (Kakuta

et al., 1999; Negishi et al., 2001), com o domínio sulfotransferase contendo

uma fenda catalítica que pode acomodar até seis resíduos de açúcar, definida

por uma α‐hélice e uma superfície hidrofílica. Inúmeros resíduos nesses

elementos estruturais diferem em carga e hidrofobicidade nas quatro NDSTs, o

que pode explicar algumas diferenças na atividade catalítica observadas entre

as isoformas (Aikawa et al., 2001). A NDST2 possui maior atividade N‐

deacetilase em relação à atividade de N‐sulfotransferase quando comparada

com a NDST1, o que pode explicar a maior extensão de N‐sulfatação observa

na heparina do que em mastócitos (onde a enzima foi originalmente clonada).

Confirmando essa ideia, a inativação da NDST2 em camundongos leva a uma

diminuição seletiva na sulfatação da heparina dos mastócitos, sem nenhum

efeito notável em outros tecidos (Forsberg et al., 1999; Humphries et al., 1999).

Entretanto, existem evidências sugerindo que ambas NDST1 e NDST2

participam na formação de HS: mRNAs dessas enzimas são expressos

abundantemente em tecidos e células que sintetizam HS (Toma et al., 1998;

Aikawa et al., 2001; Kusche-Gullberg and Kjellen, 2003), e um mutante da

NDST1 em CHO produz HS contendo ~25% de GlcNS (Bame and Esko, 1989;

Aikawa et al., 2001). Esses dados indicam que ambos os níveis de expressão

da enzima e propriedades específicas da isoforma de NDST determinam a

extensão da N‐sulfatação de HS.

As NDST3 e NDST4 possuem propriedades diferentes em comparação

com a NDST1 e NDST2. A NDST3 possui atividade deacetilase muito maior do

que a atividade N‐sulfotransferase, enquanto para NDST4 ocorre o oposto

(Aikawa et al., 2001). Os mRNAs das NDST1 e NDST2 são expressos

abundantemente em tecidos, enquanto os das NDSTs 3 e 4 são restritos ao

cérebro adulto e tecidos fetais (Toma et al., 1998; Humphries et al., 1999;

(32)

terminal 5’‐UTR dos mRNAs das NDSTs indicam que o controle da tradução

pode ser importante na regulação da expressão (Aikawa et al., 2001). Todas as

sequências 5’UTR são usualmente longas, possuem estruturas secundárias

retidas, e contém códons (u)AUG múltiplos, resultando em pequenos frames de

leitura (uORF). Essas características impõem uma barreira ao escaneamento

ribossomal convencional dependente de cap. Os 5’UTRs da NDST4 são

capazes de regular a tradução de diferentes modos in vivo, dependendo do

tipos celular e das condições de cultura. A tradução in vitro e análises de

mutantes sugerem a presença de sítios de entrada internos no ribossomo

(IRES), nos 5’‐UTRs das NDSTs 2, 3 e 4, proporcionando uma passo adicional,

dependente de cap, no controle fino de sua expressão.

O screening de bancos de dados indica que todos os genes das

enzimas necessárias para a síntese de GAGs podem possuir sequências de 5’‐

UTR longas e estruturadas, o que sugere que a síntese de GAGs é um

processo altamente regulado, assim como a tradução dos fatores de

crescimento que se ligam a ele (FGF‐2) (Kevil et al., 1995). Normalmente, a N‐

sulfatação é acoplada a N‐deacetilação, possivelmente pela proximidade dos

sítios ativos das enzimas ativas. As duas reações podem ser dissociadas pelo

tratamento com N‐etilmaleimida ou DTT, que bloqueia seletivamente o domínio

deacetilase (Pettersson et al., 1991), ou pela mutação de um resíduo de lisina

crítico no sítio ativo de sulfotransferase (Sueyoshi et al., 1998).

Interessantemente, os resíduos modificados pelo domínio deacetilase de uma

enzima podem ser modificados pelo domínio N‐sulfotransferase de uma enzima

diferente, o que indica que as duas reações podem ocorrer de forma

dissociada. O fato de que as sequências modificadas tendem a estar

agrupadas pela cadeia em domínios NS ou NA/NS sugerem que a enzima se

distância do resíduo GlcNAc inicial de forma prédeterminada. A NDST2 parece

preferir substratos N‐sulfatados, proporcionando um mecanismo de

retroalimentação que pode explicar a formação dos domínios NS (Riesenfeld et

al., 1982).

Todos os domínios de ligação a glicosaminoglicanos caracterizados

(33)

Diferentemente do GlcA, o IdoA pode adotar várias conformações no anel

piranose (1C4, 4C1 e barco inclinado 2S0‐figura 5), enquanto os anéis de

piranose dos resíduos de GlcNAc e GLcA estão na conformação 4C1 (Mulloy

and Forster, 2000). Essa flexibilidade adicional permite o reposicionamento dos

átomos de hidrogênio viscinal e os constituintes sulfatados em posições não‐

equivalentes dependendo da conformação adotada.

Figura 5. Epimerização de resíduos de ácido urônico. Conformação do ácido glucurônico, ácido idurônico e dos anéis de piranose da glucosamina encontrados em HS/Hep.

A abundância relativa das conformações de barco inclinado e cadeira

dependem da substituição do sulfato na posição 2 nos resíduos adjacentes de

glucosamina, e na estrutura do ligante protéico que se liga ao oligossacarídeo

contendo IdoA. Estudos recentes demonstraram que a C5‐epimerase age tanto

em D‐GlcA quanto em L‐IdoA (reação reversa), de acordo com o mecanismo

proposto no qual a reação deve ocorrer pela abstração reversível e readição do

próton em C‐5 (Hagner-Mcwhirter et al., 2000). Resíduos de lisina conservados

na porção C‐terminal da proteína podem agir como doadores de prótons/

aceptores da reação, explicando a inibição da atividade pelas modificações

nessa região (Crawford et al., 2001). A especificidade da enzima sugere que a

epimerização se inicia após a N‐deacetilação/ N‐sulfatação dos resíduos de

GlcNAC, mas antes da 6‐O‐sulfatação de 3‐O‐sulfatação dos resíduos de

(34)

1.3.6. Sulfotransferases

A 2‐O‐sulfotransferase atua sobre ambos resíduos de ácido urônico,

IdoA e GlcA, preferindo o primeiro sob a maioria das condições quando

incubada com substrato contendo ambas as unidades, refletindo a variação na

afinidade para substratos contendo ácido idurônico (Rong et al., 2000). Outros

fatores aparentemente regulam a extensão da 2‐O‐sulfatação, que varia de 50

a 90% para resíduos de IdoA, e aumenta consistentemente em frequência

conforme o tamanho do domínio NS aumenta (Safaiyan et al., 2000). As

unidades de IdoA ocorrem tanto nos domínios NS quanto nos domínios NA/NS,

sendo que os localizados no último tendem a ser não sulfatados (Maccarana et

al., 1996). Interessantemente, a 2Osulfatação também pode afetar o grau de

N‐deacetilação/N-sulfatação e 6‐O‐sulfatação dos resíduos de GlcNAc sob

algumas circunstâncias (Bai and Esko, 1996; Merry et al., 2001), sugerindo que

as modificações a nível polimérico provavelmente ocorrem simultaneamente.

Vertebrados e invertebrados possuem somente um gene óbvio para a

heparam sulfato 2-O-sulfotransferase (HS2st) (Kusche-Gullberg and Kjellen,

2003), e mutações envolvendo perda de função foram estudadas em

camundongos provocando agênese renal e desenvolvimento cortical (Bullock et

al., 1998). A perda do gene HS2st em C. elegans causa problemas no

crescimento axonal e defeitos na migração celular (Bulow and Hobert, 2004;

Kinnunen et al., 2005). O gene pipe de D. melanogaster, que apresenta

similaridades com as HS2sts, está envolvido no desenvolvimento do padrão

dorso/ventral (Sen et al.), mas não está envolvido na biossíntese de HS (Zhu et

(35)

Tabela 2: Sítios putativos de ligação a PAPS das sulfotransferases. 5’-PBS e 3’-PB representam os sítios de ligação ao fosfosulfato 5’ e 3’ respectivamente. Os resíduos de Os resíduos de aminoácidos conservados estão mostrados em negrito (Habuchi et al., 2000).

Existem ainda duas atividades que catalisam reações envolvendo a

transferência de sulfato em grupos hidroxil dos respectivos resíduos de

glucosamina: HS 3O‐sulfotransferase (HS3STs) e HS 6O‐sulfotransferases

(HS6STs). Ao contrário dos invertebrados, ambas as famílias estão expandidas

nos vertebrados, havendo seis genes codificando para a HS3ST e três

codificando para a HS6ST em camundongo. Três isoformas foram inativadas

em camundongo, resultando em efeitos leves, como retardamento do

crescimento intrauterino (Shworak et al., 2002; HajMohammadi et al., 2003). A

isoforma de HS3ST específica na modificação que introduz o domínio de

ligação à antitrombina foi silenciada em camundongos, não afetando entretanto

a coagulação sanguínea desses animais, provavelmente por causa da

redundância destas modificações (Shworak et al., 2002; HajMohammadi et al.,

2003). Enquanto vertebrados possuem pelo menos três genes codificando para

a HS6st, só foi encontrado um gene em D. melanogaster e em C. elegans.

Experimentos de knockdown em zebrafish demonstraram que a 6O‐sulfatação

está envolvida no desenvolvimento muscular e vascular (Bink et al., 2003;

Chen et al., 2005), e knockdown mediado por RNAi em D. melanogaster

levaram a problemas no desenvolvimento da traquéia similares aos

(36)

leva a defeitos no crescimento neuronal similares aos da perda das enzimas

epimerase e HS2st (Bulow and Hobert, 2004). Existem pelo menos cinco

isoformas da 3‐O‐sulfotransferase (Shworak et al., 2002). A 3‐O‐sulfatação dos

resíduos de glucosamina é uma modificação importante durante a biossíntese

de pelo menos dois domínios de ligação caracterizados (antitrombina e

glicoproteína gD do vírus da Herpes simplex). A 3OST1 é a única isoforma

capaz de produzir sequências com alta afinidade de ligação para a antitrombina

por causa de sua afinidade por resíduos contendo GlcA‐GlcNS ou GlcA‐

GlcNS6S (Shworak et al., 2002). Entretanto, essa isoenzima também reage

com resíduos de IdoA‐GlcNS e IdoA‐GlcN6S, se esses resíduos não possuírem

2‐O‐sulfatação (Zhang et al., 2001), sugerindo que essa modificação no

terminal não redutor do resíduo‐alvo normalmente bloqueia a ação da 3OST1.

A 3OST2 transfere o sulfato para unidades de GlcA2S‐GlcNS e IdoA2S‐GlcNS,

enquanto 3OST3A e B transferem o sulfato para unidades de IdoA2S‐GlcNS e

IdoA2S-GlcNH2 (Liu et al., 1999), gerando um seqüência com alta afinidade

para a glicoproteína gD do vírus da Herpes simplex (Shukla et al., 1999).

As 3OSTs são similares as NDSTs, especialmente, nos domínios

sulfotransferases C‐terminais (~50%). A especificidade das enzimas reside

nessa região, mas os resíduos de aminoácidos responsáveis pelas

preferências ao substrato ainda são desconhecidas (Yabe et al., 2001).

Interessantemente, as 3OSTs não demonstram homologia significativa com as

6OSTs, exceto pelos domínios de ligação ao PAPS conservados (Shworak et

al., 1999; Habuchi et al., 2000). Uma visão geral da biossíntese de

(37)

Figura 6: Biossíntese de Glicosaminoglicanos: modificações poliméricas

1.3.7. Sítio de ligação ao PAPS e mecanismo de ação da STS

Um domínio strandloophelix e strandturnhelix constituem o sítio de

ligação ao PAPS, promovendo a maioria das interações da enzima em todas as

estruturas das STs. Um loop (PSB loop) interage com o fosfato 5’ da molécula

de PAP, enquanto a hélice 6 do domínio strandturnhelix, paralelo ao loop PSB

promove a interação com o fosfato 3’ (Figura 7). Não somente as estruturas,

(38)

fosfato estão conservados em todas as STS, citosólicas e de membrana. As

seqüências consenso PKT/SGTTW/AL e IT/YV/I/LLRNPA/KDR/VL/AVSYY/Q

para os domínios de ligação ao fosfato 5’ e 3’, respectivamente, sendo

denominados 5’PSB e 3’PB (Kakuta et al., 1998).

Figura 7. Alinhamento mútiplo das sulfotransferases. 5´PSB e 3´PB representam os

domínios de ligação ao fosfato 5´‐e 3´‐, respectivamente, deduzidos da estrutura cristalográfica

da sulfotransferase de estrógeno (EST). O loop PSB é mostrado em magenta e a região em

coil é representada em azul, logo após a α-hélice 11 em amarelo.

Um resíduo de lisina no 5’PSB está conservado em virtualmente todas

as STs. O nitrogênio coordenado da cadeia lateral desse resíduo de serina

forma uma ponte de hidrogênio com um átomo de oxigênio do fosfato 5’ nas

STs ligadas ao PAP. No domínio de ligação 3’PB, um resíduo de serina fornece

o hidroxil da cadeia lateral, que interage com um átomo de oxigênio do fosfato

3’. Ainda, o resíduo de lisina pode doar seu próton para o oxigênio nascente,

auxiliando a dissociação do grupamento sulfato do PAPS e, após a ligação ao

substrato, o resíduo de histidina remove o próton do grupo aceptor, tornando‐o

um nucleófilo que ataca o átomo de enxofre da molécula de PAPS. Finalmente,

o desenvolvimento de cargas negativas força a troca do nitrogênio para a

(39)

Figura 8. O mecanismo proposto de reação para a transferência do sulfuril catalizada pelas STs. Os números dos resíduos são tomados com base na sulfotransferase de estrógeno (hEST).

1.4. Considerações sobre a corrente hipótese sobre a biossíntese de HS/Heparina

Embora as enzimas envolvidas no processo de modificação das cadeias

de GAGs tenham sido extensivamente estudadas em termos de estrutura,

atividade e especificidade com relação aos glicosaminoglicanos, a seqüência e

a forma com que essas modificações ocorrem ainda é obscura. Um GAG

peculiar na espécie Achatina fulica, denominado acaram sulfato (Kim et al.,

2001) possui estrutura relacionada, porém totalmente distinta do heparam

(40)

Figura 9: Estrutura do dissacarídeo repetitivo de acaram sulfato.

Esse glicosaminoglicano possui uma estrutura atípica, pois contém

resíduos de ácido idurônico sulfatados adjacentes a um resíduo de

N-acetilglucosamina não modificada. O que torna atraente o estudo deste

composto é o fato de que sua estrutura é totalmente incompatível com as

etapas de modificações do processo biosintético descrito para o heparam

sulfato e heparina. Assim, segundo as teorias correntes, a enzima 2‐O‐

iduronosil‐sulfotransferase agiria após a N‐deacetilase/N-sulfotransferase e

uronosil C5‐epimerase, não sendo portanto compatível com a presença de uma

N‐acetilglucosamina vicinal a um resíduo de ácido idurônico‐2‐O‐sulfatado,

como ocorre na Achatina fulica.

Por outro lado, heparina com estruturas semelhantes a de mamíferos

tem sido descritas em invertebrados (Dietrich et al., 1987; Pejler et al., 1987;

Dietrich et al., 1988). Ainda, para o molusco bivalve Anomalocarida brasiliana,

foi demonstrado que a heparina apresenta‐se exclusivamente em grânulos

intracelulares de células tipo mastócito, com distribuição tecidual semelhante à

de mamíferos e outros tipos de vertebrados (intestino, pele/manto,

pulmão/brânquias) (Santos et al., 2002; Nader et al., 2004). Assim, as vias de

biossíntese dessas heparinas contidas em invertebrados devem ser

semelhantes àquela presente em mamíferos, insetos e nematódeos. Algumas

evidências da presença de Gagossomos que regulam a síntese das diversas

estruturas dos GAGs sintetizados em uma células é dada pela investigação da

influência da utilização durante a biossíntese de diferentes xilosídeos.

(41)

dissacarídica e tipo de cadeias de GAG de maneira relativamente específica,

influenciando mudanças na estrutura fina e quantidade de cadeias de GAGs

produzidas na célula.

1.5. Caracterização conformacional da ligação ao dissacarídeo e

transferência de sulfato através de dinâmica molecular (DM)

O uso de simulações de dinâmica molecular (DM), um procedimento de

simulação que consiste na computação do movimento dos átomos em uma

molécula, iniciou-se há mais de 30 anos para sistemas biológicos, com o

estudo de um sistema protéico envolvendo um inibidor de tripsina pancreática

bovina (McCammon et al., 1977). Atualmente, consiste em uma ferramenta

amplamente difundida, que é empregada na investigação da estrutura e

dinâmica de biomoléculas em geral, abrangendo estudos que envolvem desde

a interação de compostos às suas proteínas-alvo, desnaturação e

enovelamento protéicos (Ponder and Case, 2003), até o estudo de

exopolissacarídeos bacterianos (Nogueira et al., 2005).

A integração da equação de movimento de Newton d2ri(t)/dt2=Fi /mi,

sendo d2ri(t)/dt2 a aceleração, mi a massa e Fi a força sobre um determinado

átomo i, é a característica fundamental dos cálculos de DM que, quando

realizada sucessivamente e sobre todos os átomos do sistema, gera uma

trajetória de movimento das moléculas em estudo, ou seja, uma seqüência de

diferentes posições dos átomos em função do tempo (Leach, 2001).

Esta integração é realizada de forma que uma força Fi acarreta uma

aceleração sobre um determinado átomo i e, em conseqüência, causa uma

mudança de sua posição num intervalo de tempo Δt relativo à aceleração. No

entanto, considerando somente tal equação, não é possível determinar o

módulo e a direção da força Fi sobre os átomos do sistema, nem sua relação

com as características químicas de cada molécula em estudo (Leach, 2001).

Dessa forma, tais parâmetros são calculados em função de mudanças na

energia potencial entre a posição atual e a posição seguinte (a que

representará o próximo passo da simulação) sobre cada átomo

separadamente. Esta superfície de energia potencial representa a energia de

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