Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Programa de Pós-Graduação em Alimentos e Nutrição
Área Ciências Nutricionais
JOÃO PAULO BURIAN
Efeito imunomodulatório e controle da infecção fúngica do extrato
de alho (
Allium sativum
L.) em modelo murino de esporotricose
Araraquara
JOÃO PAULO BURIAN
Efeito imunomodulatório e controle da infecção fúngica do
extrato de alho (
Allium sativum
L.) em modelo murino de
esporotricose
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-graduação em Alimentos e
Nutrição da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas da Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho”,
UNESP, para obtenção do título de estre
em Ciências Nutricionais.
Orientador: Prof. Dr. Luís Vitor Silva do Sacramento
Ficha Catalográfica
Elaborada Por Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
UNESP – Campus de Araraquara
Burian, João Paulo
B958e Efeito imunomodulatório e controle da infecção fúngica do extrato de alho (Allium sativumL.) em modelo murino de esporotricose / João Paulo Burian.–Araraquara, 2016.
58 f.
Dissertação (Mestrado) –Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”.
Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Alimentos e Nutrição, Área de concentração Ciências Nutricionais.
Orientador: Luís Vitor Silva do Sacramento.
1.Alho. 2. Macrófago. 3. Sporothrix schenckii. 4. Esporotricose. 5. Interleucina.
I. Sacramento, Luís Vitor Silva do, orient. II. Título.
AGRADECIMENTOS
À Prof. Dr.ª Iracilda Zeppone Carlos, que abriu as portas de seu laboratório sem o qual não seria possível a realização desse trabalho e a toda equipe do laboratório de Imunologia Clínica, em especial para Marisa e Lucas, pessoas que estiveram sempre me ajudando e ensinando no decorrer do experimento.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÂO. . . 1
1.1. Justificativa. . . 2
2. REVISÂO BIBLIOGRÀFICA. . . 2
2.1. Aspectos gerais do alho. . . 2
2.1.1. Composição química dos bulbilhos. . . 3
2.1.2. Compostos bioativos do alho. . . 4
2.1.3. Ingesta de alho. . . 5
2.1.4. Biodisponibilidade dos compostos do alho. . . 7
2.1.5. Toxicidade. . . 8
2. 2. Imunidade. . . 8
2.2.1. Macrófagos. . . 9
2.2.2. Óxido nítrico. . . 10
2.2.3. Interleucinas (IL-1 , IL-10 e IL-12) . . . 10
2.2.4. Alho e imunidade. . . 12
2.3. Infecções fúngicas. . . 13
2.3.1.. Sporothrix schenckii e esporotricose. . . 14
3.OBJETIVOS. . . 15
3.1. Objetivo geral. . . 15
3.2. Objetivos específicos. . . 15
4. MATERIAL E MÉTODOS . . . 15
4.1. Obtenção dos extratos. . . 15
4.2. Ensaio com animais. . . 15
4.3. Obtenção das células do exsudato peritoneal. . . 16
4.4. Avaliação da Viabilidade Celular pelo método de MTT. . . 17
4.5. Determinação de NO. . . 17
4.6. Determinação de citocinas. . . 18
4.7. Microrganismo e condições de cultivo. . . 18
4.8. Infecção experimental. . . 19
4.9. Determinação da carga fúngica. . . 19
4.10. Avaliação da capacidade antifúngica por microdiluição. . . 19
4.11. Análise estatística. . . 20
5. RESULTADOS. . . 20
5.1. Determinação da viabilidade celular. . . 20
5.2. Determinação da liberação de NO. . . 20
5.3. Determinação da produção Interleucinas. . . 22
5.3.1. Determinação da produção de IL-1 . . . 22
5.3.2. Determinação na produção de IL-10. . . 23
5.3.3. Determinação na produção de IL-12. . . 25
5.4. Determinação da carga fúngica (UFC) . . . 26
5.5. Avaliação da capacidade antifúngica por microdiluição. . . 27
6. DISCUSSÃO. . . 28
7. CONCLUSÂO. . . 31
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. . . 32
9. ANEXOS. . . 40
9.1. Anexo1 - Artigo. . . 40
RESUMO
O alho (Allium sativum L.) é cultivado em todo o mundo como hortaliça condimentar e
medicinal desde 3.000 a. C. A aliina (composto majoritário) e a alinase permanecem em compartimentos separados nos bulbilhos de alho, e somente quando cortados ou triturados, a aliina é convertida em alicina pela ação da alinase. A alicina é o principal componente do alho, sendo atribuída a ela a maior parte das suas atividades biológicas, dentre elas as ações bactericida, antifúngica e antiviral. Porém, outros compostos do alho apresentam atividade antioxidante, hipocolesterolemiante, vasodilatadora, ação protetora contra diversos tipos de câncer e imunomoduladora. Ante a invasão de patógenos, o sistema imunológico desencadeia respostas que envolvem células como macrófagos e linfócitos. Essa complexa interação entre células é coordenada pela liberação de citocinas e outros mediadores. A nutrição tem papel relevante na modulação da resposta imune e inflamatória em diferentes tipos de doenças. As infecções por fungos são causas importantes de morbidade e mortalidade no homem
principalmente em indivíduos imunossuprimidos. O Sporothrix schenckii, agente causal da
esporotricose (micose subcutânea mais comum na América Latina), é fungo dimórfico, de vida
saprofítica no solo ou em vegetais, infectando homens e os animais principalmente através de
lesões e arranhões na pele. O objetivo desse trabalho foi avaliar a influência do consumo de alho
na imunomodulação de camundongos Swiss saudáveis e infectados por S. schenckii, a partir do estado funcional dos macrófagos peritoneais desses animais quanto à produção de óxido nítrico
e das citocinas (IL-1 , IL-10 e IL-12) e avaliar o potencial antifúngico do alho frente ao S.
schenckii por meio de teste de concentração inibitória mínima e unidades formadoras de
colônia. Os resultados demonstraram que o alho apresenta potencial antifúngico frente S.
schenckii. A administração oral de extratos de alho influencia a liberação de citocinas por
macrófagos ex vivo, o consumo regular apresenta efeito anti-inflamatório em animais sadios, e seu uso agudo pode gerar uma resposta inflamatória. Camundongos que consumiram alho responderam de forma mais efetiva ao combate da infecção.
ABSTRACT
Garlic (Allium sativum L.) is grown all over the world as seasoning and medicinal food since
3,000 a. C. The aliin (major compound) and alliinase remain in separate compartments in intact garlic clove, and when the garlic is cut or crushed, the alliin is converted to allicin by the action of alliinase. Allicin is the main component of garlic is attributed to it most of the biological activities of garlic, including the bactericide, antifungal and antiviral action. However, other garlic compounds have antioxidant activity, hypocholesterolemic and vasodilating activities, guard action against many types of cancer and immunomodulatory. At the invasion of pathogens, the immune system triggers responses involving cells such as macrophages and lymphocytes. This complex interaction between cells is coordinated by the release of cytokines and other mediators. Nutrition plays an important role in modulating the immune and inflammatory response in different types of diseases. Fungal infections are significant reasons of
human morbidity and mortality mainly in immunocompromised people. The Sporothrix
schenckii, the causal agent of sporotrichosis (most common subcutaneous mycosis in Latin America), is dimorphic fungus, of saprophytic life in soil or in plant that infects humans and animals mainly through skin injuries and scratches. The aim of this study was to evaluate the influence of garlic consumption in immunomodulation of Swiss healthy and infected mice by S. schenckii from the functioning of peritoneal macrophages of the animals and the production of nitric oxide and cytokines (IL 1 , IL-10 and IL-12) and evaluating the antifungal potential of garlic against S. schenckii by minimum inhibitory concentration test and colony forming units. The results show that garlic has potential antifungal front S. schenckii. Oral administration of
garlic extracts influences the releasing of cytokines by macrophages ex vivo, regular
consumption has anti-inflammatory effects in healthy animals, and its use can generate an acute inflammatory response. Mices that consumed garlic responded more effectively to combat the infection.
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1. INTRODUÇÃO
O alho (Allium sativum L.) é cultivado em todo o mundo como hortaliça condimentar e medicinal. Pertence a família Liliaceae, junto com mais de 700 espécies como a cebolinha e o
alho-poró. Seu nome científico é derivado da palavra celta ‘all’, que significa ardente ou quente,
e da palavra latina ‘sativum’ que significa cultivo ou cultivado. Existem registros do uso de alho
desde 3000 a.C. pelos sumérios e indianos (GARCIA GOMEZ et al.,2014; ABREU MATOS, 2000; HOLUB et al., 2002). O Codex Ebers, papiro médico egípcio traduzido em 1937 contava com 22 formulações que utilizavam alho (CHARRON et al., 2014 & HARRIS et al., 2001).
Embora muito utilizado na culinária de muitos povos, sua importância nutricional energética na dieta diária é quase insignificante. Isso é explicado pelo uso como aromatizante em pequenas quantidades e não como alimento (GARCIA GOMEZ et al., 2014).
A nutrição tem papel relevante na modulação da resposta imune e inflamatória em diferentes tipos de doenças, uma vez que nutrientes modulam sistemas de defesa celular e humoral, pela alteração na formação de mediadores ou pela interferência nas vias de transdução de sinais celulares, podendo alterar o balanço entre citocinas e atenuar a depleção de nutrientes teciduais (HEPBURN, 2014; PARHAM, 2011).
As infecções por fungos são causas importantes de morbidade e mortalidade no homem (JANEWAY, et al., 2000). Existem infecções ditas oportunistas, pois os agentes etiológicos causam doença branda ou nenhuma doença em indivíduos sadios, mas podem infectar e causar graves doenças em indivíduos imunossuprimidos. Uma simples infecção, como a candidíase, pode se tornar grave e invasiva, colonizando esôfago, estômago e intestino em pacientes portadores da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) (ABBAS et al., 2012 & COELHO-CASTELO et al., 2009).
O Sporothrix schenckii, agente causal da esporotricose é fungo dimórfico, de vida
saprofítica no solo ou em vegetais, infectando ocasionalmente o homem e os animais. No homem a maior parte das infecções é provocada por lesões com farpas, madeiras ou arame
(MARQUES et al., 1993). Conhecida popularmente como a “doença dos jardineiros”, uma vez
que acomete principalmente estes indivíduos pela alta exposição aos espinhos, estes que podem causar traumas e arranhões, e com isso levando a inoculação do fungo via subcutânea. Pelo exposto, horticultores, floristas, fazendeiros e pescadores são exemplos de atividades ocupacionais e de lazer que podem facilitar a exposição ao fungo (ALEGRANCI, 2013).
2 1.1 Justificativa
Na região metropolitana do Estado do Rio de Janeiro, nos últimos anos, vem ocorrendo uma epidemia zoonótica de esporotricose que se encontra em franco crescimento e negligenciada pelo poder público. Apesar de se verificar um expressivo aumento no número de registro de casos, não existem medidas específicas que objetivem o seu controle (SILVA et al., 2012).
A maioria dos casos de esporotricose no Brasil, transmitidos de forma clássica, ou seja, pelo solo ou matéria orgânica foram confirmados no Estado de São Paulo, com 235 casos humanos confirmados até o ano de 1953. Já no Estado do Rio Grande do Sul, um total de 646 casos humanos acumulados em diferentes casuísticas entre os anos 1957 e 2002 (FREITAS, 2014). Nos casos confirmados em humanos no Estado do Rio de Janeiro, a maior parte das infecções foi originada por ferimentos causados por gatos domésticos (SILVA, et al., 2012).
É preciso considerar também, que o tratamento de infecções fúngicas com agentes antifúngicos sintéticos pode causar diversos efeitos colaterais em pacientes, especialmente em pacientes imunocomprometidos ou que estejam recebendo doses repetidas para tratar infecções persistentes. Dessa forma é preferível prevenir infecções fúngicas em pacientes de alto risco ao invés de ter que tratá-los (KYM, et al., 2012).
Considerando os agravos a saúde que indivíduos podem apresentar frente a infecções fúngicas e ao seu tratamento com antifúngicos sintéticos convencionais, o objetivo desse trabalho foi avaliar a influência do consumo de alho (Allium sativum L.) na imunomodulação de
camundongos Swiss saudáveis e infectados por S. schenckii. uma vez que não existem dados
sobre o alho no controle da esporotricose.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Aspectos gerais do alho
A planta do alho pode alcançar até 60 cm de altura, partindo de um bulbo subterrâneo que é envolvido por uma película esbranquiçada ou rósea, composto de bulbilhos, popularmente chamados de “dentes”. Suas flores de cor esbranquiçada ou avermelhada são dispostas em umbela. Pode ser cultivado a partir dos bulbilhos, que devem ser plantados em solo leve, rico em matéria orgânica e de preferência em locais de clima ameno. A colheita é feita de cinco a oito meses após o plantio (ABREU MATOS, β000).
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melhores características comerciais são: 1 - Grupo comum: Amarante, Gigante Lavínia, Gigante
roxo e Gravatá, e β- Grupo nobre: Caçador, Quitéria, Jonas e Chonan (SILVA, β009). O grupo
nobre é caracterizado por bulbos que apresentem até β0 bulbilhos, enquanto os bulbos do grupo comum possuem mais de β0 bulbilhos (ANAPA, β016).
O Brasil é um país importador de alho, contabilizando um consumo mensal de ββ mil toneladas. A produção nacional supre γγ% desse mercado, e os estados com maior produção são Minas Gerais e Goiás. O restante do alho consumido é importado, principalmente da China e da Argentina (ANAPA, β015).
2.1.1. Composição química dos bulbilhos
A química dos bulbilhos é bastante complexa e provavelmente desenvolvida como um mecanismo de autoproteção contra micro-organismos e outras ameaças presentes principalmente no solo (AMAGASE at al., 2001).
Entre os componentes com atividade biológica, talvez os mais significativos sejam os compostos organossulfurados, que se apresentam em quantidades de 11 a 35 mg por grama de alho fresco. O alho contém três vezes mais compostos sulfurados que a cebola, o brócolis e a couve- flor, além de arginina, oligossacarídeos, flavonóides e selênio (HOLUB et al., 2002;
MILNER & DONATO, 2010). Na Tabela 1 encontra-se a composição centesimal do alho.
Tabela 1 – Composição do alho cru.
Fonte: Tabela Brasileira de Composição de Alimentos (TACO), 2006 – Campinas.
Nutrientes Unidade Valor por 100g
Umidade % 67,5
Energia Kcal 113
Proteína G 7,0
Lipídeos G 0,2
Carboidrato G 23,9
Fibra Alimentar G 4,3
Cinzas G 1,3
Cálcio Mg 14
Magnésio Mg 21
Manganês Mg 0,24
Fósforo Mg 149
Ferro Mg 0,8
Sódio Mg 5
Potássio Mg 535
Cobre Mg 0,15
Zinco Mg 0,8
Retinol Mg NA
Tiamina Mg 0,18
Riboflavina Mg Tr
Piridoxina Mg 0,44
4
O sabor e ardor característico do alho é derivado da hidrólise dos compostos S-alk(en)yl
cysteine sulphoxides (ACSOs) pela enzima alinase. Nos bulbilhos de alho foram encontrados
quatro (ACSOs) diferentes: S-metil-L-cisteína sulfóxido (MCSO), S-propil-L-cisteína sulfóxido
(PCSO), trans-S-(1-propenil) – L-cisteína sulfóxido (1-CEPSO) e S-(β-propenil)-L-cisteína sulfóxido (RANDLE & LANCASTE, β00β). O principal precursor para a caracterização de compostos voláteis de aroma no alho é o aminoácido cisteína. A dialil tiossulfinato (alicina) também contribui para seu sabor e aroma característicos (KREST & KEUSGEN, 1999).
O alho tem um elevado teor de enxofre devido a elevadas concentrações de ACSOs e de seus intermediários metabólicos. O enxofre é um dos seis macronutrientes requerido pelas
plantas e encontra-se nos aminoácidos cisteína e metionina, e em uma variedade de metabólitos.
O enxofre é absorvido pelas raízes como sulfato e transportado pelos vasos para as folhas, onde a maior parte da assimilação de sulfato e a redução dos compostos orgânicos ocorrem (RANDLE & LANCASTE, β00β).
2.1.2. Compostos bioativos do alho
A aliina (S-alilcisteína S-óxido) é o principal composto organossulfurado identificado nos bulbilhos de alho íntegros, pois quando cortados ou triturados, a aliina é convertida pela ação da alinase, enzima que possui atividade ótima em pH de 5 a 10, podendo ser desnaturada irreversivelmente em pH de 1,5 a 3,0. A alicina é um composto muito instável e se decompõe
rapidamente (HARRIS et al., 2001; KREST & KEUSGEN, 1999).
Solúvel em solventes orgânicos e pouco solúvel em água, a alicina têm vida média em água de 30 dias e em ácido cítrico de 60 dias. A transformação de aliina na molécula biologicamente ativa, alicina, ocorre em poucos segundos após o esmagamento do dente de alho. A enzima alinase é uma glicoproteína dependente de piridoxal-5-fosfato, constituída de duas subunidades, e está presente em quantidades elevadas nos dentes de alho, representando pelo menos 10% do conteúdo de proteína total (LAWSON, 1998; ANKRI & MIRELMAN, 1999; HOLUB et al., 2002; MIRON et al, 2000).
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massiva de alicina poderia ser tóxica para outros tecidos da planta (ANKRI & MIRELMAN, 1999).
A transformação química da alicina por meio do calor produz outros compostos sulfurosos, como ajoenos, vinilditiina e trissulfeto de alil metila (ANKRI & MIRELMAN,
1999). Esses compostos estão apresentados na Tabela 2.
Tabela 2 –Compostos sulfurados do alho e possíveis atividades biológicas atribuídas
Fonte: Adaptado de García-Gómez & Sánchez-Muniz (β000).
2.1.3. A ingesta de alho
A ingestão diária de alho é benéfica para a saúde como coadjuvante importante na vasodilatação, na hipertensão arterial, na dislipidemia e como preventivo do câncer do aparelho digestivo (JÚNIOR & LEMOS, β011). Baseado em vários ensaios clínicos em humanos, a ingesta de alho cru até 10 g/dia (1 a β dentes de alho), ou 4 a 6 g de alho em pó/dia, é considerada segura quando ingerido em uma refeição (SILVA, β009 & KOCH, 1996).
O uso diário de 4 a 6 g de alho fresco durante 61 dias reduziu em 15% o nível de triglicérides no sangue e em 1β% o de colesterol de adultos com níveis altos (LORENZI & ABREU MATOS, β00β; SENDL et al. 199β). A redução do colesterol sanguíneo, promovida por compostos de enxofre do alho solúveis em óleo pode estar relacionada à toxicidade, pois
Composto Possível atividade
Aliina Hipotensor;
Hipoglicemiante;
Ajoeno (ajocisteína)
Prevenção de coágulos;
Anti-inflamatório; Vasodilatador; Hipotensor; Antibiótico;
Alicina e
tiosulfinatos
Antibiótica; Antifúngica; Antiviral;
Alil maercaptano Hipocolesterolemiante;
S-alil-cisteína e
compostos -
Glutâmico
Hipocolesterolemiante; Antioxidante;
Quimioprotetor
6
aumentou a concentração da enzima lactato desidrogenase em contato com os hepatócitos, por outro lado, a soluções aquosas diminuíram o colesterol sem apresentar hepatotoxicidade (AMAGASE, et al., β001). O alho também é usado de maneira tópica em ferimentos infectados,
aplicando-se alho triturado em água sobre o ferimento. Nos casos de corrimento vaginal e mau
odor causado por infecções, coloca-se antes de dormir, um dente de alho perfurado enrolado em
gaze, como se fosse um óvulo vaginal (ABREU MATOS, β000).
Alho, cebola, alho-poró e cebolinha, têm sido relacionados com proteção contra o
câncer, principalmente no estômago, cólon e reto. O efeito protetor parece estar relacionado com a presença de compostos organossulfurados, os quais também inibem a carcinogênese no esôfago, nas glândulas mamárias e no pulmão de animais experimentais (BIANCHINI & VAINIO, β001).
Milner (2010) apresenta resultados significativos relacionando o consumo de alho isoladamente ou associado à cebola na prevenção e combate ao câncer, alguns deles são: A partir da análise da dieta de 2230 sujeitos, foi possível relacionar o consumo de alho e cebola com a diminuição de 54% do risco de incidência do câncer de pâncreas; em 51 pacientes com câncer colorretal tratados com extrato de alho envelhecido por 6 meses, o número de tumores e seus tamanhos foram menores comparados ao grupo controle; estudo duplo cego com 50 indivíduos japoneses com tipos inoperáveis de câncer de fígado, pâncreas ou cólon receberam 500 mg ao dia de extrato de alho envelhecido por 6 meses. Os tamanhos dos tumores não diferiram estatisticamente, entretanto, o número de células natural killer e sua atividade aumentaram; um estudo controle realizado entre 1986 e 1989 na França com 345 pacientes mostrou que a incidência de câncer de mama foi menor no grupo que consumia regularmente alho e cebola.
O tratamento com o extrato aquoso de A. sativum em ratos diabéticos, nas doses de 200
e 400 mg kg -1 por via gástrica promoveu melhora no perfil lipídico, especialmente na redução
das taxas de colesterol e de LDL, acentuando seu efeito anti-aterosclerótico. Além disso, o alho apresentou efeito benéfico na redução da glicemia no grupo que recebeu a maior dose de extratos, nas condições experimentais analisadas. Houve redução da glicemia só no 29º dia, no grupo de maior dose (KISS, et al., 2006). O extrato de alho em óleo também apresenta atividade biológica. Os tiossulfonatos produzidos com a maceração são muito solúveis em óleo e se transformam em vinilditiinas, sulfidos e ajoenos, compostos a que são atribuídas atividades anti-trombóticas (SILVA, 2009).
O Extrato de alho apresentou capacidade de neutralizar diretamente um número de espécies reativas de oxigênio em lesão tecidual em ratos, induzida por queimadura de segundo grau provocada por água em 90° C, demonstrando um efeito protetor (SENER et al., 2003).
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pertencentes aos sistemas citocromo P450s e glutationa S-transferases que desintoxicam os tecidos de potenciais agentes cancerígenos, protegendo contra danos ao DNA (AMAGASE, et al., 2001). Contudo, o alho em excesso pode também causar alterações na função plaquetária e no processo de coagulação. Isso não representa um problema significativo em condições normais, entretanto deve ser levado em conta em condições de casos pré e pós-operatório (MILNER & DONATO, 2010).
Análises de expressão gênicas podem levar a descobertas importantes no papel do alho em respostas biológicas. Essas respostas podem ser estudadas a partir de análises do transcriptoma (expressão de genes de rotina), epigenéticas (modificação de histonas e metilação do DNA), proteômica (efeitos sobre as concentrações e atividades de proteínas) e metabolômica (alterações de metabólitos celulares). Nesse contexto, em células animais, o extrato aquoso de alho diminui a expressão de RNA mensageiro para a proteína Npc1l1 que possui papel relevante na absorção de colesterol pelo intestino, por outro lado aumenta a expressão de m-RNA para o receptor retinóico Rarb, que vem sendo considerado limitador de crescimento tumoral (CHARRON et al., 2014).
2.1.4. Biodisponibilidade dos compostos do alho
Acredita-se que a biodisponibilidade (quantidade e velocidade de absorção) de compostos organossulfurados tenha um papel importante em determinadas respostas biológicas para as diferentes preparações do alho. A S-allil cisteína (SAC) é um dos compostos organossulfurados solúveis em água e presentes no alho, sua farmacocinética é bem estabelecida, sendo detectada no plasma sanguíneo, fígado e rim depois da ingestão oral e rapidamente absorvida no trato gastrointestinal e sua concentração aumenta durante a extração e/ou envelhecimento. No envelhecimento de longo tempo, pedaços de alho cru são colocados em etanol (15-20%) por 20 meses ou mais (SILVA, 2009).
Os compostos organossulfurados do alho solúveis em óleo, incluindo alicina, sulfidos, ajoeno e vinilditinas, não foram encontrados no sangue e urina, mesmo depois do consumo em grande quantidade (25 g) de alho ou alicina pura (60 mg). O estudo demonstrou a irreversibilidade da inativação da enzima aliinase em pH baixo, portanto, a enzima aliinase é
inibida pelas condições de acidez do estômago(LAWSON, 1998).
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metabolizados pelo Alil Metil Sulfido, um composto que estimula a produção de acetona e pode ser utilizado para medir a biodisponibilidade da alicina (SILVA, 2009).
2.1.5. Toxicidade
AAmerican Dietetic Association (2004) considera o alho um alimento funcional e
recomenda a ingestão de um dente de alho fresco diariamente (3 a 10 gramas) para diminuição do colesterol total e da fração LDL.
Não está claro se uma resposta ao alho aumenta proporcionalmente com o aumento do consumo. Revisões fornecem evidências de que apenas 1g de alho cru ao dia pode ser protetor contra o risco de câncer. Ingestões exageradas podem causar consequências, no entanto, nem todos os indivíduos que consomem alho em grande quantidade apresentam alguma complicação. Os raros relatos de caso têm destacado o uso de alho como capaz de causar reações alérgicas (dermatite de contato alérgica, urticária generalizada, angioedema, pênfigo, anafilaxia e fotossensibilidade) e queimaduras quando o alho fresco é aplicado sobre a pele especialmente em curativos. Em um estudo conduzido com 1γβ crianças alérgicas, o alho estava ligado com a alergia de apenas γ casos (MILNER & DONATO, β010).
Dois artigos japoneses tratam da toxicidade aguda e crônica relacionada ao consumo de alho. SUMIYOSHI e colaboradores (1984) não observaram sintomas de toxicidade causados
por extrato de alho em ratos Wistar após o consumo oral de βg kg-1, 5 vezes por semana durante
6 meses. Também não encontraram diferenças significativas nas análises histológicas e nos exames urinários e hematológicos comparados ao grupo controle; NAKAGAWA et al. (1984) estimaram valores de DL50 de extrato de alho para ratos e camundongos por via oral,
intraperitoneal e subcutânea em mais de γ0 ml kg-1. Em γ0 ml kg-1, cinco dos dez ratos machos
e uma de dez em ratas morreram dentro de um dia após a administração intraperitoneal, no entanto, não houve sinais específicos devido ao extrato de alho nos sobreviventes.
2.2. Imunidade
Ante a invasão de patógenos, o sistema imunológico desencadeia uma série de respostas que envolvem células como granulócitos, macrófagos e linfócitos. Essa complexa interação entre células é coordenada pela liberação de citocinas e outros mediadores (COZZOLINO & COMINETTI, 2013).
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Algumas citocinas são mediadoras e reguladoras da imunidade natural, produzidas por células dendríticas e macrófagos, por exemplo, e impulsionam o processo da inflamação ou contribuem para a defesa contra infecções. Outras citocinas produzidas por células T auxiliares contribuem para a defesa do hospedeiro mediada pela imunidade adaptativa e também regulam a resposta imune (ABBAS et al., 2012). Na maioria dos casos, as citocinas promovem seus efeitos por receptores células-alvo relevantes e parecem atuar de uma maneira similar ao mecanismo de ação dos hormônios. Em outros casos, as citocinas podem ter efeitos antiproliferativos, antimicrobianos e antitumorais (TREVOR, MASTERS, BERTRAM, 2014).
Uma citocina pode exercer múltiplos efeitos biológicos (pleiotropismo) e por outro lado, várias citocinas podem exercer a mesma ação (redundantes). Também podem estimular ou inibir a produção de outras citocinas, antagonizar ou produzir efeito aditivo ou sinérgico entre si (ALEGRANCI, 2013; ABBAS et al., 2012).
A imunomodulação pode ser exercida mediante a potencialização ou supressão de elementos do sistema imunológico. A supressão do sistema imunológico pode ter como consequência a proliferação de microrganismos oportunistas que vivem nos organismos vivos e, por este motivo, normalmente é tida como um evento prejudicial. No entanto, há circunstâncias em que a atividade do sistema imune deve ser reduzida ou suprimida. Em casos de transplante, por exemplo, a tendência natural do sistema imune é rejeitar o órgão enxertado, e potentes fármacos imunossupressores são necessários para evitar tais rejeições e aumentar a taxa de sobrevida dos enxertos. Agentes imunossupressores também são usados nas doenças autoimunes para controlar a resposta imunológica descontrolada contra os próprios tecidos (FISCHER et al., 2008).
Os macrófagos desempenham um papel fundamental na defesa do organismo, por meio da fagocitose, geração de radicais livres, mediação de processos inflamatórios e secreção de uma variedade de substâncias bioquimicamente diferentes, como enzimas, citocinas e componentes do sistema complemento (FISCHER et al., 2008). Os linfócitos Natural Killer (NK), que apresentam atividade citotóxica sobre várias células tumorais ou células infectadas por vírus, são considerados o primeiro mecanismo de defesa do organismo para essas doenças (FISCHER et al., 2008).
2.2.1. Macrófagos
10
renovação dos tecidos, na ação microbicida, e na interação da resposta imune inata com a adquirida (KLIMP et al., 2002).
São classificados como M1 e M2, sendo os M1 ativados por sinalizadores como IFN-y e LPS, levando a produção de mediadores envolvidos na resposta proinflamatória e os M2, que podem ser ativados pela IL-4, IL-13, complexos imunes, entre outros, sendo sua principal característica a produção de altos níveis de IL-10 que atua diminuindo a inflamação e promove a reparação tecidual. Ambos os tipos de macrófagos produzem enzimas que degradam a L-arginina, sendo a NOS (óxido nítrico sintase) produzida pelos M1 e a arginase pelos M2, no entanto os produtos finais são funcionalmente distintos (ALEGRANCI, 2013).
A destruição de invasores por macrófagos é significativamente aumentada com as propriedades do extrato do alho, uma vez que o número de macrófagos peritoneais é aumentado frente estímulo parasitário ou infeccioso, e a expressão de receptores nas membranas de macrófagos também é aumentada (GHAZANFARI et al., 2006).
2.2.2. Óxido nítrico
De acordo com o meio em que está, o óxido nítrico pode ser um oxidante ou um redutor. Sua meia vida é curta, variando de 3 a 60 segundos, e a especificidade de suas reações é mínima. É citotóxico e vasodilatador, modulando reações inflamatórias ou anti-inflamatórias, dependendo do tipo celular e do estímulo. É sintetizado pelas enzimas óxido nítrico sintases (NOSs) por células do sistema cardiovascular e outras células como as endoteliais, os macrófagos, os fibroblastos, as plaquetas e as musculares lisas, a partir da L-arginina. Tem papel importante no controle fisiológico do sistema cardiovascular, atuando como mensageiro inter e intracelular (CERQUEIRA & YOSHIDA, 2002; MORIHARA et al., 2002).
Especificamente no sistema imune, o NO interfere em vários processos, como na diferenciação, proliferação e apoptose de células imunológicas, na produção de citocinas e outros mediadores solúveis e na síntese de componentes da matriz extracelular (FERREIRA, et al.; 2014).
2.2.3. Interleucinas (IL-1 β, IL-10 e IL12)
Diversas citocinas produzidas por leucócitos são denominadas de interleucinas. A Interleucina-1, por exemplo, media a inflamação e é produzida principalmente por macrófagos ativados. Seus efeitos incluem a ativação de células endoteliais, estímulo na produção de quimiocinas, aumento da produção de neutrófilos pela medula óssea e aumento da atividade citotóxica das células NK e linfócitos (ABBAS et al., 2012).
Assim como a IL-1, o fator de necrose tumoral alfa é uma citocina inflamatória. Os
11
hipotálamo e o músculo esquelético. Entre seus efeitos biológicos estão: ativação da inflamação e coagulação, febre, catabolismo e apoptose de diversas células (ABBAS et al., 2012).
A IL-1 participa do desencadeamento de uma resposta imune específica que gera
citocinas participantes da resposta Th1 como a IL-12 e o IFN- . Todavia, esse processo pode ser
altamente regulado pela ação de antagonistas como a IL-10. A resposta Th1 está relacionada com a defesa contra protozoários, bactérias intracelulares e vírus, enquanto a resposta Th2 é mais efetiva contra os helmintos e bactérias extracelulares. Essas respostas são também
antagônicas, desde que o IFN- modula negativamente a resposta Th2, e a IL-4 e a IL-10
modulam negativamente a resposta Th1, o que permite uma homeostasia no sistema imune e uma resposta imunológica balanceada (CORREA-CAMACHO et al., 2007).
Há dois tipos de IL-1: IL-1α e IL-1 , com γ1 a γγ kDa cada, respectivamente. Estes
atuam sobre os mesmos receptores, IL-1RI e IL-1RII. A IL-1α é marcadamente associada a
membranas celulares e age através de contatos celulares. Já a IL-1 é sintetizada como uma
proteína precursora (Pro-IL-1 ), que não é secretada na forma ativa até ser metabolizada pela
enzima caspase-1. As primeiras citocinas formadas após lesão tecidual ou infecção são IL-1
(OLIVEIRA et al., 2011).
A interleucina-10 (IL-10) atua como imunossupressor, exercendo atividade anti- inflamatória. Suprime a atividade de células T, NK e macrófagos ativados, e está, portanto, envolvida no controle de reações da imunidade natural e da imunidade mediada por células. A IL-10 em macrófagos causa inibição da produção de IL-12 que consiste na principal forma de ativação das células NK. Também atua suprimindo a produção de diversas outras citocinas
(IL-1α, IL-1 , IL-6, IL-8, IL, IL-18 e TNF -a). Também suprime a atividade de células dendríticas e
diminui a expressão do gene para síntese de macrófagos e linfócitos. Estudos in vitro
demonstraram que a IL-10 é um forte estimulador da diferenciação de células B e da secreção de imunoglobulinas. Pode ser produzida por inúmeras células imunológicas, entre elas macrófagos ativados, linfócitos e células dendríticas, como também pode ser produzida por células não imunes, apresentando como exemplo os queratinócitos (ABBAS et al., 2012).
Sugere-se que a IL-10 seja importante para o controle de reações inflamatórias na mucosa, teoria sustentada pela existência de uma rara doença autoimune herdada, geradora de uma mutação no receptor IL-10 que causa colite severa em seus portadores, destacando a possível ativação descontrolada de macrófagos reagindo a microbiota intestinal (ABBAS et al., 2012). Por outro lado, antagonistas de IL-10 podem ter efeito satisfatório durante a ativação de células-B policlonal e hiperglobulinemia em pacientes com Aids (OLIVEIRA et al., 2011).
Os efeitos supressivos da IL -10 sobre as células Th1 podem ser clinicamente úteis em prevenir a rejeição de transplantes e tratar doenças autoimunes mediadas por células-T, como
esclerose múltipla e diabetes mellitus tipo I. Efeito benéfico também pode ser observado em
12
Secretada predominantemente por macrófagos e células dendríticas, a IL-12 estimula a produção de IFN- por células NK e linfócitos T, aumenta a citotoxicidade mediada por células NK e estimula a diferenciação de células T. Embora muitas outras células pareçam poder secretar IL-12, apenas macrófagos e células dendríticas produzem a citocina biologicamente ativa. Pacientes com mutações no receptor de IL-12, por exemplo, são altamente suscetíveis a infecções por bactérias intracelulares, fato que denota a importância da IL-12 na diferenciação de linfócitos, importantes células de defesa contra a infecções intracelulares (ABBAS et al., 2012). Tem papel fundamental no desenvolvimento de um tipo de célula T auxiliar, sendo um co-fator de crescimento potente, além de estimulante da adesão de células Th1 já diferenciadas, uma citocina chave da imunorregulação, está intimamente envolvida no desenvolvimento de doenças auto-imunes mediadas por células Th1 (JANEWAY, et al., 2000).
2.2.4. Alho e imunidade
TENDE at al. (2014) observaram que o extrato aquoso de alho aumentou significativamente a contagem de leucócitos totais no fluido peritoneal de ratos Wistars tratados com a solução, sendo o efeito dose dependente. Por outro lado, as concentrações de células brancas de forma isolada não apresentaram diferenças estatísticas significantes.
Existem poucos estudos sobre a ação antiviral do alho, comparados aos estudos sobre sua ação antibacteriana. Entre os estudos, relata-se atividade in vitro contra a influenza A e B, citomegalovírus, rinovirus, pneumonia viral, rotavirus e HIV. A atividade antiviral é atribuída somente à alicina e seus metabólitos (HARRIS et al., 2001).
O alho é uma das várias plantas com componentes bioativos que podem servir de agentes antimicrobianos e tem sido historicamente reconhecido por esta atividade contra vários agentes de deterioração e bactérias patogênicas (MILNER & DONATO, 2010). A alicina possui atividade contra uma vasta gama de bactérias Gram - negativas e positivas, incluindo as
cepas de Escherichia coli multirresistentes. O principal efeito antimicrobiano de alicina é
devido à sua reação química com grupos tiol de várias enzimas. Também possui atividade
antifúngica, particularmente contra Cândida albicans e atividade antiparasitária incluindo
alguns dos principais protozoários parasitas intestinais humanos, tais como Entamoeba
histolytica e Giardia lamblia (ANKRI & MIRELMAN, 1999).
BAKRI & DOUGLAS (2005), comprovaram a ação bactericida do extrato aquoso de
alho em bactérias orais patogênicas. A concentração de extrato necessária foi de 35,7 mg mL-1
para bactérias Gram-negativas e de 142 mg mL-1 para Gram-positivas, o que indica que o
13
No entanto, nem todos os microrganismos são igualmente sensíveis a esses compostos, ou seja, as taxas de absorção e seu metabolismo podem determinar o grau de resposta global dos microrganismos para os compostos de enxofre. A adição de alho na manteiga, por exemplo, aumentou as taxas de inativação de três patógenos (Salmonella spp., Escherichia coli e Listeria monocytogeneses) quando incubadas a 21 e 37ºC (MILNER & DONATO, 2010). A atividade antibiótica de 1 mg de alicina tem sido igualada à de 15 UI de penicilina (HOLUB et al., 2002; SILVA, 2009).
Também é demonstrado na literatura, que suplementos de alho contendo alicina foram eficientes em diminuir a incidência de resfriados (p>0,001) na população estudada, além disso, a intensidade dos sintomas e a duração do resfriado foram menores no grupo que consumiu os produtos de alho (JOSLING, 2001; NANTZ et al., 2012).
2.3. Infecções fúngicas
Fungos são organismos eucarióticos que ocorrem em forma filamentosa ou de levedura. As leveduras são unicelulares e se reproduzem por brotamento, processo que as células filhas apresentam-se em tamanhos diferentes, por outro lado, fungos filamentosos reproduzem-se por divisão celular e possuem longos filamentos de células denominados hifas. Alguns fungos são dimórficos, podendo existir nas duas formas, por exemplo, são filamentosos em temperatura ambiente e leveduriforme na temperatura corporal de humanos (LEVINSON, 2014).
Difundidos por todos os ambientes, os fungos possuem um papel ecológico importante da decomposição do material orgânico. Podem afetar a saúde humana de 3 formas: alergia, infecção e toxicidade (OLSON, 2013). Diferentes fungos infectam o homem e podem viver em tecidos extracelulares ou dentro de fagócitos, então as respostas imunológicas a esses microrganismos combinam respostas a bactérias celulares e intracelures (ALEGRANCI, 2013; FERREIRA, 2014; ABBAS, 2012).
Os fagócitos, principalmente macrófagos, respondem contra fungos ou micoses utilizando a enzima NO sintase induzida e outros mediadores secretados para a destruição desses patógenos. A participação de citocinas é imprescindível, pois aumenta a capacidade fungicida dos fagócitos, favorecendo a destruição do fungo (COELHO-CASTELO et al., 2009).
Os antifúngicos de maneira geral são classificados como: orais, parentais ou tópicos. Esses fármacos atuam diretamente nas diversas fases dos fungos, ou seja, desde a germinação de esporos, tubo germinativo, hifa de penetração, crescimento miceliar e esporulação. O efeito fungicida de determinado antifúngico está baseado exclusivamente na diferença da composição lipídica das membranas celulares dos fungos e das células (MARTINEZ, 2006).
14
para micoses e, ao mesmo tempo, ao fato de que essas infecções normalmente afligem indivíduos incapazes de apresentar respostas imunes efetivas (ABBAS et al., 2012).
2.3.1 Sporothrix schenckii e esporotricose
Em Baltimore, EUA no ano de 1898, Benjamin Schenck descreveu pela primeira vez a esporotricose, isolando o microrganismo responsável pela doença em amostras de tecido subcutâneo no Hospital John Hopkins (SCHENCK, 1898). Anos mais tarde esse microrganismo
foi identificado pelo micologista Erwin F. Smith como pertencente ao gênero Sporotrichum.
Outros relatos foram surgindo e o agente responsável pela doença foi denominado Sporothrix
schenckii (HEKTOEN &PERKINS, 1900). No Brasil, Lutz e Splendore descreveram em 1907,
os primeiros casos de esporotricose em seres humanos e ratos (BARROS et al., 2010).
A forma miceliar saprofítica do fungo encontrada no meio ambiente cresce em temperaturas que variam de 25ºC a 30ºC. Esta forma é caracterizada por hifas hialinas e septadas de 1 a 2 µm de diâmetro, com seus conidióforos e conídios organizados em grupos
assemelhando-se a pétalas de uma flor. A forma leveduriforme é encontrada in vivo, a 37°C,
onde se reproduz por brotamento e não forma conídios. Tipicamente a forma de levedura tem de
4 a 6 µm de diâmetro e frequentemente apresenta forma de charuto. Em laboratório, in vitro a
37°C, o fungo é convertido à forma de levedura em meios suplementados, como o caldo BHI, cuja colônia apresenta coloração creme (ALEGRANCI, 2013).
Diversos fatores determinam a forma que a infecção se apresenta, como o tamanho do inóculo, a profundidade da inoculação, a tolerância térmica da cepa e o estado imunológico do hospedeiro. As lesões costumam ser restritas à pele, tecido celular subcutâneo e vasos linfáticos adjacentes. Raramente pode disseminar-se para outros órgãos, ou ainda ser sistêmica, resultante da inalação de esporos. A infecção pode ser classificada em cutânea (fixa ou localizada), cutâneo-linfática, cutânea disseminada, mucosa e sistêmica (BARROS et al., 2010).
15 3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Avaliar a influência do consumo de alho (Allium sativum L.) na imunomodulação de
camundongos Swiss saudáveis e infectados por S. schenckii.
3.2. Objetivos específicos
Avaliar o estado funcional dos macrófagos peritoneais de animais sadios e infectados
quanto à produção de óxido nítrico e das citocinas (IL-1 , IL-10 e IL-12) produzidas em
sobrenadantes de cultura de macrófagos de animais tratados ou não com extrato de alho.
Avaliar o potencial antifúngico do alho frente ao S. schenckii por meio de teste de
concentração inibitória mínima e unidades formadoras de colônia.
4. MATERIAL E MÉTODO
4.1. Obtenção dos extratos
Extratos aquoso e oleoso foram preparados utilizando bulbilhos de alho (Allium sativum L.) adquiridos em mercado de hortifrutigranjeiros de Araraquara. Depois de descascados, 32 gramas de bulbilhos in natura foram triturados em 200 mL de água destilada em liquidificador durante um minuto, permanecendo em repouso por meia hora e sendo posteriormente filtrado e dividido em alíquotas que foram armazenadas em refrigerador durante o experimento. O extrato oleoso foi obtido utilizando-se o mesmo processo, substituindo-se a água por óleo de soja. O óleo de soja foi escolhido por ser um óleo bastante consumido na alimentação humana, e por se tratar de uma substância inócua, quando aplicado em doses baixas como a do estudo.
4.2. Ensaio com animais
16
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNESP - FCF - Araraquara conforme protocolo
de aprovação nº 15/2015 que consta no Anexo1.
Foram utilizados camundongos Swiss, machos, adultos (oito semanas de idade),
provenientes do Biotério da UNESP – Botucatu e mantidos no Biotério da FCF - UNESP -
Araraquara - SP. Os animais foram alimentados com ração balanceada padrão para roedores e água "ad libitum". Os camundongos foram mantidos em gaiolas coletivas a temperatura ambiente de 25° C e fotoperíodo de 12 horas de claro/12horas de escuro.
O animais foram divididos em 2 grupos principais, os sadios e os infectados por S.
schenckii, e cada grupo foi dividido em 3 subgrupos, de acordo com o extrato recebido: grupo
controle que recebeu o tampão PBS (GC), grupo que recebeu extrato aquoso (GA) e grupo que recebeu extrato oleoso (GO). Foram realizados 2 experimentos independentes com 4 animais por grupo. Todos os grupos receberam no mesmo horário seus respectivos extratos e solução controle. A dose dos extratos (0,1 mL) utilizada no tratamento correspondeu a 800 mg kg -1,
equivalente a 16 mg por animal e administrada por via intragástrica (gavagem) uma vez ao dia durante 15 dias. Considerando o peso médio do camundongo adulto (20 g) a dose administrada corresponde aproximadamente em ingerir 4 a 5 bulbilhos médios ao dia para um indivíduo de
75 kg. Sabe-se que até 2g de alho kg -1 não causam efeitos adversos.
A Figura A mostra um esquema do cronograma do experimento:
Figura A. Cronograma do experimento.
4.3. Obtenção das células do exsudato peritoneal
Foram obtidas células do exsudato peritoneal (CEPs), após os animais serem previamente estimulados com 3,0 mL de tioglicolato de sódio 3% através de inoculação
intraperitoneal três dias antes de serem eutanasiados em câmara de CO2. Os animais tiveram a
pele da região abdominal retirada assepticamente em câmara de fluxo laminar e o peritônio exposto. Foram inoculados 5 mL de solução PBS gelado a pH 7,2 na cavidade abdominal. O líquido peritoneal resultante foi coletado e transferido para um tubo cônico estéril e centrifugado
Semana 1
Chegada dos animais. 4 semanada de idade. Divisão dos grupos.
Semana 4
Administração dos extratos
8 semanas de idade.
Infecção dos animais no 5º dia após administração
dos extratos.
Semana 5 Semana 6
Eutanásia
17
a 2500 rpm durante 5 min. O sedimento celular foi lavado três vezes com 3 mL de PBS. Após a última lavagem as células foram ressuspendidas em 1 mL de meio de cultura RPMI-1640 completo para a contagem de células. O número de células foi determinado pela contagem em câmara hemocitométrica tipo Neubauer e a suspensão celular ajustada à concentração final de
5x106 células para realização dos testes propostos, sendo que as placas com as CEPs foram
incubadas por uma hora em estufa de CO2 a γ7ºC para a formação do “tapete” e após este
período desprezou-se o sobrenadante e foram acrescentados os extratos e soluções correspondentes aos testes.
4.4. Avaliação da Viabilidade Celular pelo método de MTT
Para o ensaio de viabilidade celular, utilizou-se o método baseado na capacidade que têm as células viáveis de clivar o anel tetrazólico presente no MTT (brometo de 3-4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio) pela ação de enzimas desidrogenases presentes na mitocôndria ativa, formando cristais de formazana (MOSMANN, 1983). A uma placa de microtitulação de 96 cavidades de fundo plano foram distribuídos 100 µL por cavidade das suspensões de células do exsudato peritoneal de animais infectados e não infectados, ajustadas à
concentração de 5x106 células mL-1 em meio de cultura RPMI-1640-C em presença de 100 µL
de cada extrato testado (1 mg mL -1), LPS a 1 mg mL -1 ou somente meio de cultura RPMI-
1640-C, em triplicata. As placas foram incubadas por 24 h, a 37º C, em estufa contendo tensão
constante de 5% de CO2. As células aderentes foram tratadas com 100 µL de uma solução de
MTT (Across Organics) a 1 mg mL -1 em RPMI-1640. A placa foi incubada por mais 3 horas
nas mesmas condições anteriores. Após esta incubação os sobrenadantes foram descartados e as células aderentes foram tratadas com 100 µL de isopropanol para solubilizar os cristais de formazana formados. A leitura da densidade ótica foi determinada em espectrofotômetro de UV/visível, a 540 nm, com filtro de referência de 620 nm.
4
.5. Determinação de NOO NO foi quantificado espectrofotometricamente pela Reação de Griess (GREEN et al., 1982). A partir da cultura de células aderentes do exsudato peritoneal ajustadas como descrito anteriormente no item acima. Foram retirados 100 µL e colocados em placa de cultura de células de 96 cavidades. Em seguida foram adicionados os extratos a serem testados e suas
respectivas soluções controle. A placa foi incubada por 24 horas em estufa incubadora de CO2 a
37º C. Alíquotas de 50 μL do sobrenadante de cada amostra em triplicata foram transferidas
18
volume de reagente de Griess. Após 10 minutos de incubação em temperatura ambiente e ao abrigo da luz, a absorbância foi determinada com filtro de 540 nm em espectrofotômetro. A concentração de NO liberado no sobrenadante das culturas celulares foi calculada a partir de
uma curva padrão, previamente estabelecida e os valores foram expressos em μmols de
nitrito/5x106 células.
4.6. Determinação de citocinas
As citocinas IL- 1 , IL-10 e IL-12 foram quantificadas nos sobrenadantes de (CEPs)
obtidas e ajustadas como descrito acima. A quantificação foi realizada através do teste imunoenzimático ELISA de captura para cada citocina, de acordo com as instruções do fabricante. As absorbâncias foram lidas a 450 nm em espectrofotômetro UV/visível para microplacas (Multiskan Ascent, Labsystems), e as concentrações de cada citocina foram determinadas através da utilização de curva padrão previamente estabelecida com concentrações
conhecidas dos padrões de cada citocina. Os resultados foram expressos em pg mL -1. Os limites
de detecção das citocinas analisadas podem ser consultados na Tabela 3.
Tabela 3. Limite de detecção das citocinas analisadas.
Interleucina pg mL -1
IL-1 8 - 1000
IL-10 30 - 4000
IL-12 15 - 2000
4.7. Microrganismo e condições de cultivo
Foi utilizada a cepa 16345 de Sporothrix schenckii isolada de um caso de infecção
pulmonar humano de esporotricose (Baltimore, MD), cedida gentilmente pelo Laboratório de Materiais de Referências da Fundação Oswaldo Cruz, Departamento de Microbiologia, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, Rio de Janeiro. Atualmente, este isolado é mantido no Laboratório de Imunologia Clínica do Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara - UNESP, na fase miceliar em meio Sabouraud, a temperatura ambiente (± 25°C). A forma leveduriforme é obtida em meio BHI (Brain Heart Infusion, Difco) líquido a 37°C sob agitação constante de 150 rpm por sete dias. Em seguida, uma alíquota contendo 107 unidades fúngicas foi transferida para um Erlenmeyer de 250 mL, contendo 100 mL de caldo BHI e cultivada por cinco dias nas mesmas condições anteriores, que corresponde com a fase de crescimento logarítmica previamente descrita por
19 4.8. Infecção Experimental
A infecção dos animais foi realizada com a forma leveduriforme de S. schenckii, obtida pela transferência de uma parte da massa de crescimento fúngico em forma miceliar para meio caldo BHI (Difco), do qual, após 7 dias de cultivo a 37ºC sob agitação constante de 150 rpm,
uma alíquota contendo 2 x 10 7 leveduras foi transferida para um novo caldo BHI e cultivada
por mais 5 dias nas mesmas condições. Este procedimento garante que a cultura usada para as infecções esteja em fase logarítmica de crescimento, segundo Ferreira et al. (2015).
A infecção experimental pode ser facilmente induzida em camundongos pela injeção
intraperitoneal de células leveduriformes de S. schenckii, e aproximadamente em 10 dias, os
animais podem desenvolver peritonite ou orquite grave. Para os experimentos os animais foram
inoculados com 200 µL de uma suspensão contendo 10 6 leveduras de S. schenckii em PBS ou
com igual volume de PBS apenas, por via intraperitoneal.
4.9. Determinação da carga fúngica
A avaliação da carga fúngica sistêmica para acompanhamento das infecções foi feita ao se considerar uma determinação das unidades formadoras de colônia (UFC) no baço dos animais após sua retirada. Após exposição do peritônio dos animais e coleta das CEPs, o baço foi assepticamente removido em câmara de fluxo laminar e passado através de uma malha de
nylon com poros de 100μm em βmL de PBS usando o êmbolo de uma seringa. Uma alíquota do
macerado do baço em PBS foi inoculada em placas de meio sólido MycoselTM em diluição
pré-determinada para permitir a contagem adequada das colônias. As UFC foram contadas após 3 dias e confirmadas após 5 dias de incubação a temperatura ambiente.
4.10. Avaliação da capacidade antifúngica por microdiluição
A avaliação da atividade antifúngica foi realizada através do teste de microdiluição de
acordo com a Norma M27-A2 do National Committee for Clinical Laboratory Standards. Foi
utilizada a cultura de S. schenckii preparando um inóculo em PBS estéril. Foram realizadas
diluições seriadas em meio RPMI-1640 com MOPS (3-(N-morpholino) propanesulfonic acid),
ajustando a suspensão fúngica em uma concentração de 2,5×103 UFC mL-1. A concentração
mais elevada dos extratos foi de (160mg mL-1), a utilizada no tratamento dos animais
(gavagem), seguidas de diluições 1:2. A placa foi mantida em estufa a 37ºC contendo tensão
constante de 5% de CO2. Após 4 dias a leitura foi realizada em espectrofotômetro com
20 4.11. Análise estatística
Os resultados obtidos foram expressos como média ± desvio padrão e submetidos ao teste de Lilliefors para verificação da normalidade, ao teste de Levene para verificação da
homocedasticidade e à análise de variância (ANOVA one-way – pós teste de Tukey). O valor de
significância adotado foi de 5% (p<0,05).
5. RESULTADOS
5.1. Determinação da viabilidade celular
A determinação da viabilidade celular em células do exsudato peritoneal (CEPs) após
estímulo prévio com tioglicolato de sódio 3% em camundongos Swiss não infectados e
infectados com o fungo S. schenckii foi previamente realizada a fim de observar se a infecção ou os extratos utilizados como estímulo poderiam ser tóxicos para as culturas celulares. Os
resultados obtidos demonstraram que a viabilidade celular nos camundongos Swiss não
infectados manteve-se acima de 90% e nos infectados acima de 85% mediante os desafios com os extratos de alho, controle positivo e negativo. O teste de viabilidade celular também mostrou que os extratos, assim como as condições de cultura e a infecção não foram tóxicos às culturas celulares, uma vez que a viabilidade dos grupos manteve-se acima de 85%.
5.2. Determinação da liberação de NO
A determinação da liberação de óxido nítrico (NO) foi realizada em sobrenadantes de culturas de células do exsudato peritoneal (CEPs) de camundongos infectados e não infectados
com o fungo S. schenckii, mediante o desafio com os extratos de alho (1mg mL-1), e os controles
LPS (controle positivo) ou meio RPMI- 1640-C (controle negativo). O grupo GC não recebeu extrato de alho via gavagem, no entanto, as CEPs desse grupo foram desafiadas com os dois extratos diferentes (oleoso e aquoso).
A produção de óxido nítrico (NO) pelas CEPs revelou que animais sadios do grupo GA têm uma produção significativamente menor (p<0,05) de NO em comparação aos grupos GO e GC. Não obstante, animais que não foram expostos previamente aos extratos (GC), ao serem estimulados pelos extratos, apresentam maior produção de NO, comparados ao controle negativo, o que não ocorre com animais que receberam os extratos de alho via oral (GA). Isso demonstra que a atividade imunomoduladora do alho pode ser usada de formas diferentes, ou
21
No grupo GA infectados com o fungo S. schenckii, houve aumento significativo
(p<0,05) na produção de NO por CEPs desafiadas com extrato aquoso frente ao controle negativo. Esse resultado mostra que o consumo de alho pode aumentar a produção de NO, mesmo em condições que a produção já está aumentada, como nesse caso pela infecção (Figura 1B).
A infecção aumentou a produção de NO em todos os grupos analisados, isso pode ser
observado nas Figuras 1C, 1D e 1E.
A n im a is s a d io s - Ó x id o N ítr ic o
µ m o ls m L -1 d e n it ri to GA (a q
uo s o)
GA + GA -GO (o leo
s o)GO+ GO
-GC (a q
uos o )
GC (o
leo s o)
GC + GC -0 5 3 0 6 0 9 0 1 2 0
A
a
b c c
**
A n im a is in fe c ta d o s - Ó x id o N ítr ic o
µ m o ls m L -1 d e n it ri to GA (a q
uo s o)
GA + GA -GO (o leo
s o)GO+ GO
-GC (a q
uos o )
GC (o
leo s o)
GC + GC -0 3 0 6 0 9 0 1 2 0
B b a b c c *
G A - Ó x id o N ítr ic o
µ m o ls m L -1 d e n it ri to
Ex t rato
Co n tro l
e + Co n
tro l e
-0 1 3 0 6 0 9 0 1 2 0 C
**
**
**
G O - Ó x id o N ítr ic o
µ m o ls m L -1 d e n it ri to
Ex t
rato
Con
trole
+
Co
ntro le -0
4 3 0 6 0 9 0 1 2 0 D
** **
**
G C - Ó x id o N ítr ic o
µ m o ls m L -1 d e n it ri to
Ex t . A
q uo s o
Ex t . O
leo s o
Co n tro l
e +
Co n tro l
e
-0 3 0 6 0 9 0 1 2 0
S a u d á v e is
E
In fe c ta d o s
**
**
** **
Figura 1. Produção de NO em cultura de células do exsudato peritoneal (CEPs) de camundongos
Swiss sadios e infectados com o fungo S. schenckii no 10º dia após infecção. GA (grupo que recebeu
extrato aquoso), GO (grupo que recebeu extrato oleoso) e GC (grupo que recebeu tampão PBS) via gavagem. Os macrófagos dos camundongos foram cultivados em presença dos extratos aquoso e oleoso
(1 mg mL -1) de alho, LPS (controle +) e meio RPMI-1640-C (controle -). Cada animal estudado foi
avaliado em triplicata no momento de execução do teste. As concentrações de nitrito foram obtidas através de uma reta padrão previamente estabelecida com concentrações molares conhecidas de nitrito de
sódio (NaNO2) e os resultados expressos em µmols de nitrito mL -1 de 5x106 células, como média ±
22 5.3. Determinação da produção Interleucinas
Foi avaliada a produção de citocinas pelas CEPs dos animais dos diferentes grupos (GA, GO e GC) tratados via intragástrica com diferentes extratos de alho (aquoso e oleoso)
frente aos desafios LPS, RPMI-1640-C e do próprio extrato recebido por gavagem (1
mg mL
-1). O grupo GC não recebeu extratos de alho via gavagem, no entanto, as CEPs desse grupo
foram desafiadas com os extratos (oleoso e aquoso).
5.3.1. Determinação da produção de IL-1β
A determinação da produção de IL-1 foi realizada em sobrenadantes de culturas de
células do exsudato peritoneal (CEPs) de camundongos sadios e infectados, mediante o desafio com o extrato aquoso e oleoso de alho, e os controles: LPS (controle positivo) ou meio RPMI-1640-C (controle negativo). Os resultados obtidos foram calculados por meio de curva analítica
previamente estabelecida com concentrações molares conhecidas de IL-1 , como média ±
desvio padrão de quatro animais.
A produção de IL-1 em animais sadios de diferentes grupos foi estatisticamente
diferente entre si (p<0,01), e o grupo dos animais tratados com os extratos apresentou menor
produção da citocina (Figura 2A). Também foi diferente a produção desta citocina entre
animais sadios de um mesmo grupo, comparando o estímulo extrato com seus respectivos
controles (LPS e RPMI) (***p<0,001), o que não ocorreu com os animais infectados (Figura
2B). A produção de IL-1 em animais infectados não diferiu entre os grupos estudados frente
aos desafios com extratos, apenas houve diferença entre os controles positivos, onde todos foram diferentes entre si, com maior produção para o grupo GO. Nitidamente os extratos de alho mostraram atividade anti-inflamatória quando administrados de maneira crônica (15 dias), contudo, CEPs de animais que não tiveram contato prévio com os extratos (GC), quando desafiados com os extratos de alho, apresentaram valores superiores ao desafio LPS (controle positivo), indicando que o uso agudo do alho pode ser um potente estimulador da produção de
IL-1 , principalmente em indivíduos sadios. A Figura 2 apresenta o gráfico da produção de
23
A n im a is s a d io s - In te rle u c in a 1 -
In te rl e u c in a 1 - ( p g m L -1 ) GA (a q
uo s o)
GA +
GA
-GO (ole
os o ) GO + GO -GC (a q
uo s o)
GC (ole
os o ) GC + GC -0 5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0
A
a a
b
c * * *
A n im a is in fe c ta d o s - In te r le u c in a 1 -
In te rl e u c in a 1 - ( p g m L -1 ) GA (a q
uo s o)
GA + GA -GO (o leo s o)
GO +
GO
-GC (a q
uos o )
GC (o
leo s o)
GC +
GC -0
5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0
B
a a a a
* *
G A - In te r le u c in a 1 -
In te rl e u c in a 1 - ( p g m L -1)
Ex t rato
Co n tro l
e +
Co n tro l
e -0
5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 C
** **
G O - In te r le u c in a 1 -
In te rl e u c in a 1 - ( p g m L -1)
Ex t rato
Co n tro l
e +
Co n tro l
e -0
5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 D
** **
**
G C - In te r le u c in a 1 -
In te rl e u c in a 1 - ( p g m L -1 )
Ex t . Aq
uos o
Ex t . O
leo s o
Con tro
le +
Con trole
-0
5 0 0 1 0 0 0 1 5 0 0
2 0 0 0 S a u d á v e is
In fe c ta d o s E
**
** **
**
Figura 2. Concentração de IL-1β liberada em cultura de CEPs tratadas com tioglicolato de sódio
3% de camundongos Swiss sadios e infectados com o fungo S. schenckii no 10º dia após a infecção.
GA (grupo que recebeu extrato aquoso), GO (grupo que recebeu extrato oleoso) e GC (grupo que recebeu
PBS) via gavagem. Os macrófagos dos animais foram cultivados em presença de extrato aquoso (1 mg
mL -1), extrato oleoso (1 mg mL -1), LPS (controle +) e somente meio RPMI-1640-C (controle -). As
concentrações de IL-1 foram calculadas através de uma reta padrão previamente estabelecida com
concentrações molares conhecidas de IL-1 . . Os resultados foram expressos em pg mL -1, como média ±
desvio padrão de 4 animais em 2 experimentos independentes. Letras iguais não apresentam diferença estatística significativa. Letras diferentes apresentam diferença significativa (ANOVA - pós-teste de Tukey (p<0,05)). Comparação entre estímulos do extrato em A e B. Comparação entre sadios e infectados em C, D e E. (* p<0,05) (**p<0,01).
5.3.2. Determinação da produção de IL-10
A determinação da produção de IL-10 foi realizada em sobrenadantes de culturas
de células do exsudato peritoneal (CEPs) de camundongos sadios e infectados, mediante o
