UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU
EFEITO DA INOCULAÇÃO in ovo DE PROBIÓTICO E PRODUTO DE EXCLUSÃO COMPETITIVA EM FRANGOS DE CORTE DESAFIADOS COM
Salmonella HEIDELBERG
ISABELLA GOULART OLIVEIRA DA SILVA
CAMPUS DE BOTUCATU
EFEITO DA INOCULAÇÃO in ovo DE PROBIÓTICO E PRODUTO DE EXCLUSÃO COMPETITIVA EM FRANGOS DE CORTE DESAFIADOS COM
Salmonella HEIDELBERG
ISABELLA GOULART OLIVEIRA DA SILVA
Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Raphael Lucio Andreatti Filho
ISABELLA GOULART OLIVEIRA DA SILVA
EFEITO DA INOCULAÇÃO in ovo DE PROBIÓTICO E PRODUTO DE EXCLUSÃO COMPETITIVA EM FRANGOS DE CORTE DESAFIADOS COM
Salmonella HEIDELBERG
COMISSÃO EXAMINADORA
_______________________________ Prof. Dr. Raphael Lucio Andreatti Filho Presidente e Orientador
Departamento de Clínica Veterinária FMVZ – UNESP – Botucatu
_______________________________ Prof. Dr. Adriano Sakai Okamoto Membro
Departamento de Clínica Veterinária FMVZ – UNESP – Botucatu
_______________________________
Prof. Dr. Guilherme Augusto Marietto Gonçalves Membro
Departamento de Sanidade Animal Unoesc - Xanxerê
Dedico
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a Deus por permitir a realização desta etapa tão importante em minha vida, guiando meus passos e me fortalecendo durante este período.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Raphael Lucio Andreatti Filho, por acreditar na minha capacidade inúmeras vezes, pelos conhecimentos transmitidos e por estar sempre disposto a ajudar e esclarecer minhas dúvidas, contribuindo para o meu amadurecimento pessoal e profissional.
A BioCamp Laboratórios por abraçar de imediato a idéia e financiamento dos experimentos, especialmente Paulo, Ivan, Sônia, Bauer, Cida, Massaru e Thon, sem os quais não seria possível a realização deste projeto.
Ao incubatório do Grupo Alvorada, pela disponibilidade e por permitir a execução da parte inicial do experimento.
Ao Prof. Dr. Adriano Sakai Okamoto pelos conhecimentos compartilhados e ensinamentos no laboratório.
Ao Prof. Dr. Alessandre Hataka pela ajuda com o processamento do material histológico e disponibilidade.
Aos colegas de pós-graduação que já se formaram ou que ainda estão cursando a pós pela companhia, pelas risadas e conselhos.
Ao Igor, Carol, Elisane e todos que contribuíram diretamente ou indiretamente na execução deste experimento.
Aos professores Julio, Noeme e funcionários do Departamento de Patologia por toda a colaboração.
“A luta pela vida nem sempre é vantajosa aos fortes nem aos espertos. Mais cedo ou mais tarde, quem cativa a vitória é aquele que crê plenamente: eu conseguirei!!”
SUMÁRIO
Lista de Tabelas ... viii
Resumo ... ix
Abstract ... x
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS ... 1
1.Introdução ... 1
2. Revisão de Literatura ... 2
2.1 Salmoneloses aviárias e saúde pública ... 2
2.1.1 Salmonella Heidelberg ... 3
2.2. Microbiota intestinal e imunidade ... 4
2.3 Probióticos ... 7
2.4 Exclusão Competitiva ... 8
2.5 Inoculação in ovo ... 9
3. Objetivos ... 10
CAPÍTULO 2 – EFEITO DA INOCULAÇÃO IN OVO DE PROBIÓTICO E PRODUTO DE EXCLUSÃO COMPETITIVA EM FRANGOS DE CORTE DESAFIADOS COM SALMONELLA HEIDELBERG ... 11
Resumo ... 12
Abstract ... 13
Introdução... 14
Material e métodos ... 15
Experimento I ... 15
Experimento II ... 18
Experimento III ... 18
Análise Estatística ... 18
Resultados ... 19
Discussão ... 20
Agradecimentos ... 22
Conclusão ... 22
Referências ... 23
CAPÍTULO 3 ... 28
Discussão geral ... 29
Conclusão geral ... 30
Referências Bibliográficas ... 31
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Percentual de eclodibilidade dos ovos inoculados in ovo com probiótico, exclusão competitiva e tratamento controle...26
Tabela 2 - Médias da quantificação bacteriana de Salmonella Heidelberg (log10UFC) no
conteúdo cecal...26
Tabela 3 - Médias da quantificação bacteriana (log10 UFC) de Salmonella Heidelberg
em pool de fígado e baço...26
Tabela 4 - Concentração de IgA no fluido intestinal (ng/mL) nos diferentes tratamentos em aves desafiadas com Salmonella Heidelberg...27
Tabela 5 - Enriquecimento seletivo para Salmonella Heidelberg em ceco e pool de fígado e baço...27
Tabela 6 - Viabilidade bacteriana em cultivo aeróbio (log10 UFC) das soluções de
probiótico e exclusão competitiva em diferentes momentos de coleta...27
Tabela 7 - Viabilidade bacteriana em cultivo anaeróbio(log10 UFC) das soluções de
probiótico e exclusão competitiva em diferentes momentos de coleta...28
Tabela 8 - Médias da quantificação bacteriana (log10 UFC) da microbiota cecal cultivada
em aerobiose durante os quatro primeiros dias de vida...28
Tabela 9 – Médias da quantificação bacteriana (log10 UFC) da microbiota cecal
Resumo – SILVA, I.G.O. Efeito da inoculação in ovo de probiótico e produto de exclusão competitiva em frangos de corte desafiados com Salmonella Heidelberg. Botucatu, 2016. 58p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”.
A administração de probióticos e produto de exclusão competitiva na indústria avícola têm o objetivo de estabelecer a comunidade microbiana, evitando assim a incidência de patógenos intestinais, principalmente Salmonella spp. A Salmonella Heidelberg é um sorovar emergente e preocupante para a avicultura e saúde pública, mostrando-se mais invasivo quando comparado a outros sorovares paratíficos. Visando garantir o equilíbrio da microbiota de forma precoce, o presente estudo teve como objetivo a inoculação in ovo de probiótico comercial e produto de exclusão competitiva no 18º dia de incubação utilizando como diluente vacina para a Doença de Marek para realização de três experimentos distintos. O primeiro trabalho consistiu em avaliar o efeito dos tratamentos sobre a eclodibilidade dos ovos e integridade intestinal nos primeiros dias de vida, resposta imune de mucosa através da secreção de imunoglobulina A detectada através da técnica de ensaio imunoenzimático (ELISA) e avaliar a colonização de
Salmonella Heidelberg em frangos de corte no segundo dia de vida. O segundo
experimento consistiu na viabilidade bacteriana dos produtos inoculados em solução diluente com vacina de Marek e mantidos em temperatura ambiente até seis horas após o preparo da amostra. O terceiro estudo avaliou a influência dos tratamentos sobre a quantificação da microbiota cecal nos quatro primeiros dias de vida das aves.
Abstract - SILVA, I.G.O. Effect of in ovo inoculation of probiotic and competitive exclusion product in broiler chickens challenged with Salmonella Heidelberg. Botucatu, 2016. 58p. Dissertation (Masters Degree) – School of Veterinary Medicina and Animal Husbandry, Botucatu Campus, Paulista State University “Júlio de Mesquita Filho”
Probiotic and competitive exclusion product administration have the objective to stablish the microbial community, avoiding the intestinal pathogen incidence, essentially Salmonella spp. Salmonella Heidelberg is a emerging serovar and concerning pathogen for aviculture and public health, and more invasive when compared to other paratyphoid serovars. To secure the equilibrium of the microbiota as soon as possible, the present study aimed the in ovo inoculation of probiotic or competitive exclusion product diluted in Marek´s disease vaccine on day 18 of incubation for tree experiments. The first work evaluate the effect of treatments at hatching and intestinal integrity during the first days of life, mucosal immune response at secretory immunoglobulin A detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and evaluate the Salmonella Heidelberg colonization in broilers challenged at second day of life. The second experiment consisted in bacterial viability of the inoculated products in dilute solution with Marek´s vaccine at ambient temperature untill six hours after prepared. The third study evaluate the treatment influence in cecal microbiota quantification at first four days of birds life.
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS 1. Introdução
A demanda na produção de carne de frango no Brasil influencia significativamente o mercado interno e externo, com 67,3% da produção avícola abrangendo o mercado interno e 32,7% voltada para exportação, totalizando mais de 13 milhões de toneladas (ABPA, 2016). Para atender à alta produtividade do setor é necessário um rígido controle sanitário, reduzindo a incidência de enfermidades e consequentemente contaminação da carne de frango e produtos avícolas por patógenos como Salmonella spp., responsável pela ocorrência de doenças transmitidas por alimentos e agente causador de diversos surtos alimentares relacionado ao consumo de carne de frango e derivados.
O uso de antimicrobianos em doses subterapêuticas na produção animal foi durante muitos anos prática de rotina na produção avícola evitando a ocorrência de gastroenterites, melhorando o desempenho zootécnico, conversão alimentar e reduzindo a contaminação de carcaças. A freqüente exposição aos antimicrobianos pode contribuir para a seleção de bactérias resistentes, fenômeno conhecido como “pressão seletiva”, dificultando o tratamento de enfermidades e ocasionando transferência de genes de resistência entre espécies bacterianas (DIBNER e RICHARDS, 2005).
Visando reduzir a resistência bacteriana, a União Europeia decretou em 2006 a proibição do uso de antimicrobianos como promotores de crescimento, levando aos países exportadores a busca de medidas que atendessem às expectativas do mercado consumidor, trouxessem benefícios para a produtividade e não deixassem resíduos na carne de frango. Entre estas alternativas encontram-se o uso de probióticos ou produto de exclusão competitiva, administrados em água de bebida, via spray ou como aditivos na dieta.
Algumas pesquisas utilizando a inoculação de substâncias durante o período embrionário para suprir o gasto energético decorrente do desenvolvimento corporal, demonstraram a capacidade do embrião de absorver nutrientes inoculados no 18º dia de incubação, período no qual tem início a ingestão do fluido amniótico pelo embrião.
embrionário, para que a população bacteriana intestinal seja estabelecida de forma precoce, protegendo a ave de desafios sanitários.
2. Revisão de literatura
2.1 Salmoneloses aviárias e saúde pública
Pertencente à família Enterobacteriaceae o gênero Salmonella é composto pelas espécies enterica e bongori. A espécie enterica está segmentada em seis subespécies:
enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica. A subespécie enterica inclui
sorovares paratíficos relacionados com a ocorrência de salmoneloses aviárias, como por exemplo: Enteritidis, Heidelberg, Typhimurium, Kentucky e Hadar (ANDREATTI FILHO, 2007).
Apresentam-se como bastonetes gram-negativos, não esporogênicos, não encapsulados, anaeróbios facultativos, sendo que a maioria das espécies paratifóides apresenta motilidade. Nos testes de identificação bioquímica apresentam Vorges-Proskauer negativo, produção de ácido e gás a partir da glicose na maioria das espécies, descarboxilam a lisina e ornitina, apresentam resultado negativo para urease, indol e fenilalanina, não fermentam adonitol. A classificação segundo o esquema Kauffman-White é segmentada em antígenos flagelares (H), somáticos (O) e capsulares (Vi) (BORSOI, 2009).
A contaminação de subprodutos de origem animal, aves, forros de caixas de pintos de um dia de idade, cama, equipamentos e roedores auxiliam na transmissão horizontal das salmoneloses aviárias (ROCHA et al., 2003). Sua disseminação via vertical é mediada pela presença da Salmonella spp. nos folículos reprodutivos da ave. Após a eclosão dos ovos a contaminação pode ocorrer pela passagem da bactéria através dos poros da casca ou em contato com fezes contaminadas (GANTOIS et al.,2009).
A patogenicidade das salmonelas paratíficas inclui a presença da parede de lipopolissacárideo (LPS) e liberação de endotoxinas, enterotoxinas e citotoxinas. A colonização bacteriana danifica a integridade intestinal, afetando as vilosidades e criptas intestinais. A capacidade de sobrevivência no interior dos macrófagos facilita sua disseminação sistêmica, atingindo órgãos como fígado e baço (CHAPELL et al., 2009).
infecção, enquanto aves adultas podem tornar-se portadoras sem a manifestação de sinais clínicos (BARROW et al., 2000).
O gênero Salmonella é um dos principais agentes causadores de doenças transmitidas por alimentos, no qual o consumo de carne de aves e derivados são a principal fonte de contaminação. A ocorrência de gastroenterites em humanos representa mundialmente a principal causa de morbidade e mortalidade, nas quais as enfermidades causadas por Salmonella enterica representam 93,8 milhões de casos por ano e estima-se que destes, 80,3 milhões estejam relacionados a surtos alimentares (MAJOWICZ et al., 2010).Estima-se que a salmonelose seja responsável por um milhão de surtos alimentares nos Estados Unidos anualmente, resultando em 35% de hospitalizações (SCALLAN et al., 2011).
No Brasil a ocorrência de salmonelose nos anos de 2000 a 2014 foram responsáveis por 18,6% dos casos reportados (ANVISA, 2014). Em Santa Catarina a
Salmonella spp. foi identificada como principal agente etiológico responsável por
doenças transmitidas por alimentos, representando 54% das ocorrências entre os anos de 1995 a 2007 (MARCHI et al., 2011).
No estado de Goiás foi observado o isolamento de Salmonella enterica em 66,7% das coletas realizadas em abatedouros, sendo constatada a resistência a antimicrobianos como tetraciclina, estreptomicina, ampicilina, cefalotina, cloranfenicol, sulfazotrim, e em alguns casos foi detectada a multirresistência a estes antimicrobianos (REZENDE et al., 2005).
2.1.1 Salmonella Heidelberg
A Salmonella Heidelberg é considerada um dos três principais sorovares de
Salmonella relacionados com doenças transmitidas por alimentos na América do Norte,
apresentando maior invasividade nas infecções humanas quando comparado a outros sorovares (MENCONI et al., 2011).
O relato de sua identificação no Brasil foi realizado a partir de um estudo retrospectivo de 30 anos, durante os anos de 1962 a 1991, relatando a presença deste sorovar em órgãos como coração, fígado e fezes de aves (HOFER et al.,1997).
durante o abate e processamento a partir de amostras de swabs de cloaca e gaiola, água de escaldagem, chiller, depenagem e resfriamento (COLLA et al., 2012).
A penetração deste sorovar pelos poros da casca do ovo, um dos principais alimentos envolvidos em surtos alimentares, ocorre entre duas a três horas após a exposição ao contaminante (RAGHIANTE et al., 2010).
Avaliando a presença de Salmonella spp. em carcaças de frango comercializadas no Rio Grande do Sul, Borsoi et al. (2010) detectaram a ocorrência de Salmonella
Heidelberg em 9% dos isolados. Estudo realizado por Pulido-Landínez et al. (2013) avaliando a diversidade de Salmonella enterica na região sul do Brasil isolaram o sorovar Heidelberg em 46% das amostras, apresentando-se como o sorovar de maior predominância.
O perfil de resistência de Salmonella Heidelberg isolada de abatedouros à clorexidina, amônia quaternária e ácido peracético foi descrito por Colla et al. (2012). Os autores verificaram que amostras isoladas no ano de 2005 apresentavam 100% de sensibilidade a amônia quaternária, enquanto amostras do ano de 2009 obtiveram 33% de resistência ao mesmo sanitizante, ocorrendo uma progressão na resistência aos antimicrobianos.
A persistência como sorovar infectante pode ser demonstrada através da resistência aos antimicrobianos e presença de Salmonella spp. em carcaças de frango congeladas comercializadas em diversos estados brasileiros. Pesquisas realizadas por Medeiros et al. (2011) resultaram na identificação de Salmonella Heidelberg em 6,4% das amostras positivas com 100% de multirresistência aos antimicrobianos testados. 2.2 Microbiota intestinal e imunidade
Os gêneros de bactérias presentes na microbiota são compostos por Bacillus, Bacteroides, Bifidobacterium, Clostridium, Enterococcus, Escherichia, Eubacterium,
Fusobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus e Serratia. Estas podem estar
dispostas ligadas a receptores no epitélio intestinal ou livres no lúmen intestinal, podendo estar associadas a outras bactérias aderidas na mucosa (ANDREATTI FILHO et al., 2007).
considerados locais de alta fermentação, no qual estão dispostas famílias de Firmicutes, Bacteroidetes e Proteobacteria, apresentando espécies em sua maioria anaeróbias restritas (PEDROSO et al.,2015).
A composição da microbiota pode ser afetada por fatores como idade: aves mais jovens possuem microbiota pouco desenvolvida; dieta: ingredientes presentes na alimentação fornecem nutrientes para crescimento bacteriano; uso de antibióticos: pode reduzir algumas populações bacterianas; stress relacionado às práticas de manejo ou jejum prolongado (CHAMBERS e GONG, 2011). Estima-se que grande parte da população presente na microbiota não é cultivável por métodos tradicionais. Algumas espécies possuem exigências nutricionais e atmosféricas obtidas no ambiente intestinal para o seu crescimento, como por exemplo a presença de dióxido de carbono e nitrogênio, além das relações simbióticas nas quais o crescimento de determinada bactéria é mediado pela presença de outra espécie, a qual produz metabólitos necessários para seu crescimento ( PEDROSO et al., 2010).
A comunidade intestinal está envolvida na degradação de compostos da dieta e regulação do metabolismo de sais biliares, absorção de lipídios, ácidos graxos, síntese de vitaminas e produção de ácidos graxos voláteis (LAN et al., 2005). Estudos comparando aves isentas de microbiota ou com a microbiota ainda não estabelecida avaliaram que estas possuíam menor comprimento de vilos e profundidade de criptas intestinais quando comparadas a aves com a microbiota já estabilizada (PAN e YU, 2014).
O estabelecimento da microbiota ocorre aproximadamente após duas semanas de vida. A ausência de uma microbiota pré-estabelecida ao nascimento favorece a suscetibilidade das aves à infecção bacteriana (AMIT-ROMACH et al., 2004), logo quanto mais cedo houver a colonização por bactérias que promovam o equilíbrio bacteriano maiores as chances de proteção da ave exposta ao desafio.O desequilíbrio da população intestinal altera a proporção de bactérias benéficas e patogênicas. Este processo afeta a absorção de nutrientes e aumenta a quantidade de bactérias ou produtos do metabolismo bacteriano circulantes induzindo o processo inflamatório (KOGUT, 2013).
da imunidade adaptativa, não apresenta especificidade ao antígeno e memória. A resposta imune adaptativa ocorre por intermédio da resposta imune humoral, expressa por anticorpos, e resposta imune celular mediada por linfócitos (MONTASSIER, 2009).
O trato gastrointestinal é o órgão com maior quantidade de células imunológicas na ave. A imunidade intestinal é composta pela bursa de Fabricius, tonsilas cecais, placas de Peyer, divertículo de Meckel e estruturas linfóides intra-epiteliais e da lâmina própria. As populações celulares da resposta inata são constituídas por macrófagos, células natural killers e heterófilos, enquanto na imunidade adaptativa atuam as células T e células B (BEAL et al., 2006).
Os linfócitos intra-epiteliais da lâmina própria são diretamente influenciados pela modulação da microbiota. A aderência de bactérias ácido-láticas na mucosa intestinal induz a produção de INF-, contribuindo para apresentação do antígeno e estimulação de IgA secretória (HERICH e LEVKUT, 2000).
A imunoglobulina A (IgA) é a imunoglobulina mais importante no intestino e superfície mucosa. O componente secretor presente na mucosa associado a esta imunoglobulina resulta na IgA secretória, protegendo a superfície mucosa através da neutralização do antígeno evitando sua ligação aos receptores celulares (SHARMA, 2008).
Os probióticos atuam diretamente na imunomodulação da mucosa intestinal através da ativação de macrófagos, indução da produção de citocinas pelos linfócitos intraepiteliais e estimulam a secreção de IgA intestinal. Durante a exposição a um agente invasor a IgA está presente nos sítios de ligação formando uma barreira imunológica no epitélio intestinal (EDENS et al., 2003).
Lactobacillus plantarum fornecido na dieta de frangos de corte no período
inicial (0-21 dias) ou crescimento (21-42 dias) aumentou os níveis de IgA secretória no íleo. O aumento nos níveis desta imunoglobulina foi observado em ambos os períodos de tratamento (PENG et al., 2016). Outros estudos verificaram o aumento da expressão de interleucinas no baço e tonsilas cecais em frangos de corte tratados com
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus reuteri e Lactobacillus salivarius (BRISBIN et
al., 2010).
Noujaim et al. (2008) reportaram aumento de linfócitos T CD3+, CD4+ e CD8+ no epitélio intestinal e lâmina própria de frangos de corte tratados com Lactobacillus
Enteritidis, constando que além do estímulo relacionado à microbiota, a presença de infiltrado linfocitário aumenta de acordo com a idade da ave.
2.3 Probióticos
Probióticos são definidos como microorganismos vivos que administrados em quantidades adequadas beneficiam a saúde do hospedeiro. Entre as características esperadas dos probióticos estão: resistência à acidez gástrica, resistência aos sais biliares e redução na adesão de patógenos intestinais (FAO/WHO, 2002).
Embora o modo de ação das bactérias probióticas ainda não seja completamente conhecido, sabe-se que estas atuam proporcionando a modulação da microbiota do trato gastrointestinal, acidificam o pH intestinal evitando a prevalência de determinadas bactérias patogênicas, melhoram a motilidade intestinal, aumentam a produção de muco e secretam bacteriocinas (CASLTILLO et al., 2012). Bacteriocinas são peptídeos antimicrobianos com capacidade bacteriostática ou bactericida. Sua produção é influenciada pela temperatura, pH do meio e disponibilidade de nutrientes, favorecendo a exclusão competitiva (DOBSON et al.,2012).
A presença de bactérias probióticas também contribui para o aumento da produção de mucinas, formando uma camada de glicoproteínas no intestino, dificultando a invasão bacteriana e sua aderência no intestino (CORR et al., 2009).
Foi demonstrado por Zhang e Kim (2014) que o uso de cepas de Lactobacillus
acidophilus, Bacillus subtilis e Clostridium butyricum na dieta melhoraram o ganho de
peso e conversão alimentar, aumentaram a concentração de imunoglobulinas no soro e
Lactobacillus spp. nos cecos.
Os probióticos são aplicados na produção avícola como uma alternativa para reduzir a infecção por Salmonella spp. Wolfenden et al. (2007) ao utilizarem probiótico à base de Lactobacillus spp. administrado via água de bebida ou spray verificaram menor recuperação de Salmonella Enteritidis nas tonsilas cecais em frangos de corte desafiados 8 horas após o tratamento. Destacou-se que a exposição imediata ao patógeno logo após o tratamento não protege a ave, portanto quanto mais cedo a ave estiver protegida melhor a resposta ao tratamento.
A composição das cepas probióticas influencia o modo de ação do probiótico. Higgins et al. (2010), comparando cepas probióticas compostas por Lactobacillus casei,
composto por onze cepas relataram que o último apresentou menores valores de
Salmonella Entritidis nas tonsilas cecais
O uso de Bacillus subtilis na dieta de frangos de corte desafiados com
Salmonella Heidelberg no primeiro dia de vida diminuiu a presença da bactéria no
conteúdo cecal e swab de arrasto aos 42 dias, evitando a disseminação da infecção (KNAP et al., 2011).
A associação entre espécies bacterianas selecionadas para terapia probiótica vem sendo objetivo constante de estudo para prevenção de enteropatógenos, definição do melhor momento de aplicação e via de inoculação mais eficaz.
2.4 Exclusão Competitiva
O princípio de exclusão competitiva em aves também pode ser nomeado como “Conceito de Nurmi”, devido ao fato deste iniciar as pesquisas sobre a ação da microbiota e sua ação de reduzir a colonização de Salmonella spp. no trato gastrointestinal (NURMI e RANTALA, 1973).
Entre os mecanismos de ação da exclusão competitiva estão: competição por nutrientes e sítios de ligação, aumento da atividade do sistema imune e produção de compostos antimicrobianos como ácidos graxos voláteis, produto da fermentação microbiana. Deste modo a microbiota desejável ocupa os sítios de ligação do intestino além de impedir a multiplicação de patógenos, eliminando-os gradualmente do hospedeiro (CALLAWAY et al., 2008).
Culturas de exclusão competitiva são compostas pela microbiota intestinal de aves adultas, destinadas a administração em aves jovens de forma a melhoraro sinergismo entre populações benéficas do trato gastrointestinal, impedindo o estabelecimento de patógenos como Salmonella enterica (TELG e CALDWELL, 2009). A administração de produtos de exclusão competitiva é mediada através do uso de culturas bacterianas específicas para a espécie na qual é destinada, no qual seu efeito pode ser constatado de uma a duas horas após a aplicação (SCHNEITZ, 2005).
Schneitz et al. (1998) utilizando o tratamento de exclusão competitiva durante os primeiros dias de vida das aves constatou redução na multiplicação de Salmonella
bacterianas mostram-se mais efetivos e com maior durabilidade contra Salmonella
enterica quando comparada com a administração de cepas definidas.
Analisando a aspersão de produto de exclusão competitiva em frangos de corte de um dia de vida, Al-Zenki et al. (2009) constataram redução de Salmonella spp. nos cecos e superfície corporal das aves.Nas etapas de processamento da carcaça o tratamento diminuiu o isolamento desta bactéria após a evisceração e chiller, etapas importantes de contaminação durante o abate. Acredita-se que o crescimento de culturas anaeróbias facultativas reduz o oxigênio nos cecos, favorecendo a multiplicação bacteriana de espécies anaeróbias restritas (ANDREATTI FILHO et al., 2003).
2.5 Inoculação in ovo
A técnica de inoculação in ovo iniciou na década de 80 através da vacinação para a Doença de Marek, a qual demonstrou ser mais vantajosa que o antigo método convencional, diminuindo o stress das aves causado pela vacinação manual e proporcionando resposta imune prematura (RICKS et al., 1999).
No período final de incubação o término do desenvolvimento fisiológico do embrião requer alto gasto energético, momento em que ocorre alto consumo de glicose e degradação de proteínas, entre elas imunoglobulina A, para síntese de energia, prejudicando os mecanismos de defesa do embrião e tornando a ave recém-eclodida exposta a infecções (ROCHA e MAIORKA, 2013).
O trato gastrointestinal da ave tem seu desenvolvimento funcional nos últimos dias do período embrionário, no qual as enzimas proteolíticas do pâncreas, tripsina e enzimas de borda em escova aumentam sua atividade (UNI e FERKET, 2004). No 17º dia de incubação o peso do intestino aumenta de 1,4% para 3,4% do peso da ave ao nascimento, o que a torna porta de entrada para enteropatógenos (NOY e UNI, 2012).
Objetivando proteger a ave de desafios sanitários utilizando a metodologia de vacinação in ovo Cox et al. (1992) administraram cultura de exclusão competitiva no 18º dia de incubação. Os resultados constataram que ovos inoculados com exclusão competitiva utilizando como diluente vacina para doença de Marek eram menos suscetíveis à infecção no primeiro dia de vida por Salmonella Typhimurium.
cecos, diferentemente do grupo controle. Estes autores constataram que a inoculação da bactéria não era prejudicial para a eclodibilidade e mortalidade, além de reduzir a prevalência de Salmonella Typhimurium.
Cheled-Shoval et al. (2011) realizaram a aplicação de mananoligossacarídeos no 17º dia de incubação, constatando ao 3º dia de vida maior comprimento e área das vilosidades. Os autores também observaram maior atividade das enzimas da borda em escova dos enterócitos, concluindo que o tratamento auxiliou na maturação intestinal.
O alto gasto energético durante o período final de incubação compromete as reservas de glicogênio resultando na diminuição do ganho de peso nos primeiros dias de vida das aves. Visando suprir as necessidades do embrião Kornasio et al. (2011) inocularam no 18º dia de incubação solução contendo carboidratos, melhorando os níveis de glicogênio no fígado e músculo peitoral nos dias seguintes ao tratamento.
3. Objetivos
3.1 Objetivos gerais
Analisar a inoculação in ovo de probiótico e produto de exclusão competitiva em frangos de corte desafiados com Salmonella Heidelberg.
Verificar a eficácia dos tratamentos propostos na colonização cecal de aves não submetidas ao desafio bacteriano.
3.2 Objetivos específicos
- Avaliar os seguintes parâmetros em aves desafiadas com Salmonella Heidelberg: Resposta imune pela quantificação das concentrações de IgA no fluido intestinal;
Verificar a aplicação dos tratamentos propostos na redução de Salmonella Heidelberg por meio da quantificação da bactéria no conteúdo cecal e em pool de fígado e baço; - Analisar a viabilidade bacteriana do probiótico e produto de exclusão competitiva diluídos em solução contendo Vacina de Marek;
CAPÍTULO 2 – EFEITO DA INOCULAÇÃO IN OVO DE PROBIÓTICO E PRODUTO DE EXCLUSÃO COMPETITIVA EM FRANGOS DE CORTE DESAFIADOS COM SALMONELLA HEIDELBERG.
SILVA, I.G.O 1; VELLANO, I.H.B 1; MORAES, A.C.I 1; LEE, I.M 2; ALVARENGA,
B 2; MILBRADT,E 1; HATAKA, A 3; OKAMOTO, A.S 1; ANDREATTI FILHO, R.L1
1Laboratório de Ornitopatologia,Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
(FMVZ), Departamento de Patologia Veterinária,Botucatu, SP, Brasil.
2BioCamp Laboratórios, Campinas, SP, Brasil.
3Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ),
Botucatu, SP, Brasil.
Resumo
O presente trabalho teve como objetivo avaliar por meio da realização de três experimentos a inoculação in ovo de probiótico e produto de exclusão competitiva no 18º dia de incubação juntamente com a Vacina de Marek em ovos provenientes de matrizes de corte de 56 semanas. No primeiro estudo foi avaliado o efeito dos tratamentos sobre a eclodibilidade, colonização de Salmonella Heidelberg e imunidade intestinal de mucosa através da quantificação de imunoglobulina A (IgA) no fluido intestinal. No segundo experimento foi avaliada a viabilidade bacteriana dos produtos inoculados em solução contendo diluente e Vacina de Marek. O terceiro estudo avaliou a colonização da microbiota cecal em aves não desafiadas durante os quatro primeiros dias de vida, cultivada em condições de aerobiose e anaerobiose. O percentual de eclodibilidade não diferiu estatisticamente entre os tratamentos. Houve redução na quantificação de Salmonella Heidelberg no conteúdo cecal no terceiro dia de vida em aves inoculadas com produto de exclusão competitiva. Não foram observadas diferenças estatísticas na quantificação bacteriana em pool de fígado e baço. A inoculação de probiótico e produto de exclusão competitiva influenciou a resposta imune de mucosa, sendo observado aumento da concentração de IgA intestinal 24 horas após o desafio. A avaliação da microbiota cecal de aves não desafiadas apresentou diferenças no terceiro dia de vida em cultivo aeróbio e segundo dia de vida em anaerobiose. A viabilidade dos produtos inoculados e diluídos em solução vacinal foi observada no cultivo anaeróbio em todos os períodos analisados. Os resultados sugerem a via de inoculação in ovo
como alternativa viável, na qual os produtos inoculados melhoram a resposta imune de IgA intestinal em resposta ao desafio e a inoculação com produto de exclusão competitiva demonstrou capacidade de reduzir a colonização cecal de Salmonella
Heidelberg.
Palavras-chave: Salmonella Heidelberg, probiótico, exclusão competitiva, inoculação
Abstract
This work aimed to evaluate by conducted three experiments the in ovo inoculation with probiotic or competitive exclusion product on day 18 of incubation simultaneously with Marek´s disease vaccine in eggs from breeders at 56 weeks of age. The first study was evaluated the treatments effect at eggs hatchability, Salmonella Heidelberg colonization and mucosal immune response at immunoglobulin A in intestinal fluid. The second experiment was evaluated the bacterial viability of the inoculated products in diluted solution and Marek´s disease vaccine. The third study evaluated the cecal microbiota quantification at first four days of life in chickens that were not challenged, at aerobic and anaerobic cultivation. The percent hatchability were not statistically different between treatments. Salmonella Heidelberg quantification reduced only at three day of age in chicken embryos inoculated with competitive exclusion product. No statistical difference was observed at bacterial quantification in pool of liver and spleen. In ovo
inoculation of probiotic and competitive exclusion product influenced in mucosal immunity response, were was observed high levels at IgA concentration 24 hours after challenge. Evaluation of cecal microbiota in not chalenged chickens have differences at third day of life in anaerobic conditions and second day in anaerobically culture. The viability of inoculated product and diluted in vaccine solution was observed in anaerobioc culture in all periods. The results suggest the in ovo inoculation route as viable alternative in witch the inoculated products improve the immunity response of intestinal IgA at challenge response and the inoculation of competitive exclusion product showed the ability to reduce cecal colonization of Salmonella Heidelberg.
Keywords: Salmonella Heidelberg, probiotic, competitive exclusion, in ovo
Introdução
Os sorovares paratíficos de Salmonella spp. são conhecidos mundialmente como principais agentes responsáveis pela ocorrência de doenças transmitidas por alimentos, resultante do consumo de carne de aves e seus subprodutos.Foley et al. (1) sugerem que vacinação para Salmonella Enteritidis e sua supressão favoreçam a emergência de outros sorovares paratíficos mais invasivos. No Brasil, a Salmonella Heidelberg foi descrita como terceiro sorovar isolado em swabs provenientes de aviários comerciais nos últimos anos, considerado como um sorovar emergente (2).
A proibição do uso de antimicrobianos em doses subterapêuticas como promotores de crescimento pela União Europeia em 2006 gerou a busca pelo uso de tratamentos alternativos para melhorar os índices de produção e diminuir a incidência de enteropatógenos.Os probióticos compostos por culturas definidas ou indefinidas estimulam o sistema imune associado à mucosa, produzem compostos antimicrobianos, diminuem o pH intestinal dificultando a multiplicação de bactérias patogênicas (3).
O tratamento com probióticos e produto de exclusão competitiva vem sendo amplamente utilizado, porém a presença de contaminação por Salmonella spp. no incubatório logo após o nascimento ou durante o transporte das aves recém-eclodidas reflete a necessidade do estabelecimento de bactérias favoráveis no trato gastrointestinal o mais cedo possível.Em frangos de corte, o aumento da altura das vilosidades e profundidade de criptas intestinais tem início no 17º dia de incubação, período em que o trato gastrointestinal encontra-se em completa formação e com funcionamento das enzimas intestinais, sendo considerada a primeira experiência digestiva da ave a ingestão de fluido amniótico no 18º dia de incubação (4).
A ave recém-eclodida ainda não possui microbiota estabelecida, o que a torna altamente suscetível à contaminação por enteropatógenos. Os benefícios do tratamento com bactérias probióticas durante o período de vida das aves demonstrou redução na infecção por Salmonella Enteritidis (5), entretanto as chances de eficácia do tratamento são maiores quanto mais precocemente ocorrer sua administração.
Baseado no exposto acima, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a inoculação in ovo de probiótico e produto de exclusão competitiva no 18º dia de incubação, concomitantemente à vacinação para Doença de Marek, sobre o desafio com
Material e Métodos
Foram inoculados 480 ovos provenientes de incubatório comercial para a realização de três experimentos. O primeiro experimento consistiu na avaliação da eficácia dos tratamentos no desafio com Salmonella Heidelberg, no experimento II foi verificada a viabilidade bacteriana do probiótico e produto de exclusão competitiva em solução contendo vacina de Marek. O experimento III objetivou avaliar a colonização da microbiota cecal das aves inoculadas in ovo e não desafiadas.
Os procedimentos foram realizados conforme aprovação do Comitê de ética em experimentação animal da FMVZ/UNESP – Protocolo nº93/2015.
Experimento I
No 18º dia de incubação ovos embrionados da linhagem COBB® provenientes de matrizes de 56 semanas de idade passaram pelo procedimento de ovoscopia, foram acondicionados em bandejas de incubação com capacidade para 96 ovos cada e receberam no fluído amniótico pelo equipamento de vacinação Embrex 0,05 mL/ovo de vacina para Doença de Marek acrescida dos seguintes tratamentos:
Grupo 1 – Aves vacinadas com solução contendo vacina para Doença de Marek e probiótico composto por 21 cepas com os seguintes níveis de garantia: uma cepa de
Bacillus subtilis (1,0x108UFC/g), seis cepas de Enterococcus faecium (6,0x108UFC/g),
uma cepa de Lactobacillus acidophilus (1,0x108 UFC/g), uma cepa de Lactobacillus
delbrueckii (1,0x108 UFC/g), três cepas de Lactobacillus plantarum (3,0x108 UFC/g),
cinco cepas de Lactobacillus reuteri (5,0x108 UFC/g), uma cepa de Lactobacillus
salivarius (1,0x108 UFC/g) e três cepas de Pediococcus acidilactici (3,0x108 UFC/g).
Grupo 2- Aves vacinadas com solução contendo vacina para Doença de Marek acrescida de produto de exclusão competitiva com 106 UFC/g de bactérias anaeróbias
totais e 106 UFC/g de bactérias produtoras de ácido láctico.
Grupo 3- Tratamento controle: Aves vacinadas para Doença de Marek.
Eclodibilidade
Após o nascimento foi avaliado o efeito dos tratamentos sobre a taxa de eclosão dos ovos através da quantificação de aves nascidas vivas e número de ovos incubados. Quantificação dos produtos comerciais inoculados in ovo
Os tratamentos de probiótico e produto de exclusão competitiva foram diluídos de acordo com a recomendação do fabricante em solução contendo diluente e vacina para Doença de Marek. Uma alíquota de cada solução preparada foi armazenada em tubos coletores estéreis e mantida em temperatura de 2 a 8ºC.
A quantificação do inóculo foi realizada através de sucessivas diluições decimais seriadas em solução salina fosfatada tamponada (PBS), plaqueadas em ágar Man Rogosa Sharpe (MRS) e cultivadas em aerobiose e anaerobiose. As pacas foram incubadas a 41ºC pelo período de 24 horas.
Determinação do inóculo e desafio com Salmonella Heidelberg
Foi utilizada Salmonella Heidelberg resistente a 100µg de ácido nalidíxico (Nal) e 100µg de rifampicina (Rif). A amostra foi cultivada em 250 mL de caldo infusão de cérebro e coração (BHI) e incubada a 37ºC por 24 horas. A contagem de unidades formadoras de colônia (UFC) foi realizada por meio de diluição decimal seriada em solução salina fosfatada tamponada (PBS) e plaqueamento em ágar verde brilhante (AVB) contendo ácido nalidíxico (100µg/mL de meio) e rifampicina (100µg/mL de meio). No segundo dia de vida todos os grupos receberam 0,5 mL do inóculo de
Salmonella Heidelberg contendo 6,8.105 UFC/mL administrado com auxílio de agulha
de gavagem estéril.
Quantificação de Salmonella Heidelberg em ceco e pool de fígado e baço
Coleta de fluído intestinal e teste de ELISA
Aos 1, 3, 7, 14, 21 e 35 dias de vida cinco aves de cada tratamento foram eutanasiadas e os intestinos coletados de forma asséptica. Com o auxílio de uma seringa de 2 mL posicionada no duodeno para que todo o trato gastrointestinal fosse lavado foi injetada solução de PBS contendo 0,01% de Timerosal, 1% de Albumina de Soro Bovino, 1 mM de Fenilmetil Sulfonil Fluoredo e 5 mM de Ácido Etilenodiamino Tetra-acético (EDTA), segundo Donato (6). As amostras foram centrifugadas a 1200 xg durante 7 minutos para a coleta do sobrenadante, o qual foi armazenado a -20ºC.
Para a determinação de Imunoglobulina A (IgA) no conteúdo intestinal foi realizado teste de ELISA (Enzime-Linked Immunosorbent Assay) seguindo os procedimentos preconizados no Kit Chicken IgA ELISA Quantitation (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA). Foram utilizadas placas de poliestireno compostas por 96 poços de fundo chato, sensibilizadas com a adição de 100µL em cada poço de anticorpo de captura diluído na proporção 1:100 em solução tampão carbonato bicarbonato 0,005M. Após uma hora de incubação a 25ºC os poços foram lavados 5 vezes com solução de lavagem (50mM TRIS, 0,14M NaCl, 0,05% tween 20, pH 8,0) e foi adiconado 200µL/poço de solução de bloqueio (50mM TRIS, 0,14M NaCl, 1% BSA, pH 8,0), incubados por 30 minutos a 25°C e lavados três vezes. Adicionou-se 100μL/poço das amostras de fluído intestinal, seguidas de incubação por 60 minutos a 25°C. Em seguida, as placas foram lavadas cinco vezes e adicionado 100μL de conjugado 1:75.000 em cada poço, incubadas a 25°C por 60 min e lavadas cinco vezes. Após este período foi aplicado em cada poço 100μL da solução substrato TMB e as placas foram incubadas no escuro a 25°C por 15 minutos. A reação foi bloqueada com 100μL /poço de H2SO4 (2M).
A leitura dos resultados foi realizada com auxílio de um espectofotômetro leitor de microplacas em comprimento de onda de 450 ŋm.
Enriquecimento seletivo para Salmonella Heidelberg
Experimento II
O probiótico comercial e produto de exclusão competitiva foram diluídos separadamente de acordo com as recomendações do fabricante em solução diluente contendo vacina para a Doença de Marek. Imediatamente após o preparo e nos momentos de uma, três e seis horas foram realizadas sucessivas diluições decimais seriadas das soluções separadamente em PBS, plaqueadas em MRS e incubadas a 41ºC por 24 horas em condições de aerobiose e anaerobiose para a determinação da viabilidade bacteriana.
Experimento III
A inoculação dos ovos e tratamentos ocorreram de acordo com a metodologia do experimento I. Após a eclosão 180 aves distribuídas em três grupos de 60 aves cada, foram alojadas durante quatro dias em gaiolas experimentais no Infectório do Laboratório de Ornitopatologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia UNESP, Campus de Botucatu-SP, recebendo água e alimentação ad libitum sem adição de antimicrobianos ou promotores de crescimento.
No primeiro, segundo, terceiro e quarto dia de vida 10 aves de cada tratamento foram eutanasiadas mediante deslocamento cervical e necropsiadas de forma asséptica para a retirada dos cecos. O material foi acondicionado em sacos plásticos coletores estéreis, macerado e diluído em PBS na proporção 1:10. A quantificação de unidades formadoras de colônia (UFC) presente na microbiota cecal foi realizada a partir de diluições decimais seriadas em PBS e plaqueamento em ágar MRS. As placas foram incubadas em condições de aerobiose e anaerobiose a 41ºC por 24 horas.
Análise estatística
No experimento I os dados de eclodibilidade foram avaliados estatisticamente por meio do Teste de Associação de Goodman para contrastes dentro de populações binomiais. A quantificação bacteriana de Salmonella Heidelberg, assim como o teste de ELISA foram submetidos à análise de variância complementada com teste de comparações múltiplas de Tukey com nível de 5% de significância.
Resultados Experimento I
A quantificação do inóculo da solução contendo produto de exclusão competitiva foi de 3,2x103 UFC/embrião em cultivo aeróbio e 1,17x105 UFC/embrião
em anaerobiose. O inóculo do probiótico comercial apresentou contagem de 1,59x105
UFC/embrião em condições de aerobiose e 1,11x104 UFC/embrião em anaerobiose.
A eclodibilidade dos ovos está descrita na Tabela 1. Não foram encontradas diferenças estatísticas entre os tratamentos, embora a eclosão dos ovos inoculados com produto de exclusão competitiva (87,92%) e probiótico (86,25%) tenham apresentado resultados superiores ao grupo controle (85,20%).
Os resultados da quantificação de Salmonella Heidelberg no conteúdo cecal estão expressos na Tabela 2. No terceiro dia de vida, 24 horas após o desafio, o tratamento de exclusão competitiva reduziu a quantificação da bactéria, apresentando 3,3 log10UFC enquanto o probiótico e controle apresentaram contagens de 3,7 e 4,7
log10UFC respectivamente. Nos momentos de 7, 14, 21 e 35 dias não foram observadas
diferenças estatísticas entre os tratamentos.
Os valores da quantificação em pool de fígado e baço estão descritos na Tabela 3. Os tratamentos não apresentaram diferença estatística durante todo o período do experimento, entretanto foi identificada contagem bacteriana apenas no momento de 7 dias de vida.
A concentração de IgA no fluído intestinal através do teste de ELISA está descrita na Tabela 4. No primeiro dia de vida a concentração desta imunoglobulina foi maior no grupo controle, apresentando 428 ng/mL, enquanto a inoculação com probiótico obteve 264,1 ng/mL e exclusão competitiva 262,3 ng/mL. No terceiro dia de vida, 24 horas após o desafio com Salmonella Heideberg, houve uma queda considerável de IgA intestinal no tratamento controle (45,5 ng/mL) e pode ser observada a influência dos tratamentos em resposta ao desafio. Nos momentos de 7, 14, 21 e 35 dias não foram encontradas diferenças estatísticas significativas.
Os resultados do enriquecimento seletivo demonstram a presença de Salmonella
Heidelberg nos cecos em todas as amostras enriquecidas. Até os sete dias de vida houve predominância do tratamento de exclusão competitiva na redução da contaminação em
Experimento II
A viabilidade bacteriana das soluções inoculadas manteve-se constante em cultivo aneróbio durante todo o período do experimento (Tabela 6). No cultivo em aerobiose foi observada ausência de crescimento bacteriano em solução contendo produto de exclusão competitiva no momento de uma até seis horas após seu preparo. A solução com probiótico nesta mesma condição de cultivo permaneceu viável durante todos os momentos de coleta.
Experimento III
No terceiro dia de vida houve diferença estatística no tratamento controle e de exclusão competitiva em comparação com o probiótico. O cultivo em anaerobiose apresentou diferença estatística no segundo dia de vida no qual prevaleceu a quantificação bacteriana dos tratamentos controle e probiótico.
Discussão
No presente trabalho foi analisada a aplicabilidade dos tratamentos inoculados no 18º dia de incubação, seu efeito protetor contra Salmonella Heidelberg, viabilidade dos produtos em função do tempo e interferência dos tratamentos na modulação da microbiota cecal durante os primeiros dias de vida.
Observando os resultados do experimento I nota-se que embora o percentual de eclodibilidade nos grupos tratados não tenha apresentado significância estatística, o número de aves nascidas vivas nos grupos tratados foram superiores ao tratamento controle. Os resultados da inoculação de exclusão competitiva foram superiores aos achados de Meijerhof e Hulet (7), em que o tratamento com exclusão competitiva apresentou piora na eclosão.
A eclosão de 86,25% dos ovos inoculados com probiótico assemelha-se aos resultados obtidos por Yamawaki et al. (8), em que a inoculação de cepas probióticas na câmara de ar ao 18º dia de incubação resultou em 83% de eclodibilidade. No entanto, estudo realizado por Andreatti Filho et al. (9) através da inoculação de Lactobacillus
salivarius ou microbiota cecal indefinida na câmara de ar observaram 60% e 55% de
eclosão nos respectivos grupos.
No presente estudo o tratamento de exclusão competitiva reduziu a quantificação
2), diferentemente dos resultados obtidos por Andreatti Filho et al. (9) em que a inoculação de microbiota cecal no período embrionário não reduziu a colonização cecal
de Salmonella Enteritidis. Estes resultados podem ter ocorrido pelo fato de o tratamento
de exclusão competitiva apresentar composição mais complexa, permitindo maior interação com o hospedeiro e associação entre bactérias da microbiota (10).
Os resultados do probiótico comercial corroboram com os achados de Yamawaki et al. (8) em que a inoculação in ovo de cepas de Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus fermentum e Lactobacillus salivarius em frangos de corte não apresentou
redução de Salmonella Enteritidis em conteúdo cecal.Martins (11) inoculando in ovo o mesmo probiótico comercial do presente estudo e desafiando as aves eclodidas com
Salmonella Enteritidis não observou sua redução no ceco das aves desafiadas, da mesma
maneira que no presente trabalho mediante desafio com sorovar Heidelberg.
Estudo realizado por Leandro et al. (12) demonstrou que cepas probióticas administradas in ovo podem reduzir a colonização cecal em aves desafiadas com
Salmonella Enteritidisde forma mais eficaz do que sua administração após o desafio e
aplicação via ração, onde foi constatada redução tardia da infecção.
Não foram observadas diferenças entre os tratamentos na quantificação de
Salmonella Heidelberg em pool de fígado e baço. Em contrapartida, Andreatti Filho et
al. (9) inoculando microbiota ou probiótico in ovo não observaram crescimento de Salmonela no fígado no grupo inoculado com Lactobacillus salivarius cinco dias após o desafio.
O efeito imunomodulatório avaliado através da concentração de IgA intestinal foi proeminente 24 horas após o desafio, período no qual os valores de IgA nos tratamentos com probiótico e exclusão competitiva foi superior ao grupo controle. Este é o primeiro estudo relatando a inoculação in ovo de probiótico comercial e produto de exclusão competitiva interferindo na atividade desta imunoglobulina. A maturidade do sistema imune associado à mucosa ocorre a partir de duas semanas de vida, entretanto, a administração de probióticos em frango de corte durante os primeiros dias de vida e sua influência na maturação da imunidade de mucosa pela liberação de IgA foi reportada por Haguighi et al. (13).
Os resultados obtidos através do enriquecimento seletivo para Salmonella
Heidelberg relatam redução tardia do tratamento probiótico na infecção sistêmica em
redução da bactéria no fígado e baço nos primeiros dias do experimento. O enriquecimento seletivo mostrou-se efetivo para detectar a presença da bactéria em menores quantidades.
A viabilidade de probióticos comerciais e produtos de exclusão competitiva, avaliada através da quantificação bacteriana dos mesmos em diferentes períodos, é pouco discutida na literatura, enfatizando a relevância de maiores estudos. Menconi et al. (14) analisando duas amostras de bactérias ácido láticas presentes em probiótico comercial e mantidas em período de incubação de duas e quatro horas e temperatura de 15ºC e 45ºC constataram crescimento positivo em microaerofilia. No presente estudo o probiótico comercial mantido a 25ºC apresentou crescimento em aerobiose e anaerobiose até seis horas de incubação. A ausência de crescimento do produto de exclusão competitiva em aerobiose a partir de uma hora de incubação pode ser resultado da composição bacteriana de bactérias anaeróbias estritas e pouca interação com oxigênio das culturas anaeróbias facultativas.
A avaliação da microbiota cecal em aves inoculadas e não desafiadas não sofreu influência significativa dos tratamentos durante os quatro primeiros dias de vida, porém a colonização da microbiota apenas estabiliza-se a partir de onze dias de vida, período não avaliado no presente trabalho (15). A presença de valores semelhantes na quantificação bacteriana da microbiota inclusive no grupo controle corrobora com os resultados de Borges (16) em que a inoculação in ovo de Bacillus subtillis resultou na identificação da bactéria em todos os grupos estudados.Em comparação com outras vias de utilização, Gérard et al. (17) notificou que o fornecimento de Lactobacillus spp. via água de bebida não influenciou a contagem da bactéria no ceco de frangos de corte no quarto dia de vida. Mountzouris et al. (18) constataram que o tratamento probiótico fornecido na dieta apenas influenciou a quantificação da microbiota no final do período de criação.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer à empresa BioCamp Laboratórios pelo fornecimento do probiótico e produto de exclusão competitiva.
Conclusão
frangos de corte no período pós-eclosão. Foi constatada a capacidade imunomodulatória dos produtos inoculados através do aumento na concentração de IgA no fluido intestinal mediante desafio. Os produtos comerciais mantiveram-se viáveis e capazes de colonizar e estabelecer-se na microbiota. As soluções inoculadas testadas em laboratório apresentaram crescimento mesmo após horas de preparo e em temperaturas adversas. Referências
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TABELA 1 - Percentual de eclodibilidade dos ovos inoculados in ovo com probiótico, produto de exclusão competitiva e tratamento controle.
Tratamentos Ovos Eclodidos Ovos não eclodidos Eclodibilidade* Total
Probiótico 414 66 86,25% 480
Exclusão
competitiva 421 59 87,92% 480
Controle 408 72 85,20% 480
*Número de ovos incubados/número de aves nascidas.
TABELA 2 – Médias da quantificação bacteriana de Salmonella Heidelberg (log10UFC) no conteúdo cecal.
Grupos 3 7 Idade (dias) 14 21 35
Controle 4,7 b 5,1 3,0 ≤ 2 0
Exclusão
Competitiva 3,3 a 4,8 3,2 ≤ 2 0
Probiótico 3,7 b 5,3 2,9 ≤ 2 0
Médias seguidas por letras distintas na linha diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
TABELA 3 – Médias da quantificação bacteriana (log10 UFC) de Salmonella
Heidelberg em pool de fígado e baço.
Tratamentos Momentos de Coleta (dias)
3 7 14 21 35
Controle 0 ≤ 2 0 0 0
Exclusão
Competitiva 0 ≤ 2 0 0 0
TABELA 4 - Concentração de IgA no fluido intestinal (ng/mL) nos diferentes tratamentos em aves desafiadas com Salmonella Heidelberg.
Idade (Dias) Tratamentos
Probiótico Competitiva Exclusão Controle
1 264,1 262,3 428
3 272,8 b* 230,6 b 45,5 a
7 194,2 148,9 199,4
14 1141,9 1513,2 1708,6
21 1480 1635,4 1110,8
35 993,5 892,3 1179,9
*Médias seguidas por letras distintas na linha diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
TABELA 5 – Enriquecimento seletivo para Salmonella Heidelberg em ceco e pool de fígado e baço.
Idade Probiótico Competitiva Exclusão Controle
C F+B C F+B C F+B
3 *1/1 7/9 1/1 4/9 1/1 8/8
7 ** 3/3 1/1 2/4 ** **
14 ** 1/6 ** 1/6 ** 2/7
21 7/7 0/10 2/2 2/10 5/5 3/10
35 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
C: enriquecimento em conteúdo cecal; F+B: enriquecimento em pool de fígado e baço.
*Amostras positivas/total de amostras; ** amostras não submetidas ao enriquecimento seletivo.
TABELA 6 – Viabilidade bacteriana em cultivo aeróbio (log10 UFC) das soluções de
probiótico e produto de exclusão competitiva em diferentes momentos de coleta.
Tratamentos Momentos de coleta (horas)
0 hora 1 hora 3 horas 6 horas
Probiótico 5,09 5,05 5,64 4,95
Exclusão
TABELA 7 - Viabilidade bacteriana em cultivo aneróbio (log10 UFC) das soluções de
probiótico e produto de exclusão competitiva em diferentes momentos de coleta.
Tratamentos Momentos de coleta (horas)
0 hora 1 hora 3 horas 6 horas
Probiótico 5,71 5,65 5,79 5,61
Exclusão
Competitiva 5,25 5,25 5,05 5,41
TABELA 8 – Médias da quantificação bacteriana (log10 UFC) da microbiota cecal
cultivada em aerobiose durante os quatro primeiros dias de vida.
Tratamentos Momentos de Coleta (dias)
1 2 3 4
Controle 7,31 A 8,32 B 8,27 b,B* 7,42A
Exclusão
Competitiva 7,45 A 8,45 B 7,94 ab,AB 7,39 A
Probiótico 7,65 AB 8,18 B 7,49 a,A 7,22 A
* Médias seguidas pela mesma letra maiúscula na linha ou minúscula na coluna não diferem estatisticamente pelo teste Tukey (p>0,05).
TABELA 9 – Médias da quantificação bacteriana (log10 UFC) da microbiota cecal
cultivada em anaerobiose.
Tratamentos Momentos de Coleta (dias)
1 2 3 4
Controle 6,73 7,24 ab* 7,15 6,74
Exclusão
Competitiva 7,22 6,72 a 7,10 6,67
Probiótico 6,94 AB 7,29 b,B 7,22 B 6,41 A
CAPÍTULO 3 – DISCUSSÃO GERAL
A salmonelose é uma zoonose responsável por intoxicações alimentares severas em humanos, ocupando posição de destaque entre agentes causadores de doenças transmitidas por alimentos. Na tentativa de reduzir as enfermidades intestinais na indústria avícola os antimicrobianos foram utilizados durante muitos anos como promotores de crescimento em doses subterapêuticas.
A proibição no uso de antimicrobianos para esta finalidade somada às exigências do mercado consumidor favoreceu o surgimento de produtos alternativos aos antimicrobianos. O uso de probióticos não deixa resíduos na carne de frango, não confere mecanismos de resistência e reduz a incidência de enteropatógenos.
Entre as vias de aplicação do tratamento probiótico na produção avícola destacam-se: spray,água de bebida e ração. A demora entre a eclosão e alojamento ou até mesmo o tempo de nascimento até a aspersão do tratamento torna a ave exposta à contaminação.
A vacinação in ovo é prática de rotina nos incubatórios, portanto a administração de culturas definidas ou indefinidas no momento de vacinação torna-se uma medida interessante para proporcionar o desenvolvimento da microbiota intestinal favorável antes do nascimento da ave, tornando-a menos suscetível aos desafios sanitários.
No presente estudo a administração no 18º dia de incubação de produto de exclusão competitiva em solução diluente para vacina de Marek reduziu a quantificação
de Salmonella Heidelberg no ceco no terceiro dia de vida. A concentração de IgA no
fluido intestinal aumentou quando o mesmo tratamento foi exposto ao desafio o que comprova a imunoestimulação relacionada com a microbiota intestinal.
CONCLUSÃO GERAL
O presente estudo constatou a aplicabilidade do probiótico comercial e produto de exclusão competitiva utilizados para via de inoculação in ovo. O produto de exclusão competitiva apresentou de redução de Salmonella Heidelberg em conteúdo cecal no terceiro dia de vida, o que demonstra a capacidade de proteção do tratamento na ave recém-eclodida.
A administração dos tratamentos aumentou os níveis de IgA intestinal constatando o efeito imunoestimulatório de bactérias presentes nos tratamentos em resposta ao desafio, o que ainda não havia sido relatado em outros estudos.
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