ISQUEMIA HEPÁTICA NORMOTÉRMICA EM RATOS: ESTUDO
DA LESÃO CELULAR ATRAVÉS DO USO DE CLAMPEAMENTO
PEDICULAR CONTÍNUO E INTERMITENTE
NORMOTHERMIC HEPATIC ISCHEMIA IN RATS: STUDY OF CELULAR INJURY
BY THE USE OF CONTINUOUS AND INTERMITTENT PEDICULAR CLAMPING
Fabio Neves da Silva, TCBC-RJ1
1. Mestre em Cirurgia Geral (Setor Abdominal) pela Universidade Federal do Rio de Janeiro — UFRJ. Doutorando em Cirurgia Geral (Setor Abdominal) pela Universidade Federal do Rio de Janeiro — UFRJ. Cirurgião Geral do Hospital Geral de Ipanema, RJ. Cirurgião Geral do Hospital Central da Polícia Militar, RJ.
Recebido em 22/11/2001
Aceito para publicação em 13/08/2002
Trabalho desenvolvido no Setor de Cirurgia Experimental da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ. RESUMO: Objetivo: Avaliar as alterações bioquímicas decorrentes da isquemia hepática normotérmica, segui-da de reperfusão em duas mosegui-dalisegui-dades de clampeamento segui-da tríade portal em ratos. Método: Trinta ratos Wistar machos pesando entre 250 e 320 gramas foram divididos em três grupos de 10 animais cada. Induzimos 40 minutos de isquemia hepática por clampeamento pedicular contínuo (grupo I) ou intermitente (grupo II). No grupo controle não houve clampeamento. Como parâmetro de lesão hepatocelular adotamos a concentração plas-mática de: transaminase glutâmico oxalacética (TGO), transaminase glutâmico pirúvica (TGP) e lactato desidro-genase (LDH). Colhemos as amostras de sangue no início (T1) e no final da cirurgia (T2). Todos os animais foram submetidos ao mesmo tempo operatório: 60 minutos.Resultados: Não houve diferença estatística nos valores iniciais (T1) das três enzimas nos três grupos. Todos apresentaram aumento significativo das enzimas do momen-to 1 (T1) para o momenmomen-to 2 (T2). Houve diferença estatística no aumenmomen-to médio de TGO e TGP entre os três grupos, sendo o maior aumento encontrado no grupo I e o menor, no grupo controle. Não houve diferença signi-ficativa, em relação à LDH, entre o grupo II e o grupo controle. No grupo I, entretanto, houve aumento significa-tivo em relação aos demais. Conclusão: Comparado ao clampeamento contínuo, para um período total de 40 minutos de isquemia, o clampeamento da tríade portal em ratos realizado de forma intermitente, com ciclos de 10 minutos de isquemia e 5 minutos de reperfusão, provoca menor dano hepatocelular, o que foi constatado pela menor alteração enzimática.
Descritores: Fígado – irrigação sangüínea; Isquemia; Reperfusão; Constrição; Ratos.
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INTRODUÇÃO INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO INTRODUÇÃOINTRODUÇÃO
Por receber todo o retorno da circulação esplâncnica através da veia porta, além do suprimento arterial pela artéria hepática, o fígado é o órgão abdominal com maior fluxo de sangue (cerca de 1.500ml/min)1. Exerce grande
variedade de funções incluindo o metabolismo de carboi-dratos, lipídios, proteínas e fatores de coagulação; meta-bolismo e armazenamento de vitaminas; produção de bile, detoxificação e excreção de endo e exotoxinas.
O controle do sangramento durante a cirurgia hepá-tica é fator prognóstico essencial quanto à mortalidade e
morbidade pós-operatória. Diversos métodos baseados na interrupção do aporte sangüíneo ao fígado vêm sendo am-plamente estudados e desenvolvidos. Cada um destes métodos possui indicações precisas. Todos apresentam, no entanto, em maior ou menor grau os inconvenientes da hipóxia tecidual, refletidos em graus variados de altera-ções histológicas e funcionais induzidos pela isquemia.
maio-ria dos pacientes, entretanto, não se enquadra neste grupo. Pertencem àquele cujas lesões de localização central, bi-lateral ou próxima a estruturas vasculares nobres impõem um controle mais amplo e efetivo do sangramento. Além disso, nas cirurgias realizadas em caráter de emergên-cia, por trauma aberto ou fechado, é fundamental que o controle do sangramento seja obtido através do método mais rápido, eficaz e de mais fácil execução. Nestes ca-sos o clampeamento de todo o pedículo hepático é o mais indicado.
Na impossibilidade da seletividade da isquemia de-vemos ponderar sobre as vantagens de minimizar a perda sangüínea, com as conseqüências da isquemia no fígado remanescente, especialmente nos casos de hepatectomias extensas e clampeamentos prolongados. Com este objeti-vo foi desenobjeti-volvida a técnica de clampeamento pedicular intermitente, permitindo a restauração temporária do flu-xo hepático em ciclos regulares 2,3. O objetivo deste
traba-lho foi avaliar, através de um estudo experimental, se o clampeamento intermitente do pedículo hepático provoca menor lesão celular quando comparado ao clampeamento contínuo, o que poderia minimizar as conseqüências da is-quemia hepática normotérmica.
MÉT MÉTMÉT MÉTMÉTODOODOODOODOODO
Foram utilizados nesta pesquisa 30 ratos Wistar, machos, pesando entre 250 e 320 gramas provenientes do biotério do Setor de Cirurgia Experimental do Departa-mento de Cirurgia da Faculdade de Medicina da Univer-sidade Federal do Rio de Janeiro.
Todos os animais foram mantidos em condições idên-ticas de alimentação e água, oferecidos, sem restrição, no período pré-operatório. Foram submetidos a jejum para sólidos desde a noite que antecedeu a cirurgia e operados pela manhã, sendo aleatória a escolha do animal na com-posição dos grupos.
Os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob anestesia inalatória com éter, inicialmente em campânu-la fechada e posteriormente com algodão embebido no mesmo anestésico e introduzido em cilindro de vidro ou plástico onde a cabeça do animal era parcialmente intro-duzida. Após a fixação do animal na mesa cirúrgica, era
realizada tricotomia abdominal ampla, anti-sepsia com ál-cool iodado e iniciada a cirurgia.
O acesso à cavidade abdominal foi obtido por meio de incisão mediana, partindo do apêndice xifóide e esten-dendo-se 5cm no sentido caudal.
Foram colhidas amostras de sangue por punção da veia cava inferior supra-hepática no início (T1) e no final de 60 minutos de cirurgia (T2). As amostras eram acondi-cionadas, centrifugadas e analisadas no mesmo dia para dosagem de transaminase glutâmico oxalacética (TGO), transaminase glutâmico pirúvica (TGP) e lactato desidro-genase (LDH).
Os 30 ratos Wistar foram divididos em três grupos de 10 animais cada, de acordo com o tipo de operação exe-cutada (Figura 1):
• Grupo I (Clampeamento contínuo da tríade portal): após 15 minutos de laparotomia, identificava-se a tría-de portal, que era comprimida pela aplicação tría-de clam-pes vasculares (Figura 2). O fluxo hepático era inter-rompido por 40 minutos, quando se retirava o clampe. O fígado era reperfundido por 5 minutos, momento em que se colhia nova amostra de sangue. Procedia-se, então, à síntese da aponeurose e pele com algodão 000 em sutura contínua.
Grupo I
Grupo II
Grupo III
Perfusão
Isquemia
Momento da coleta de sangue
5 minutos
Figura 1 — Divisão dos grupos de acordo com o procedimento cirúrgico utilizado.
• Grupo II (Clampeamento intermitente da tríade por-tal): imediatamente após a laparotomia, o pedículo he-pático era identificado e clampeado. Realizamos qua-tro ciclos de 10 minutos de isquemia com intervalos de 5 minutos de reperfusão. Após 5 minutos do último desclampeamento nova amostra de sangue era colhi-da. Procedia-se à síntese da aponeurose e pele da mes-ma formes-ma.
• Grupo Controle (Sem clampeamento da tríade portal): após a laparotomia não era realizado clampeamento algum. Aguardávamos 60 minutos, colhíamos a amos-tra de sangue e procedíamos à síntese da aponeurose e pele da mesma forma.
O tempo total de isquemia hepática normotérmica nos Grupos I e II foi o mesmo: 40 minutos. Nestes, o perí-odo de reperfusão anterior à última coleta de sangue tam-bém foi o mesmo: 5 minutos. O tempo operatório total até a segunda coleta das amostras nos três grupos foi de 60 minutos.
Para cada enzima foram calculados os valores médi-os, a variação absoluta (T1-T2) e a variação percentual dos dados obtidos nos três grupos de acordo com os momentos da coleta: no início (T1) ou no final da cirurgia (T2). Pro-cedeu-se, então, à análise comparativa entre os grupos.
Os testes estatísticos utilizados foram: a) Análise de variância: compara os três grupos e especifica em que pon-to eles diferem; b) Teste de comparações múltiplas de Tukey: também tem a função de comparar os três grupos, indicando em que ponto diferem; c) Teste T de Student emparelhado: de forma diferente do Teste T de Student, que avalia dois grupos num mesmo tempo, o teste empare-lhado permite o estudo das variações ocorridas num mes-mo animal ou grupo com o passar do tempo.
Observação: devido a grande variabilidade dos da-dos foi utilizada a transformação logarítmica para fins de análise.
Foi definido como valor significativo: p < 0,05.
RESUL RESUL RESUL RESUL
RESULTTTTTADOSADOSADOSADOSADOS
Os valores médios, a variação absoluta (T1-T2) e a variação percentual dos dados obtidos nos três grupos po-dem ser encontrados na Tabela 1 e nas Figuras 3, 4 e 5.
Os três grupos do trabalho foram considerados com-paráveis por apresentar o mesmo sexo, peso semelhante, além de terem sido submetidos às mesmas condições pré-operatórias e anestésicas, e terem tido o mesmo tempo ope-ratório.
Transaminase Glutâmico Oxalacética (TGO)
Não houve diferença significativa (p = 0,63) nos ní-veis basais (T1) de TGO entre os três grupos, sendo, por-tanto, passíveis de comparação.
Todos os grupos, inclusive o grupo controle, apre-sentaram um aumento significativo do momento 1 (T1) para o momento 2 (T2) (Controle: p = 0,04; Grupo I: p = 0,0001; Grupo II: p = 0,0001).
Há diferença significativa (p = 0,0001) no aumento médio entre os três grupos. O aumento do grupo controle é significativamente menor do que o dos grupos I e II, sendo o aumento do grupo I significativamente maior do que o do grupo II. Assim, temos: Controle < Grupo II < Grupo I.
Transaminase Glutâmico Pirúvica (TGP)
Não houve diferença significativa (p = 0,89) nos ní-veis basais (T1) de TGP entre os três grupos, o que permi-te estudo comparativo.
Todos os grupos apresentaram um aumento signifi-cativo do momento 1 para o momento 2 (Controle: p = 0,03; Grupo I: p = 0,0001; Grupo II: p = 0,0001).
Há diferença significativa (p = 0,0001) no aumento médio entre os três grupos. O aumento do grupo controle é significativamente menor do que o dos grupos I e II, sendo o aumento do grupo I significativamente maior do que o do grupo II. Assim, temos: Controle < Grupo II < Grupo I.
Tabela 1
Média dos valores obtidos na dosagem de TGO, TGP e LDH (UI/L)
Enzima Grupo Amostra T1 T2 Variação Absoluta Variação %
TGO Controle 10 320,70 385,20 64,50 19,18
Grupo I 10 302,00 1737,00 1435,00 515,76
Grupo II 10 273,60 797,10 523,50 209,59
TGP Controle 10 153,80 212,00 58,20 60,28
Grupo I 10 159,90 2586,70 2426,80 1898,28
Grupo II 10 150,60 1086,30 935,70 844,01
LDH Controle 10 2044,40 2490,90 446,50 21,43
Grupo I 10 2801,90 6984,20 4182,30 184,62
Grupo II 10 2747,40 3757,00 1009,60 43,15
TGO – Transaminase Glutâmico Oxalacética TGP – Transaminase Glutâmico Pirúvica LDH – Lactato Desidrogenase
Figura 4 — Gráfico do resultado dos valores médios de Transaminase Glutâmico Pirúvica, TGP (UI/L) obtido no início (T1) e no final da cirurgia (T2).
Figura 3 — Gráfico do resultado dos valores médios de Transaminase Glutâmico Oxalacética, TGO (UI/L) obtido no início (T1) e no final da cirurgia (T2).
Lactato Desidrogenase (LDH)
Não há diferença significativa (p = 0,12) nos níveis basais (T1) de LDH entre os três grupos.
Todos os grupos apresentam aumento significativo do momento 1 para o momento 2 (Controle: p = 0,01; Gru-po I: p = 0,0001; GruGru-po II: p = 0,001).
Não houve diferença estatística nas variações entre o grupo II e grupo controle, porém, o aumento do grupo I é significativamente maior do que o dos grupos Controle e II. Assim temos: Controle = Grupo II < Grupo I.
DISCUSSÃO DISCUSSÃODISCUSSÃO DISCUSSÃODISCUSSÃO
A importância da cirurgia hepática pode ser avalia-da pelo grande número de publicações encontrado na lite-ratura. O fígado se apresenta em posição de destaque nas cirurgias de emergência por ser o órgão mais lesado no trauma abdominal geral, já que ocupa a segunda coloca-ção tanto no traumatismo fechado, onde o baço é o pri-meiro, como no trauma aberto, onde o intestino delgado o precede4,5.
A maioria das lesões encontradas no momento da laparotomia é de baixa complexidade, constituindo peque-nas lacerações ou hematomas subcapsulares. Muitas de-las já não apresentam sangramento ativo. Lesões mais complexas, no entanto, em decorrência do vulto do san-gramento, tornam imperioso o controle do fluxo sangüí-neo hepático aferente e algumas vezes do eferente. A ma-nobra mais utilizada para este fim é a mama-nobra de Pringle6,
descrita em 1908, que consiste no clampeamento de todo o pedículo hepático. Esta manobra permite a melhor visuali-zação das lesões, facilitando o controle definitivo do san-gramento. Além de sua utilidade no trauma, a possibilida-de do controle per-operatório do sangramento através possibilida-desta manobra encorajou sua utilização também nas cirurgias eletivas para ressecções de lesões ou segmentos doentes, onde se destacam mundialmente as ressecções de metásta-ses hepáticas dos carcinomas colorretais. O clampeamento da tríade portal apresenta, no entanto, os inconvenientes da hipóxia tecidual, refletidos em graus variados de altera-ções histológicas e funcionais induzidos pela isquemia.
Com o objetivo de minimizar as lesões provocadas pela isquemia e pela reperfusão alguns estudos foram ela-borados utilizando a manobra de Pringle por curtos perío-dos, seguidos de reperfusão em vários ciclos7-14.
Teorica-mente, nos pequenos intervalos em que o órgão era perfundido haveria retorno da atividade aeróbia, o que diminuiria a produção de ácido láctico e radicais livres, já sabidamente envolvidos na etiologia da lesão celular. Esta modalidade de clampeamento, o clampeamento intermi-tente, foi o objeto deste estudo2,3.
A possibilidade de minimizar a lesão do hepatócito durante a cirurgia hepática seja ela eletiva ou emergenci-al nos motivou a criar um modelo experimentemergenci-al em ratos em que comparamos o grau de lesão celular, medido por dosagem enzimática, decorrente de clampeamentos con-tínuos e intermitentes para um mesmo tempo total de is-quemia (40 minutos). A escolha do ciclo de 10 minutos de isquemia com 5 minutos de reperfusão, descrita no método
do nosso trabalho, não foi aleatória. Este é o ciclo mais freqüentemente utilizado na prática clínica, em humanos. Alguns autores preferiram utilizar ciclos com períodos de isquemia e/ou reperfusão maiores (12 ou 15 minutos de isquemia, 10 ou 15 minutos de reperfusão) em seus traba-lhos experimentais7,12,13,15.
Como parâmetro de avaliação de lesão celular utili-zamos a dosagem plasmática da Transaminase Glutâmico Oxalacética (TGO), da Transaminase Glutâmico Pirúvica (TGP) e da Lactato Desidrogenase (LDH). Estas enzimas são intracelulares, sendo liberadas no interstício e na cir-culação no momento em que a célula, no caso o hepatóci-to, se rompe. A principal causa de sua ruptura é a isque-mia. A falta de energia secundária à hipóxia prejudica o funcionamento da bomba de sódio-potássio-ATPase, per-mitindo o influxo celular de grande quantidade de sódio e água levando à ruptura celular. A utilização das transami-nases e da LDH como parâmetro de lesão do hepatócito vem sendo bem demonstrada em diversos estudos, como o de Isozaki8, Kimura9, Luo16, Nishimura17, Urakami15 e van
Wagensveld12,13.
A coleta do sangue do animal foi realizada através de punção direta com agulha fina da veia cava supra-hepá-tica. A veia cava supra-hepática do rato é longa (1cm) e calibrosa (3 a 4mm), o que facilita a coleta. Outra vanta-gem encontrada é que ela recebe grande fluxo de sangue proveniente diretamente do fígado, órgão em estudo. O volume de 1ml (0,5ml por punção) representa aproxima-damente 1/15 da volemia do rato, que por si só não afetaria de maneira importante as condições hemodinâmicas do animal. Por outro lado, quando associamos a anestesia ge-ral inalatória e o clampeamento pedicular hepático provo-camos, provavelmente, um certo grau de hipotensão. A anestesia geral e a coleta de sangue estavam presentes no três grupos.
A TGO e a LDH não são enzimas exclusivas do fíga-do. Podem ser encontradas também, por exemplo, nas musculaturas esquelética e cardíaca. A melhor perfusão tecidual destes órgãos no grupo controle, já que não houve clampeamento e, conseqüentemente, um menor grau de hipotensão poderia ser um viés que beneficiaria este grupo na dosagem destas enzimas. A restauração temporária do fluxo hepático, observada no grupo II, também melhoraria a hipotensão e, portanto, a perfusão destes órgãos. Com a inclusão da dosagem da TGP, enzima encontrada apenas no hepatócito, a possibilidade de que a elevação de TGO e LDH derivasse da má perfusão de outros órgãos e não so-mente do fígado, diminui sensivelso-mente. Nossos resulta-dos, inclusive, demonstraram que dentre as enzimas estu-dadas, a TGP foi a que apresentou elevações mais significativas atingindo 1898,28% no grupo I em relação à média de seus níveis basais. A TGO atingiu 515,76% e a LDH, 184,62% no mesmo grupo.
Além das enzimas descritas, outros dados podem ser utilizados para a monitorização da lesão do hepatócito como: metabolismo de N colesterol18, ATP hepático19,
re-generação de radicais livres11, tensões de CO
2 e O2 no
mu14, a elevação de xantinas e ATP20, fator de necrose
tu-moral e interleucina 6 (IL 6)9, avaliação do fluxo hepático,
a análise histológica e a dosagem de bATP 7. Apesar de
existirem muitas opções entre as diversas substâncias utili-zadas para qualificar e quantificar a lesão da célula hepáti-ca optamos pela dosagem de TGO, TGP e LDH por quatro motivos principais: 1) muitos dos estudos que utilizam outras substâncias também fazem dosagem de uma ou mais destas enzimas 9,12,13,15,17; 2) são as substâncias mais
fre-qüentemente encontradas na literatura na avaliação do dano celular; 3) são de fácil acesso, podendo ser dosadas em qualquer laboratório; 4) são, efetivamente, o que utili-zamos na prática clínica no acompanhamento de nossos doentes.
Para que não houvesse interferência do tempo ope-ratório e anestésico nos resultados, assim como Wang14,
tivemos o cuidado de manter o mesmo tempo operatório (60 minutos) nos três grupos, incluindo o grupo controle. Os resultados aqui apresentados demonstraram ele-vação das três enzimas estudadas do momento 1 (T1) para o momento 2 (T2) em todos os grupos. Nos grupos I e II as variações foram, no entanto, bem mais significativas do que a elevação ocorrida no grupo controle. O aumento estatisti-camente significativo ocorrido neste grupo não era espera-do. Acreditamos que possa ser decorrente da ação direta do anestésico (éter) na célula hepática, combinado à hipoten-são secundária à diminuição da volemia (coleta de sangue) e anestesia geral, acarretando menor oferta de O2 ao tecido
hepático. Houve significativa diferença estatística entre os grupos na análise das três enzimas. Só não houve diferença significativa entre o grupo controle e o grupo II na avalia-ção da LDH. A elevaavalia-ção das três enzimas no grupo I, do momento 1 (T1) para o momento 2 (T2) foi significativa-mente maior que no grupo II (p = 0,0001). A análise destes dados nos permitiu verificar que o clampeamento intermi-tente, exceto na avaliação da LDH, provoca significativa-mente mais lesão celular do que o grupo controle. O clam-peamento contínuo, no entanto, provoca lesões ainda maiores, com diferença significativa na dosagem das três enzimas com relação ao clampeamento intermitente.
Foram poucos os trabalhos encontrados na literatura que compararam o grau de lesão celular do hepatócito nas duas modalidades de clampeamento apresentadas. Além disso, alguns utilizaram parâmetros de lesão celular dife-rente dos nossos, assim como incluíram a avaliação de ani-mais cirróticos e ictéricos1. A utilização de outros
parâme-tros, contudo, não inviabiliza a comparação, pois o resultado da proteção ou não do hepatócito pela utilização do clam-peamento intermitente é o que realmente importa. Nosso trabalho utilizou apenas animais sem doença hepática, o que foi confirmado pela igualdade estatística dos valores basais das três enzimas estudadas entre os 30 ratos incluí-dos no estudo.
Na literatura não encontramos nenhum trabalho com a metodologia exatamente igual à utilizada por nós. En-tretanto, vários trabalhos que compararam os dois tipos de clampeamento, mesmo que com a utilização de inter-valos de isquemia e reperfusão diferentes ou de animais doentes ou sadios na metodologia, utilizando-se uma ava-liação enzimática precoce ou tardia8,9,11,13,20, chegaram às
mesmas conclusões: há benefício da utilização do clampe-amento intermitente, especialmente em situações de neces-sidade de isquemia prolongada.
O conhecimento da maior proteção do hepatócito no clampeamento intermitente abre caminho para novos estudos, experimentais ou clínicos, dos mecanismos en-volvidos na lesão celular induzida pela isquemia normo-térmica. As implicações na regeneração tecidual, o bene-fício no desenvolvimento de cirrose ou de insuficiência hepática, o ciclo ideal de clampeamento intermitente e os resultados na presença de patologias associadas são exem-plos de temas a serem estudados com grande poder apli-cativo no nosso cotidiano.
Os dados encontrados em nossa experimentação nos permitiu concluir que o clampeamento intermitente do pedículo hepático, em ciclos de 10 minutos de isquemia e cinco minutos de reperfusão, provoca menor lesão do he-patócito, para um mesmo tempo total de isquemia de 40 minutos, em fígado de ratos normais, se comparado ao clampeamento contínuo.
ABSTRACT
Background: Our objective was to access the biochemical alterations due to hepatic warm ischemia followed
by reperfusion in two modalities of portal triad clamping in rats. Method: We divided thirty male Wistar rats, weighting between 250 and 320 grams into three groups with 10 animals each. Forty minutes of hepatic ischemia was induced by continuous (group I) or intermittent (group II) clamping. No clamping was used in control group. As a parameter of hepatocelular injury, plasma concentrations of glutamic oxaloacetic transaminase (GOT), glutamic pyruvic transaminase (GPT) and lactate dehydrogenase (LDH) were measured. Blood specimens were obtained at the begining (T1) and at the end of the surgery (T2). All animals had the same operative time, 60 minutes. Results: There was not statistic difference between baseline (T1) values of the three enzymes in all groups. All animals showed significant increases of all enzymes from moment 1 (T1) to moment 2 (T2). There was statistical difference in the mean increase of GOT and GPT between the three groups, but the greatest elevation was found in group I and the lowest, in control group. In LDH analysis, there was not significant difference between group II and control group. Group I, however, showed significant increases compared with the other two. Conclusion: Compared with the continuous clamping, to a total ischemic period of 40 minutes, intermittent portal triad clamping, in rats, with 10/5 minutes ischemia/reperfusion cycles, leads to a lesser hepatocelular damage, verified by the lowest enzymatic values.
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Endereço para correspondência: Fábio Neves da Silva
