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Kanno, Cláudia Misue
K16e Efeitos da ciclosporina, fenitoína e nifedipina sobre a síntese e degradação de colágeno da gengiva de macacos0prego ( !: estudo histoquímico e através de RT0PCR / Cláudia Misue Kanno. 0 Araçatuba : [s.n.], 2006
75 f. : il. ; tab.
Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia, Araçatuba, 2006
Orientador: Prof. Dr. Alvimar Lima de Castro
1. Crescimento excessivo da gengiva – Induzido quimicamente Ciclosporina 3. Fenitoína. 4. Colágeno tipo I. 5. MMP01. 6. MMP02 não hidrossolúveis
signifique errar. Nunca me aconselharam a ser perfeita, a ser a melhor, apenas a
ser feliz, mas que a felicidade só é plena quando calcada em valores éticos. Não
só me amaram; me aceitaram apesar de todas as minhas imperfeições e erros.
Aprendi com o Professor Alvimar que o Tempo que gastamos
fazendo o que gostamos nunca é “tempo perdido”. O Tempo é um aliado valioso
no nosso processo de crescimento, pois é ele que traz novas experiências,
amadurece idéias, permite que pessoas com novos pensamentos entrem em
nosso caminho.
Aprendi com o Professor Américo que, se queremos colher bons
frutos, devemos plantar boas sementes. Crescer é uma arte, devemos exercê0la
com esmero, superando dificuldades que nunca devem ser motivo de
desencanto, e sim, um estímulo para um salto a um patamar mais alto.
Aprendi com os Professores Fernando, Caris, Sílvia, Renato, e
Marcelo que crescer sozinho é muito chato. Crescemos muito mais rápido
quando estamos organizados como um grupo em que a palavra “juntos” é a mola
mestre.
Aprendi com os Professores Cláudio, Ana Maria, Edílson e
Buratini que conhecimento é algo que deve ser partilhado. Um cérebro cheio de
conhecimentos não tem valor se não houver um coração cheio de generosidade.
Aprendi
com o
Junqueira
e o
Arnaldo
que
ética
em
experimentação também se exerce quando damos carinho ao animal.
Aprendi com a To, o Sérgio, o Gustavo, a Luciana, o Juliano, a
Val e a Érica que crescimento, muitas vezes, é sinônimo de sonho, algo valioso
pelo qual devemos lutar com toda nossa garra.
,
e à minha irmã,
úcia,
Professor Doutor José Fernando Garcia; Professora Doutora Caris Maroni Nunes ;
Professora Doutora Silvia Helena Venturoli Perri Professor Doutor Renato Sundfeld;
Professor Doutor Marcelo Macedo Crivelini; Professor Doutor Cláudio Aparecido Casatti; Professor Doutor Edílson Ervolino;
Professor Doutor José Buratini Junior;
Professora Dorutora Ana Maria Pires Soubhia Professor Doutor Wilson Roberto Poi;
Sr. José Ari Gualberto Junqueira; Sr. Arnaldo César dos Santos;
Doutora Célia Tomiko Matida Hamata Saito; Doutor Sérgio Moraes Aoki;
Doutor Gustavo Avelar Arbex; Doutora Luciana Simonato
Srta. Valquíria Rissato Gazoli: Dra. Érica de Souza Ribeiro;
Sr. Juliano Rodrigues Sangalli; Sr. José Fernando Zanon;
Sra. Elaine Cristina Francischini Ferreira Sr. José Marcelo Tramarin
Sr. Pedro Luís Florindo;
Sra. Luzia Maria de Oliveira Francischini Sra. Ana Cláudia M. Grieger Manzatti
KANNO, C. M.
!" #$! 2006. 75f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Odontologia, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2006.
RESUMO
%&"!'()*+', As alterações em gengiva induzidas por medicamentos têm sido
pouco estudadas quanto à expressão dos genes das metoloproteinases
(MMPs). O objetivo do presente trabalho foi avaliar o padrão histológico de distribuição de fibras colágenas após a administração de ciclosporina, nifedipina ou fenitoína e correlacionar com a expressão dos genes do colágeno do tipo I, MMP:1 e MMP2.
-." !%./ -0"'(',Amostras da gengiva da área de canino superior direito
foram obtidas de doze macacos prego ( ) machos. A extremidade mesial
de cada amostra foi imediatamente congelada em nitrogênio líquido enquanto que a distal foi processada para inclusão em parafina. Após uma semana, os animais foram divididos em três grupos que receberam doses diárias de ciclosporina, fenitoína ou nifedipina, durante 120 dias. Procedeu:se à remoção de amostras da gengiva da área do canino superior esquerdo de dois animais de cada grupo aos 52 e 120 dias. Os cortes histológicos foram corados pelas técnicas da hematoxilina e eosina, vermelho picrosirius, além da marcação imunoistoquímica para colágeno do tipo IV. O RT:PCR semiquantitativo foi realizado para se determinar os níveis de mRNA.
! 1)/".('1, No grupo controle, houve o predomínio de fibras colágenas maduras, evidenciadas com a cor vermelha em cortes corados pela técnica do vermelho picrosirius analisados com microscópio de luz polarizada. Observou:se nos grupos tratados aos 52 e 120 dias um aumento da porcentagem de áreas ocupadas por fibras imaturas, em todos os grupos, independentemente da idade do animal. No entanto, não foram observadas diferenças morfológicas entre os grupos controle e tratado nos cortes corados pela hematoxilina e eosina. Houve uma tendência a valores médios mais baixos de expressão da MMP:1 em todos os grupos, aos 52 dias. Contudo, as expressões da MMP:2 e colágeno do tipo I parecem estar sujeitas a mudanças fásicas e dependentes do medicamento.
$'&$/)1+', Os resultados permitiram concluir que a ciclosporina, fenitoína e nifedipina ocasionam padrões diferentes de expressão genética, resultando em metabolismo de colágeno alterado, independentemente da idade do animal e ausência de sinais clínicos evidentes de crescimento gengival. As alterações não ocorrem de forma uniforme ao longo do corte histológico.
# : Crescimento excessivo da gengiva : induzido quimicamente.
KANNO, C. M. E 2 2 2
3 2 4 --# 5 --# 6
2 % 7 2 2006. 75f. Tese (Doutorado) – Faculdade de
Odontologia, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2006.
ABSTRACT
: Few studies have focused on the expression of matrix
metalloproteinase (MMP) genes in gingival changes induced by drugs. The aim of the present study was to evaluate the histological pattern of collagen fiber distribution after phenytoin, cyclosporine or nifedipine medication and correlate with collagen
type 1, MMP:1 and MMP:2 gene expression levels. ! Gingival samples were
obtained from superior right canine area of twelve male capuchin monkeys ( ). The mesial part of the biopsy specimens was immediately frozen in liquid nitrogen, while the distal one was processed for paraffin inclusion. One week after the control biopsy, the animals were divided in three groups that received daily doses of cyclosporine, phenytoin or nifedipine during 120 days. Gingival samples were
obtained from left superior canine area on 52nd and 120th day of treatment (two
animal of each experimental group). Histologic sections were subjected to hematoxylin and eosin, picrosirius red stainings, and to immunohistochemical reaction for collagen type IV. MMP:1, MMP:2 and collagen type I mRNA levels were determined by RT:PCR.
" : Predominance of mature collagen fibers was observed in the control group
after picrosirius red staining, visualized as red fibers under polarized microscope. Increased percentage of areas occupied by immature collagen fibers was observed on 52 and 120 experimental periods, in all groups, despite the animal age. However, no morphological differences between treated and control groups were observed on hematoxilin and eosin stained sections. There was a trend to lower levels of MMP:1 expression on 52:day samples. However, MMP:2 and collagen type I gene expressions seemed to be phased and drug:related.
" # ! The results allowed the conclusion that cyclosporine, phenytoin and
nifedipin lead to different gene expression patterns, resulting in impaired collagen metabolism, despite animal age and lack of overt clinical signs. Histologic changes were not uniform all over each section.
8 29 : Gingival overgrowth – chemically induced. Cyclosporine. Phenytoin.
/%1". ( :%;)!.1
FIGURA 1 Aspectos clínicos e respectivas fotomicrografias de gengiva de
macacos. Cortes transversais corados com vermelho picrosirius. (A) Animal 3, adulto jovem, antes do tratamento com ciclosporina. (B) Fotomicrografia de biópsia gengival no animal da figura A : predomínio de fibras vermelhas e alaranjadas. Aumento original de 200x. (C) Crescimento gengival observado no animal 3, após 120 dias de tratamento com ciclosporina. (D) Fotomicrografia de biópsia gengival no animal da figura C : predomínio de fibras verdes e amarelas. Aumento original de 200x. (E) Animal 10, adulto, antes do tratamento com fenitoína. (F) Fotomicrografia de biópsia gengival no animal da figura E : predomínio de fibras vermelhas e alaranjadas. Indicação das camadas TCO, TCI e TCS. Aumento original de 100x.
34
FIGURA 2 Aspectos clínicos e respectivas fotomicrografias de gengiva de
macacos. Cortes transversais corados com vermelho picrosirius. (A) Animal 10, após 52 dias de tratamento com fenitoína. Ausência de sinais clínicos de crescimento gengival. (B) Fotomicrografia de biópsia gengival no animal da figura A : predomínio de fibras verdes e amarelas. Aumento original de 100x. (C) Animal 12, adulto jovem, antes do tratamento com nifedipina. (D) Fotomicrografia de biópsia gengival no animal da figura C : predomínio de fibras vermelhas e alaranjadas. Aumento original de 100x. (E) Crescimento gengival observado no animal 12, após 52 dias de tratamento com nifedipina (F) Fotomicrografia de biópsia gengival no animal da figura E : predomínio de fibras amarelas e verdes. Aumento original de 100x.
35
FIGURA 3 Fotomicrografias de cortes transversais de gengiva de macacos. (A)
Fotomicrografia de biópsia gengival no animal 12, antes do tratamento com nifedipina. Marcação imunoistoquímica para colágeno IV. Aumento original de 100x. (B) Fotomicrografia de biópsia gengival no animal 12, após 52 dias de tratamento com nifedipina. Marcação imunoistoquímica para colágeno IV. Aumento original de 100x. (C) Animal 8, antes do tratamento com fenitoína. HE. Aumento original de 100x. (D) Fotomicrografia da mesma amostra da figura C, corada pela técnica do vermelho picrosirius. Predomínio de fibras vermelhas e alaranjadas. Aumento original de 100x. (E) Animal 8, após 52 dias de tratamento com fenitoína. HE. Aumento original de 100x. (F) Fotomicrografia da mesma amostra da figura E corada pela técnica do vermelho picrosirius. Predomínio de fibras amarelas e verdes. Aumento original de 100x.
36
FIGURA 4 Distribuição das porcentagens das áreas ocupadas pelas diferentes
cores após a coloração pelo vermelho picrosirius. Grupo tratado com Ciclosporina (A), Fenitoína (B) e Nifedipina (C). TCO= Tecido conjuntivo associado ao epitélio oral; TCI= Tecido conjuntivo localizado na camada profunda da lâmina própria; TCS= Tecido conjuntivo associado ao epitélio sulcular
FIGURA 5 Efeito da Ciclosporina (A), Fenitoína (B) e Nifedipina (C) sobre a expressão dos genes do colágeno do tipo 1, MMP:1 e MMP:2. Valores relativos médios de mRNA (Média+ Desvio Padrão).
38
FIGURA 6 Validação do número de ciclos. Colágeno – 29 (A), MMP:2 – 27 (B),
/%1". ( ".< /.1
Tabela 1: Características dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a
amplificação dos genes da MMP:1, MMP:2, Col1α1 e betaglobina.
27
Tabela 2 Características dos animais e doses individuais dos
medicamentos, a partir do oitavo dia de tratamento.
/%1". ( .<! =%.")!.1
MMP= do inglês Matrix Metaloproteinase
RT:PCR= do inglês Reverse Trasncriptase Polimerase Chain Reaction
DNA= do inglês Deoxyribonucleic Acid
mRNA= do inglês messenger Ribonucleic Acid
cDNA= do inglês complementary DNA
TCO= Tecido conjuntivo associado ao epitélio oral
TCI= Tecido conjuntivo localizado na camada profunda da lâmina própria
TCS= Tecido conjuntivo associado ao epitélio sulcular
dNTP= do inglês Deoxyribonucleotide triphosphate
DEPC= Dietilpirocarbonato
TBE= Tris, ácido bórico e EDTA
Col1α1= Colágeno do tipo I, cadeiaα
TGF:β= do inglês Transforming Growth Factor – beta
1)->!%'
5 %&"!'()*+' 7
1.1 MATRIZ EXTRACELULAR 11
1.2 CRESCIMENTO EXCESSIVO DA GENGIVA INDUZIDO POR
MEDICAMENTOS
15
1.3 ALTERAÇÕES DA MATRIZ EXTRACELULAR 18
1.4 ALTERAÇÕES CELULARES 21
6 -." !%./ -0"'(' 23
2.1 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO 24
2.2 RT:PCR 25
? ! 1)/".('1 29
3.1 OBSERVAÇÕES CLÍNICAS 29
3.2 GRUPO CONTROLE 29
3.3 52 DIAS 30
3.4 120 DIAS 31
3.5 SEQÜENCIAMENTO DOS PRODUTOS DO RT:PCR 33
@ (%1$)11+' 39
A $'&$/)1+' 47
! : !B&$%.1 48
5 %&"!'()*+'
O crescimento excessivo da gengiva induzido por medicamentos foi
inicialmente descrito em pacientes sob tratamento anticonvulsivo com a fenitoína.
Posteriormente, outras drogas também foram identificadas como causadoras de
crescimentos gengivais, como o imunossupressor ciclosporina e bloqueadores de
canais de cálcio. Dentre as últimas drogas, pode:se citar o diltiazem, felodipina,
nitrendipina, verapamil, amilopiridina, bepridil, bleomicina, isradipina, nicardipina,
nimodipina, nisoldipina, oxidipina. Entretanto, a nifedipina é a que induz
crescimentos gengivais com maior freqüência (MARSHALL; BARTOLD, 1999;
NEVILLE et al., 2004).
As características clínicas e histológicas dos crescimentos excessivos
da gengiva são semelhantes, independentemente do medicamento usado. As lesões
são caracterizadas por aumentos das papilas gengivais e gengiva inserida, que podem
se desenvolver a ponto de recobrir as coroas dentárias e/ou interferir na oclusão
dental (NEVILLE et al., 2004). A higienização adequada pode se tornar difícil,
ocasionando o acúmulo de irritantes que, por sua vez, agravam o quadro clínico.
Histologicamente, observam:se alongamentos epiteliais em direção
ao tecido conjuntivo. A matriz extracelular apresenta feixes espessos de fibras
colágenas dispostos irregularmente (ROMANOS et al., 1993b).
O colágeno é a principal proteína fibrosa insolúvel presente na matriz
extracelular e nos tecidos conjuntivos (LODISH et al., 2000) e por isso, tem sido o
foco de vários estudos sobre crescimento gengival. Apesar do aumento evidente da
matriz extracelular, foi constatado que há uma diminuição na síntese de colágeno
NISHIKAWA et al., 1991), ciclosporina (MARIOTTI et al., 1998) e fenitoína (KATO et
al., 2005; SALO et al., 1990). Esses dados levaram os autores a concluírem que o
acúmulo de fibras colágenas é causado por uma diminuição de sua degradação ao
invés de um aumento de sua síntese.
A degradação do colágeno pode ocorrer através de fagocitose
(KATAOKA et al., 2001) ou pela ação de enzimas extracelulares (BIRKEDAL:
HANSEN, 1993). A degradação intracelular de fibras colágenas representa um
mecanismo de controle na manutenção do tecido conjuntivo altamente seletivo e
preciso, embora seus fatores indutores não sejam ainda bem definidos. A degradação
extracelular é menos precisa e é realizada através de um grupo de enzimas
denominadas metaloproteinases de matriz (MMP). Essas enzimas são altamente
específicas e essenciais para o início da degradação do colágeno (MONTES;
JUNQUEIRA, 1991).
Zebrowski et al. (1988) compararam a produção de colagenase por
fibroblastos de gengiva humana mantidos em cultura com a adição de ciclosporina,
nifedipina e fenitoína. Os autores observaram um aumento na atividade enzimática
induzida pela nifedipina e diminuição no grupo da fenitoína. O grupo da ciclosporina
não apresentou alterações. Dentro das condições do estudo, os autores concluíram
que a colagenase não exerce um papel significativo no desenvolvimento do
crescimento gengival. No entanto, uma diminuição da expressão de genes
responsáveis pela transcrição de MMPs foi descrita com a ciclosporina (BOLZANI et
al., 2000; COTRIN et al., 2002, HYLAND et al., 2003) e fenitoína (KATO et al.,
2005).
Os mecanismos biológicos envolvidos na patogênese do crescimento
autores. Algumas dificuldades devem ser consideradas, como a possibilidade de
condições diferentes de cultura e de linhagens celulares gerarem resultados
contraditórios (JAMES et al., 1998). Além do mais, o desenvolvimento da lesão
parece ocorrer em fases (HASSEL et al., 1982; SPOLIDORIO et al., 2004), nas quais
há a participação de fatores indutores em uma cascata de eventos cronologicamente
específica para cada tipo de medicamento (UZEL et al., 2001).
Acredita:se, por outro lado, que estudos com análises em
tempos padronizados após o início da terapêutica com drogas que interfiram no
metabolismo gengival, poderão trazer novos conhecimentos.
Desta forma, o propósito do presente trabalho é analisar
histologicamente a quantidade de colágeno em crescimentos gengivais induzidos em
macacos pela ciclosporina, nifedipina ou fenitoína e correlacioná:los com a expressão
5 5 -."!%D C"!.$ /)/.!
As células são circundadas por uma rede intricada de proteínas e
polissacarídeos denominada matriz extracelular. A quantidade relativa de seus
componentes e a forma como se organizam determinam as propriedades físicas do
tecido conjuntivo, além de ter um papel importante na diferenciação e migração
seletiva de células, disponibilização de enzimas e de fatores de crescimento, através
do confinamento de moléculas secretadas pelas células (ALBERTS et al., 2002).
Os componentes da matriz extracelular podem ser divididos em três
classes: proteínas fibrilares (colágeno, elastina), glicosaminoglicanas e proteínas
multiadesivas da matriz (LODISH et al., 2000).
Há pelo menos dezesseis tipos de colágeno descritos, cada um
expresso por um gene diferente, embora cerca de 80 a 90% do colágeno encontrado
no organismo humano sejam classificados em tipos I, II e III (LODISH et al., 2000).
As diferentes distribuições, organizações espaciais e combinações dos tipos de
colágeno possibilitam uma variedade de graus de resistência à força tensiva, de
acordo com a demanda funcional de cada tecido. Os colágenos dos tipos I, II, III, V e
XV têm um arranjo em fibras, enquanto que os do tipo IV e VII têm uma disposição
semelhante à do feltro. Os colágenos dos tipos IX e XII ocorrem associados aos tipos
fibrilares e participam da organização do arranjo espacial das fibras na matriz
extracelular (ALBERTS et al., 2002).
O colágeno do tipo I é considerado a proteína mais abundante dos
tecidos conjuntivos. Suas fibrilas se arranjam em feixes paralelos com bandas que se
repetem a cada 67 nm, o que gera birrefringência e estriação quando analisadas em
Na gengiva, há uma predominância evidente de fibras colágenas na
matriz extracelular. Dentre estas, acredita:se que as constituídas pelo tipo I sejam as
mais abundantes. Essas fibras estão dispostas em feixes que apresentam uma
distribuição uniforme, ordenada e orientada de forma a permitir uma inserção firme
da gengiva ao cemento, periósteo e outras áreas gengivais, o que confere uma forte
resistência ao tracionamento (NARAYANAN et al., 1985).
O colágeno do tipo III se apresenta como uma rede delicada de
fibrilas e tem sido correlacionado com as fases iniciais do processo de regeneração
tecidual (CHAVRIER et al., 1984; MILLER et al., 2002; SCULEAN et al., 2002;
WERFULLY et al., 2002). Em tecido gengival, o colágeno do tipo III pode ser
observado principalmente próximo ao epitélio (NARAYANAN et al., 1985) na forma
de fibras delgadas (CHO et al., 1984).
Diversas técnicas de imunoistoquímica e histoquímica têm
possibilitado o estudo da distribuição e organização dos vários tipos de colágeno nos
diversos tecidos. Dentre as técnicas histoquímicas, podem ser destacadas as do
tricrômico de Masson, van Gienson, Mallory e vermelho picrosirius. A técnica de
coloração pelo vermelho picrosirius tem se apresentado como a mais adequada e
específica para o estudo de fibras colágenas, por ser simples, confiável, sensível e
barata. Através dessa técnica, grupos sulfônicos ácidos do vermelho sirius interagem
fortemente com moléculas de colágeno, que são ricas em aminoácidos básicos. Esta
reação ocasiona o aumento da birrefringência das fibras colágenas (MONTES;
JUNQUEIRA, 1991).
As fibras colágenas coradas com a técnica do vermelho picrosirius e
analisadas com o uso de microscópio de luz polarizada adquirem cores que variam do
amarela, laranja e vermelha representam o aumento gradativo da espessura das
fibras colágenas (DAYAN et al., 1989). Montes e Junqueira (1991) afirmam que a cor
verde evidencia as fibras colágenas do tipo III, as quais são mais delgadas e
fracamente birrefringentes. Já Rich e Whittaker (2005) acreditam que todas as
variações de cor são decorrentes da maturação e espessamento progressivos das
fibras colágenas do tipo I.
Sabe:se que as proteínas fibrilares ficam imersas em um gel
composto por glicosaminoglicanas. Por serem altamente hidratadas, essas
macromoléculas são as principais responsáveis pelo volume da matriz extracelular e
pela resistência às forças de compressão do tecido. As glicosaminoglicanas formam
um gel poroso que permite a difusão rápida de nutrientes, metabólitos e hormônios
entre a circulação sangüínea e as células (ALBERTS et al., 2002).
As proteínas multiadesivas da matriz têm a função principal de
mediar a adesão das células à matriz extracelular, o que regula a migração e a
morfologia celular (LODISH et al., 2000). Dentre as proteínas multiadesivas da
matriz, pode:se citar a fibronectina, uma glicoproteína que possibilita a adesão de
células aos tipos fibrilares de colágeno, o que a torna essencial para a migração e
diferenciação de muitos tipos celulares durante a embriogênese. A fibronectina
também facilita a migração de macrófagos e de outras células do sistema imunológico
durante o processo de reparo de feridas (LODISH et al., 2000). Em gengiva, forma
uma rede fibrilar espessa e amplamente distribuída (NARAYANAN et al., 1985), com
uma alta concentração na região mais coronária de papilas gengivais (CHO et al.,
1984; 1985; ROMANOS et al., 1993b). Seus feixes formam uma conexão entre fibras
colágenas e uma variedade de células, tais como fibroblastos, linfócitos, células
A exposição de sítios promigratórios dos diversos componentes da
matriz extracelular é uma etapa que precede a sua interação com a célula. Para que
esse fenômeno ocorra, é necessária a participação de enzimas que promovem a
proteólise específica de macromoléculas da matriz extracelular (NAGASE;
WOESSNER JUNIOR, 1999). Desta forma, as MMPs modulam a interação entre a
célula e a matriz extracelular. No entanto, a principal função dessas endopeptidases é
a degradação do tecido durante processos fisiológicos de remodelação ou mesmo
patológicos, como a invasão tecidual por células malignas.
Até a presente data, foram descritas 21 MMPs em humanos, divididas
em subgrupos de acordo com sua estrutura e especificidade de substrato
(REUNANEN; KÄHÄRI, 2003). Em conjunto, podem degradar todos os
componentes da matriz extracelular (BIRKEDAL:HANSEN, 1993; LODISH et al.,
2000). A regulação da atividade das MMPs pode ocorrer em quatro níveis: controle
da transcrição de seus genes através de fatores de crescimento e citocinas; ativação
dos seus precursores; especificidade do substrato; e por fim, sua inibição através de
α:macroglobulinas e inibidores teciduais (BIRKEDAL:HANSEN, 1993).
A MMP:1 pode ser encontrada em áreas em desenvolvimento, de
reparo tecidual ou de infiltração de células malignas. Em gengiva, pode ser observada
em áreas em fase de remodelação ou associadas à infiltração de células inflamatórias
(MEIKLE et al., 1994; WOOLLEY; DAVIES, 1981). A MMP:1 degrada os colágenos
dos tipos II, III, VII, VIII, X (BIRKEDAL:HANSEN, 1993; 1995; REUNANEN;
KÄHÄRI, 2003), mas principalmente o do tipo I (MILLER et al., 2002). A MMP:2
tem com substratos a fibronectina, elastina, colágeno dos tipos I, IV, V, VII, X,
A degradação do colágeno também pode ocorrer através de fagocitose
(KATAOKA et al., 2001), que é mais precisa que a proporcionada pelas MMPs. A
fagocitose representa um mecanismo altamente seletivo e preciso de controle de
manutenção do tecido conjuntivo, embora seus fatores indutores não sejam ainda
bem definidos. Em condições normais há um equilíbrio entre a síntese e a degradação
de matriz extracelular, o que mantém o volume e a integridade do tecido conjuntivo.
5 6 $! 1$%- &"' C$ 11%=' (. ; &;%=. %&()D%(' #'!
- (%$.- &"'1
O aumento do tecido gengival pode ser idiopático, hereditário ou
induzido por medicamentos. Dentre os medicamentos que induzem ao crescimento
gengival, destacam:se a fenitoína, a nifedipina e a ciclosporina.
A fenitoína tem sido usada há mais de seis décadas para o controle de
crises convulsivas, neuralgias e arritmias ventriculares. A dose terapêutica diária
varia de 300 a 600 mg, de acordo com as características individuais do caso. A
fenitoína é absorvida de forma lenta e variável no intestino e cerca de 90% se liga às
proteínas plasmáticas (MARSHALL; BARTOLD, 1999). Há indícios de que um nível
plasmático mínimo de fenitoína seja necessário para dar início aos processos
biológicos que promovem o crescimento gengival (STAPLE et al., 1977). Acima deste
nível foi descrita uma correlação positiva de dose:dependência e severidade da lesão
(ADDY et al., 1983; STAPLE et al., 1977). No entanto, esta correlação não foi
observada por Brunet et al. (2001). A concentração da fenitoína na saliva é
proporcional à dos níveis plasmáticos (MORISAKI et al., 1990; STAPLE et al., 1977).
Pacientes mais jovens parecem ser mais suscetíveis ao crescimento gengival induzido
O crescimento gengival induzido pela ciclosporina foi inicialmente
descrito por Calne et al. em 1981, e tem efeito mais severo que o induzido pela
fenitoína (SPOLIDORIO et al., 2002) e nifedipina (NISHIKAWA et al., 1996). A
ciclosporina tem sido usada como imunossupressor, em doses terapêuticas diárias
que variam de 300 a 920 mg, em pacientes portadores de órgão transplantado ou de
doenças auto:imunes. Acredita:se que esse medicamento tenha uma melhor absorção
na forma de microemulsão (Neoral), o que tornaria sua biodisponibilidade e pico de
concentração plasmática mais constantes (MARSHALL; BARTOLD, 1999).
Há evidências de que seja necessária uma concentração plasmática
mínima de ciclosporina e/ou de seus metabólitos para induzir algum crescimento
gengival. Entretanto, ainda não está bem estabelecida uma correlação entre dosagem
e severidade da lesão em concentrações maiores, já que outras variáveis relacionadas
aos pacientes e às condições locais parecem concorrer para o seu desenvolvimento.
Não há diferenças nos níveis plasmáticos de ciclosporina entre pacientes portadores
ou não de lesão gengival (MCGAW et al., 1987). No entanto, em um estudo realizado
por Daley et al. (1986), todos os pacientes que receberam doses acima de 700 mg por
dia apresentaram algum grau de crescimento gengival. Esse dado é condizente com
estudos nos quais foi observada a indução à lesão ou de seus mecanismos,
diretamente proporcionais à dose utilizada (COTRIM et al., 2002; FU et al., 1995;
MELLER et al., 2002). Por outro lado, podem ser encontrados outros trabalhos cujos
resultados não confirmam os dos autores acima (DALEY et al., 1986; WYSOCKI et al.,
1983).
Um dos metabólitos da ciclosporina, a hidroxiciclosporina, também
induz a respostas biológicas condizentes com crescimento gengival (MARIOTTI et al.,
podendo ser adsorvida na placa bacteriana, que pode assim atuar como um
reservatório (McGAW et al., 1987). Daley et al. (1986) e Nishikawa et al. (1996)
relataram que indivíduos jovens e do sexo masculino têm uma maior suscetibilidade
ao crescimento gengival induzido pela ciclosporina, dados estes que não foram
confirmados por McGaw et al. (1987) e por Redlich et al. (1997).
A nifedipina atua como bloqueadora de canais de cálcio e tem sido
prescrita para o controle de doenças cardiovasculares, principalmente a hipertensão.
Estudos experimentais demonstraram que ela induz ao crescimento gengival desde
que uma concentração plasmática mínima seja atingida (ISHIDA et al., 1995). Porém
não foi observada uma correlação de dose:dependência em relação à severidade do
crescimento gengival (MIRANDA et al., 2001; MORISAKI et al., 1993). A dose
necessária para a indução ao crescimento gengival em ratos é proporcionalmente alta
quando comparada à usada em humanos, mas próxima àquela que lhes proporciona
um efeito anti:hipertensivo (NISHIKAWA et al., 1996). O sexo masculino parece ser
mais propenso ao crescimento gengival induzido pela nifedipina (ELLIS et al., 1999;
ISHIDA et al., 1995, NISHIKAWA et al., 1996), assim como os jovens (DALEY et al.,
1986, ISHIDA et al., 1995). A presença de placa bacteriana, embora não seja
imprescindível ao crescimento gengival, aumenta sua severidade (MORISAKI et al.,
1993; THOMASON et al., 1993,).
A semelhança de características histológicas entre os crescimentos
gengivais induzidos por diversas drogas levou à pesquisa de uma base comum dos
efeitos farmacológicos da nifedipina, fenitoína e ciclosporina. Acredita:se que a
alteração no metabolismo do cálcio, comum entre os três medicamentos citados, seja
o fator desencadeante do crescimento gengival (HALLMON; ROSSMANN, 1999;
e Porter (1988) acreditam que o cálcio seja particularmente importante na promoção
da fagocitose. Por outro lado, Marshall e Bartold (1999) acreditam que eventos
moleculares diferentes podem resultar em modificações teciduais e celulares
semelhantes.
5 ? ./" !.*E 1 (. -."!%D C"!.$ /)/.!
As alterações da matriz extracelular induzidas por medicamentos têm
sido estudadas extensamente. No entanto, tais pesquisas têm gerado resultados
conflitantes, de forma que os mecanismos envolvidos ainda não são claramente
compreendidos.
A manutenção da matriz extracelular depende de um balanço entre a
síntese e a degradação de seus diversos componentes. Não há um consenso se o
crescimento gengival induzido por medicamentos é causado por um aumento na
síntese de colágeno ou de glicosaminoglicanas, ou se há uma diminuição na
degradação desses componentes.
Os eventos moleculares que levam ao crescimento gengival podem
ocorrer em diversos níveis: expressão dos genes relacionados à síntese de proteínas
da matriz extracelular ou das enzimas que as degradam; tempo de atividade dos
mRNAs que traduzem as proteínas da matriz; ou mesmo através de mecanismos
extracelulares de controle de ativação e inibição de enzimas.
Estudos mostraram uma menor quantidade de colágeno e um
aumento de proteoglicanas e glicosaminoglicanas em crescimentos gengivais
induzidos pela fenitoína (DAHLLÖF et al., 1986; HALL; SQUIER, 1982). a
KATO et al., 2005; YAMADA et al., 2000;), induz à diminuição na síntese de
colágeno do tipo I (SALO et al., 1990) e III (KATO et al., 2005), além de inibir a
endocitose de colágeno por fibroblastos de gengiva (KATO et al., 2005).
Fujii et al. (1994) observaram, , um aumento da síntese de
colágeno induzido pela nifedipina, o qual era mais evidente nas culturas de
fibroblastos provenientes de pacientes portadores de crescimento gengival.
Entretanto, esses dados não foram confirmados por McKevitt e Irwin (1995). ,
a nifedipina induziu à diminuição da expressão do gene do colágeno do tipo I, ao
mesmo tempo em que, , ocasionou uma redução da capacidade de fagocitose
dos fibroblastos (KATAOKA et al., 2001). Romanos et al (1993b) observaram um
aumento de fibras colágenas dos tipos I e III em crescimentos gengivais causados
pela nifedipina. O aumento de glicosaminoglicanas sulfatadas e de ácido hialurônico
não parece fazer parte das alterações induzidas pela nifedipina (MARTINS et al.,
2003).
O crescimento gengival induzido pela ciclosporina tem sido atribuído
ao acúmulo de fibras colágenas, mas há pesquisas que mostram ocorrer às custas de
uma maior quantidade de substância fundamental amorfa (MARIANI et al., 1993;
1996; PISANTY et al., 1988; ZEBROWSKI et al., 1994). Não há realmente um
consenso entre os pesquisadores, pois há relatos de aumento da síntese de colágeno
(SCHINCAGLIA et al., 1992), de diminuição (MARIOTTI et al., 1998) e mesmo, de
nenhuma alteração (REDLICH et al., 1997, GAGLIANO et al., 2004). Por outro lado,
James et al. (1998) observaram que pode ocorrer aumento ou diminuição na síntese
de colágeno dos tipos I e III, de acordo com as condições de cultura e de linhagens
Estudos mostraram que o mecanismo de ação principal da
ciclosporina no processo de acúmulo de componentes da matriz extracelular está
associado à diminuição na síntese de metaloproteinases (HYLAND et al., 2003;
THOMASON et al., 1998), juntamente com uma diminuição na atividade fagocitária
de fibroblastos (McGAW; PORTER, 1988). Já foram descritas diminuições na síntese
ou na expressão do gene da MMP:1 (BOLZANI et al., 2000; HYLAND et al., 2003;
THOMASON et al., 1998), MMP:2 (BOLZANI et al., 2000; COTRIM et al., 2002) e
MMP:3 (BOLZANI et al., 2000).
Apesar da semelhança morfológica dos crescimentos gengivais
induzidos pelos diferentes medicamentos, há padrões característicos de distribuição e
composição da matriz extracelular, o que se comprovou através de técnicas
imunoistoquímicas (BONNAURE:MALLET et al., 1995; ROMANOS et al., 1992;
UZEL et al., 2001).
Romanos et al. (1992) observaram que a nifedipina, a ciclosporina e a
difenilhidantoína ocasionam distribuições características de fibronectina, o que
poderia diferenciar as lesões induzidas por cada medicamento. O padrão de
distribuição de colágenos dos tipos IV, V e VI também foi peculiar a cada tipo de
droga indutora (ROMANOS et al., 1993a). Bonnaure:Mallet et al. (1995) descreveram
quantidades diferentes de vários tipos de colágeno, além de diferenças na distribuição
de fibronectina, fibras elásticas, vasos sangüíneos e fibroblastos, em crescimentos
gengivais induzidos pela ciclosporina, nifedipina e hidantoína. Os autores aventaram
a hipótese de que cada medicamento tem uma ação específica na indução do
crescimento gengival. Uzel et al. (2001) verificaram diferenças de distribuição do
que a fenitoína era a droga indutora de uma maior fibrose quando comparada com a
ciclosporina e nifedipina.
5 @ ./" !.*E 1 $ /)/.! 1
Os fibroblastos exercem um papel central no desenvolvimento do
crescimento gengival por serem as células responsáveis pela síntese e degradação das
proteínas da matriz extracelular, além da produção de fatores de crescimento.
Durante muito tempo, o crescimento gengival induzido pela fenitoína
foi denominado hiperplasia gengival dilantínica, até que estudos morfológicos
concluíssem que não há hipertrofia nem hiperplasia celular (HASSELL et al., 1978,
KATO et al., 2005; MARIANI et al., 1993; McGAW; PORTER, 1988; MORISAKI et
al., 1993). No entanto, Hassell et al. (1982) observaram um aumento inicial e
transitório no número de fibroblastos induzido pela fenitoína, após o qual, a relação
matriz extracelular/ número de células voltou ao normal.
Um aumento no número de fibroblastos também foi observado em
crescimentos gengivais induzidos pela ciclosporina (SPOLIDORIO et al., 2001) e que
estava correlacionado com um aumento e posterior diminuição dos níveis de TGFβ1
(SPOLIDORIO et al., 2005).
O fato do crescimento gengival não ser induzido em todos os
pacientes gerou a teoria de que há subpopulações de fibroblastos que respondem ou
não aos medicamentos (HASSELL et al., 1982). Segundo essa teoria, pacientes que
não desenvolvem o crescimento gengival não teriam a subpopulação responsável
pelas modificações teciduais induzidas pelos medicamentos (McGAW; PORTER,
fibroblastos provenientes de gengiva normal e de crescimentos gengivais (JAMES et
al., 1998; HYLAND et al., 2003; McKEVITT; IRWIN, 1995).
A quantidade de células inflamatórias está intimamente relacionada à
presença de fatores irritantes. A observação clínica de que o crescimento gengival
desenvolve inicialmente e/ou é mais severo em áreas de acúmulo de placa bacteriana
levou à crença de que a inflamação gengival seria essencial para o desenvolvimento
da lesão (STAPLE et al., 1978). Embora a placa bacteriana aumente sua severidade, o
crescimento gengival induzido pela ciclosporina também se desenvolve em pacientes
cujo grau de higiene parece ser adequado (DALEY et al., 1986, PILATTI; SAMPAIO,
1997; PISANTY et al., 1988) e nos quais os aspectos histológicos não mostraram
sinais de infiltração de células inflamatórias (MARIANI et al., 1993). Da mesma
forma, a placa bacteriana aumenta a severidade do crescimento gengival induzido
pela fenitoína, mas não é um requisito para seu desenvolvimento (MORISAKI et al.,
1990). A qualidade do agente irritante da gengiva, mais que a sua quantidade, parece
6 -." !%./
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O presente trabalho foi analisado e aprovado pela Comissão de Ética
na Experimentação Animal da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba –
UNESP (Protocolo 41/03 – Anexo I). Foram utilizados doze macacos:prego (
) machos, provenientes do Núcleo de Procriação de Macacos:Prego da
Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP. Os animais foram mantidos em
gaiolas individuais, alimentados com frutas, ração, legumes cozidos, iogurte, ovos e
água à vontade, com ventilação e luz naturais durante o dia e aquecimento noturno
durante o inverno.
O grupo controle foi constituído por amostras de gengiva inserida
obtidas da área de canino superior direito. Para tanto, os animais foram sedados com
éter e pesados para a posterior anestesia intraperitoneal com Thionembutal na dose
de 30 mg/kg de peso corporal. Após a anti:sepsia com solução aquosa de clorexidina
a 0,12%, a gengiva da área da biópsia foi avaliada e classificada quanto ao
sangramento de sulco gengival, segundo os critérios de MÜHLEMANN & MAZOR, e
índice gengival de LÖE & SILNESS (Anexo II). Em seguida, foi realizada uma
anestesia terminal infiltrativa com mepivacaína a 2% associada a epinefrina a
1:100.000 (DFL®). A região cirúrgica foi delimitada por incisões verticais que
abrangiam as papilas gengivais mesial e distal da gengiva vestibular até o limite
muco:gengival. A parte mesial da gengiva foi imediatamente congelada em nitrogênio
líquido, enquanto que a distal foi fixada em solução tamponada de formol a 10%. A
área operada foi protegida com cimento cirúrgico sem eugenol.
Após o período de uma semana, os animais foram divididos em três
etária seguiu os critérios de Gilmore (FREESE; OPPENHEIMER, 1981). Os animais
do primeiro grupo receberam ciclosporina na forma de xarope (Sandimmun Neoral)
na dose de 5 mg/kg de peso corporal. O segundo grupo recebeu fenitoína na dose de
7,5 mg/kg. Após o período de uma semana, tanto a dose de ciclosporina quanto da
fenitoína passaram para 15 mg/kg. O terceiro grupo recebeu nifedipina na dose de 40
mg/kg durante todo o período experimental (Anexo IX). Todos os medicamentos
foram administrados por via oral, em dose única diária.
Após 52 dias, dois animais de cada grupo foram sedados com éter e
anestesiados com cloridrato de cetamina (Cristália) na dose de 10 mg/kg para a
obtenção de amostras de gengiva inserida da área de canino superior esquerdo. O
período experimental foi concluído aos 120 dias, com a obtenção de amostras de
gengiva inserida da área de caninos superiores do lado esquerdo dos animais não
submetidos à biópsia aos 52 dias. Todos os procedimentos cirúrgicos descritos para a
biópsia inicial foram realizados aos 52 e 120 dias.
6 5 #!'$ 11.- &"' 4%1"'/F;%$'
As peças fixadas em solução tamponada de formol a 10% foram
processadas para a inclusão em parafina. Os cortes foram obtidos no sentido
transversal vestíbulo:lingual, com 6 cm de espessura e submetidos à coloração com
hematoxilina e eosina. Para análise de fibras colágenas, procedeu:se à técnica do
vermelho picrosirius (Anexo IV). A reação imunoistoquímica para evidenciação de
colágeno do tipo IV foi realizada em cortes com 3 cm de espessura (ANEXO III).
Os cortes corados pela técnica do vermelho picrosirius foram
áreas distintas de tecido conjuntivo: subjacente ao epitélio sulcular (TCS); associada
ao epitélio oral (TCO), e a terceira mais profunda, denominada de intermediária
(TCI) (Figura 2D). Imagens obtidas com um aumento de 200x foram digitalizadas
para permitir a análise da área ocupada por fibras verdes, amarelas, alaranjadas e
vermelhas, com o uso do programa QWin (Leica). Para tanto, foram delineadas
áreas de 600.000 m2. Os dados foram transformados em valores porcentuais .
6 6 !" #$!
As peças cirúrgicas congeladas foram maceradas imersas em
nitrogênio líquido para a extração de mRNA total (ANEXO V), com o uso de TRIzol
(Invitrogen Life TechnologiesTM, Carlsbad, CA, EUA). No final desta fase, realizou:se
tratamento com DNAase com o intuito de controlar uma eventual contaminação com
DNA genômico. A transcrição reversa para a obtenção de cDNA foi realizada com o
uso do kit Superscript II (Invitrogen Life TechnologiesTM, Carlsbad, CA, EUA),
conforme as instruções do fabricante, a partir de 750 ng de mRNA de cada amostra
(ANEXO VI). Para tanto, as amostras obtidas foram quantificadas em
espectrofotômetro (NanoDrop® ND:1000 UV:Vis).
Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a amplificação da
MMP:1, MMP:2, colágeno do tipo I (Col1α1) e betaglobina (Invitrogen Life
TechnologiesTM, Carlsbad, CA, EUA) foram desenhados com o auxílio dos programas
Primer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research) e ClustalW (European
Bioinformatics Institute), priorizando:se seqüências conservadas entre as espécies de
betaglobina, considerado constitutivo, foi utilizada como controle interno das reações
de forma a permitir a análise semiquantitativa.
As validações do PCR semiquantitativo para a MMP:2 e colágeno do
tipo I foram realizadas com a amplificação simultânea do gene alvo e o constitutivo
betaglobina. O oligonucleotídeo iniciador para MMP:1 mostrou:se incompatível com
a amplificação simultânea com o do gene constitutivo, motivo pelo qual foi
amplificado separadamente. O número de ciclos ideal para a amplificação de cada
gene alvo foi definido como aquele em que ocorria aumento linear de expressão
gênica (ANEXO VII). A mistura de amplificação foi composta por 500 ng de cDNA, 2
mM de MgCl2(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), 1,9 mM de dNTP
(deoxyribonucleoside 5’: triophosphates – dATP, dCTP, dGTPe dTTP – Amershan
Biosciences, Pisctaway, NJ, EUA), 2,5 l de tampão PCR 10x (10 mM de Tris:HCl pH
8, e 50 mM de KCl : Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), 1U de Taq
DNA polimerase (Invitrogen Life Technologies, Brasil) em reações duplex e 0,5 U
em reações simplex, água ultrapura qsp (Invitrogen Life TechnologiesTM, Carlsbad,
CA, EUA) para um volume final de 25 l. O controle negativo foi composto por
mistura de amplificação e água ultrapura. As características e quantidade de cada
oligonucleotídeo iniciador adicionado à solução de amplificação são mostradas na
Tabela 1.
Os ciclos de amplificação consistiram de uma fase inicial de
desnaturação (5 minutos a 94ºC), seguida por ciclos de desnaturação (45 segundos a
94ºC), anelamento (40 segundos) e extensão (40 segundos a 72ºC), seguidos por 7
minutos a 72ºC para extensão final. A temperatura de anelamento e o número de
Tabela 1: Características dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a
amplificação dos genes da MMP:1, MMP:2, Col1α1 e betaglobina.
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$9 ;< =$=!#$==##$!#$#!$$$=
130
220
3 pmol 60ºC 29
S= , A= , pb= pares de bases
Todas as reações em cadeia da polimerase (PCR) foram realizadas em
duplicata, em eventos separados, com ensaios que incluíram os grupos tratados e
controle. Os seus produtos foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida
a 8% durante três horas, sob voltagem constante de 100 volts. A evidenciação das
bandas foi realizada em solução de SYBR Green 1/10000 de tampão TBE. As imagens
dos géis foram capturadas em triplicata com o uso do programa Kodak Digital
Science 1D, que também permitiu a análise da intensidade média das bandas. O valor
referente à intensidade da banda do gene alvo foi dividido pelo do gene constitutivo.
Para a análise dos resultados, calculou:se a média dos dados obtidos.
Os produtos do PCR foram seqüenciados para confirmação da
natureza dos fragmentos amplificados. Para tanto, utilizou:se o kit Dynamic ET®
seqüências foram produzidas em equipamento MegaBace 1000 (GE: Healthcare: UK
Limited) e submetidas à análise.
Testes estatísticos não foram aplicados devido ao número reduzido
de animais em cada grupo. Os valores numéricos das médias dos grupos estão
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? 5 '<1 !=.*E 1 $/I&%$.1
O período experimental transcorreu sem complicações. A grande
maioria dos animais manteve o peso. Em alguns, houve o aumento ou a diminuição,
sem, no entanto, haver um padrão que pudesse ser atribuído ao medicamento
administrado. Não foram observadas alterações comportamentais atribuíveis à
administração dos medicamentos ou possíveis efeitos colaterais.
Clinicamente, constatou:se aumento gengival em todos os animais
subadultos, em graus variados de severidade (Figuras 1C e 2E). Não foram
observados padrões de severidade que pudessem ser correlacionados aos diferentes
medicamentos ou à presença de cálculo periodontal e placa bacteriana. Nos animais
adultos, a faixa de gengiva inserida era mais delgada quando comparada com a dos
mais jovens e as alterações induzidas pelos medicamentos não foram clinicamente
perceptíveis (Figuras 1E e 2F). As alterações em todos animais foram mais evidentes
na gengiva dos dentes anteriores.
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HEMATOXILINA E EOSINA, COLÁGENO TIPO IV
Subjacente ao tecido conjuntivo frouxo da camada papilar da lâmina
própria da gengiva, observou:se uma faixa ampla de tecido conjuntivo denso, cujos
feixes de fibras colágenas estavam dispostos em direções variáveis (TCO). A camada
mais profunda da lâmina própria (TCI) era constituída por tecido conjuntivo frouxo,
evidente nas amostras de maior volume. O tecido conjuntivo subjacente ao epitélio
sulcular (TCS) apresentava graus variáveis de infiltração inflamatória do tipo crônico,
associado a um número maior de vasos sangüíneos.
VERMELHO PICROSIRIUS, RT:PCR
A coloração pela técnica de vermelho picrosirius permitiu evidenciar
um predomínio de fibras colágenas maduras, distribuídas na forma de feixes de
diâmetros variáveis (Figuras 1B, 1F e 2D). No entanto, os feixes de fibras colágenas
eram mais espessos na camada TCO. A camada intermediária era composta por feixes
dispostos de forma mais esparsa em relação à camada TCO. Nos animais mais velhos,
essa diferença não era discernível (Figura 1F). Quando presentes, as fibras com a cor
verde eram delgadas, com predomínio nas camadas TCI e TCS.
A expressão do gene da MMP:1 mostrou variação interindividual, não
correlacionada aos índices de MÜHLEMANN & MAZOR e de LÖE & SILNESS, em
nenhum tempo experimental. Em algumas imagens digitalizadas, a banda
correspondente à expressão desse gene não foi detectada, a despeito da expressão do
gene constitutivo.
As expressões dos genes da MMP:2 e do Col1α1 foram mais
uniformes entre as amostras e, de forma semelhante ao da MMP:1, não
correlacionadas com os índices gengivais.
? ? A6 (%.1
HEMATOXILINA E EOSINA, COLÁGENO TIPO IV
Não foram observadas alterações no padrão de distribuição de fibras
concentração central de vasos mais calibrosos não era tão nítida como no grupo
controle (Figura 3B). Havia uma maior distribuição de vasos nas áreas TCO, TCI e
TCS em todos os animais.
VERMELHO PICROSIRIUS, RT:PCR
Os animais do grupo da ciclosporina e da fenitoína apresentaram
aumento de fibras verdes, que apesar de terem uma distribuição mais difusa, estavam
em maior quantidade nas áreas TCI e TCS. As fibras da camada TCI eram delgadas,
ao contrário daquelas da camada TCO. Houve predomínio de fibras amarelas e
verdes, tanto nos animais jovens quanto nos mais velhos (Figura 2B, 5A e 5B). As
alterações descritas foram acompanhadas por uma tendência à diminuição da
expressão dos genes do colágeno, MMP:1 e MMP:2 (Figura 6A).
No grupo da nifedipina, além do predomínio de fibras novas,
observou:se um aumento da densidade de fibras (Figura 2F). Paralelamente,
verificou:se uma tendência ao aumento da expressão do gene da MMP:2, enquanto
que a do Col1α1 permaneceu constante (Figura 5C).
? @ 56J (%.1
HEMATOXILINA E EOSINA, COLÁGENO TIPO IV
No grupo da fenitoína se observou uma trama de tecido conjuntivo
denso composto por fibras colágenas espessas e células com núcleo condensado.
Algumas células inflamatórias crônicas foram observadas de forma esparsa no tecido
e, em alguns espécimes, concentradas na camada TCS. A distinção entre as camadas
No grupo da cliclosporina, a distinção entre a camada TCO e TCI
também não era nítida em nenhum espécime. Células com núcleo condensado
tinham uma distribuição ampla e uniforme e em quantidade variável entre as
amostras.
A lâmina própria era composta por tecido conjuntivo denso no grupo
da nifedipina. Células com núcleo condensado eram distribuídas de forma uniforme e
em grande número. Não foi possível a distinção entre as camadas TCO e TCI.
O padrão de distribuição de vasos sanguíneos foi semelhante em
todos os grupos, sem qualquer característica peculiar que pudesse ser atribuída ao
medicamento. Pequenos vasos sanguíneos foram observados na lâmina própria,
enquanto que os de maior calibre encontravam:se principalmente na área central da
lâmina própria. Em alguns espécimes observou:se um maior número de vasos
sanguíneos na região TCS.
VERMELHO PICROSIRIUS, RT:PCR
Os cortes pertencentes ao grupo da fenitoína mostraram um
predomínio de fibras amarelas espessas, distribuídas de forma uniforme nas três
áreas analisadas. Em um espécime foi possível a distinção entre a camadas TCO e
TCI, que mantinham características de distribuição de fibras semelhantes às do grupo
controle. Os dados obtidos do RT:PCR sugeriram que ocorreu um aumento da
expressão de todos os genes analisados em relação ao período de 52 dias.
No grupo da ciclosporina observou:se um aumento da espessura das
fibras, o que tornava difícil a distinção entre as camadas TCO e TCI (Figura 1D). A
expressão dos genes do colágeno e da MMP:2 permaneceu nos mesmos níveis do
As mesmas características histológicas do grupo da ciclosporina
foram observadas nos espécimes pertencentes ao grupo da nifedipina. No entanto, os
dados obtidos da expressão do Col1α1 e da MMP:2 sugerem uma diminuição em
relação ao período anterior, e um aumento da MMP:1.
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O seqüenciamento dos produtos do RT:PCR confirmou a natureza
dos fragmentos do Col1α1, MMP:1 e MMP:2. A análise comparativa das seqüências
de mRNA de humanos e de macacos:prego, tanto da MMP:1 quanto da MMP:2,
mostrou homologia de 96%. Os oligonucleotídeos iniciadores da MMP:1 também
foram usados para amplificar DNA humano e desse macaco. Os produtos resultantes
apresentaram homologia de 99%. O mRNA do Col1α1 do macaco:prego apresentou
91% de homologia em relação à seqüência do humano. A análise de homologia das
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Figura 4. Distribuição das porcentagens das áreas ocupadas pelas diferentes cores após a coloração pelo vermelho picrosirius. Grupo tratado com Ciclosporina (A), Fenitoína (B) e Nifedipina (C).
TCO= Tecido conjuntivo associado ao epitélio oral; TCI= Tecido conjuntivo localizado na camada profunda da lâmina própria; TCS= Tecido conjuntivo associado ao epitélio sulcular
A
B
Figura 5. Efeito da Ciclosporina (A), Fenitoína (B) e Nifedipina (C) sobre a expressão do gene do colágeno do tipo 1, MMP:1 e MMP:2. Valores relativos médios de mRNA (Média+ Desvio Padrão).
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A
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Nos trabalhos descritos na literatura consultada, constata:se que há
ampla variação no percentual de prevalência do crescimento excessivo da gengiva
induzido por medicamentos. Essa prevalência varia de 13 a 81% para os casos
induzidos pela ciclosporina, enquanto que pela nifedipina e fenitoína, há uma
variação de 14,7 a 83% e 0 a 100%, respectivamente (MARSHALL; BARTOLD, 1999).
A ausência de alterações clínicas em alguns indivíduos gerou o conceito de pacientes
não suscetíveis. Segundo essa teoria, existem subpopulações de fibroblastos que
respondem de forma heterogênea às drogas que induzem crescimento excessivo da
gengiva (MCKEVITT; IRWIN, 1995; THOMASON et al., 1998). Acredita:se que
pacientes que não desenvolvem a lesão não possuem a subpopulação de fibroblastos
sensíveis aos medicamentos.
A dificuldade em se estabelecer parâmetros objetivos que orientem o
diagnóstico clínico pode ser apontada como uma das principais causas das diferenças
nos índices de prevalência do crescimento gengival induzido por medicamentos.
Associada à subjetividade do diagnóstico, as alterações morfológicas não são
evidentes quando os cortes histológicos são corados apenas com hematoxilina e
eosina (Figura 3C e 3E). No entanto, os dados obtidos com a metodologia empregada
no presente trabalho indicaram que os medicamentos estudados sempre ocasionam
modificações na matriz extracelular (Figura 3D e 3F). Provavelmente a diferença
entre pacientes suscetíveis e não suscetíveis seja apenas uma questão de graus
diferentes de intensidade em eventos moleculares que ocorrem em todos os casos. A
dose necessária para o desenvolvimento da lesão é outro fator a ser considerado. É
partir de uma certa dose do medicamento, já que Daley et al. (1986) observaram que
todos os que tomaram doses de ciclosporina acima de 700 mg por dia desenvolveram
a lesão em algum grau. Entretanto, os três medicamentos estudados nos macacos são
prescritos para os pacientes por um período muito longo, mas dificilmente mantidos
em doses altas.
A idade é um outro fator modificante de importância a ser
considerado (ADDY et al, 1983; DALEY et al., 1986; ISHIDA et al, 1995; NISHIKAWA
et al., 1996). Tal assertiva foi comprovada, uma vez que os macacos adultos não
apresentaram evidências clínicas de crescimento gengival, a despeito das alterações
dos aspectos histológicos evidenciados pelo vermelho picrosirius (Figura 2A e 2B).
A técnica de coloração pelo vermelho picrosirius tem sido sugerida
para o estudo de alterações temporais da organização de fibras colágenas. Sabe:se
que sua espessura aumenta com o tempo, a demanda funcional e a idade (RICH;
WHITTAKER, 2005). Esse aumento na espessura das fibras determina uma variação
do verde para o amarelo, alaranjado e vermelho quando coradas com vermelho
picrosirius e analisadas em microscópio de luz polarizada (DAYAN et al., 1989;
MONTES; JUNQUEIRA, 1991; RICH; WHITTAKER, 2005). Não há um consenso,
entretanto, se a cor verde representa formas imaturas de colágeno do tipo I ou fibras
de colágeno do tipo III. Alguns autores consideram o tipo III como uma forma
imatura de colágeno e correlacionam sua presença a uma maior capacidade de
remodelação tecidual. (CHAVRIER et al., 1984; MILLER et al., 2002; SCULEAN et
al. 2002; WERFULLY et al. 2002). Desta forma, independente da natureza do
colágeno evidenciado com a cor verde, parece ser lícito associá:lo a áreas de reparo
A análise dos resultados obtidos evidenciou um aumento de fibras
colágenas imaturas, induzido por todos os medicamentos estudados, à semelhança
dos dados obtidos por Dayan et al. (1993) em crescimento gengival associado à
ingestão de oxidipina. No entanto, as modificações teciduais não ocorreram de forma
uniforme na gengiva dos macacos. A região central do tecido conjuntivo parece ser o
principal foco das alterações, já que foi a que apresentou percentagens maiores de
área ocupada por fibras evidenciadas com a cor verde pelo vermelho picrosirius aos
52 e 120 dias, com exceção, entretanto, do grupo da nifedipina (Figura 4). Em
condições de normalidade, essa região foi descrita como sendo uma área de maior
concentração de metaloproteinases (MEIKLE et al., 1994) e de monócitos em
processos de maturação e diferenciação (NURMENNIEMI et al., 2002). Uzel et al.
(2001) descreveram distribuições diferentes de marcação imunoistoquímica para o
TGF:β, células endoteliais e fator de crescimento de tecido conjuntivo, em amostras
de gengiva com crescimentos excessivos induzidos por ciclosporina, nifedipina e
fenitoína. Os autores observaram uma marcação mais forte para TGF:β, considerado
um iniciador do processo de reparo tecidual, na área central das amostras dos grupos
da nifedipina e fenitoína.
Embora as áreas próximas ao epitélio também tenham sido descritas
como sendo sedes de reparo tecidual, quer seja pela maior concentração de colágeno
do tipo III (CHAVRIER et al., 1984; CHO et al., 1984; NARAYANAN et al., 1985), de
metaloproteinases (MEIKLE et al., 1994; WOOLEY; DAVIES, 1981,) ou de células de
reparo (NARES et al., 1996; NURMENNIEMI et al., 2002; PERNU; KNUUTTILA,
2001; PLEMONS et al., 1996), não foram observadas características morfológicas
Romanos et al. (1993a) observaram que a nifedipina, ciclosporina e a
difenilidantoína ocasionam distribuições características de colágeno dos tipos IV, V e
VI. O colágeno do tipo IV é encontrado nas membranas basal e endotelial e pode
servir como um indicador da proliferação epitelial e vascular. Apesar das mudanças
na distribuição de vasos sangüíneos e da hiperplasia epitelial observadas no presente
experimento, não foi possível detectar padrões característicos a cada medicamento
através da metodologia empregada.
Não há um consenso se o crescimento gengival induzido por
medicamentos ocorre às custas do aumento de fibras colágenas ou de
glicosaminoglicanas. Esse aumento pode ocorrer tanto às custas de síntese
aumentada ou pela diminuição de sua degradação. É interessante observar que
também tem sido descrita a diminuição na expressão dos genes de várias enzimas da
família das metaloproteinases. Considerando que as metaloproteinases, em conjunto,
podem degradar todos os componentes da matriz extracelular (BIRKEDAL:
HANSEN, 1993; LODISH et al., 2000), pode:se inferir que o metabolismo não só das
fibras colágenas e das glicosaminoglicanas pode sofrer alterações em crescimentos
gengivais induzidos por medicamentos, mas também todos os substratos de outras
metaloproteinases.
O fibroblasto tem sido o principal foco de estudos sobre crescimento
excessivo de gengiva induzido por medicamentos, principalmente através de
pesquisas com cultura de células. No entanto, já foi demonstrado que a fenitoína
(IACOPINO et al., 1997), a nifedipina (PERNU, KNUUTTILA, 2001) e a ciclosporina
(NARES et al., 1996; PLEMONS et al., 1996; NURMENNIEMI et al., 2002) também
induzem a modificações nas respostas biológicas de macrófagos. Essas células têm
tecidual (NURMENNIEMI et al., 2002). Estes dados indicam que os mecanismos de
indução ao crescimento gengival são complexos, envolvem interações de vários
fatores de crescimento e citocinas, os quais modulam eventos biológicos de diferentes
tipos celulares. A conseqüente reação em cascata cria um microambiente favorável às
modificações características do crescimento gengival. Desta forma, padrões de
expressão genética observados podem diferir substancialmente daqueles
observados Além do mais, há relatos de heterogeneidade na resposta
aos medicamentos sob as mesmas condições de estudo (JAMES et al., 1998; TIPTON;
DABBOUS, 1986). Metaloproteinases expressas por muitas células em cultura podem
ter uma expressão limitada (BIRKEDAL:HANSEN, 1995). A alteração da
produção de enzimas pode ser um reflexo da exposição das células a um novo
ambiente, indução a uma forma de reparo após a colocação das células em cultura ou
perda de componentes tissulares normais (WOOLLEY & DAVIES, 1981). Talvez esses
dados expliquem os resultados obtidos por Yamada et al. (2000), que não
observaram uma menor marcação imunoistoquímica para MMP:1 em amostras de
gengiva com crescimentos excessivos induzidos pela fenitoína, embora constatassem
uma diminuição da expressão dessa enzima. Por outro lado, outros fatores
modificantes da expressão genética das MMPs devem ser considerados nos trabalhos
, como a presença de inflamação em diferentes graus.
A MMP:1 tem sido correlacionada à destruição tecidual causada pela
doença periodontal (GAGLIANO et al., 2004; KUBOTA et al., 1996). O controle de
placa bacteriana não foi realizado devido às dificuldades impostas pelo manejo do
modelo experimental. Para eliminar a interferência da inflamação e variações
individuais na resposta aos fatores irritantes, optou:se por um estudo longitudinal,
condições, não foi observada uma correlação entre os parâmetros clínicos de
avaliação do grau de inflamação gengival e a expressão da MMP:1 e da MMP:2.
Gagliano et al. (2004) atribuíram a variação interindividual nos
níveis das metaloproteinases à diversidade de fenótipos entre subgrupos de
fibroblastos. Hyland et al. (2003) sugerem que as diferenças fenotípicas entre as
diversas subpopulações de fibroblastos podem ser atribuídas ao polimorfismo da
região promotora do gene que expressa a MMP:1. Segundo esses últimos autores, a
ciclosporina poderia estimular a proliferação seletiva de fibroblastos que produzem
uma menor quantidade de MMP:1, resultando em uma população fenotipicamente
diferente daquela de gengiva normal. Da mesma forma, a nifedipina também parece
selecionar uma subpopulação de fibroblastos (MCKEVITT; IRWIN, 1995). Esses
dados estão de acordo com os obtidos por Thomason et al. (1998), que observaram
uma maior quantidade de fibroblastos não positivos para a MMP:1 em crescimentos
gengivais em relação ao grupo controle, através de técnicas imunoistoquímicas.
Os dados ora obtidos indicam que a idade também deve ser
considerada um fator modificante, já que animais mais velhos apresentaram uma
menor expressão do gene da MMP:1. Os genes das metaloproteinases são pouco
expressos em tecidos normais de indivíduos adultos, embora seus níveis possam
aumentar durante o reparo tecidual, inflamação, invasão tumoral e metástases
(BIRKEDAL:HANSEN, 1995).
Uma grande variabilidade na expressão do gene da MMP:1 foi
observada entre as amostras deste experimento. Os valores obtidos aos 52 dias
sugerem que ocorreu uma diminuição da expressão do gene da MMP:1 em todos os
grupos, enquanto que aos 120 dias, um aumento desses valores. Esse aumento
observou histologicamente. Se a expressão do gene da MMP:1 realmente estiver
correlacionada com o reparo de tecidos periodontais, conforme afirmaram Romanelli
et al. (1999), pode:se inferir que o desenvolvimento do crescimento gengival induzido
por medicamentos deve envolver mecanismos semelhantes aos de remodelação ou
reparo tecidual.
As expressões dos genes da MMP:2 e do colágeno do tipo I não
mostraram um padrão de expressão uniforme entre os medicamentos estudados
(Figura 5). No entanto, os dados obtidos no grupo da fenitoína sugerem um aumento
diferenciado em torno de 36% aos 120 dias em relação ao período anterior.
Histologicamente, a fenitoína foi o medicamento que induziu uma maior fibrose.
Esses dados são condizentes com os obtidos por Uzel et al. (2001), que atribuíram
este fato à maior concentração do Fator de Crescimento de Tecido Conjuntivo no
grupo da fenitoína, quando comparada com a ciclosporina e nifedipina
Cabe ressaltar que apenas uma diminuição na degradação das fibras
colágenas do tipo I, ocasionada pela diminuição da expressão das MMPs, não seria
suficiente para ocasionar o crescimento gengival observado. Para tanto, seria
necessário que a expressão do colágeno se mantivesse em níveis próximos aos
normais ou mesmo, em níveis mais altos.
Não foi possível estabelecer uma correlação entre os níveis de
expressão dos genes da MMP:2 e do colágeno e as modificações observadas
histologicamente. É provável que o quadro histológico seja o resultado de um padrão
de expressão genética que ocorreu na gengiva em uma fase anterior. De qualquer
forma, a alteração na expressão dos genes analisados através dos níveis de mRNA,
expressão do gene até a presença da proteína no meio extracelular, há vários
mecanismos controladores que definem o resultado final.
Os padrões de expressão dos genes ora observados indicam que o
crescimento gengival induzido por medicamentos apresenta fases diferentes e
parecem justificar os dados contraditórios encontrados na literatura. Dessa forma é
possível obter como resultado um aumento ou diminuição da expressão dos genes da
MMP:1, MMP:2 ou do colágeno do tipo I, de acordo com a fase de desenvolvimento
da lesão. Essas modificações fásicas da expressão genética seriam resultantes da
expressão transitória de fatores de crescimento, em uma cascata de eventos
cronologicamente característica para cada medicamento (UZEL et al., 2001).
Similarmente, os aspectos histológicos modificam em função do estágio do
desenvolvimento da lesão, havendo inclusive, relatos de proliferação transitória de
fibroblastos (HASSEL et al., 1982; SPOLIDORIO et al., 2004). Em longo prazo, há
uma tendência de retorno aos valores normais, mesmo com a manutenção dos
medicamentos (SPOLIDORIO et al., 2004). Neste experimento uma tendência à
normalidade não pôde ser comprovada, entretanto, através das análises histológica e
do RT:PCR. Talvez um período maior de experimentação fosse necessário para
