Adriana Demathé
Detecção de papilomavírus
humano (HPV) em material
biológico de pacientes com
carcinoma epidermóide de
orofaringe
Adriana Demathé
Detecção de papilomavírus
humano (HPV) em material
biológico de pacientes com
carcinoma epidermóide de
orofaringe
Tese apresentada a Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba – UNESP, para a obtenção
do Grau de “Doutor em Odontologia”, Área de
concentração: Estomatologia
Orientador: Prof. Dr. Glauco Issamu Miyahara Co-orientadores: Prof. Dr. José Fernando Garcia Profa. Dra. Styna Marita Syrjänen
Catalogação na Publicação (CIP)
Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação – FOA / UNESP
Demathé, Adriana.
D372c Detecção de papilomavírus humano (HPV) em material biológico de pacientes com carcinoma epidermóide de orofaringe/Adriana Demathe. Araçatuba : [s.n.], 2011.
77 f. : il.
Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia, Araçatuba, 2011
Orientador: Prof. Dr. Glauco Issamu Miyahara Coorientador: Prof. Dr. José Fernando Garcia Coorientadora: Profa. Dra. Styna Marita Syrjänen
1. Carcinoma de células escamosas 2. Papillomaviridae 3. Reação em cadeia da polimerase
Black D65
Dados Curriculares
Nascimento: 19.10.1969
Curitiba
–
PR
Filiação
:
Valdir Demathé e Helenir Demathé
1992/1996 : Graduação em Odontologia
–
Universidade Estadual de
Maringá
–
UEM
2000/2001 : Curso de Pós-Graduação em Saúde Pública, nível
de Especialização
–
Faculdade de Saúde Pública
da Universidade de São Paulo
–
USP
2006/2007 : Curso de Pós-Graduação em Odontologia, Área
de Estomatologia, nível de Mestrado, na Faculdade
de Odontologia do Campus de Araçatuba
–
UNESP
2008/2011 : Curso de Pós-Graduação em Odontologia, Área
de Estomatologia, nível de Doutorado, na Faculdade
Dedicatória
Aos meus familiares: minha querida irmã
Veridiana,
minha sobrinha
Letícia,
minha avó
Ana
, minha prima
Carla
e meus tios
Almir
e
Diva
agradeço pelo carinho, pelas palavras amigas e pelo auxílio que me
prestaram durante esta jornada.
À minha grande amiga
Maria de Lurdes Braun
obrigada pela
convivência, carinho e pela paciência que teve comigo.
Agradecimentos Especiais
Ao meu orientador,
Prof. Dr. Glauco Issamu Miyahara
, pela sua
paciência, constante incentivo e por não ter me deixado desistir
durante o tortuoso caminho que encontrei neste período.
Ao meu co-orientador,
Prof. Dr. José Fernando Garcia
, meu
obrigada, pelas oportunidades de aprendizado e por incentivar sempre
meu espírito investigativo.
À minha co-orientadora,
Profa. Dra. Styna Marita Syrjänen
, seus
trabalhos foram uma fonte de inspiração, muito obrigada pelo contato
e orientações nesta pesquisa.
À
Profa. Dra. Cáris Maroni Nunes
por seu auxílio em momentos de
dificuldades, meus sinceros agradecimentos.
Ao
Prof. Dr. Éder Ricardo Biasoli
por ter sempre uma palavra amiga.
À minha grande amiga
Eloisa Gregori
por partilhar comigo as
Agradecimentos
À Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP, no nome da atual
Diretora
Profª. Adj. Ana Maria Pires Soubhia
e do Vice-Diretor
Prof. Adj.
Wilson Roberto Poi.
Ao
Programa de pós-graduação em Odontologia da Faculdade de
Odontologia de Araçatuba
–
UNESP
, na pessoa da coordenadora
Profa.
Ass. Dr. Maria José Hitomi Nagata.
Aos
docentes do Departamento de Patologia e Propedêutica Clinica
da
Faculdade de Odontologia de Araçatuba
–
UNESP, Prof. Dr. Alvimar Lima
de Castro, Prof.ª Dr.ª Ana Maria Pires Soubhia, Prof. Dr. Eder Ricardo
Biasoli, Prof. Dr. Norberto Perri Moraes Prof.ª Dr.ª Ana Claudia Okamoto,
Prof. Dr. Elerson Gaetti Jardim Júnior, Prof. Dr. Gilberto Aparecido Coclete,
Prof.ª Dr.ª Leda Maria Pescinini Salzedas, Prof. Dr. Marcelo Macedo
Crivelini e Prof.ª Dr.ª Renata Callestini Felipini, meus agradecimentos pela
acolhida.
Às
funcionárias do Centro de Oncologia Bucal
(Unidade Auxiliar) da
Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba
–
UNESP, Jane
Fátima Mendes Fernandes da Silva e Nair Ramos Macedo Cardoso pelo
auxílio fundamental nos momentos necessários.
Aos
funcionários do Departamento de Patologia e Propedêutica
Clínica
Francischini e José Marcelo Tramarin pelo carinho e dedicação que sempre
tratam os alunos.
Aos
amigos do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular Animal
(LBBMA)
da Faculdade de Odontologia e Curso de Medicina Veterinária de
Araçatuba
–
UNESP, Érica de Souza Ribeiro, Valquiria Rissato Gazola,
Pedro Luis Florindo, Fulvia di Pillo, Adriana Santana do Carmo, Silvana de
Cássia Paulan, Fernanda Muller de Oliveira e Danielly Vieira Bortoletto,
pelos momentos de convivência e pelo auxílio técnico.
Ao
Instituto de Patologia de Araçatuba
, por cederem as amostras
necessárias para o estudo.
Ao amigo
Daniel Bernabé
pelos momentos compartilhados e troca de
conhecimentos durante esta jornada, obrigada.
A
Profa. Dra. Maria Lúcia Marçal Mazza Sundefeld
muito obrigada pela
atenção e cuidado com que realizou a análise estatística desse trabalho.
Aos
funcionários da Seção de pós-graduação
da Faculdade de
Odontologia de Araçatuba
–
UNESP, Valeria de Queiroz Marcondes
Zagatto e Diogo Luis Reatto, pela presteza com que sempre me
atenderam.
Aos
colegas pós-graduandos da estomatologia
, muito obrigada pelo
convívio e pela troca de experiências.
À Fundação de Auxílio à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP
(Processo N° 2010 / 00026-1) agradecimentos pelo auxílio financeiro.
Demathé A. Detecção de papilomavírus humano (HPV) em material biológico de pacientes com carcinoma epidermóide de orofaringe. [tese]. Araçatuba: Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual Paulista; 2011.
Resumo
O papilomavirus humano (HPV) tem sido relacionado com a etiologia dos carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço, em análise de tecidos cerca de 60% destes carcinomas podem ser HPV positivos. O objetivo deste trabalho foi analisar a presença do HPV em material genético obtidos de tecidos, secreção salivar e sangue de pacientes portadores de carcinoma epidermóide (CEC) de orofaringe e controles e a correlação da presença viral com as váriáveis sexo, idade, tabagismo, etilismo e perfil anatomopatologico do tumor. Foi realizada uma análise do material genético de 46 pacientes com diagnóstico de CEC de orofaringe e 40 pacientes sem carcinoma. A extração do DNA dos espécimes foi realizada utilizando o kit de extração de DNA QuiAMP. O DNA isolado foi submetido a PCR para beta-globina para confirmar a presença e integridade do DNA, em seguida, foram realizadas novas reações para detecção do DNA do HPV. Para análise estatística foram empregados o teste Qui-quadrado e teste exato de Fisher. A idade média de idade foi de 60 anos para os casos e 58,2 anos para os controles e a mediana foi de 59 e 56 anos, respectivamente. Os resultados obtidos com a metodologia descrita permitiram concluir que não houve diferenças estatisticamente significativas na análise das variáveis em relação à presença do papilomavírus humano nas amostras de tecidos biológicos dos pacientes estudados.
Demathé A. Human papillomavirus (HPV) detection in biological tissues of patiens with oropharyngeal squamous cell carcinoma [thesis]. Araçatuba: UNESP
– São Paulo State University; 2011.
Abstract
Human papillomavirus (HPV) it has been related with head and neck SCC etiology, about 60% of these carcinomas tissues can be HPV positive. The aim of this study was to analyze the HPV presence in genetic material obtained from tissues, salivary secretion and blood of oropharyngeal SCC patients and controls and correlate the virus presence with variables: sex, age, smoking, alcoholism and pathological profile of the tumours.It was made molecular and statistical analysis of genetic material of 46 oral and oropharyngeal SCC patients and 40 controls patients without carcinoma. The DNA extraction of all specimens was accomplished using the DNA extraction kit QuiAMP. The isolated DNA was submitted PCR for beta-globin to confirm the DNA presence and integrity, after new reactions it was accomplished for HPV DNA detection. Chi-square test and Fisher exact test were used for statistical analysis. The average age was 60 years for cases and 58.2 years for controls and the median age was 59 and 56 years respectively. The results obtained with the described methodology shows there was no statistically significant differences between HPV presence in samples of biological tissues and the analyzed variables.
Epígrafes
“É melhor tentar e falhar,
que preocupar-se e ver a vida passar,
É melhor tentar, ainda que em vão,
que sentar-se fazendo nada até o final.
Eu prefiro na chuva caminhar,
que em dias tristes em casa me esconder.
Prefiro ser feliz, embora louco,
que em conformidade viver...”
Martin Luther King
“Se pude enxergar mais longe foi
porque estava
nos ombros de gigantes...”
Lista de Abreviaturas
HPV
- do inglês Human Papillomavirus
DNA
- do inglês Deoxyribonucleic Acid
PCR
- do inglês Polymerase Chain Reaction
nPCR
- do inglês nested Polymerase Chain Reaction
HeLa
- linhagem de células de carcinoma cervical uterino com até 4
cópias de HPV-18 por célula
CP -
Controle Positivo
NO -
Amostra contendo mistura de componentes e ausência de DNA
PM -
Peso Molecular
INCA -
Instituto Nacional do Câncer
IARC -
do inglês
International Agency for Research on Cancer
COB
- Centro de Oncologia Bucal
FOA-UNESP
- Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba
–
UNESP
dNTP
- do inglês Deoxyribonucleotide Triphosphate
pb
- pares de base
CDC
- do inglês Center of Disease Control
TNM -
Sistema de Classificação de tumores malignos
Sumário
1 Introdução
18
2 Proposição
22
3 Material e Método
24
4 Resultados
36
5 Discussão
43
6 Conclusões
51
Referências
54
Normas do Periódico Journal American Dental Association - JADA
,1752'8 2
Nos últimos 15 anos o papilomavírus humano (HPV) foi a principal causa do câncer de colo de útero e sua etiologia atualmente tem sido relacionada com carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço,1 em especial os carcinomas de orofaringe.2
O papilomavirus humano é um vírus circular, não envelopado, com aproximadamente 7,9 kD que infecta células escamosas do epitélio. O HPV infecta a camada basal do epitélio através de rupturas na superfície epitelial se mantendo no núcleo das células basais. As infecções por HPV frequentemente se apresentam clinicamente como verrugas ou papilomas. Cerca de 120 subtipos de
HPV já foram identificados e eles se dividem em HPV’s de alto e baixo risco de
acordo com sua propensão a causar neoplasias. Os HPV’s de baixo risco estão
associados a verrugas benignas enquanto que os subtipos de alto risco estão associados com displasia e carcinomas invasivos. 3 Na cavidade oral os subtipos de baixo risco mais comuns são os HPV’s 11, 36 e 42 enquanto que os subtipos
de alto risco mais comuns são o HPV 16, 18 e 31.4
Cerca de 90% das infecções pelo HPV’s associados aos carcinomas
epidermóides de cabeça e pescoço são causadas pelo HPV16. 1 O HPV, principalmente os tipos 16 e 18, tem um papel direto na carcinogênese codificando oncoproteínas, as quais são capazes de promover a transformação celular por alterar a regulação do ciclo celular, o sistema telomero/telomerase, a apoptose e outros sinalizadores celulares .2
A detecção de anticorpos para as proteínas L1, E6 e E7 do HPV realizada em um estudo caso-controle com 1670 pacientes portadores de carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço e 1732 controles demonstrou que a presença destes anticorpos estava associada a um risco três vezes maior para carcinomas orais e nove vezes maiores para carcinomas de orofaringe.5
maior prevalência de HPV positivo foi em carcinomas epidermóides de orofaringe (35.6%), seguida pela laringe (24%) e orais (23.5%).1
O DNA do HPV tem sido isolado em materiais biológicos como tecidos parafinados e células exfoliadas da mucosa oral, estas obtidas através de bochechos ou esfregaços .6
Em estudo de lesões orais potencialmente malignas e lesões malignas, demonstrou-se que na comparação de detecção do DNA do HPV, este é mais facilmente detectável pela análise de células exfoliadas do que pela análise de espécimes de biópsia, com sensibilidade de 50% e especificidade de 100%, através de Southern Blot.7
Testes salivares em pacientes que no pós tratamento se apresentam ainda positivos para HPV podem ser bons marcadores de recorrência do tumor.4 O papilomavirus humano também tem sido detectado no soro e plasma de pacientes com carcinoma cervical HPV positivos, com taxas que variam de 7 a 48% 8 e também em soro de pacientes HIV/HPV positivos.9 Na região de cabeça e pescoço o HPV foi detectado em 45,6% dos pacientes portadores de carcinoma através da análise de secreção salivar.10
Dados de recentes estudos moleculares e epidemiológicos sugerem fortemente que carcinomas de orofaringe HPV positivos apresentam padrões clínicos, epidemiológicos, patológicos e moleculares distintos provavelmente associados à infecção pelo HPV e que apresentam um melhor prognóstico em relação aos pacientes HPV negativos. 11,12
Recente revisão sistemática sobre a presença do HPV mostrou uma prevalência de 38,1% em carcinomas orais e 24,1% em carcinomas de cabeça e pescoço. Com relação ao método de detecção os estudos baseados em PCR relatam uma taxa de prevalência maior (34,8% versus 32,9%) em relação à hibridização in situ.13 Pacientes HPV positivos com tumores tem melhores taxas de respostas após à quimioterapia (84% versus 57%) comparados aos pacientes HPV negativos. Um seguimento de 39,1 meses em pacientes HPV positivos que tiveram câncer mostrou um acréscimo de 33% na sobrevida.14
distinta e que diferenças no manejo clínico de tumores HPV positivos e negativos representam o melhor argumento para se incrementar o uso da detecção destes vírus.
Há também outras indicações clínicas para este screening:
(1) definir melhor o prognóstico do paciente; (2) otimizar a seleção do tratamento;
(3) educação do paciente.5
352326, 2
O objetivo deste trabalho foi:
0
0DWHULDO
3 MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba – Universidade
Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” (FOA-UNESP), (Processo SISNEP
Número: FOA 2008/00869) (Anexo A).
Este estudo baseou-se numa análise prospectiva de 46 pacientes
com diagnóstico de carcinoma epidermóide de orofaringe diagnosticados no
Centro de Oncologia Bucal (Unidade Auxiliar) da Faculdade de Odontologia do
Campus de Araçatuba – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
– UNESP e 40 pacientes sem carcinoma, que se enquadraram nos critérios de
seleção do estudo, no período de março de 2007 a fevereiro de 2011.
Critérios de seleção:
Os critérios para a inclusão dos pacientes com carcinoma
epidermóide de orofaringe foram:
1. Pacientes portadores de carcinoma epidermoide de orofaringe com registro no
Centro de Oncologia Bucal (Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba
– UNESP) e confirmação diagnóstica através de exame histológico;
2. Pacientes tratados com finalidade curativa.
Os critérios para inclusão dos controles foram:
1. Pacientes que necessitavam de procedimento cirúrgico oral (cunha distal ou
cirurgia pré-protética);
3. Pacientes que possuiam os mesmos fatores de risco para o carcinoma (etilismo
e tabagismo) e pacientes sem nenhum destes vícios.
4. Pacientes com mais de 40 anos de idade.
5. Pacientes sem histórico de carcinoma de cabeça e pescoço.
Coleta de dados:
Através de formulário próprio foram coletadas informações
existentes nos prontuários dos pacientes. Os dados utilizados para avaliação das
possíveis associações entre as variáveis foram obtidos dos prontuários e
transcritos para uma ficha clínica individual (Anexo B).
Foram considerados tabagistas os indivíduos que fumaram
diariamente durante alguma época da vida, mesmo aqueles que abandonaram o
vício. Os não-tabagistas foram aqueles que não fizeram uso do fumo diariamente.
Foram considerados etilistas aqueles que consumiam no mínimo um drink por dia
e não etilistas os que não utilizavam álcool diariamente. 15
Foi realizada a classificação TNM e o grupamento por estádios de
acordo com as recomendações preconizadas pela União Internacional Contra o
Câncer (Anexo C).16 O diagnóstico histopatológico das peças cirúrgicas foi
revisado por um único patologista, utilizando para a graduação histológica a
Coleta de materiais biológicos:
Depois de selecionados os pacientes portadores de carcinoma de
boca e orofaringe que preenchiam os critérios de elegibilidade foram coletados
materiais biológicos para realização dos procedimentos laboratoriais.
Para os pacientes com suspeita de carcinoma:
1. Foram solicitados exames pré-operatórios considerados necessários para cada
caso. Na coleta de sangue foi separado 1 ml para sorologia do HPV.
2. Foram realizadas biópsias ou exéreses de lesões e o material obtido foi
dividido em duas partes, uma parte seguiu para processamento histopatológico de
rotina e outra parte foi congelada para posterior exame biomolecular de detecção
do HPV. Não houve necessidade de se aumentar a amplitude do procedimento
cirúrgico visto que somente 25 miligramas de material são suficientes para
detecção do DNA. A remoção do fragmento bucal para análise molecular foi
realizada de forma a não interferir na análise microscópica das margens
cirúrgicas.
3. Foram realizados swabs da lesão, nos pacientes com carcinoma de orofaringe
e swabs da região de orofaringe, bilateralmente, nos pacientes controle para
comparações com a sorologia e material obtido de peças operatórias .
Certificou-se anteriormente que a pessoa submetida à coleta da amostra que o paciente
estava em jejum há pelo menos 30 minutos. Procedeu-se à coleta das amostras
esfregando-se o swab firmemente contra cada mucosa 6 vezes. O swab foi
conservado em um tubo ependorf de 2 ml contendo 300 microlitros de PBS.
Solicitou-se que o paciente eliminasse saliva em um copo descartável durante um
materiais (swab e saliva) foram misturados em laboratório para compor a
secreção salivar que então foi analisada molecularmente.
Para os pacientes do grupo controle:
1. Foram selecionados 40 pacientes sem carcinoma que necessitavam de
cirurgias orais por outras causas (ver observação).
2. Foram solicitados exames pré-operatórios considerados necessários para
cada caso. Na coleta de sangue foi separado 1 ml para sorologia do HPV.
3. Foram realizados swabs da região de orofaringe para comparações com o
material obtido da cirurgia. Solicitou-se que o paciente eliminasse saliva em um
copo descartável durante um minuto e o material obtido foi conservado em tubos
eppendorf de 2 ml. Estes dois materiais (swab e saliva) foram misturados em
laboratório para compor a secreção salivar que então foi analisada
molecularmente.
Observação: os procedimentos cirúrgicos (cunha distal ou cirurgia pré-protética) foram realizados independentemente da pesquisa, pois se configuram como
tratamento.
Extração de DNA de tecido parafinado
Foram coletados de seis a dez cortes histológicos com 08
micrômetros das peças parafinadas até obter 25 mg de material, procedendo-se a
descontaminação do micrótomo com xilol e troca de luvas e lâminas entre cada
exemplar. Após a coleta, os cortes foram identificados, acondicionados em tubos
de polipropileno esterilizados de 1,5 ml e mantidos em temperatura ambiente até
o momento da extração.
Para a realização da extração do DNA, foram seguidos três passos:
desparafinização, digestão e purificação.
A desparafinização foi realizada pela dissolução da parafina em xilol
e etanol, revertendo a embebição e desidratação dos tecidos processados. Aos
tubos foram adicionados 1200 Pl de xilol (Synth®) e agitados por 15 segundos em
vortex (Thermoline® – EUA). Em seguida os tubos foram centrifugados
(Centrifuge 5417C – Eppendorf®– Alemanha) a 14.000 rotações por minuto (rpm)
durante cinco minutos. O sobrenadante foi descartado e sobre o sedimento foram
adicionados 1200 Pl de álcool etílico absoluto (Synth®) no tubo. Os tubos foram
agitados em vórtex por 15 segundos e centrifugados a 14.000 rpm durante 5
minutos com posterior descarte do sobrenadante. Este ciclo (xilol-etanol) foi
repetido novamente e ao final do processo as tampas foram abertas e os tubos
colocados em um bloco térmico (Dri-block DB3 – Techne® - Inglaterra) a 37ºC por
15 minutos para evaporação do etanol remanescente.
A digestão dos tecidos foi feita adicionando-se ao tubo 20 Pl de
solução contendo proteinase K (20mg/ml) e 180 Pl de ATL (tissue lysis buffer) do
agitando-se no vortex por 1 minuto e mantendo-se o material em banho-maria
(Modelo 146 – FANEM – São Paulo – Brasil) por 3 horas, a 56°C.
Para o isolamento dos ácidos nucléicos foi utilizado o sistema de
extração de DNA QIAamp DNA Mini Kit®, segundo as instruções do fabricante e
o DNA extraído (100 μl) foi transferido para tubos de polipropileno com tampa
rosqueável, identificado e conservado a – 20º C. Após esta etapa, a quantidade e
pureza do DNA genômico foram determinadas através da espectrofotometria
(NanoDrop® ND-1000 UV-Vis).
Com a confirmação da presença e integridade do DNA, foram
realizadas as PCRs com os oligonucleotídeos iniciadores para o gene controle da
β-globina. Em caso de ausência do gene da β-globina foi realizada nova extração
de DNA pelo método do fenol-clorofórmio.
Extração de DNA de sangue
Foram colocados 200 Pl de cada amostra de sangue dentro de um
tubo eppendorf de 1,5 ml identificados, foram adicionados 20 Pl de proteinase K
às amostras e os tubos foram agitados em vórtex por 30 segundos. Adicionou-se
200 Pl de buffer AL e agitaram-se os tubos em vórtex por 15 segundos,
levando-os em seguida ao banho-maria a 56º C por 10 minutlevando-os. Após a incubação o
material foi retirado do banho-maria e os tubos foram colocados na centrífuga a
8000 rpm, por 10 segundos, para retirar as bolhas.
Adicionou-se 200 Pl de etanol 100% aos tubos e agitaram-se os
tubos em vórtex por 15 segundos. Em seguida os tubos foram colocados na
centrífuga a 8000 rpm por 10 segundos, seu conteúdo foi transferido para a
rpm por 1 minuto. Desprezou-se o filtrado trocando-se o tubo inferior e
acrescentou-se 500 Pl do Buffer AW1 centrifugando-se o tubo a 8000 rpm por 1
minuto. Após a etapa anterior foram acrescentados 500 Pl do Buffer AW2 e os
tubos foram centrifugados a 14.000 rpm por 3 minutos. Para etapa final
acrescentou-se 100 Pl de AE para ressuspender/diluir o DNA, o tubo foi deixado
em repouso por 1 minuto, centrifugando-o em seguida a 8000 rpm por 1 minuto. O
DNA obtido foi armazenado à –20º C até a espectrofotometria e PCR.
Extração de DNA de secreção salivar
O tubo contendo as células exfoliadas foi colocado em vórtex por 30
segundos e então foram retirados 400 Pl da amostra sendo misturado com 400 Pl
da amostra de saliva do mesmo paciente, em um novo tubo antes de se proceder
a extração de DNA.
Adicionou-se 400 Pl de PBS, 400 Pl de AL e 20Pl de proteinase K ao
tubo contendo a secreção salivar e agitou-se em vórtex por 15 segundos. A
incubação da amostra foi feita à 56º C por 10 minutos.
Após a incubação adicionou-se 400Pl de etanol 100% à amostra e
misturou-se novamente no vórtex por 15 segundos, centrifugando-o em seguida
por 10 segundos a 8000 rpm. Do volume total de 1220 Pl, foram aplicados 600Pl
da mistura anterior à coluna do tubo de centrifugação do kit QIAmp e
centrifugados a 8000 rpm por 1 minuto. O filtrado resultante foi desprezado e foi
aplicado o restante da mistura repetindo-se a centrifugação.
Após descarte do restante do filtrado foram adicionados 500Pl da
minuto. Colocar a parte superior do tubo com a coluna sobre um tubo de coleta de
2ml limpo e descartar o tubo contendo o filtrado. Adicionar 500Pl da solução AW2
e centrifugar à velocidade máxima (14000 rpm) por 3 minutos. Descartado o
filtrado anterior foram adicionados 100 Pl da solução AE, incubados à temperatura
ambiente por 1 minuto e depois centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto. Este DNA
obtido foi mantido à temperatura de 20ºC até a utilização.
O DNA obtido de ambos os materiais foi submetido à
espectrofotometria através de software próprio (NanoDrop® ND-1000 UV-Vis,
Nanodrop Technologies Inc., Wilmington, DE) para confirmação da presença e
integridade do DNA, posteriormente foram realizadas as PCRs com os
oligonucleotídeos iniciadores para o gene controle da β-globina humana e para o
gene do HPV.
PCR para gene humano controle
Foram realizadas as PCR para o gene controle da β-globina (110
pares de base) utilizando os oligonucleotídeos PCO3 (5’-ACACAACTG
TGTTCACTAGC-3’) e PC04 (5’-CAACTTCATCCACGTTCACC-3’) descritos por
Nonogaki et al.18 A reação foi realizada em termociclador (Peltier Effect Cycling
modelo PTC – 100, MJ Research, Inc., Watertown, MS, USA) adicionando-se ao
DNA um mix com os seguintes componentes: 10,9 Pl de água ultra-pura; 1,5 Pl
(15 pmol) de cada oligonucleotídeo iniciador (PCO3 e PCO4); 0,1 Pl (1U) de Taq
DNA polimerase 2,5 Pl de tampão de PCR 10X (10 mM de Tris-HCl pH 8 e 50 mM
(deoxyribonucleoside 5’-triophosphates – dATP, dCTP, dGTP e dTTP – GE
Healthcare, Piscataway, NJ, EUA), com exceção da água ultra-pura e dos dNTPs,
os demais componentes são da Invitrogen Life Technologies®, Brasil.
Após a mistura dos componentes em um fluxo - laminar (Heto-Holter
Tivo HV PCR, Dinamarca) foram adicionados 5 Pl do DNA de cada amostra
totalizando um volume final de 25 Pl. Como controle positivo (CP) para o gene da
β-globina foi utilizada uma amostra de sangue previamente testada e como
controle negativo (NO) uma amostra contendo somente o mix, sem DNA.
Os fragmentos de DNA foram amplificados em termociclador sob as
seguintes condições: desnaturação inicial a 95º C durante 5 minutos, 40 ciclos de
desnaturação a 95º C por 1 minuto, anelamento a 55º C por 1 minuto e extensão
a 72º C por 2 minutos, com extensão final a 72º C por 8 minutos.
Para verificação da presença do DNA humano foi feita a análise
através da eletroforese em gel de agarose a 2% em tampão 1x TBE (Fonte
Eletroforética - Amersham Pharmacia Biotech modelo EP3501, Suécia), durante 1
hora a 100 volts. A visualização foi feita após coloração com brometo de etídeo
observado o gel sob luz ultravioleta. A documentação foi realizada com auxílio do
sistema Kodak Digital Science 1D.
Após a confirmação da presença e integridade do DNA genômico, as
amostras foram submetidas à pesquisa do gene do HPV através de dois métodos:
PCR e nPCR com oligonucleotídeos iniciadores para o DNA do HPV. Para as
amostras com resultado negativo para o DNA da β-globina foram realizadas
novas extrações de DNA dos materiais genéticos e repetida a PCR. As amostras
PCR para amplificação do HPV
Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados nesta técnica foram
MY11 (5’-GCMCAGGGWCTATAAYAATGG-3’) e MY09 (5’-CTCCMARRGGAW
ACTGATC-3’) da Invitrogen Life Technologies®, Brasil, para amplificar fragmentos
da região tardia L1 do genoma viral, com 450 pares de bases.19
Os componentes do mix para esta PCR foram: 10,9 Pl de água
ultra-pura; 2,5 Pl de tampão de PCR 10X (10 mM de Tris-HCl pH 8 e 50 mM de KCl); 2
Pl de MgCl2 (4 mM); 1,5 Pl de dNTPs (0,25 mM); 0,2 Pl (2U) de Taq polimerase e
1,5 Pl de cada oligonucleotídeo iniciador (15 pmol). Em fluxo laminar foi
adicionado 5 Pl de DNA genômico de cada amostra. Como controle positivo para
infecção por HPV, foi utilizada uma amostra de HeLa, uma linhagem de células de
carcinoma cervical uterino com até 4 cópias de HPV-18 por célula. O controle
negativo foi composto por mistura de amplificação e água ultra-pura.
Os fragmentos foram amplificados em termociclador sob as
seguintes condições: desnaturação inicial a 94ºC durante 10 minutos, 40 ciclos de
desnaturação a 94º C por 1 minuto, anelamento a 55º C por 1 minuto e extensão
a 72º C por 40 segundos, com extensão final a 72º C por 4 minutos.
Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de
poliacrilamida a 8%, durante 3 horas, sob voltagem constante de 100 volts. A
evidenciação das bandas foi realizada em solução de nitrato de prata e a
nPCR para amplificação do HPV
Na primeira etapa da nPCR foram utilizados os oligonucleotídeos
MY09 e MY11, com os componentes do mix e condições de termociclagem
citadas acima. Após a termociclagem foram separados 2 Pl do produto obtido
nesta primeira PCR para utilização na segunda etapa da nPCR.
Na segunda etapa foram utilizados os oligonucleotídeos iniciadores
GP5+ (5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACYAC-3’) e GP6+ (5’-GAAAAATAAACT
TGTAAATCATATTC-3’) da Invitrogen Life Technologies®, Brasil, cujo fragmento
é de 150 pares de bases.20 A mistura de amplificação, os controles utilizados e
as condições de ciclagem foram semelhantes às da primeira etapa, com
diferenças na quantidade de água ultra-pura (13,9 Pl) e na temperatura de
anelamento (43ºC). Os produtos da nPCR foram submetidos à eletroforese em gel
de poliacrilamida sob as mesmas condições da técnica de PCR e após
evidenciação foi realizada a documentação. Estes processos (PCR e nPCR)
foram feitos em duplicata cada material (sangue, secreção salivar e biópsia),
quando houve divergência entre os dois resultados o processo foi feito em
triplicata.
Foi verificada a existência de associação entre as variáveis dos dois
grupos estudados pela aplicação de testes estatísticos (Qui-quadrado ou Teste
5
5(68/7$'26
Todas as amostras analisadas, dos pacientes portadores de
carcinoma de orofaringe e controles, amplificaram o gene controle da β-globina
humana e conseqüentemente foram utilizadas para análise da presença do DNA
do HPV através da aplicação dos métodos de PCR em duas etapas. Os
resultados numéricos estão expressos nas tabelas 1 a 6 e parte dos resultados
laboratoriais está ilustrada nas figuras 1 e 2 abaixo.
Tabela 1 - Correlação entre a presença do DNA do HPV detectado em sangue com as variáveis clínico patológicas e os fatores de risco dos pacientes com carcinoma epidermóide de orofaringe
Variáveis
Pacientes (n=46) n %
Sangue HPV+
n % n % HPV- p* Sexo
Masculino
Feminino 37 (80) 09 (20) 24 (65) 05 (56) 13 (35) 04 (44) 0,439
Idade <60
>=60 29 (63) 17 (37) 16 (55) 08 (47) 13 (45) 09 (52)
0,595 Estadiamento I II III IV
07 (15) 07 (15) 10 (22) 22 (48)
04 (57) 05 (71) 09 (90) 11 (50)
03 (43) 02 (29) 01 (10) 11 (50)
0,320
Gradação histológica Bem diferenciado
Moderadamente Pouco diferenciado
09 (20) 29 (63) 08 (17)
04 (44) 21 (72) 04 (50)
05 (56) 08 (28) 04 (50)
0,375
Tabaco Tabagista
Não tabagista 40 (87) 06 (13) 26 (65) 03 (50) 14 (35) 03 (50) 0,389
Álcool Etilista
Abstêmio 37 (80) 09 (20) 25 (68) 04 (44) 12 (32) 05 (56) 0,182
Fatores de risco
Tabela 2 - Correlação entre a presença do DNA do HPV detectado em secreção salivar com as variáveis clínico patológicas e os fatores de risco dos pacientes com carcinoma epidermóide de orofaringe
Variáveis
Pacientes (n=46) n %
Secreção salivar HPV+
n % n % HPV- p* Sexo
Masculino
Feminino 37 (80) 09 (20) 28 (76) 06 (67) 09 (24) 03 (33) 0,432
Idade <60
>=60 24 (52) 22 (48) 16 (67) 18 (82) 08 (33) 04 (18) 0,242 Estadiamento I II III IV
07 (15) 07 (15) 10 (22) 22 (48)
05 (72) 06 (86) 07 (70) 16 (73)
02 (28) 01 (14) 03 (30) 06 (27)
0,316
Gradação histológica Bem diferenciado
Moderadamente Pouco diferenciado
09 (20) 29 (63) 08 (17)
07 (78) 20 (69) 07 (87)
02 (22) 09 (31) 01 (13)
0,745
Tabaco Tabagista
Não tabagista 40 (87) 06 (13) 29 (73) 05 (83) 11 (27) 01 (17) 0,500
Álcool Etilista
Abstêmio 37 (80) 09 (20) 27 (73) 07 (78) 10 (27) 02 (22) 0,568
Fatores de risco
Tabela 3 - Correlação entre a presença do DNA do HPV detectado em tecido com as variáveis clínico patológicas e os fatores de risco dos pacientes com carcinoma epidermóide de orofaringe
Variáveis
Pacientes (n=46) n %
Tecido HPV+
n % n % HPV- p* Sexo
Masculino
Feminino 37 (80) 09 (20) 16 (43) 00 (00) 21 (57) 09 (100)
0,013
Idade <60
>=60 24 (52) 22 (48) 10 (42) 06 (27) 14 (58) 16 (73) 0,306 Estadiamento I II III IV
07 (15) 07 (15) 10 (22) 22 (48)
02 (29) 02 (29) 02 (20) 10 (45)
05 (71) 05 (71) 08 (80) 12 (55)
0,293
Gradação histológica Bem diferenciado
Moderadamente Pouco diferenciado
09 (20) 29 (63) 08 (17)
01 (11) 10 (34) 05 (63)
08 (89) 19 (66) 03 (37)
0,135
Tabaco Tabagista
Não tabagista 40 (87) 06 (13) 15 (38) 01 (17) 25 (62) 05 (83) 0,307
Álcool Etilista
Abstêmio 37 (80) 09 (20) 15 (41) 01 (11) 22 (59) 08 (89) 0,098
Fatores de risco
desconhecidos 03 00 (0) 03 (100) 0,267
Tabela 4 - Correlação entre a presença do DNA do HPV detectado em sangue com as variáveis clínico patológicas e os fatores de risco dos pacientes sem carcinoma epidermóide
Variáveis
Pacientes (n=40) n %
Sangue HPV+
n % n % HPV- p* Sexo
Masculino
Feminino 26 (65) 14 (35) 16 (57) 12 (43) 10 (83) 02 (17) 0,111
Idade <60
>=60 22 (55) 18 (45) 16 (57) 12 (43) 06 (50) 06 (50) 0,677
Tabaco Tabagista
Não tabagista 09 (22) 31 (78) 04 (14) 24 (86) 05 (42) 07 (58) 0,072
Álcool Etilista
Abstêmio 12 (30) 28 (70) 06 (21) 22 (79) 06 (50) 06 (50) 0,071
Fatores de risco
Tabela 5 - Correlação entre a presença do DNA do HPV detectado em secreção salivar com as variáveis clínico patológicas e os fatores de risco dos pacientes sem carcinoma epidermóide
Variáveis
Pacientes (n=40) n %
Secreção salivar HPV+
n % n % HPV- p* Sexo
Masculino
Feminino 26 (65) 14 (35) 13 (59) 09 (41) 13 (72) 05 (28) 0,386
Idade <60
>=60 22 (55) 18 (45) 11 (50) 11 (50) 11 (61) 07 (39) 0,482
Tabaco Tabagista
Não tabagista 09 (22) 31 (78) 05 (23) 17 (78) 04 (22) 14 (78) 0,970
Álcool Etilista
Abstêmio 12 (30) 28 (70) 06 (27) 16 (73) 06 (33) 12 (67) 0,677
Fatores de risco
desconhecidos 22 16 (73) 06 (27) 0,013
Tabela 6 - Correlação entre a presença do DNA do HPV detectado em tecido com as variáveis clínico patológicas e os fatores de risco dos pacientes sem carcinoma epidermóide
Variáveis
Pacientes (n=40) n %
Tecido HPV+
n % n % HPV- p* Sexo
Masculino
Feminino 26 (65) 14 (35) 05 (56) 04 (44) 21 (68) 10 (32) 0,383
Idade <60
>=60 22 (55) 18 (45) 05 (56) 04 (44) 17 (55) 14 (45) 0,970
Tabaco Tabagista
Não tabagista 09 (22) 31 (78) 02 (22) 07 (78) 07 (23) 24 (77) 0,667
Álcool Etilista
Abstêmio 12 (30) 28 (70) 03 (33) 06 (67) 09 (29) 22 (71) 0,552
Fatores de risco
Figura 1 – Eletroforese em gel de agarose 2% mostrando resultado da amplificação da betaglobina humana (110 pb) por PCR em parte das 46 amostras de pacientes com carcinoma epidermóide de orofaringe. PM 50 = peso molecular de 50 pb; SG = sangue; CP = controle positivo para betaglobina; NO = controle negativo
Figura 2 – Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% mostrando resultado da amplificação do HPV (140 pb) por nPCR em parte das 46 amostras de pacientes com carcinoma epidermóide de orofaringe. PM 50 = peso molecular de 50 pb; SL = secreção salivar; TC = tecido; NO = controle negativo; HeLa = controle positivo para HPV
A idade média de idade foi de 60 anos para os pacientes portadores
de carcinoma de orofaringe e 58,2 anos para os controles e a mediana foi de 59 e
56 anos, respectivamente. Tanto o cruzamento entre as médias de idades dos
grupos quanto o cruzamento entre as faixas etárias (idade acima ou abaixo de 60
Os cruzamentos entre os grupos HPV negativo e HPV positivo tanto
entre os pacientes portadores de carcinoma de orofaringe como entre os
controles não foram estatisticamente significativos segundo as variáveis: idade,
tabagismo, etilismo, grau histológico e estadiamento clínico.
A análise de tecido dos pacientes com carcinoma epidermóide de
orofaringe mostrou que 100% dos casos em mulheres foram HPV negativos
enquanto que para os homens esta porcentagem foi de apenas 57% (p=0,013)
conforme demonstra a tabela 3.
Na análise de secreção salivar dos pacientes sem carcinoma e sem
os hábitos de etilismo e tabagismo a diferença entre os casos HPV positivos e
negativos foi significante (p=0,013) mostrando que 73% dos pacientes sem
hábitos eram HPV positivos conforme tabela 5.
Apesar das amostras positivas terem sido submetidas a um
seqüenciador automático (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit for
MegaBACE DNA Analysis Systems - Amersham Biosciences) não foi possível a
tipagem dos HPVs encontrados neste estudo, possivelmente devido ao pequeno
5 DISCUSSÃO
Os trabalhos encontrados na literatura apresentam taxas variáveis
de detecção do DNA do HPV principalmente devido aos diferentes tipos de
material biológico estudado (esfregaços, sangue, saliva, tecido congelado, tecido
parafinado), localização anatômica, questões populacionais, técnicas/meios de
detecção do vírus, desenho dos oligonucleotídeos e número de amostras
estudadas.21
Quanto à análise dos diversos tipos de materiais biológicos,
SahebJamee et al.,22 detectaram uma positividade para o DNA do HPV de 40,9%
nos pacientes com carcinoma oral e de 25% em pacientes não portadores de
carcinoma oral através da análise de saliva. Em nosso estudo a presença de DNA
do HPV na secreção salivar (a secreção salivar compôs-se da mistura da saliva
com células exfoliadas) foi de 73,9% para os pacientes portadores de carcinoma
epidermóide de orofaringe(34/46) e 55% para os controles. Através da análise de
células exfoliadas também já foi demonstrado que mesmo os tecidos normais
adjacentes a lesões apresentam positividade diferente para o DNA do HPV
(41,2% versus 35,3%).23
Similarmente a outras investigações que utilizaram saliva7,10,24,
nosso estudo não encontrou correlação entre a presença do DNA do HPV em
saliva e o carcinoma epidermóide de orofaringe. Em contraste, em estudo de
Zhao et al.10, foi demonstrado que a presença do DNA do HPV 16 na saliva pode
refletir o status do HPV 16 em carcinomas de cabeça e pescoço e sugeriram que
com alta taxa de falso-positivos. Discordamos de Zhao et al.10 e Smith et al.25
que acreditam que a detecção de DNA do HPV na saliva/células exfoliadas pode
ser um fator preditivo para o surgimento de carcinomas de cabeça e pescoço
relacionados ao HPV, pois deve-se levar em conta a persistência da infecção com
HPVs de alto risco, fator diretamente dependente do sistema imune e hábitos do
hospedeiro (número de parceiros sexuais, sexo sem proteção, tabagismo, etilismo
entre outros). Estudos com pacientes imunologicamente comprometidos (HIV
positivos) tem mostrado maiores taxas de detecção de DNA do HPV na saliva.26
Acreditamos entretanto que a persistência da infecção associada a lesões
pré-malignas como a leucoplasia deveria ser melhor estudada.
Quanto às células exfoliadas concordamos com Herrero et al.27, que
não encontrou associação entre a positividade para o DNA do HPV e os
carcinomas de cabeça e pescoço e discordamos de Smith et al.25 que
demonstraram uma associação estatística entre a detecção de HPVs de alto risco
em células exfoliadas e tecidos tumorais sugerindo que o screening para HPV
usando células exfoliadas pode ser preditivo para carcinomas de cabeça e
pescoço relacionados ao HPV. Vale lembrar que a análise da saliva e células
transitórias pode indicar apenas uma contaminação e não necessariamente uma
infecção, enquanto que a análise do tecido representa uma infecção instalada.28
Tal fato ficou comprovado na análise da secreção salivar de pacientes sem
hábitos cuja diferença entre os casos HPV positivos e HPV negativos foi
significativa (p=0,013), mostrando um maior número de pacientes HPV positivos
Na análise de sangue Capone et al. 28, encontraram uma taxa de
positividade para DNA do HPV de 17% através da PCR, dot blot, hibridização,
southern blot, hibridização e hibridização in situ e utilizando os primers
MY09/MY11. Já Tachezy et al.29, num estudo caso-controle detectaram anticorpos
do HPV no sangue de 44% dos casos e 4% dos controles e concluíram que nem
sempre a presença do DNA do HPV no sangue resulta em soroconversão. Em
estudos com pacientes saudáveis, doadores de sangue, Chen et al.30
encontraram positividade para o DNA do HPV em 8,3 % dos participantes e
sugeriram que o sangue pode representar um meio de reserva e um novo meio de
transmissão viral. Analisando sangue através da nPCR encontramos 63 % nos
pacientes portadores de carcinoma de orofaringe e 70 % nos controles do
presente estudo. Concordamos com os autores que acreditam que este seja um
possível meio de disseminação do vírus através do organismo28,30. Entre as
regiões acometidas pelo câncer de cabeça e pescoço, a orofaringe tem sido a
localização com maior prevalência de HPV sendo especificamente a tonsila o
local mais acometido pelo vírus1,31,32. A distinção entre as áreas da cavidade
bucal, orofaringe e laringe é necessária já que a distribuição do vírus é diferente
nos diversos sítios anatômicos21,25,33-35 sendo em orofaringe 2,6 vezes maior que
na boca36. Na análise de tecido dos pacientes portadores de carcinoma
epidermóide de orofaringe avaliados encontramos uma positividade de 34,8%. Em
recente metanálise esta taxa variou entre 3,35% e 84%, sendo de 40,97% para
tumores de orofaringe21. Diante dos fatos expostos concordamos com as opiniões
de outros autores11,24,37-41 que consideram que o HPV como um fator de risco na
Quanto às diferenças populacionais estas também podem ser
constatadas na análise de uma revisão sistemática que avaliou estudos de
detecção tecidual do DNA do HPV em vários continentes1. Para países europeus
e asiáticos esta taxa ficou entre 16% e 33%1, porém quando considerada a
população latinoamericana esta taxa variou entre 43,5% a 60% para carcinomas
epidermóides da cavidade oral 42,43. Corroboramos com a opinião de recentes
estudos, que tem demonstrado que as taxas de detecção do DNA do HPV em
cavidade oral têm aumentado, mesmo em populações mais conservadoras como
a população iraniana22. Ernster et al. 37 em estudo epidemiológico nos Estados
Unidos demonstraram que a razão HPV positivo/negativo aumentou de 0,72 antes
de 1995 para 3,81 após este período.
Um dos métodos utilizados mais sensíveis é a PCR e entre os
oligonucleotídeos iniciadores mais empregados em pesquisas de DNA viral para o
HPV estão: MY09/MY1146 e GP5+/GP6+ 47, ambos utilizados em nosso estudo
em reação nPCR. Esta diferença metodológica fica clara quando comparamos,
por exemplo, os resultados do HPV positivo em tecido do grupo de pacientes sem
carcinoma de nosso estudo (22,5%) com os resultados do estudo de Sacramento
et al. 48, em uma população brasileira, porém mais jovem (média de idade = 28
anos), sendo a maioria de mulheres (58%) e utilizando a PCR com um
oligonucleotídeo de maior tamanho (MY09/MY11 com 450 pb) que resultou em
uma positividade de 14%.
Em relação às variáveis estudadas não encontramos diferenças
significativas em nosso estudo quanto à idade entre os Grupos HPV negativo e
e Báez et al. 49 . Apesar disso, a média de idade dos pacientes do estudo foi alta
(60 anos para casos versus 58 anos para controles) e não podemos discordar
com os resultados dos estudos de Ringstrom et al.24; Smith et al. 33; Smith et al. 25
e Fakry et al. 12 que revelaram que o HPV foi mais associado à pacientes com
menor idade. Smith et al. 33 ainda justificam o fator idade considerando que o vírus
é sexualmente transmitido e que os pacientes mais jovens têm mais atividade
sexual.
Alguns estudos não encontraram diferenças estatísticas entre a
presença de HPV em ambos os sexos11,49-53 , porém contradizendo outros
estudos que revelaram que o grupo HPV era formado predominantemente por
mulheres43.54-56. No presente estudo encontramos diferença estatisticamente
significativa entre a presença do HPV e a variável sexo (p=0,013), sendo que o
grupo HPV positivo era formado predominantemente por homens, ratificando
dados de estudos anteriores24,34,46,57. A princípio, não vemos explicações ou
motivos para existir uma correlação entre o gênero e a presença do HPV, exceto
para os parceiros de mulheres com displasia cervical 58,59.
Alguns autores relatam que no Grupo HPV positivo, os pacientes
são compostos predominantemente por não tabagistas ou que fumam
menos.25,33,37,38,60,61 Em nosso estudo, assim como em outros anteriores11,49 não
houve diferença significante entre tabagistas e não tabagistas na análise de
sangue (p=0,389), secreção salivar (p=0,500) ou tecido (p=0,307) dos pacientes
portadores de carcinome epidermóide de orofaringe. A infecção pelo HPV
parece ser independente da exposição ao tabaco.11,25,36,51,62,63 Sabe-se que o
vez, torna as mucosas da cavidade bucal e orofaringe mais resistentes a traumas
secundários, proporcionando um efeito protetor à infecção pelo HPV.11 Por outro
lado, há indícios de que o HPV seja um fator importante no desenvolvimento de
câncer de boca em pacientes não-tabagistas. 54 D´Souza et al. 44, não
encontraram relação de sinergismo entre o HPV e uso de tabaco e álcool e
sugeriram que há mecanismos distintos no desenvolvimento do câncer de
orofaringe: um predominantemente associado aos efeitos do tabaco e álcool e
outro induzido pela instabilidade genômica devido ao HPV.
No presente estudo, os pacientes etilistas apresentaram o DNA do
HPV em uma porcentagem superior em relação aos abstêmios (41% versus 11%
avaliados no tecido), mas não a ponto de valores estatisticamente significante,
concordando com alguns autores11,42,49 e discordando de outros que revelam que
no grupo HPV positivo há maior quantidade de pacientes não alcoólatras ou que
bebem menos.24,33,38,55,60,61,64 Vale lembrar que não há padronização da
quantidade de álcool nos trabalhos revisados. Assim como outros
autores,11,25,36,42,51,62,63 cremos que estes dois fatores de risco (álcool e fumo)
atuem de forma independente do HPV na carcinogênese oral, entretanto não
podemos descartar a possibilidade de um efeito sinérgico ou antagônico entre
estes agentes etiológicos e a presença do vírus.
Neste trabalho não houve diferença estatisticamente significativa
entre os grupos na análise da variável grau de diferenciação histológico, o que
ratifica alguns estudos,24,37,49 porém discorda de outros11.25.53 que relatam que os
tumores com presença do HPV são pobremente diferenciados. Em relação ao
moderadamente diferenciados e 17 % dos pouco diferenciados avaliados no
presente estudo. Segundo Bouda et al.,20 Ringstrom et al.24 e Sugiyama et al.65 a
maior prevalência do HPV em tumores bem e moderadamente diferenciados pode
ser explicada pelo fato deste estar relacionado à fase inicial da carcinogênese
bucal.
Dados de nosso estudo ainda mostram que não há relação entre a
presença do HPV e o estadiamento clínico, corroborando com os achados de
Ringstrom et al. 24, Ernster et al. 37, D´Souza et al. 44, Baez et al. 49, Reimers et
al.53 e Klussman et al.61. Em nossa casuística tivemos 70 % dos nos pacientes
portadores de carcinoma de boca e orofaringe em estádios III e IV e ainda assim
verificamos alta prevalência do vírus (12/16) nestes estádios. Por outro lado para
Lindel et al. 55 e Mellin et al. 60 tumores com estadiamento clínico avançado
(estádios III e IV) são menos infectados pelo HPV.
Apesar das amostras positivas terem sido submetidas à purificação
e serem processadas em um seqüenciador automático a tipagem dos HPVs
&RQFO
XV·HV
7 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos com a metodologia descrita permitiram concluir que:
1. A presença de partículas virais do DNA do HPV nos diferentes materiais biológicos de pacientes portadores de carcinoma de orofaringe estudados não apresentou diferenças estatisticamente significativas na análise das variáveis: idade, consumo de fumo e álcool, estadiamento clínico e gradação histológica.
2. Houve diferença significante entre a positividade para o DNA do HPV em relação à variável sexo na análise de tecido de pacientes com carcinoma epidermóide de orofaringe.
3. A presença de partículas virais do DNA do HPV nos diferentes materiais biológicos de pacientes sem carcinoma estudados não apresentou diferenças estatisticamente significativas na análise das variáveis: idade e sexo.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
IMPLICAÇÕES PARA A PRÁTICA
A Agencia para Pesquisa sobre o Cancer (IARC) atualmente
reconhece o HPV como fator de risco para o câncer de orofaringe e dados
moleculares e epidemiológicos agora mostram que os HPV’s de alto risco são
responsáveis por um sub-grupo de tumores de orofaringe.
O prognóstico para os tumores de cabeça e pescoço são geralmente
piores nos estádios mais avançados tendo o cirurgião a necessidade de realizar
um tratamento oncológico cirúrgico mais extenso e como consequencia
frequentemente estes pacientes apresentam seqüelas como por exemplo
dificuldades na alimentação, na fonética, xerostomia e osteoradionecrose. Desta
maneira o tratamento oncológico tem se voltado na direção oposta incluindo
alterações nos esquemas de radioterapia, integração da radioterapia e
quimioterapia e introdução de terapia biológica, o que tem aumentado a sobrevida
para os pacientes portadores de carcinomas de cabeça e pescoço. Não há
entretanto um consenso sobre qual a terapia seria melhor para determinado
paciente.
Recentes estudos tem mostrado que os pacientes com tumores HPV
positivos de orofaringe mostram uma melhora na sobrevida independente da
estratégia de tratamento, a questão porém é o quanto este tratamento necessita
ser agressivo para este sub-grupo de pacientes, portanto baseados no profundo
impacto da respostas ao tratamento dos pacientes com tumores de orofaringe
positividade destes pacientes para o DNA do HPV nos tecidos tumorais para
melhor planejamento das estratégias de tratamento.
IMPLICAÇÕES PARA A PESQUISA
Os tumores de orofaringe HPV-positivos apresentam um perfil
clinico-patológico distinto e no momento ainda existem várias questões a ser
respondidas a respeito da biologia e carcinogênese destes tumores.
No futuro as pesquisas sobre tumores de orofaringe deveriam levar
em conta o status do HPV, principalmente visando a melhora na escolha da
terapia para estes pacientes, visto que os pacientes HPV positivos são mais
jovens e teriam que conviver mais tempo com seqüelas se ainda continuar a se
adotar as terapias vigentes atualmente.
Outra implicação importante seria monitorar o status do HPV com
leucoplasias que não pudessem ser retiradas na sua totalidade, uma vez que a
persistência da infecção pelo HPV poderia aumentar o índice de transformação
REFERÊNCIAS
1. Kreimer AR, Clifford GM, Boyle P, Franceschi S. Human papillomavirus types in head and neck squamous cell carcinomas worldwide: a systematic review. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005;14:467-475.
2. World Health Organization. World Cancer Report 2008. Boyle P, Levin B, editors. Lyon: International Agency for Research on Cancer, 2009.
3. Hennessey PT, Westra WH, Califano JA. Human papillomavirus and head and neck squamous cell carcinoma: recent evidence and clinical implications. J Dent Res. 2009;88(4):300-6.
4. Chuang AY, Chuang TC, Chang S, et al. Presence of HPV DNA in convalescent salivary rinses is an adverse prognostic marker in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol 2008;44(10):915-919.
5. Gillespie MB, Rubinchik S, Hoel B, Sutkowski N. Human Papillomavirus and oropharyngeal cancer: what you need to know in 2009. Curr Treat Options Oncol 2009;10(5-6):296-307.
6. Cuberos V, Perez J, Lopez CJ, et al. Molecular and serological evidence of the epidemiological association of HPV 13 with focal epithelial hyperplasia: a case-control study. J Clin Virol 2006;37(1):21-26.
7. Furrer VE, Benitez MB, Furnes M, Lanfranchi HE, Modesti NM. Biopsy vs. superficial scraping: detection of human papillomavirus 6, 11, 16, and 18 in potentially malignant and malignant oral lesions. J Oral Pathol Med 2006;35:338-344.
9. Bodaghi S, Wood LV, Roby G, Ryder C, Steinberg SM, Zheng ZM. Could human papillomaviruses be spread through blood? J Clin Microbiol 2005;43(11):5428-5434.
10. Zhao M, Rosenbaum E, Carvalho AL, et al. Feasibility of quantitative PCR-based saliva rinse screening of HPV for head and neck cancer. Int J Cancer 2005;117:605-610.
11. Gillison ML, Koch WM, Capone RB, et al. Evidence for causal association between human papillomavirus and a subset of head and neck cancers. J Natl Cancer Inst 2000;92(9):709-720.
12. Fakhry C, Westra WH, Li S, et al. Improved survival of patients with human papillomavirus-positive head and neck squamous cell carcinoma in a prospective clinical trial. J Natl Cancer Inst 2008; 100(4):261-269.
13. Termine N, Panzarella V, Falaschini S, et al. HPV in oral squamous cell carcinoma vs head and neck squamous cell carcinoma biopsies: a meta-analysis (1988-2007). Ann Oncol 2008; 19(10):1681-1690.
14. Goon PK, Stanley MA, Ebmeyer J, et al. HPV & head and neck cancer: a descriptive update. Head Neck Oncol 2009;1(1):36.
15. Harris SL, Kimple RJ, Hayes DN, Couch ME, Rosenman JG. Never-smokers, never-drinkers: unique clinical subgroup of young patients with head and neck squamous cell cancers.Head Neck 2010; 32(4):499-503.
16. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde. Instituto Nacional de Câncer. TNM: classificação de tumores malignos. 6nd ed. Rio de Janeiro: INCA; 2004.
18. Nonogaki S, Wakamatsu A, Filho AL, et al. Molecular strategies for identifying human papillomavirus infection in routinely processed samples: focus on paraffin sections. J Low Genit Tract Dis 2005;9(4):219-224.
19. Uobe K, Masuno K, Fang YR, et al. Detection of HPV en Japanese and Chinese oral carcinomas by in situ PCR. Oral Oncol 2001; 37:146-152.
20. Bouda M, Gorgoulis VG, Kastrinakis NG, et al. “High risk” HPV types are
frequently detected in potentially malignant and malignant oral lesions, but not in normal oral mucosa. Mod Pathol 2000;13(6):644-653.
21. Dayyani F, Etzel CJ, Liu M, Ho CH, Lippman SM, Tsao AS. Meta-analysis of the impact of human papillomavirus (HPV) on cancer risk and overall survival in head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Head Neck Oncol 2010;2:15.
22. SahebJamee M, Boorghani M, Ghaffari SR, AtarbashiMoghadam F, Keyhani A. Human papillomavirus in saliva of patients with oral squamous cell carcinoma. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2009;14 (10):e525-528.
23. Giovannelli L, Campisi G, Colella G, et al. Brushing of oral mucosa for diagnosis of HPV infection in patients with potentially malignant and malignant oral lesions. Mol Diagn Ther 2006;10(1):49-55.
24. Ringstrom E, Peters E, Hasegawa M, Posner M, Liu M, Kelsey KT. Human papillomavirus type 16 and squamous cell carcinoma of the head and neck. Clin Cancer Res 2002;8(10):3187-3192.
25. Smith EM, Ritchie JM, Summersgill KF, et al. Human Papillomavirus in oral exfoliated cells and risk of head and neck cancer. J Natl Cancer Inst 2004;96(6):449-555.
27. Herrero R, Castellsagué X, Pawlita M, et al. Human papillomavirus and oral cancer: the International Agency for Research on Cancer multicenter study. J Natl Cancer Inst 2003; 95(23):1772-1783.
28. Capone RB, Pai SI, Koch WM, et al. Detection and quantitation of Human Papillomavirus (HPV) DNA in the sera of patients with HPV-associated head and neck squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res 2000;6(11):4171-4175.
29. Tachezy R, Klozar J, Rubenstein L, et al. Demographic and risk factors in patients with head and neck tumors. J Med Virol 2009;81(5):878-887.
30. Chen AC, Keleher A, Kedda MA, Spurdle AB, McMillan NA, Antonsson A. Human papillomavirus DNA detected in peripheral blood samples from healthy Australian male blood donors. J Med Virol 2009;81(10):1792-1796.
31. Hansson BG, Rosenquist K, Antonsson A, et al. Strong association between infection with human papillomavirus and oral and oropharyngeal squamous cell carcinoma: a population-based case-control study in southern Sweden. Acta Otolaryngol 2005;125:1337-1344.
32. Weinberger PM, Yu Z, Haffty BG, et al. Molecular classification identifies a subset of human papillomavirus-associated oropharyngeal cancers with favorable prognosis. J Clin Oncol 2006;24:736-747.
33. Smith E, Ritchie J, Summersgill K, et al. Age, sexual behavior and human papillomavirus infection in oral cavity and oropharyngeal cancers. Int J Cancer 2004;108(5):766-772.
34. Ritchie JM, Smith EM, Summersgill KF, et al. Human papillomavirus infection as a prognostic factor in carcinomas of the oral cavity and oropharynx. Int J Cancer 2003;104(3):336-344.
36. Miller CS, Johnstone BM. Human papillomavirus as a risk factor for oral squamous cell carcinoma: a meta-analysis, 1982-1997. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2001;91:622-635.
37. Ernster JA, Sciotto CG, O'Brien MM, et al. Rising incidence of oropharyngeal cancer and the role of oncogenic human papilloma virus. Laryngoscope 2007;117(12):2115-2128.
38. Fakhry C, Gillison ML. Clinical implications of human papillomavirus in head and neck cancers. J Clin Oncol 2006;24:2606-2611.
39. Furniss CS, McClean MD, Smith JF, et al. Human papillomavirus 16 and head and neck squamous cell carcinoma. Int J Cancer 2007;120(11):2386-2392.
40. Campisi G, Panzarella V, Giuliani M, et al. Human papillomavirus: its identity and controversial role in oral oncogenesis, premalignant and malignant lesions (review). Int J Oncol 2007;30(4):813-823.
41. Hobbs CG, Sterne JA, Bailey M, Heyderman RS. Birchall MA, Thomas SJ. Human papillomavirus and head and neck cancer: a systematic review and meta-analysis. Clin Otolaryngol 2006;31(4):259-266.
42. Anaya-Saavedra G, Ramírez-Amador V, Irigoyen-Camacho ME, et al. High association of human papillomavirus infection with oral cancer: A case-control study. Arch Med Res 2008;39(2):189-197.
43. Correnti M, Rivera H, Cavazza ME. Detection of human papillomaviruses of high oncogenic potential in oral squamous cell carcinoma in a Venezuelan population. Oral Dis 2004;10(3):163-166.
45. Giovannelli L, Bellavia C, Capra G, et al. HPV group- and type-specific concordance in HPV infected sexual couples. J Med Virol 2007;79(12):1882-1888.
46. Zhang ZY, Sdek P, Cao J, Chen WT. Human papillomavirus type 16 and 18 DNA in oral squamous cell carcinoma and normal mucosa. Int J Oral Maxillofac Surg 2004;33(1):71-74.
47. Remmerbach TW, Brinckmann UG, Hemprich A, et al. PCR detection of human papillomavirus of the mucosa: comparison between MY09/11 and GP5+/6+ primer sets. J Clin Virol 2004;30(4):302-308.
48. do Sacramento PR, Babeto E, Colombo J, et al. The prevalence of human papillomavirus in the oropharynx in healthy individuals in a Brazilian population. J Med Virol 2006;78(5):614-618.
49. Báez A, Almodovar JI, Cantor A, et al. High frequency of HPV 16 associated head and neck squamous cell carcinoma in the Puerto Rican population. Head Neck 2004;26:778-784.
50. Tachezy R, Klozar J, Saláková M, et al. HPV and other risk factors of oral cavity/oropharyngeal cancer in the Czech Republic. Oral Dis 2005;11(3):181-185.
51. Nemes JA, Deli L, Nemes Z, Márton IJ. Expression of p16INK4A, p53, and Rb proteins are independent from the presence of human papillomavirus genes in oral squamous cell carcinoma. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2006;102(3):344-352.
52. Cortezzi SS, Provazzi PJ, Sobrinho JS, et al. Analysis of human papillomavirus prevalence and TP53 polymorphism in head and neck squamous cell carcinomas. Cancer Genet Cytogenet 2004;150(1):44-49.