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Detecção de papilomavírus humano (HPV) em material biológico de pacientes com carcinoma epidermóide de orofaringe

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(1)

Adriana Demathé

Detecção de papilomavírus

humano (HPV) em material

biológico de pacientes com

carcinoma epidermóide de

orofaringe

(2)

Adriana Demathé

Detecção de papilomavírus

humano (HPV) em material

biológico de pacientes com

carcinoma epidermóide de

orofaringe

Tese apresentada a Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba – UNESP, para a obtenção

do Grau de “Doutor em Odontologia”, Área de

concentração: Estomatologia

Orientador: Prof. Dr. Glauco Issamu Miyahara Co-orientadores: Prof. Dr. José Fernando Garcia Profa. Dra. Styna Marita Syrjänen

(3)

Catalogação na Publicação (CIP)

Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação FOA / UNESP

Demathé, Adriana.

D372c Detecção de papilomavírus humano (HPV) em material biológico de pacientes com carcinoma epidermóide de orofaringe/Adriana Demathe. Araçatuba : [s.n.], 2011.

77 f. : il.

Tese (Doutorado) Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia, Araçatuba, 2011

Orientador: Prof. Dr. Glauco Issamu Miyahara Coorientador: Prof. Dr. José Fernando Garcia Coorientadora: Profa. Dra. Styna Marita Syrjänen

1. Carcinoma de células escamosas 2. Papillomaviridae 3. Reação em cadeia da polimerase

Black D65

(4)

Dados Curriculares

Nascimento: 19.10.1969

Curitiba

PR

Filiação

:

Valdir Demathé e Helenir Demathé

1992/1996 : Graduação em Odontologia

Universidade Estadual de

Maringá

UEM

2000/2001 : Curso de Pós-Graduação em Saúde Pública, nível

de Especialização

Faculdade de Saúde Pública

da Universidade de São Paulo

USP

2006/2007 : Curso de Pós-Graduação em Odontologia, Área

de Estomatologia, nível de Mestrado, na Faculdade

de Odontologia do Campus de Araçatuba

UNESP

2008/2011 : Curso de Pós-Graduação em Odontologia, Área

de Estomatologia, nível de Doutorado, na Faculdade

(5)
(6)

Dedicatória

Aos meus familiares: minha querida irmã

Veridiana,

minha sobrinha

Letícia,

minha avó

Ana

, minha prima

Carla

e meus tios

Almir

e

Diva

agradeço pelo carinho, pelas palavras amigas e pelo auxílio que me

prestaram durante esta jornada.

À minha grande amiga

Maria de Lurdes Braun

obrigada pela

convivência, carinho e pela paciência que teve comigo.

(7)
(8)

Agradecimentos Especiais

Ao meu orientador,

Prof. Dr. Glauco Issamu Miyahara

, pela sua

paciência, constante incentivo e por não ter me deixado desistir

durante o tortuoso caminho que encontrei neste período.

Ao meu co-orientador,

Prof. Dr. José Fernando Garcia

, meu

obrigada, pelas oportunidades de aprendizado e por incentivar sempre

meu espírito investigativo.

À minha co-orientadora,

Profa. Dra. Styna Marita Syrjänen

, seus

trabalhos foram uma fonte de inspiração, muito obrigada pelo contato

e orientações nesta pesquisa.

À

Profa. Dra. Cáris Maroni Nunes

por seu auxílio em momentos de

dificuldades, meus sinceros agradecimentos.

Ao

Prof. Dr. Éder Ricardo Biasoli

por ter sempre uma palavra amiga.

À minha grande amiga

Eloisa Gregori

por partilhar comigo as

(9)
(10)

Agradecimentos

À Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP, no nome da atual

Diretora

Profª. Adj. Ana Maria Pires Soubhia

e do Vice-Diretor

Prof. Adj.

Wilson Roberto Poi.

Ao

Programa de pós-graduação em Odontologia da Faculdade de

Odontologia de Araçatuba

UNESP

, na pessoa da coordenadora

Profa.

Ass. Dr. Maria José Hitomi Nagata.

Aos

docentes do Departamento de Patologia e Propedêutica Clinica

da

Faculdade de Odontologia de Araçatuba

UNESP, Prof. Dr. Alvimar Lima

de Castro, Prof.ª Dr.ª Ana Maria Pires Soubhia, Prof. Dr. Eder Ricardo

Biasoli, Prof. Dr. Norberto Perri Moraes Prof.ª Dr.ª Ana Claudia Okamoto,

Prof. Dr. Elerson Gaetti Jardim Júnior, Prof. Dr. Gilberto Aparecido Coclete,

Prof.ª Dr.ª Leda Maria Pescinini Salzedas, Prof. Dr. Marcelo Macedo

Crivelini e Prof.ª Dr.ª Renata Callestini Felipini, meus agradecimentos pela

acolhida.

Às

funcionárias do Centro de Oncologia Bucal

(Unidade Auxiliar) da

Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba

UNESP, Jane

Fátima Mendes Fernandes da Silva e Nair Ramos Macedo Cardoso pelo

auxílio fundamental nos momentos necessários.

Aos

funcionários do Departamento de Patologia e Propedêutica

Clínica

(11)

Francischini e José Marcelo Tramarin pelo carinho e dedicação que sempre

tratam os alunos.

Aos

amigos do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular Animal

(LBBMA)

da Faculdade de Odontologia e Curso de Medicina Veterinária de

Araçatuba

UNESP, Érica de Souza Ribeiro, Valquiria Rissato Gazola,

Pedro Luis Florindo, Fulvia di Pillo, Adriana Santana do Carmo, Silvana de

Cássia Paulan, Fernanda Muller de Oliveira e Danielly Vieira Bortoletto,

pelos momentos de convivência e pelo auxílio técnico.

Ao

Instituto de Patologia de Araçatuba

, por cederem as amostras

necessárias para o estudo.

Ao amigo

Daniel Bernabé

pelos momentos compartilhados e troca de

conhecimentos durante esta jornada, obrigada.

A

Profa. Dra. Maria Lúcia Marçal Mazza Sundefeld

muito obrigada pela

atenção e cuidado com que realizou a análise estatística desse trabalho.

Aos

funcionários da Seção de pós-graduação

da Faculdade de

Odontologia de Araçatuba

UNESP, Valeria de Queiroz Marcondes

Zagatto e Diogo Luis Reatto, pela presteza com que sempre me

atenderam.

(12)

Aos

colegas pós-graduandos da estomatologia

, muito obrigada pelo

convívio e pela troca de experiências.

À Fundação de Auxílio à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP

(Processo N° 2010 / 00026-1) agradecimentos pelo auxílio financeiro.

(13)

Demathé A. Detecção de papilomavírus humano (HPV) em material biológico de pacientes com carcinoma epidermóide de orofaringe. [tese]. Araçatuba: Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual Paulista; 2011.

Resumo

O papilomavirus humano (HPV) tem sido relacionado com a etiologia dos carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço, em análise de tecidos cerca de 60% destes carcinomas podem ser HPV positivos. O objetivo deste trabalho foi analisar a presença do HPV em material genético obtidos de tecidos, secreção salivar e sangue de pacientes portadores de carcinoma epidermóide (CEC) de orofaringe e controles e a correlação da presença viral com as váriáveis sexo, idade, tabagismo, etilismo e perfil anatomopatologico do tumor. Foi realizada uma análise do material genético de 46 pacientes com diagnóstico de CEC de orofaringe e 40 pacientes sem carcinoma. A extração do DNA dos espécimes foi realizada utilizando o kit de extração de DNA QuiAMP. O DNA isolado foi submetido a PCR para beta-globina para confirmar a presença e integridade do DNA, em seguida, foram realizadas novas reações para detecção do DNA do HPV. Para análise estatística foram empregados o teste Qui-quadrado e teste exato de Fisher. A idade média de idade foi de 60 anos para os casos e 58,2 anos para os controles e a mediana foi de 59 e 56 anos, respectivamente. Os resultados obtidos com a metodologia descrita permitiram concluir que não houve diferenças estatisticamente significativas na análise das variáveis em relação à presença do papilomavírus humano nas amostras de tecidos biológicos dos pacientes estudados.

(14)

Demathé A. Human papillomavirus (HPV) detection in biological tissues of patiens with oropharyngeal squamous cell carcinoma [thesis]. Araçatuba: UNESP

– São Paulo State University; 2011.

Abstract

Human papillomavirus (HPV) it has been related with head and neck SCC etiology, about 60% of these carcinomas tissues can be HPV positive. The aim of this study was to analyze the HPV presence in genetic material obtained from tissues, salivary secretion and blood of oropharyngeal SCC patients and controls and correlate the virus presence with variables: sex, age, smoking, alcoholism and pathological profile of the tumours.It was made molecular and statistical analysis of genetic material of 46 oral and oropharyngeal SCC patients and 40 controls patients without carcinoma. The DNA extraction of all specimens was accomplished using the DNA extraction kit QuiAMP. The isolated DNA was submitted PCR for beta-globin to confirm the DNA presence and integrity, after new reactions it was accomplished for HPV DNA detection. Chi-square test and Fisher exact test were used for statistical analysis. The average age was 60 years for cases and 58.2 years for controls and the median age was 59 and 56 years respectively. The results obtained with the described methodology shows there was no statistically significant differences between HPV presence in samples of biological tissues and the analyzed variables.

(15)

Epígrafes

“É melhor tentar e falhar,

que preocupar-se e ver a vida passar,

É melhor tentar, ainda que em vão,

que sentar-se fazendo nada até o final.

Eu prefiro na chuva caminhar,

que em dias tristes em casa me esconder.

Prefiro ser feliz, embora louco,

que em conformidade viver...”

Martin Luther King

“Se pude enxergar mais longe foi

porque estava

nos ombros de gigantes...”

(16)

Lista de Abreviaturas

HPV

- do inglês Human Papillomavirus

DNA

- do inglês Deoxyribonucleic Acid

PCR

- do inglês Polymerase Chain Reaction

nPCR

- do inglês nested Polymerase Chain Reaction

HeLa

- linhagem de células de carcinoma cervical uterino com até 4

cópias de HPV-18 por célula

CP -

Controle Positivo

NO -

Amostra contendo mistura de componentes e ausência de DNA

PM -

Peso Molecular

INCA -

Instituto Nacional do Câncer

IARC -

do inglês

International Agency for Research on Cancer

COB

- Centro de Oncologia Bucal

FOA-UNESP

- Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba

UNESP

dNTP

- do inglês Deoxyribonucleotide Triphosphate

pb

- pares de base

CDC

- do inglês Center of Disease Control

TNM -

Sistema de Classificação de tumores malignos

(17)

Sumário

1 Introdução

18

2 Proposição

22

3 Material e Método

24

4 Resultados

36

5 Discussão

43

6 Conclusões

51

Referências

54

(18)
(19)

Normas do Periódico Journal American Dental Association - JADA

,1752'8‰…2

Nos últimos 15 anos o papilomavírus humano (HPV) foi a principal causa do câncer de colo de útero e sua etiologia atualmente tem sido relacionada com carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço,1 em especial os carcinomas de orofaringe.2

O papilomavirus humano é um vírus circular, não envelopado, com aproximadamente 7,9 kD que infecta células escamosas do epitélio. O HPV infecta a camada basal do epitélio através de rupturas na superfície epitelial se mantendo no núcleo das células basais. As infecções por HPV frequentemente se apresentam clinicamente como verrugas ou papilomas. Cerca de 120 subtipos de

HPV já foram identificados e eles se dividem em HPV’s de alto e baixo risco de

acordo com sua propensão a causar neoplasias. Os HPV’s de baixo risco estão

associados a verrugas benignas enquanto que os subtipos de alto risco estão associados com displasia e carcinomas invasivos. 3 Na cavidade oral os subtipos de baixo risco mais comuns são os HPV’s 11, 36 e 42 enquanto que os subtipos

de alto risco mais comuns são o HPV 16, 18 e 31.4

Cerca de 90% das infecções pelo HPV’s associados aos carcinomas

epidermóides de cabeça e pescoço são causadas pelo HPV16. 1 O HPV, principalmente os tipos 16 e 18, tem um papel direto na carcinogênese codificando oncoproteínas, as quais são capazes de promover a transformação celular por alterar a regulação do ciclo celular, o sistema telomero/telomerase, a apoptose e outros sinalizadores celulares .2

A detecção de anticorpos para as proteínas L1, E6 e E7 do HPV realizada em um estudo caso-controle com 1670 pacientes portadores de carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço e 1732 controles demonstrou que a presença destes anticorpos estava associada a um risco três vezes maior para carcinomas orais e nove vezes maiores para carcinomas de orofaringe.5

(20)

maior prevalência de HPV positivo foi em carcinomas epidermóides de orofaringe (35.6%), seguida pela laringe (24%) e orais (23.5%).1

O DNA do HPV tem sido isolado em materiais biológicos como tecidos parafinados e células exfoliadas da mucosa oral, estas obtidas através de bochechos ou esfregaços .6

Em estudo de lesões orais potencialmente malignas e lesões malignas, demonstrou-se que na comparação de detecção do DNA do HPV, este é mais facilmente detectável pela análise de células exfoliadas do que pela análise de espécimes de biópsia, com sensibilidade de 50% e especificidade de 100%, através de Southern Blot.7

Testes salivares em pacientes que no pós tratamento se apresentam ainda positivos para HPV podem ser bons marcadores de recorrência do tumor.4 O papilomavirus humano também tem sido detectado no soro e plasma de pacientes com carcinoma cervical HPV positivos, com taxas que variam de 7 a 48% 8 e também em soro de pacientes HIV/HPV positivos.9 Na região de cabeça e pescoço o HPV foi detectado em 45,6% dos pacientes portadores de carcinoma através da análise de secreção salivar.10

Dados de recentes estudos moleculares e epidemiológicos sugerem fortemente que carcinomas de orofaringe HPV positivos apresentam padrões clínicos, epidemiológicos, patológicos e moleculares distintos provavelmente associados à infecção pelo HPV e que apresentam um melhor prognóstico em relação aos pacientes HPV negativos. 11,12

Recente revisão sistemática sobre a presença do HPV mostrou uma prevalência de 38,1% em carcinomas orais e 24,1% em carcinomas de cabeça e pescoço. Com relação ao método de detecção os estudos baseados em PCR relatam uma taxa de prevalência maior (34,8% versus 32,9%) em relação à hibridização in situ.13 Pacientes HPV positivos com tumores tem melhores taxas de respostas após à quimioterapia (84% versus 57%) comparados aos pacientes HPV negativos. Um seguimento de 39,1 meses em pacientes HPV positivos que tiveram câncer mostrou um acréscimo de 33% na sobrevida.14

(21)

distinta e que diferenças no manejo clínico de tumores HPV positivos e negativos representam o melhor argumento para se incrementar o uso da detecção destes vírus.

Há também outras indicações clínicas para este screening:

(1) definir melhor o prognóstico do paciente; (2) otimizar a seleção do tratamento;

(3) educação do paciente.5

(22)

(23)

352326,‰…2

O objetivo deste trabalho foi:

(24)

0

0DWHULDO

(25)

3 MATERIAL E MÉTODOS

Este trabalho foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba – Universidade

Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” (FOA-UNESP), (Processo SISNEP

Número: FOA 2008/00869) (Anexo A).

Este estudo baseou-se numa análise prospectiva de 46 pacientes

com diagnóstico de carcinoma epidermóide de orofaringe diagnosticados no

Centro de Oncologia Bucal (Unidade Auxiliar) da Faculdade de Odontologia do

Campus de Araçatuba – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

– UNESP e 40 pacientes sem carcinoma, que se enquadraram nos critérios de

seleção do estudo, no período de março de 2007 a fevereiro de 2011.

Critérios de seleção:

Os critérios para a inclusão dos pacientes com carcinoma

epidermóide de orofaringe foram:

1. Pacientes portadores de carcinoma epidermoide de orofaringe com registro no

Centro de Oncologia Bucal (Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba

– UNESP) e confirmação diagnóstica através de exame histológico;

2. Pacientes tratados com finalidade curativa.

Os critérios para inclusão dos controles foram:

1. Pacientes que necessitavam de procedimento cirúrgico oral (cunha distal ou

cirurgia pré-protética);

(26)

3. Pacientes que possuiam os mesmos fatores de risco para o carcinoma (etilismo

e tabagismo) e pacientes sem nenhum destes vícios.

4. Pacientes com mais de 40 anos de idade.

5. Pacientes sem histórico de carcinoma de cabeça e pescoço.

Coleta de dados:

Através de formulário próprio foram coletadas informações

existentes nos prontuários dos pacientes. Os dados utilizados para avaliação das

possíveis associações entre as variáveis foram obtidos dos prontuários e

transcritos para uma ficha clínica individual (Anexo B).

Foram considerados tabagistas os indivíduos que fumaram

diariamente durante alguma época da vida, mesmo aqueles que abandonaram o

vício. Os não-tabagistas foram aqueles que não fizeram uso do fumo diariamente.

Foram considerados etilistas aqueles que consumiam no mínimo um drink por dia

e não etilistas os que não utilizavam álcool diariamente. 15

Foi realizada a classificação TNM e o grupamento por estádios de

acordo com as recomendações preconizadas pela União Internacional Contra o

Câncer (Anexo C).16 O diagnóstico histopatológico das peças cirúrgicas foi

revisado por um único patologista, utilizando para a graduação histológica a

(27)

Coleta de materiais biológicos:

Depois de selecionados os pacientes portadores de carcinoma de

boca e orofaringe que preenchiam os critérios de elegibilidade foram coletados

materiais biológicos para realização dos procedimentos laboratoriais.

Para os pacientes com suspeita de carcinoma:

1. Foram solicitados exames pré-operatórios considerados necessários para cada

caso. Na coleta de sangue foi separado 1 ml para sorologia do HPV.

2. Foram realizadas biópsias ou exéreses de lesões e o material obtido foi

dividido em duas partes, uma parte seguiu para processamento histopatológico de

rotina e outra parte foi congelada para posterior exame biomolecular de detecção

do HPV. Não houve necessidade de se aumentar a amplitude do procedimento

cirúrgico visto que somente 25 miligramas de material são suficientes para

detecção do DNA. A remoção do fragmento bucal para análise molecular foi

realizada de forma a não interferir na análise microscópica das margens

cirúrgicas.

3. Foram realizados swabs da lesão, nos pacientes com carcinoma de orofaringe

e swabs da região de orofaringe, bilateralmente, nos pacientes controle para

comparações com a sorologia e material obtido de peças operatórias .

Certificou-se anteriormente que a pessoa submetida à coleta da amostra que o paciente

estava em jejum há pelo menos 30 minutos. Procedeu-se à coleta das amostras

esfregando-se o swab firmemente contra cada mucosa 6 vezes. O swab foi

conservado em um tubo ependorf de 2 ml contendo 300 microlitros de PBS.

Solicitou-se que o paciente eliminasse saliva em um copo descartável durante um

(28)

materiais (swab e saliva) foram misturados em laboratório para compor a

secreção salivar que então foi analisada molecularmente.

Para os pacientes do grupo controle:

1. Foram selecionados 40 pacientes sem carcinoma que necessitavam de

cirurgias orais por outras causas (ver observação).

2. Foram solicitados exames pré-operatórios considerados necessários para

cada caso. Na coleta de sangue foi separado 1 ml para sorologia do HPV.

3. Foram realizados swabs da região de orofaringe para comparações com o

material obtido da cirurgia. Solicitou-se que o paciente eliminasse saliva em um

copo descartável durante um minuto e o material obtido foi conservado em tubos

eppendorf de 2 ml. Estes dois materiais (swab e saliva) foram misturados em

laboratório para compor a secreção salivar que então foi analisada

molecularmente.

Observação: os procedimentos cirúrgicos (cunha distal ou cirurgia pré-protética) foram realizados independentemente da pesquisa, pois se configuram como

tratamento.

Extração de DNA de tecido parafinado

(29)

Foram coletados de seis a dez cortes histológicos com 08

micrômetros das peças parafinadas até obter 25 mg de material, procedendo-se a

descontaminação do micrótomo com xilol e troca de luvas e lâminas entre cada

exemplar. Após a coleta, os cortes foram identificados, acondicionados em tubos

de polipropileno esterilizados de 1,5 ml e mantidos em temperatura ambiente até

o momento da extração.

Para a realização da extração do DNA, foram seguidos três passos:

desparafinização, digestão e purificação.

A desparafinização foi realizada pela dissolução da parafina em xilol

e etanol, revertendo a embebição e desidratação dos tecidos processados. Aos

tubos foram adicionados 1200 Pl de xilol (Synth®) e agitados por 15 segundos em

vortex (Thermoline® – EUA). Em seguida os tubos foram centrifugados

(Centrifuge 5417C – Eppendorf®– Alemanha) a 14.000 rotações por minuto (rpm)

durante cinco minutos. O sobrenadante foi descartado e sobre o sedimento foram

adicionados 1200 Pl de álcool etílico absoluto (Synth®) no tubo. Os tubos foram

agitados em vórtex por 15 segundos e centrifugados a 14.000 rpm durante 5

minutos com posterior descarte do sobrenadante. Este ciclo (xilol-etanol) foi

repetido novamente e ao final do processo as tampas foram abertas e os tubos

colocados em um bloco térmico (Dri-block DB3 – Techne® - Inglaterra) a 37ºC por

15 minutos para evaporação do etanol remanescente.

A digestão dos tecidos foi feita adicionando-se ao tubo 20 Pl de

solução contendo proteinase K (20mg/ml) e 180 Pl de ATL (tissue lysis buffer) do

(30)

agitando-se no vortex por 1 minuto e mantendo-se o material em banho-maria

(Modelo 146 – FANEM – São Paulo – Brasil) por 3 horas, a 56°C.

Para o isolamento dos ácidos nucléicos foi utilizado o sistema de

extração de DNA QIAamp DNA Mini Kit®, segundo as instruções do fabricante e

o DNA extraído (100 μl) foi transferido para tubos de polipropileno com tampa

rosqueável, identificado e conservado a – 20º C. Após esta etapa, a quantidade e

pureza do DNA genômico foram determinadas através da espectrofotometria

(NanoDrop® ND-1000 UV-Vis).

Com a confirmação da presença e integridade do DNA, foram

realizadas as PCRs com os oligonucleotídeos iniciadores para o gene controle da

β-globina. Em caso de ausência do gene da β-globina foi realizada nova extração

de DNA pelo método do fenol-clorofórmio.

Extração de DNA de sangue

Foram colocados 200 Pl de cada amostra de sangue dentro de um

tubo eppendorf de 1,5 ml identificados, foram adicionados 20 Pl de proteinase K

às amostras e os tubos foram agitados em vórtex por 30 segundos. Adicionou-se

200 Pl de buffer AL e agitaram-se os tubos em vórtex por 15 segundos,

levando-os em seguida ao banho-maria a 56º C por 10 minutlevando-os. Após a incubação o

material foi retirado do banho-maria e os tubos foram colocados na centrífuga a

8000 rpm, por 10 segundos, para retirar as bolhas.

Adicionou-se 200 Pl de etanol 100% aos tubos e agitaram-se os

tubos em vórtex por 15 segundos. Em seguida os tubos foram colocados na

centrífuga a 8000 rpm por 10 segundos, seu conteúdo foi transferido para a

(31)

rpm por 1 minuto. Desprezou-se o filtrado trocando-se o tubo inferior e

acrescentou-se 500 Pl do Buffer AW1 centrifugando-se o tubo a 8000 rpm por 1

minuto. Após a etapa anterior foram acrescentados 500 Pl do Buffer AW2 e os

tubos foram centrifugados a 14.000 rpm por 3 minutos. Para etapa final

acrescentou-se 100 Pl de AE para ressuspender/diluir o DNA, o tubo foi deixado

em repouso por 1 minuto, centrifugando-o em seguida a 8000 rpm por 1 minuto. O

DNA obtido foi armazenado à –20º C até a espectrofotometria e PCR.

Extração de DNA de secreção salivar

O tubo contendo as células exfoliadas foi colocado em vórtex por 30

segundos e então foram retirados 400 Pl da amostra sendo misturado com 400 Pl

da amostra de saliva do mesmo paciente, em um novo tubo antes de se proceder

a extração de DNA.

Adicionou-se 400 Pl de PBS, 400 Pl de AL e 20Pl de proteinase K ao

tubo contendo a secreção salivar e agitou-se em vórtex por 15 segundos. A

incubação da amostra foi feita à 56º C por 10 minutos.

Após a incubação adicionou-se 400Pl de etanol 100% à amostra e

misturou-se novamente no vórtex por 15 segundos, centrifugando-o em seguida

por 10 segundos a 8000 rpm. Do volume total de 1220 Pl, foram aplicados 600Pl

da mistura anterior à coluna do tubo de centrifugação do kit QIAmp e

centrifugados a 8000 rpm por 1 minuto. O filtrado resultante foi desprezado e foi

aplicado o restante da mistura repetindo-se a centrifugação.

Após descarte do restante do filtrado foram adicionados 500Pl da

(32)

minuto. Colocar a parte superior do tubo com a coluna sobre um tubo de coleta de

2ml limpo e descartar o tubo contendo o filtrado. Adicionar 500Pl da solução AW2

e centrifugar à velocidade máxima (14000 rpm) por 3 minutos. Descartado o

filtrado anterior foram adicionados 100 Pl da solução AE, incubados à temperatura

ambiente por 1 minuto e depois centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto. Este DNA

obtido foi mantido à temperatura de 20ºC até a utilização.

O DNA obtido de ambos os materiais foi submetido à

espectrofotometria através de software próprio (NanoDrop® ND-1000 UV-Vis,

Nanodrop Technologies Inc., Wilmington, DE) para confirmação da presença e

integridade do DNA, posteriormente foram realizadas as PCRs com os

oligonucleotídeos iniciadores para o gene controle da β-globina humana e para o

gene do HPV.

PCR para gene humano controle

Foram realizadas as PCR para o gene controle da β-globina (110

pares de base) utilizando os oligonucleotídeos PCO3 (5’-ACACAACTG

TGTTCACTAGC-3’) e PC04 (5’-CAACTTCATCCACGTTCACC-3’) descritos por

Nonogaki et al.18 A reação foi realizada em termociclador (Peltier Effect Cycling

modelo PTC – 100, MJ Research, Inc., Watertown, MS, USA) adicionando-se ao

DNA um mix com os seguintes componentes: 10,9 Pl de água ultra-pura; 1,5 Pl

(15 pmol) de cada oligonucleotídeo iniciador (PCO3 e PCO4); 0,1 Pl (1U) de Taq

DNA polimerase 2,5 Pl de tampão de PCR 10X (10 mM de Tris-HCl pH 8 e 50 mM

(33)

(deoxyribonucleoside 5’-triophosphates – dATP, dCTP, dGTP e dTTP – GE

Healthcare, Piscataway, NJ, EUA), com exceção da água ultra-pura e dos dNTPs,

os demais componentes são da Invitrogen Life Technologies®, Brasil.

Após a mistura dos componentes em um fluxo - laminar (Heto-Holter

Tivo HV PCR, Dinamarca) foram adicionados 5 Pl do DNA de cada amostra

totalizando um volume final de 25 Pl. Como controle positivo (CP) para o gene da

β-globina foi utilizada uma amostra de sangue previamente testada e como

controle negativo (NO) uma amostra contendo somente o mix, sem DNA.

Os fragmentos de DNA foram amplificados em termociclador sob as

seguintes condições: desnaturação inicial a 95º C durante 5 minutos, 40 ciclos de

desnaturação a 95º C por 1 minuto, anelamento a 55º C por 1 minuto e extensão

a 72º C por 2 minutos, com extensão final a 72º C por 8 minutos.

Para verificação da presença do DNA humano foi feita a análise

através da eletroforese em gel de agarose a 2% em tampão 1x TBE (Fonte

Eletroforética - Amersham Pharmacia Biotech modelo EP3501, Suécia), durante 1

hora a 100 volts. A visualização foi feita após coloração com brometo de etídeo

observado o gel sob luz ultravioleta. A documentação foi realizada com auxílio do

sistema Kodak Digital Science 1D.

Após a confirmação da presença e integridade do DNA genômico, as

amostras foram submetidas à pesquisa do gene do HPV através de dois métodos:

PCR e nPCR com oligonucleotídeos iniciadores para o DNA do HPV. Para as

amostras com resultado negativo para o DNA da β-globina foram realizadas

novas extrações de DNA dos materiais genéticos e repetida a PCR. As amostras

(34)

PCR para amplificação do HPV

Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados nesta técnica foram

MY11 (5’-GCMCAGGGWCTATAAYAATGG-3’) e MY09 (5’-CTCCMARRGGAW

ACTGATC-3’) da Invitrogen Life Technologies®, Brasil, para amplificar fragmentos

da região tardia L1 do genoma viral, com 450 pares de bases.19

Os componentes do mix para esta PCR foram: 10,9 Pl de água

ultra-pura; 2,5 Pl de tampão de PCR 10X (10 mM de Tris-HCl pH 8 e 50 mM de KCl); 2

Pl de MgCl2 (4 mM); 1,5 Pl de dNTPs (0,25 mM); 0,2 Pl (2U) de Taq polimerase e

1,5 Pl de cada oligonucleotídeo iniciador (15 pmol). Em fluxo laminar foi

adicionado 5 Pl de DNA genômico de cada amostra. Como controle positivo para

infecção por HPV, foi utilizada uma amostra de HeLa, uma linhagem de células de

carcinoma cervical uterino com até 4 cópias de HPV-18 por célula. O controle

negativo foi composto por mistura de amplificação e água ultra-pura.

Os fragmentos foram amplificados em termociclador sob as

seguintes condições: desnaturação inicial a 94ºC durante 10 minutos, 40 ciclos de

desnaturação a 94º C por 1 minuto, anelamento a 55º C por 1 minuto e extensão

a 72º C por 40 segundos, com extensão final a 72º C por 4 minutos.

Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de

poliacrilamida a 8%, durante 3 horas, sob voltagem constante de 100 volts. A

evidenciação das bandas foi realizada em solução de nitrato de prata e a

(35)

nPCR para amplificação do HPV

Na primeira etapa da nPCR foram utilizados os oligonucleotídeos

MY09 e MY11, com os componentes do mix e condições de termociclagem

citadas acima. Após a termociclagem foram separados 2 Pl do produto obtido

nesta primeira PCR para utilização na segunda etapa da nPCR.

Na segunda etapa foram utilizados os oligonucleotídeos iniciadores

GP5+ (5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACYAC-3’) e GP6+ (5’-GAAAAATAAACT

TGTAAATCATATTC-3’) da Invitrogen Life Technologies®, Brasil, cujo fragmento

é de 150 pares de bases.20 A mistura de amplificação, os controles utilizados e

as condições de ciclagem foram semelhantes às da primeira etapa, com

diferenças na quantidade de água ultra-pura (13,9 Pl) e na temperatura de

anelamento (43ºC). Os produtos da nPCR foram submetidos à eletroforese em gel

de poliacrilamida sob as mesmas condições da técnica de PCR e após

evidenciação foi realizada a documentação. Estes processos (PCR e nPCR)

foram feitos em duplicata cada material (sangue, secreção salivar e biópsia),

quando houve divergência entre os dois resultados o processo foi feito em

triplicata.

Foi verificada a existência de associação entre as variáveis dos dois

grupos estudados pela aplicação de testes estatísticos (Qui-quadrado ou Teste

(36)

5

(37)

5(68/7$'26

Todas as amostras analisadas, dos pacientes portadores de

carcinoma de orofaringe e controles, amplificaram o gene controle da β-globina

humana e conseqüentemente foram utilizadas para análise da presença do DNA

do HPV através da aplicação dos métodos de PCR em duas etapas. Os

resultados numéricos estão expressos nas tabelas 1 a 6 e parte dos resultados

laboratoriais está ilustrada nas figuras 1 e 2 abaixo.

Tabela 1 - Correlação entre a presença do DNA do HPV detectado em sangue com as variáveis clínico patológicas e os fatores de risco dos pacientes com carcinoma epidermóide de orofaringe

Variáveis

Pacientes (n=46) n %

Sangue HPV+

n % n % HPV- p* Sexo

Masculino

Feminino 37 (80) 09 (20) 24 (65) 05 (56) 13 (35) 04 (44) 0,439

Idade <60

>=60 29 (63) 17 (37) 16 (55) 08 (47) 13 (45) 09 (52)

0,595 Estadiamento I II III IV

07 (15) 07 (15) 10 (22) 22 (48)

04 (57) 05 (71) 09 (90) 11 (50)

03 (43) 02 (29) 01 (10) 11 (50)

0,320

Gradação histológica Bem diferenciado

Moderadamente Pouco diferenciado

09 (20) 29 (63) 08 (17)

04 (44) 21 (72) 04 (50)

05 (56) 08 (28) 04 (50)

0,375

Tabaco Tabagista

Não tabagista 40 (87) 06 (13) 26 (65) 03 (50) 14 (35) 03 (50) 0,389

Álcool Etilista

Abstêmio 37 (80) 09 (20) 25 (68) 04 (44) 12 (32) 05 (56) 0,182

Fatores de risco

(38)

Tabela 2 - Correlação entre a presença do DNA do HPV detectado em secreção salivar com as variáveis clínico patológicas e os fatores de risco dos pacientes com carcinoma epidermóide de orofaringe

Variáveis

Pacientes (n=46) n %

Secreção salivar HPV+

n % n % HPV- p* Sexo

Masculino

Feminino 37 (80) 09 (20) 28 (76) 06 (67) 09 (24) 03 (33) 0,432

Idade <60

>=60 24 (52) 22 (48) 16 (67) 18 (82) 08 (33) 04 (18) 0,242 Estadiamento I II III IV

07 (15) 07 (15) 10 (22) 22 (48)

05 (72) 06 (86) 07 (70) 16 (73)

02 (28) 01 (14) 03 (30) 06 (27)

0,316

Gradação histológica Bem diferenciado

Moderadamente Pouco diferenciado

09 (20) 29 (63) 08 (17)

07 (78) 20 (69) 07 (87)

02 (22) 09 (31) 01 (13)

0,745

Tabaco Tabagista

Não tabagista 40 (87) 06 (13) 29 (73) 05 (83) 11 (27) 01 (17) 0,500

Álcool Etilista

Abstêmio 37 (80) 09 (20) 27 (73) 07 (78) 10 (27) 02 (22) 0,568

Fatores de risco

(39)

Tabela 3 - Correlação entre a presença do DNA do HPV detectado em tecido com as variáveis clínico patológicas e os fatores de risco dos pacientes com carcinoma epidermóide de orofaringe

Variáveis

Pacientes (n=46) n %

Tecido HPV+

n % n % HPV- p* Sexo

Masculino

Feminino 37 (80) 09 (20) 16 (43) 00 (00) 21 (57) 09 (100)

0,013

Idade <60

>=60 24 (52) 22 (48) 10 (42) 06 (27) 14 (58) 16 (73) 0,306 Estadiamento I II III IV

07 (15) 07 (15) 10 (22) 22 (48)

02 (29) 02 (29) 02 (20) 10 (45)

05 (71) 05 (71) 08 (80) 12 (55)

0,293

Gradação histológica Bem diferenciado

Moderadamente Pouco diferenciado

09 (20) 29 (63) 08 (17)

01 (11) 10 (34) 05 (63)

08 (89) 19 (66) 03 (37)

0,135

Tabaco Tabagista

Não tabagista 40 (87) 06 (13) 15 (38) 01 (17) 25 (62) 05 (83) 0,307

Álcool Etilista

Abstêmio 37 (80) 09 (20) 15 (41) 01 (11) 22 (59) 08 (89) 0,098

Fatores de risco

desconhecidos 03 00 (0) 03 (100) 0,267

Tabela 4 - Correlação entre a presença do DNA do HPV detectado em sangue com as variáveis clínico patológicas e os fatores de risco dos pacientes sem carcinoma epidermóide

Variáveis

Pacientes (n=40) n %

Sangue HPV+

n % n % HPV- p* Sexo

Masculino

Feminino 26 (65) 14 (35) 16 (57) 12 (43) 10 (83) 02 (17) 0,111

Idade <60

>=60 22 (55) 18 (45) 16 (57) 12 (43) 06 (50) 06 (50) 0,677

Tabaco Tabagista

Não tabagista 09 (22) 31 (78) 04 (14) 24 (86) 05 (42) 07 (58) 0,072

Álcool Etilista

Abstêmio 12 (30) 28 (70) 06 (21) 22 (79) 06 (50) 06 (50) 0,071

Fatores de risco

(40)

Tabela 5 - Correlação entre a presença do DNA do HPV detectado em secreção salivar com as variáveis clínico patológicas e os fatores de risco dos pacientes sem carcinoma epidermóide

Variáveis

Pacientes (n=40) n %

Secreção salivar HPV+

n % n % HPV- p* Sexo

Masculino

Feminino 26 (65) 14 (35) 13 (59) 09 (41) 13 (72) 05 (28) 0,386

Idade <60

>=60 22 (55) 18 (45) 11 (50) 11 (50) 11 (61) 07 (39) 0,482

Tabaco Tabagista

Não tabagista 09 (22) 31 (78) 05 (23) 17 (78) 04 (22) 14 (78) 0,970

Álcool Etilista

Abstêmio 12 (30) 28 (70) 06 (27) 16 (73) 06 (33) 12 (67) 0,677

Fatores de risco

desconhecidos 22 16 (73) 06 (27) 0,013

Tabela 6 - Correlação entre a presença do DNA do HPV detectado em tecido com as variáveis clínico patológicas e os fatores de risco dos pacientes sem carcinoma epidermóide

Variáveis

Pacientes (n=40) n %

Tecido HPV+

n % n % HPV- p* Sexo

Masculino

Feminino 26 (65) 14 (35) 05 (56) 04 (44) 21 (68) 10 (32) 0,383

Idade <60

>=60 22 (55) 18 (45) 05 (56) 04 (44) 17 (55) 14 (45) 0,970

Tabaco Tabagista

Não tabagista 09 (22) 31 (78) 02 (22) 07 (78) 07 (23) 24 (77) 0,667

Álcool Etilista

Abstêmio 12 (30) 28 (70) 03 (33) 06 (67) 09 (29) 22 (71) 0,552

Fatores de risco

(41)

Figura 1 – Eletroforese em gel de agarose 2% mostrando resultado da amplificação da betaglobina humana (110 pb) por PCR em parte das 46 amostras de pacientes com carcinoma epidermóide de orofaringe. PM 50 = peso molecular de 50 pb; SG = sangue; CP = controle positivo para betaglobina; NO = controle negativo

Figura 2 – Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% mostrando resultado da amplificação do HPV (140 pb) por nPCR em parte das 46 amostras de pacientes com carcinoma epidermóide de orofaringe. PM 50 = peso molecular de 50 pb; SL = secreção salivar; TC = tecido; NO = controle negativo; HeLa = controle positivo para HPV

A idade média de idade foi de 60 anos para os pacientes portadores

de carcinoma de orofaringe e 58,2 anos para os controles e a mediana foi de 59 e

56 anos, respectivamente. Tanto o cruzamento entre as médias de idades dos

grupos quanto o cruzamento entre as faixas etárias (idade acima ou abaixo de 60

(42)

Os cruzamentos entre os grupos HPV negativo e HPV positivo tanto

entre os pacientes portadores de carcinoma de orofaringe como entre os

controles não foram estatisticamente significativos segundo as variáveis: idade,

tabagismo, etilismo, grau histológico e estadiamento clínico.

A análise de tecido dos pacientes com carcinoma epidermóide de

orofaringe mostrou que 100% dos casos em mulheres foram HPV negativos

enquanto que para os homens esta porcentagem foi de apenas 57% (p=0,013)

conforme demonstra a tabela 3.

Na análise de secreção salivar dos pacientes sem carcinoma e sem

os hábitos de etilismo e tabagismo a diferença entre os casos HPV positivos e

negativos foi significante (p=0,013) mostrando que 73% dos pacientes sem

hábitos eram HPV positivos conforme tabela 5.

Apesar das amostras positivas terem sido submetidas a um

seqüenciador automático (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit for

MegaBACE DNA Analysis Systems - Amersham Biosciences) não foi possível a

tipagem dos HPVs encontrados neste estudo, possivelmente devido ao pequeno

(43)

(44)

5 DISCUSSÃO

Os trabalhos encontrados na literatura apresentam taxas variáveis

de detecção do DNA do HPV principalmente devido aos diferentes tipos de

material biológico estudado (esfregaços, sangue, saliva, tecido congelado, tecido

parafinado), localização anatômica, questões populacionais, técnicas/meios de

detecção do vírus, desenho dos oligonucleotídeos e número de amostras

estudadas.21

Quanto à análise dos diversos tipos de materiais biológicos,

SahebJamee et al.,22 detectaram uma positividade para o DNA do HPV de 40,9%

nos pacientes com carcinoma oral e de 25% em pacientes não portadores de

carcinoma oral através da análise de saliva. Em nosso estudo a presença de DNA

do HPV na secreção salivar (a secreção salivar compôs-se da mistura da saliva

com células exfoliadas) foi de 73,9% para os pacientes portadores de carcinoma

epidermóide de orofaringe(34/46) e 55% para os controles. Através da análise de

células exfoliadas também já foi demonstrado que mesmo os tecidos normais

adjacentes a lesões apresentam positividade diferente para o DNA do HPV

(41,2% versus 35,3%).23

Similarmente a outras investigações que utilizaram saliva7,10,24,

nosso estudo não encontrou correlação entre a presença do DNA do HPV em

saliva e o carcinoma epidermóide de orofaringe. Em contraste, em estudo de

Zhao et al.10, foi demonstrado que a presença do DNA do HPV 16 na saliva pode

refletir o status do HPV 16 em carcinomas de cabeça e pescoço e sugeriram que

(45)

com alta taxa de falso-positivos. Discordamos de Zhao et al.10 e Smith et al.25

que acreditam que a detecção de DNA do HPV na saliva/células exfoliadas pode

ser um fator preditivo para o surgimento de carcinomas de cabeça e pescoço

relacionados ao HPV, pois deve-se levar em conta a persistência da infecção com

HPVs de alto risco, fator diretamente dependente do sistema imune e hábitos do

hospedeiro (número de parceiros sexuais, sexo sem proteção, tabagismo, etilismo

entre outros). Estudos com pacientes imunologicamente comprometidos (HIV

positivos) tem mostrado maiores taxas de detecção de DNA do HPV na saliva.26

Acreditamos entretanto que a persistência da infecção associada a lesões

pré-malignas como a leucoplasia deveria ser melhor estudada.

Quanto às células exfoliadas concordamos com Herrero et al.27, que

não encontrou associação entre a positividade para o DNA do HPV e os

carcinomas de cabeça e pescoço e discordamos de Smith et al.25 que

demonstraram uma associação estatística entre a detecção de HPVs de alto risco

em células exfoliadas e tecidos tumorais sugerindo que o screening para HPV

usando células exfoliadas pode ser preditivo para carcinomas de cabeça e

pescoço relacionados ao HPV. Vale lembrar que a análise da saliva e células

transitórias pode indicar apenas uma contaminação e não necessariamente uma

infecção, enquanto que a análise do tecido representa uma infecção instalada.28

Tal fato ficou comprovado na análise da secreção salivar de pacientes sem

hábitos cuja diferença entre os casos HPV positivos e HPV negativos foi

significativa (p=0,013), mostrando um maior número de pacientes HPV positivos

(46)

Na análise de sangue Capone et al. 28, encontraram uma taxa de

positividade para DNA do HPV de 17% através da PCR, dot blot, hibridização,

southern blot, hibridização e hibridização in situ e utilizando os primers

MY09/MY11. Já Tachezy et al.29, num estudo caso-controle detectaram anticorpos

do HPV no sangue de 44% dos casos e 4% dos controles e concluíram que nem

sempre a presença do DNA do HPV no sangue resulta em soroconversão. Em

estudos com pacientes saudáveis, doadores de sangue, Chen et al.30

encontraram positividade para o DNA do HPV em 8,3 % dos participantes e

sugeriram que o sangue pode representar um meio de reserva e um novo meio de

transmissão viral. Analisando sangue através da nPCR encontramos 63 % nos

pacientes portadores de carcinoma de orofaringe e 70 % nos controles do

presente estudo. Concordamos com os autores que acreditam que este seja um

possível meio de disseminação do vírus através do organismo28,30. Entre as

regiões acometidas pelo câncer de cabeça e pescoço, a orofaringe tem sido a

localização com maior prevalência de HPV sendo especificamente a tonsila o

local mais acometido pelo vírus1,31,32. A distinção entre as áreas da cavidade

bucal, orofaringe e laringe é necessária já que a distribuição do vírus é diferente

nos diversos sítios anatômicos21,25,33-35 sendo em orofaringe 2,6 vezes maior que

na boca36. Na análise de tecido dos pacientes portadores de carcinoma

epidermóide de orofaringe avaliados encontramos uma positividade de 34,8%. Em

recente metanálise esta taxa variou entre 3,35% e 84%, sendo de 40,97% para

tumores de orofaringe21. Diante dos fatos expostos concordamos com as opiniões

de outros autores11,24,37-41 que consideram que o HPV como um fator de risco na

(47)

Quanto às diferenças populacionais estas também podem ser

constatadas na análise de uma revisão sistemática que avaliou estudos de

detecção tecidual do DNA do HPV em vários continentes1. Para países europeus

e asiáticos esta taxa ficou entre 16% e 33%1, porém quando considerada a

população latinoamericana esta taxa variou entre 43,5% a 60% para carcinomas

epidermóides da cavidade oral 42,43. Corroboramos com a opinião de recentes

estudos, que tem demonstrado que as taxas de detecção do DNA do HPV em

cavidade oral têm aumentado, mesmo em populações mais conservadoras como

a população iraniana22. Ernster et al. 37 em estudo epidemiológico nos Estados

Unidos demonstraram que a razão HPV positivo/negativo aumentou de 0,72 antes

de 1995 para 3,81 após este período.

Um dos métodos utilizados mais sensíveis é a PCR e entre os

oligonucleotídeos iniciadores mais empregados em pesquisas de DNA viral para o

HPV estão: MY09/MY1146 e GP5+/GP6+ 47, ambos utilizados em nosso estudo

em reação nPCR. Esta diferença metodológica fica clara quando comparamos,

por exemplo, os resultados do HPV positivo em tecido do grupo de pacientes sem

carcinoma de nosso estudo (22,5%) com os resultados do estudo de Sacramento

et al. 48, em uma população brasileira, porém mais jovem (média de idade = 28

anos), sendo a maioria de mulheres (58%) e utilizando a PCR com um

oligonucleotídeo de maior tamanho (MY09/MY11 com 450 pb) que resultou em

uma positividade de 14%.

Em relação às variáveis estudadas não encontramos diferenças

significativas em nosso estudo quanto à idade entre os Grupos HPV negativo e

(48)

e Báez et al. 49 . Apesar disso, a média de idade dos pacientes do estudo foi alta

(60 anos para casos versus 58 anos para controles) e não podemos discordar

com os resultados dos estudos de Ringstrom et al.24; Smith et al. 33; Smith et al. 25

e Fakry et al. 12 que revelaram que o HPV foi mais associado à pacientes com

menor idade. Smith et al. 33 ainda justificam o fator idade considerando que o vírus

é sexualmente transmitido e que os pacientes mais jovens têm mais atividade

sexual.

Alguns estudos não encontraram diferenças estatísticas entre a

presença de HPV em ambos os sexos11,49-53 , porém contradizendo outros

estudos que revelaram que o grupo HPV era formado predominantemente por

mulheres43.54-56. No presente estudo encontramos diferença estatisticamente

significativa entre a presença do HPV e a variável sexo (p=0,013), sendo que o

grupo HPV positivo era formado predominantemente por homens, ratificando

dados de estudos anteriores24,34,46,57. A princípio, não vemos explicações ou

motivos para existir uma correlação entre o gênero e a presença do HPV, exceto

para os parceiros de mulheres com displasia cervical 58,59.

Alguns autores relatam que no Grupo HPV positivo, os pacientes

são compostos predominantemente por não tabagistas ou que fumam

menos.25,33,37,38,60,61 Em nosso estudo, assim como em outros anteriores11,49 não

houve diferença significante entre tabagistas e não tabagistas na análise de

sangue (p=0,389), secreção salivar (p=0,500) ou tecido (p=0,307) dos pacientes

portadores de carcinome epidermóide de orofaringe. A infecção pelo HPV

parece ser independente da exposição ao tabaco.11,25,36,51,62,63 Sabe-se que o

(49)

vez, torna as mucosas da cavidade bucal e orofaringe mais resistentes a traumas

secundários, proporcionando um efeito protetor à infecção pelo HPV.11 Por outro

lado, há indícios de que o HPV seja um fator importante no desenvolvimento de

câncer de boca em pacientes não-tabagistas. 54 D´Souza et al. 44, não

encontraram relação de sinergismo entre o HPV e uso de tabaco e álcool e

sugeriram que há mecanismos distintos no desenvolvimento do câncer de

orofaringe: um predominantemente associado aos efeitos do tabaco e álcool e

outro induzido pela instabilidade genômica devido ao HPV.

No presente estudo, os pacientes etilistas apresentaram o DNA do

HPV em uma porcentagem superior em relação aos abstêmios (41% versus 11%

avaliados no tecido), mas não a ponto de valores estatisticamente significante,

concordando com alguns autores11,42,49 e discordando de outros que revelam que

no grupo HPV positivo há maior quantidade de pacientes não alcoólatras ou que

bebem menos.24,33,38,55,60,61,64 Vale lembrar que não há padronização da

quantidade de álcool nos trabalhos revisados. Assim como outros

autores,11,25,36,42,51,62,63 cremos que estes dois fatores de risco (álcool e fumo)

atuem de forma independente do HPV na carcinogênese oral, entretanto não

podemos descartar a possibilidade de um efeito sinérgico ou antagônico entre

estes agentes etiológicos e a presença do vírus.

Neste trabalho não houve diferença estatisticamente significativa

entre os grupos na análise da variável grau de diferenciação histológico, o que

ratifica alguns estudos,24,37,49 porém discorda de outros11.25.53 que relatam que os

tumores com presença do HPV são pobremente diferenciados. Em relação ao

(50)

moderadamente diferenciados e 17 % dos pouco diferenciados avaliados no

presente estudo. Segundo Bouda et al.,20 Ringstrom et al.24 e Sugiyama et al.65 a

maior prevalência do HPV em tumores bem e moderadamente diferenciados pode

ser explicada pelo fato deste estar relacionado à fase inicial da carcinogênese

bucal.

Dados de nosso estudo ainda mostram que não há relação entre a

presença do HPV e o estadiamento clínico, corroborando com os achados de

Ringstrom et al. 24, Ernster et al. 37, D´Souza et al. 44, Baez et al. 49, Reimers et

al.53 e Klussman et al.61. Em nossa casuística tivemos 70 % dos nos pacientes

portadores de carcinoma de boca e orofaringe em estádios III e IV e ainda assim

verificamos alta prevalência do vírus (12/16) nestes estádios. Por outro lado para

Lindel et al. 55 e Mellin et al. 60 tumores com estadiamento clínico avançado

(estádios III e IV) são menos infectados pelo HPV.

Apesar das amostras positivas terem sido submetidas à purificação

e serem processadas em um seqüenciador automático a tipagem dos HPVs

(51)

&RQFO

XV·HV

(52)

7 CONCLUSÕES

Os resultados obtidos com a metodologia descrita permitiram concluir que:

1. A presença de partículas virais do DNA do HPV nos diferentes materiais biológicos de pacientes portadores de carcinoma de orofaringe estudados não apresentou diferenças estatisticamente significativas na análise das variáveis: idade, consumo de fumo e álcool, estadiamento clínico e gradação histológica.

2. Houve diferença significante entre a positividade para o DNA do HPV em relação à variável sexo na análise de tecido de pacientes com carcinoma epidermóide de orofaringe.

3. A presença de partículas virais do DNA do HPV nos diferentes materiais biológicos de pacientes sem carcinoma estudados não apresentou diferenças estatisticamente significativas na análise das variáveis: idade e sexo.

(53)

CONSIDERAÇÕES FINAIS

IMPLICAÇÕES PARA A PRÁTICA

A Agencia para Pesquisa sobre o Cancer (IARC) atualmente

reconhece o HPV como fator de risco para o câncer de orofaringe e dados

moleculares e epidemiológicos agora mostram que os HPV’s de alto risco são

responsáveis por um sub-grupo de tumores de orofaringe.

O prognóstico para os tumores de cabeça e pescoço são geralmente

piores nos estádios mais avançados tendo o cirurgião a necessidade de realizar

um tratamento oncológico cirúrgico mais extenso e como consequencia

frequentemente estes pacientes apresentam seqüelas como por exemplo

dificuldades na alimentação, na fonética, xerostomia e osteoradionecrose. Desta

maneira o tratamento oncológico tem se voltado na direção oposta incluindo

alterações nos esquemas de radioterapia, integração da radioterapia e

quimioterapia e introdução de terapia biológica, o que tem aumentado a sobrevida

para os pacientes portadores de carcinomas de cabeça e pescoço. Não há

entretanto um consenso sobre qual a terapia seria melhor para determinado

paciente.

Recentes estudos tem mostrado que os pacientes com tumores HPV

positivos de orofaringe mostram uma melhora na sobrevida independente da

estratégia de tratamento, a questão porém é o quanto este tratamento necessita

ser agressivo para este sub-grupo de pacientes, portanto baseados no profundo

impacto da respostas ao tratamento dos pacientes com tumores de orofaringe

(54)

positividade destes pacientes para o DNA do HPV nos tecidos tumorais para

melhor planejamento das estratégias de tratamento.

IMPLICAÇÕES PARA A PESQUISA

Os tumores de orofaringe HPV-positivos apresentam um perfil

clinico-patológico distinto e no momento ainda existem várias questões a ser

respondidas a respeito da biologia e carcinogênese destes tumores.

No futuro as pesquisas sobre tumores de orofaringe deveriam levar

em conta o status do HPV, principalmente visando a melhora na escolha da

terapia para estes pacientes, visto que os pacientes HPV positivos são mais

jovens e teriam que conviver mais tempo com seqüelas se ainda continuar a se

adotar as terapias vigentes atualmente.

Outra implicação importante seria monitorar o status do HPV com

leucoplasias que não pudessem ser retiradas na sua totalidade, uma vez que a

persistência da infecção pelo HPV poderia aumentar o índice de transformação

(55)

REFERÊNCIAS

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3. Hennessey PT, Westra WH, Califano JA. Human papillomavirus and head and neck squamous cell carcinoma: recent evidence and clinical implications. J Dent Res. 2009;88(4):300-6.

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