EFEITOS DO PRÉ-CONDICIONAMENTO POR OXIGENOTERAPIA
HIPERBÁRICA NA LESÃO DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO
HEPÁTICA EM RATOS
Cristiano Xavier Lima
EFEITOS DO PRÉ-CONDICIONAMENTO POR OXIGENOTERAPIA HIPERBÁRICA NA LESÃO DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO HEPÁTICA EM
RATOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Cirurgia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Medicina.
Área de Concentração: Cirurgia Abdominal
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Dias Sanches
Co-orientador: Prof. Dr. João Baptista de Rezende Neto
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
Reitor: Prof. Dr. Ronaldo Tadêu Penna
Vice-Reitora: Profa. Dra. Heloisa Maria Murgel Starling
Pró-Reitor de Pós-Graduação: Prof. Dr. Jaime Arturo Ramírez
FACULDADE DE MEDICINA
Diretor: Prof. Dr. Francisco José Penna
DEPARTAMENTO DE CIRURGIA
Chefe: Prof. Dr. Walter Antônio Pereira
COLEGIADO DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIRURGIA
Coordenador: Prof. Dr. Edson Samesima Tatsuo
Sub-coordenador: Prof. Dr. Tarcizo Afonso Nunes Prof. Dr. Alcino Lázaro da Silva
Prof. Dr. Andy Petroianu Prof. Dr. Marcelo Dias Sanches
Prof. Dr. Marco Antônio Gonçalves Rodrigues
EFEITOS DO PRÉ-CONDICIONAMENTO POR OXIGENOTERAPIA HIPERBÁRICA NA LESÃO DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO HEPÁTICA EM
RATOS
Dissertação apresentada e defendida perante a Comissão Examinadora, constituída pelos Professores Doutores:
Prof. Dr. Luiz Francisco Poli de Figueiredo ______________________________ Prof. Dr. Ricardo Costa Val do Rosário ______________________________ Prof. Dr. Marcelo Dias Sanches (orientador) ______________________________ Prof. Dr. João Baptista de Rezende Neto (co-orientador) ______________________________
Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais Belo Horizonte, MG
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Célio e Maria Consuelo, pelo amor e exemplo de vida.
À minha esposa Andréa, pela dedicação, incentivo e compreensão nos momentos de ausência pelo exercício da prática médica e estudo.
Aos meus filhos Arthur e Henrique, que me fazem renascer a cada novo dia.
Aos meus irmãos André, Bernardo, Daniel e Érico, pela felicidade de compartilharmos nossas vidas em família.
AGRADECIMENTOS
Ao Dr. Wilson Luiz Abrantes, meu grande mestre, pelo exemplo, confiança e incentivo para terminar este trabalho.
Ao Professor Dr. Marcelo Dias Sanches, meu orientador e amigo, pelos ensinamentos. Ao Professor Dr. João Baptista de Rezende Neto, meu orientador, pela amizade e valiosos ensinamentos em cirurgia experimental.
Ao saudoso Professor Dr. Marcos dos Mares Guia e ao Professore Dr. Luís Carlos Crocco Afonso, os quais, com seu exemplo e vocação, durante meus primeiros anos de graduação, me ensinaram o verdadeiro valor e o respeito à pesquisa científica.
Ao Dr. Roberto Carlos de Oliveira e Silva, por disponibilizar seu laboratório de Medicina Hiperbárica, pela amizade e exemplo de persistência e dedicação.
Ao Professor Dr. José Renan da Cunha Melo, pelos valiosos conselhos na elaboração do estudo, e por disponibilizar seu laboratório para realização do experimento.
Ao Professor Dr. Mauro Martins Teixeira e Professora Dra. Danielle da Glória de Souza pelo valioso auxílio.
Ao aluno da graduação Guilherme de Castro Santos, pela inestimável ajuda.
Aos Drs. Domingos André Fernandes Drumond, Guilherme Durães Rabelo, Marcus Antônio de Carvalho e Silvério Macedo Garcia, minha equipe do Hospital Felício Rocho, pela compreensão nos momentos de ausência e pelos ensinamentos.
Lista de Abreviaturas
ADP Difosfato de adenosina ALT Alanina-aminotransferase AMP Monofosfato de adenosina AST Aspartato-aminotransferase ATP Trifosfato de adenosina DHL Desidrogenase láctica
ICAM-1 Molécula de adesão intercelular-1 IL-2 Interleucina-2
IL-6 Interleucina-6 IL-8 Interleucina-8 IR Isquemia e reperfusão
LIR Lesão de isquemia e reperfusão MPO Mieloperoxidase
NaCl Cloreto de sódio
Lista de Figuras
Figura 1 –Peso dos animais (n=8 animais/grupo) ... 34
Figura 2 – Nível sérico de aspartato-aminotransferase (AST) dos animais durante o
procedimento operatório (n = 8 animais/grupo)... 36
Figura 3 – Nível sérico de alanina-aminotransferase (ALT) durante o procedimento
operatório (n = 8 animais/grupo)...37
Figura 4 – Nível sérico de DHL durante o procedimento operatório (n = 8
animais/grupo)... 39
Figura 5 – Número relativo de neutrófilos/mg de tecido hepático após 30 minutos de
isquemia hepática segmentar e 30 minutos de reperfusão hepática (n = 8 animais/grupo)... 42
Figura 6 – Número relativo de neutrófilos/mg de tecido pulmonar após 30 minutos de
Lista de Tabelas
Resumo
A lesão de isquemia e reperfusão (LIR) hepática constitui resposta celular, bioquímica e imunológica a reperfusão do fígado submetido à oclusão temporária de fluxo sanguíneo. São descritos vários métodos cirúrgicos e farmacológicos para atenuar sua intensidade, e diminuir suas conseqüências deletérias. A oxigenoterapia hiperbárica (OH) é método eficaz no tratamento de diversas doenças relacionadas à má oxigenação tecidual.
Com o objetivo de estudar os efeitos do pré-condicionamento por OH na LIR, em ratos submetidos a isquemia hepática segmentar normotérmica foram utilizados 32 ratos Wistar machos, distribuídos aleatoriamente em quatro grupos de oito animais de acordo com o procedimento realizado: grupo A - laparotomia e manipulação do pedículo hepático; grupo B – oclusão do pedículo vascular dos lobos mediano e lateral esquerdo do fígado por trinta minutos e reperfusão por trinta minutos; grupo C – OH a 2,5 atm por 90 minutos seguida de oclusão do pedículo vascular dos lobos mediano e lateral esquerdo do fígado por trinta minutos e reperfusão por trinta minutos; grupo D – exposição ao ar ambiente a 2,5 atm por 90 minutos seguida de oclusão do pedículo vascular dos lobos mediano e lateral esquerdo do fígado por trinta minutos e reperfusão por trinta minutos. O nível sérico de aspartato-aminotransferase, alanina-aminotransferase e desidrogenase láctica foram dosadas antes da isquemia, aos 30 minutos de isquemia e após 30 minutos de reperfusão. A pressão arterial durante o procedimento foi aferida por canulação da artéria carótida esquerda. Foi dosada a concentração tecidual de mieloperoxidase do fígado e do pulmão ao término da reperfusão.
Índice
1 Introdução ... 14
2 Revisão da literatura ... 16
3 Objetivo ... 26
4 Método ... 27
4.1 Animais ... 27
4.2 Divisão dos grupos ... 27
4.3 Tratamento hiperbárico ... 28
4.4 Procedimento cirúrgico ... 28
4.4.1 Técnica anestésica ... 28
4.4.2 Técnica operatória ... 29
4.5 Colheita de sangue ... 30
4.6 Monitorização pressórica ... 30
4.7 Análise bioquímica do sangue ... 31
4.8 Análise da concentração tecidual da mieloperoxidase ... 31
4.9 Análise estatística ... 32
5 Resultados ... 34
5.1 Peso dos animais ... 34
5.2 Análise bioquímica do sangue ... 35
5.2.1 Aspartato-aminotransferase ... 35
5.2.2 Alanina-aminotransferase ... 36
5.2.3 Desidrogenase láctica ... 38
5.3 Pressão arterial média ... 40
5.4 Mieloperoxidase hepática ... 41
5.5 Mieloperoxidase pulmonar ... 41
5.6 Mortalidade ... 43
6 Discussão ... 44
7 Conclusão ... 49
8 Summary ... 50
9 Referências bibliográficas ... 51
1 Introdução
As ressecções e o transplante do fígado têm se destacado como método terapêutico para o tratamento de diversas afecções hepáticas. O aprimoramento das técnicas operatória e anestésica, associado ao conhecimento da fisiopatologia dos eventos per e pós-operatórios (Bismuth and Sherlock, 1990) reduziram as taxas de morbi-mortalidade associadas a estes procedimentos.
As técnicas para prevenção e controle do sangramento trans-operatório expõem o fígado a períodos de isquemia. Alterações observadas no período de reperfusão, relacionadas, principalmente à duração da isquemia, se expressam por distúrbios da microcirculação hepática, hipotensão arterial, elevação da concentração sérica de aminotransferases e de desidrogenase láctica, disfunção mitocondrial e lipoperoxidação. Tais alterações se originam em complexa interação entre depleção de trifosfato de adenosina (ATP), adesão e ativação de leucócitos, células de Kupffer e plaquetas nos sinusóides hepáticos, liberação de proteases e fosfolipases, ativação do complemento e formação de espécies reativas de oxigênio (Miranda et al., 2004). Ao conjunto destas alterações se denomina lesão de isquemia e reperfusão (LIR) hepática.
Embora existam procedimentos para se evitar ou atenuar a LIR do fígado, não há método totalmente eficaz ou aplicável a todas situações clínicas. Dentre estes, o pré-condicionamento hepático, seja farmacológico ou isquêmico, atua no período que antecede a isquemia, fase de ativação de inúmeras alterações moleculares responsáveis pela LIR.
2 Revisão da literatura
A prevenção e controle do sangramento durante hepatectomias pela a oclusão total do pedículo hepático (Pringle, 1908), e a exclusão vascular do fígado (Heaney et al., 1966; Huguet et al., 1978) são técnicas ainda muito utilizadas. Entretanto, a isquemia decorrente da interrupção do fluxo sanguíneo para o fígado é uma das causas de disfunção hepática pós-operatória.
Como forma de minimizar os efeitos deletérios da isquemia no fígado, foram desenvolvidas diversas variações técnicas como oclusão intermitente do pedículo hepático (Makuuchi et al., 1987; Isozaki et al., 1992), pré-condicionamento isquêmico (Lloris-Carsi et al., 1993), ligadura seletiva intra-hepática do pedículo (Launois e Jamieson, 1992) e oclusão intra-parenquimatosa de ramo da veia porta por balão (Shimamura et al., 1986; Castaing et al., 1989).
O fígado pode ser submetido a isquemia normotérmica, hipotérmica ou mista. Na isquemia normotérmica, também denominada quente, o fígado fica privado de perfusão, drenagem venosa ou de ambos; mantendo-se o órgão na temperatura ambiente durante o procedimento operatório.
Histologicamente, na isquemia normotérmica ocorre vacuolização citoplasmática, congestão sinusoidal e, dependendo de sua duração focos de necrose e infiltração gordurosa (Orrenius et al., 1976; Carvalho et al., 1978; Shibayama et al., 1991).
A isquemia hipotérmica, também denominada fria, ocorre nas situações em que, juntamente com a interrupção sanguínea para o órgão, se realiza o resfriamento do parênquima hepático por contato direto ou por injeção intravascular de soluções geladas. É um método consagrado de preservação de órgãos para transplante e também utilizado em grandes ressecções hepáticas com previsão de períodos longos de isquemia.
O resfriamento do fígado, embora capaz de reduzir a demanda metabólica hepática em até 95%, tem inúmeros efeitos deletérios. O metabolismo celular é reduzido, mas não interrompido. Ocorrem reações originadas do esgotamento do ATP, agregação de leucócitos e plaquetas ao endotélio e formação de espécies reativas de oxigênio. Temperaturas abaixo de 20°C também estão associadas com disfunção da bomba de sódio-potássio, com desequilíbrio osmótico e eletrostático entre os meios intra e extracelular, e edema celular (Clavien et al., 1992;Busuttil e Klintmalm, 2005).
Na isquemia mista o fígado fica exposto a temperaturas variadas durante o tempo de oclusão, sendo o transplante hepático seu modelo mais conhecido. Neste, durante o período compreendido entre a hepatectomia do doador e a reperfusão do órgão no receptor, o tecido hepático sofre alterações decorrentes da privação de oxigênio celular e da hipotermia. É a denominada: lesão de preservação. Todos as células hepáticas sofrem danos com a isquemia fria, mas parece que as células não parenquimatosas (células de Kupffer, endoteliais e de Ito) são mais susceptíveis que os hepatócitos (Gao et al., 1998). Como conseqüência desta agressão tecidual, pode ocorrer desde disfunção hepática leve, manifestada apenas por pequeno aumento no nível sérico das aminotransferases, até falência completa do enxerto, com necessidade de retransplante de urgência. Estas lesões podem ser minimizadas com o resfriamento do órgão (Collins et al., 1969; Ross et al., 1976), a infusão intravascular de soluções de conservação de órgãos e tecidos (Kalayoglu et al., 1988; Belzer e Southard, 1988; Jamieson et al., 1989), a diminuição do tempo de isquemia (Furukawa, 1991), e o uso de imunossupressores (Laurens et al, 2006).
O conhecimento de que os efeitos nocivos da isquemia tecidual se prolongam e até mesmo se acentuam após a reperfusão foi demonstrado em estudo experimental no qual a lesão em mucosa ileal produzida por período isquêmico de três horas seguido por uma hora de reperfusão foi maior que após quatro horas de isquemia sem reperfusão (Parks e Granger, 1986). Este trabalho impulsionou novos estudos na pesquisa dos fatores determinantes da então denominada LIR tecidual, posteriormente descrita em órgãos como coração (Schaper e Schaper, 1983), pulmões (Takayama et al., 1987; Paull et al., 1989), rins (Ratych et al., 1986), e cérebro (Uematsu et al., 1989).
sinusoidais (González-Flecha et al, 1993; Kobayashi e Clemens, 1992; Cutrin et al., 1998). Na fase subseqüente, após seis a 24 horas, ocorre intenso processo inflamatório, mediado por oxidantes originados de células extra-hepáticas.
A isquemia leva a alterações das células endoteliais sinusoidais, que expressam grande número de moléculas de adesão de superfície e antígenos do complexo de histocompatibilidade maior, pré-condicionando o endotélio para inter-relações posteriores com os neutrófilos. Entre as moléculas expressas nas células endoteliais, merecem destaque as seletinas P e E e a molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) e, nos leucócitos se destacam as integrinas beta-1 e beta-2. A ação conjuntas destas moléculas ocasiona aderência firme entre leucócitos, plaquetas e células endoteliais, causando distúrbio microvascular, com extravasamento e migração de células inflamatórias para o tecido lesado (Jaeschke, 1997; Yadav et al., 1999). Após extravasamento e transmigração dos neutrófilos, os hepatócitos se aderem a estas células, sob o intermédio das integrinas beta-2 e ICAM-1 expressas nos hepatócitos (Nagendra et al., 1997). Uma vez aderido, o neutrófilo destrói o hepatócito pela ação de enzimas tóxicas como elastase, serino-protease e metaloproteinases além da produção de espécies reativas de oxigênio. O uso de anticorpos anti-ICAM-1 em modelo experimental em ratos mostrou atenuação da LIR em animais com fígado normal e esteatótico (Nakano et al., 1997). Também o bloqueio da interação da seletina P com neutrófilos polimorfonucleares mostrou importante efeito protetor em ratos com fígado esteatótico submetidos a isquemia e reperfusão (IR) (Amersi et al., 2002).
ICAM-1 e seletina-P nas células endoteliais e ativando outras células de Kupffer e neutrófilos circulantes (Hisama et al., 1996; Lentsch et al., 1998; Shigeki e Masayuki, 2000).
Estudos sugerem que a IR do fígado aumenta a produção e a atividade da caspase-3 (cisteinase especificamente envolvida nas fases de iniciação e execução do processo de apoptose) no tecido hepático causando morte celular por apoptose de até 50% a 70% das células endoteliais e de 40% a 60% dos hepatócitos (Sasaki et al, 1996; Gao et al., 1998; Cursio et al., 1999; Kohli et al., 1999). No entanto, Gujral (2001) em estudo experimental concluiu que a morte celular na LIR do fígado ocorre por necrose e que a utilização de um inibidor da caspase-3 não diminuiu os achados histopatológicos nos animais tratados quando comparados ao grupo controle.
A sugestão da participação de anticorpos no processo da LIR surgiu de observações em estudos em animais submetidos a IR, nos quais a inibição do complemento limitou a lesão. (Buerke et al., 1995; Weiser et al., 1996; Williams et al., 1999). O complexo de ataque à membrana parece ser elemento terminal da lesão causada pelo complemento (Kyriakides et al., 1999; Austen et al., 1999; Chan et al., 2003; Heijen et al, 2005).
Existem vários métodos de prevenção e tratamento da LIR do fígado. Estes podem ser divididas em duas diferentes categorias: intervenções cirúrgicas e uso de agentes farmacológicos.
O pré-condicionamento isquêmico é intervenção cirúrgica efetiva e segura na prevenção da LIR do fígado (Clavien et al., 2000; 2003). Consiste em se realizar períodos curtos de isquemia seguidos por reperfusão, no período imediatamente anterior à oclusão prolongada do pedículo hepático. Baseia-se na descoberta de que os tecidos adquirem resistência aos efeitos deletérios da IR por meio da exposição prévia a breves períodos de oclusão vascular. Murry (1986) descreveu o primeiro relato desta técnica na isquemia miocárdica. Seus efeitos protetores na LIR foram descridos no fígado (Lloris-Carsí et al., 1993; Hard et al., 1996; Peralta et al., 1996; Yadav et al., 1999; Clavien et al., 2000; Jassen et al., 2006; Azoulay, 2006), músculos esqueléticos (Pang et al., 1995), cérebro (Glazier et al., 1994), medula espinhal (Sakurai et al., 1998), rins (Turma e Bates, 1997), retina (Roth et al., 1998), pulmões (Du et al., 1996) e intestino (Hotter et al., 1996).
O pré-condicionamento isquêmico do fígado diminui também o acúmulo de xantina e a conversão de xantina-desidrogenase a xantina oxidase, prevenindo assim a produção de espécies reativas de oxigênio e consequente lesão hepática (Fernandez et al., 2002).
O uso da oclusão intermitente do pedículo hepático em cirurgias que necessitam de longos períodos de isquemia também mostrou ser eficiente na proteção da LIR do fígado (Makuuchi et al., 1987; Belghiti et al., 1999). Estudo comparando o uso desta técnica com o pré-condicionamento mostrou resultados semelhantes (Rudiger et al., 2002).
Vários agentes farmacológicos já foram descritos como protetores contra a LIR do fígado. Eles incluem substâncias antioxidantes (Atalla et al., 1985; Baker et al., 1985; Frederiks et al., 1995; Abdo et al., 2003), inibidores das proteases (Li et al., 1993), imunossupressores (Kurokawa et al., 1992; Kawano et al., 1994), agonistas de receptores da adenosina (Nakayama et al., 1999), doadores de óxido nítrico como a L-arginina (Cottart et al., 1999), pentoxifilina (Rudiger e Clavien, 2002), inibidores da caspase (Cursio et al., 1999) e inibidores da ação do fator de ativação plaquetária (Boin, 1997).
O uso científico da câmara hiperbárica de oxigênio na prática clínica iniciou em meados do século XX por Churchill-Davidson, pioneiro na utilização desta modalidade terapêutica em pacientes com seqüelas de radioterapia para tratamento do câncer (Churchill-Davidson et al., 1955).
Atualmente a terapêutica com OH consiste na inalação intermitente de oxigênio a 100% sob pressão superior a uma atmosfera.
oxigênio presente na hemoglobina, já que a saturação desta encontra-se no limite superior. A oferta de oxigênio inspirado a 100% aumenta a concentração de oxigênio dissolvido no plasma sanguíneo para 2,09 vol%. Quando associado ao aumento da pressão ambiente para 2,5 atmosferas, sua concentração no plasma alcança 6,8 vol%, efeito que, teoricamente, viabilizaria a atividade metabólica celular sem a presença da hemoglobina, sendo o principal mecanismo de ação da OH (Grim et al., 1990).
A OH oferece grande aumento da concentração tecidual de oxigênio em feridas hipoperfundidas e infectadas, o que proporciona cicatrização eficiente por meio de aumento da replicação dos fibroblastos e síntese do colágeno, do processo de neovascularização local do tecido isquêmico e aumento de atividade bactericida dos leucócitos (La Van e Hunt, 1990; Niinikoski, 2004). Pacientes diabéticos com feridas em membros inferiores de difícil cicatrização têm benefício do uso diário da OH por 30 a 60 dias (Davis, 1987). Pacientes com fasciíte necrosante têm recuperação mais rápida e menor mortalidade quando comparado ao tratamento clínico-cirúrgico convencionais associa-se OH (Riseman et al., 1990). Além destas indicações, a OH tem demonstrado ser eficiente no tratamento de queimaduras térmicas (Cianci et al., 1988), osteomielites (Esterhai et al., 1986), intoxicação por monóxido de carbono (Thom et al., 1995; Leach et al., 1998) e embolia gasosa (Kindwall et al., 1988).
Há relatos da aplicação clínica de OH em doenças hepáticas como hepatites crônicas virais (Liu et al., 2002), insuficiência hepática pós-operatória em cirróticos (Nazyrov et al., 2002), isquemia arterial pós-transplante hepático (Mazariegos et al., 1999), hepatite aguda fulminante (Ponikvar et al., 1998) e após hepatectomia parcial (Ozden et al., 2004).
A aplicação da OH no tratamento e prevenção da LIR de órgãos como testículos (Kolski et al., 1998), intestino delgado (Yamada et al., 1995) e miocárdio (Sterling et al., 1993) demonstrou-se benéfica.
Os efeitos bioquímicos e celulares da OH na LIR do fígado ainda não estão totalmente esclarecidos. Inicialmente, acreditava-se que a OH poderia exacerbar as lesões, por aumentar a oferta de oxigênio ao organismo, gerando aumento de radicais livres (Benke, 1988). No entanto, estudos subsequentes demonstraram que a OH durante a reperfusão tem efeitos benéficos (Kaelin et al., 1990; Zamboni et al., 1992). A OH diminui a aderência endotelial dos neutrófilos pós LIR, através de menor expressão de ICAM-1 nas células endoteliais (Hong, 2003). A OH aumentou a concentração tecidual de enzimas antioxidantes como catalase (Kim et al., 2001) e superóxido-dismutase (Wada et al., 2001). Estudos em ratos evidenciaram efeitos protetores do pré-condicionamento por OH na LIR do fígado (Chen, 1998; Yu, 2005). Aplicação de OH após o inicio da reperfusão, em ratos submetidos a IR hepática, atenuou infiltração leucocitária do parênquima hepático e diminuiu a mortalidade (Kihara et al., 2005).
Cavidades do organismo preenchidas por ar, tais como ouvido médio, seios paranasais e ocasionalmente dentes, quando têm sua comunicação com o ambiente bloqueada, estão sujeitas a barotrauma durante a OH, sendo desaconselhável seu uso eletivo em pacientes com sintomas gripais (Carlson et al., 1992). São descritas outras complicações, como cefaléia, dor no ouvido, embolia gasosa, parada cardio-repiratória, tonteiras e pneumotórax maciço (Kindwall, 1999).
3 Objetivo
4 Método
4.1 Animais
Foram utilizados 32 ratos (Rattus norvegicus albinus) Wistar, machos, com idade entre três e quatro meses, provenientes do biotério do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais.
Os animais foram mantidos no Biotério Central da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais, receberam ração balanceada própria para ratos (Purina, Campinas-SP) e água potável ad libitum. No biotério, foi respeitado o ritmo circadiano dos animais e mantidas condições sanitárias adequadas. Os animais foram alojados em gaiolas de polipropileno de 40cm x 30cm x 17,5cm com teto de grade metálica, em número máximo de cinco animais por gaiola. O fundo das gaiolas recebeu forração de serragem de madeira.
O projeto foi aprovado pelo comitê de ética em experimentação animal da Universidade Federal de Minas Gerais (protocolo número 089/05).
4.2 Divisão dos grupos
Os 32 animais foram distribuídos em quatro grupos de oito. Cada grupo foi submetido aos seguintes procedimentos:
• Grupo A (n=8): Laparotomia e manipulação do pedículo hepático.
• Grupo C (n=8): OH a 2,5 atm por 90 minutos, laparotomia, oclusão do pedículo vascular dos lobos mediano e lateral esquerdo do fígado 30 minutos e reperfusão por 30 minutos.
• Grupo D (n=8): Exposição ao ar ambiente a 2,5 atm por 90 minutos, laparotomia, oclusão do pedículo vascular dos lobos mediano e lateral esquerdo do fígado por 30 minutos e reperfusão por 30 minutos.
4.3 Tratamento hiperbárico
As sessões de tratamento hiperbárico foram realizadas em câmara hiperbárica multipacientes modelo A 240 (Seaway Diver Ind Met e Mont Ltda, Santa Rosa, RS, BR) entre oito e dez horas da manhã, em grupos de dois animais por sessão. No interior do equipamento foi colocada gaiola de polipropileno de 40 cm x 30 cm x 17,5 cm revestida por saco plástico com dois orifícios, um para a entrada do oxigênio e outro para saída do ar.
Os animais do grupo C foram submetidos à pressão de 2,5 atm, com oferta de oxigênio a 100% por 60 minutos. O tempo total da sessão foi de 90 minutos, devido à compressão e descompressão atmosférica gradativa, com duração de 15 minutos, cada.
Os animais do grupo D foram submetidos a pressão de 2,5 atm, em ar ambiente por 60 minutos. O tempo total da sessão foi de 90 minutos, devido à compressão e descompressão atmosférica gradativa, com duração de 15 minutos, cada.
4.4 Procedimento cirúrgico
4.4.1 Técnica anestésica
foram considerados anestesiados após verificação da perda dos reflexos córneo-palpebral e de retirada da pata traseira ao estímulo doloroso por preensão.
Doses adicionais foram usadas durante o procedimento operatório, quando o animal expressava sinais de recuperação dos reflexos citados.
4.4.2 Técnica operatória
Os animais foram submetidos a intubação orotraqueal com cateter para acesso vascular 14G (Becton Dickinson Ind. Cer. Ltda, Juiz de Fora, MG). A temperatura retal foi mantida entre 36ºC e 37ºC com auxílio de colchão térmico durante o procedimento operatório.
Posicionamento dos animais em decúbito dorsal horizontal. Tonsura dos pêlos da região abdominal seguida de anti-sepsia das regiões abdominal e cervical ventrais com solução de povinilpirrolidona iodo a 1% (Cincord Sul Química e Farmacêutica, Riberão Preto, SP).
Cervicotomia longitudinal mediana com bisturi e tesoura para isolamento da artéria carótida esquerda e veia jugular direita.
A artéria carótida esquerda foi dissecada e canulada com cateter de polipropileno PE 10 (Clay Adams, Becton Dickinson, Sparks, MD, EUA), para obtenção dos valores pressóricos arteriais e colheita de amostras de sangue durante o procedimento operatório.
A veia jugular direita foi dissecada e cateterizada com cateter de polipropileno PE 10 (Clay Adams, Becton Dickinson, Sparks, MD, EUA), para infusão de solução de NaCl 0,9%.
parâmetros respiratórios: freqüência respiratória de 60 incursões por minuto e volume de ar corrente de 1,5 ml/100g de peso.
Realizada incisão da parede abdominal por planos, com bisturi frio e tesoura, na linha mediana, do apêndice xifóide à cicatriz umbilical, com exposição da cavidade peritoneal. Os lobos esquerdo e mediano do fígado foram identificados e liberados por divulsão dos ligamentos hepáticos. O pedículo dos lobos mediano e lateral esquerdo do fígado, contendo o ducto biliar, artéria hepática e veia porta, foi ocluido por 30 minutos, utilizando microclampe para aneurisma cerebral (Yasargil FE-751, Aesculab / Alemanha) . Após este período o clampe foi retirado e os lobos isquemiados reperfundidos.
Após 30 minutos de reperfusão foi realizada a exérese do lobo lateral esquerdo do fígado e o lobo inferior do pulmão direito. Estas amostras foram lavadas com solução de cloreto de sódio (NaCl) 0,9%, pesadas e imediatamente resfriadas a -80ºC para posterior análise da MPO tecidual.
Durante todo o procedimento operatório foi realizada hidratação venosa com solução de NaCl 0,9% na dosagem de 45 ml/kg/h. Após cada colheita de sangue foi infundida a quantidade de 1,8 ml de solução de NaCl 0,9%.
4.5 Colheita de sangue
Para dosagens bioquímicas foram colhidos 600 µL de sangue arterial dos animais de cada grupo, por aspiração pelo cateter da artéria carótida esquerda, imediatamente antes da oclusão do pedículo hepático (P), 30 minutos após a oclusão (I30) e 30 minutos após a reperfusão hepática (R30). Cada amostra de sangue foi submetida a centrifugação a 1600 g durante 15 minutos, a 4°C para separação do plasma. As amostras de plasma foram resfriadas a -80ºC para análise bioquímica.
O cateter introduzido na artéria carótida esquerda foi conectado a transdutor de pressão (Transducer Amplifier, Model PM 1000, DATAQ Instruments, Inc. Software, Akron, OH, EUA) acoplado a computador com o programa WinDaq Pro Aquisition, versão 2,09 (DATAQ Instruments, Inc. Software, Adron, OH, EUA), e os níveis de pressão intra-arterial foram monitorizados durante o período intra-operatório.
4.7 Análise bioquímica do sangue
A avaliação das alterações sanguíneas da LIR do fígado foi realizada por dosagens séricas de AST, ALT e DHL, pelo método cinético otimizado por ultravioleta.
4.8 Análise da concentração tecidual da mieloperoxidase
Para dosagem da concentração tecidual de MPO, os fragmentos de pulmão e fígado previamente armazenados a -80°C foram descongelados em temperatura ambiente.
Amostras de 100 mg de tecido foram suspensas em 2,0 ml (4°C) de tampão fosfato (0,1 M NaCl, 0,02 M NaPO4, 0,015 M Na EDTA; pH 4,7), homogeneizadas por 10 minutos e
centrifugadas a 4°C por 15 min a 10.000 g. O precipitado foi suspenso em 2,0 ml (temperatura ambiente) de tampão fosfato (0,05 M Na3PO4, 0,5% brometo de
hexadecyltrimethylamonio; pH 5,4) e novamente centrifugado a 4°C por 15 min a 10.000g. O sobrenadante foi congelado por três vezes consecutivas em nitrogênio líquido e centrifugado a 4°C por 15 minutos a 10.000g e o sobrenadante armazenado a -20°C.
Para o ensaio foram utilizados 25 µL de 3,3’-5,5’-tetrametilbenzidina, dissolvidos em dimetilsulfóxido em concentração final de 1,6 mM, 100 µL de H2O2, dissolvidos em tampão
fosfato (0,05 M Na2PO4, 0,5% brometo de hexadecyltrimethylamonio; pH 5,4) na
A reação foi iniciada a 37oC por cinco minutos em microplacas com 96 poços pela adição de diluições seriadas do sobrenadante e da solução de 3,3’-5,5’-tetrametilbenzidina. Após este período foi adicionada solução de H2O2 e realizada nova incubação a 37oC por 5
minutos. A reação foi interrompida pela adição de 100 µL de 4M H2SO4 e quantificada a
45nm no espectrofotômetro (Emax – Molecular Devices). A quantificação dos neutrófilos foi calculada de uma curva padrão baseada na atividade de MPO expressa por aumento de absorbância a 450nm de neutrófilos peritoneais induzidos em caseína a 5%, em ensaio paralelo.
O resultado foi expresso em número relativo de neutrófilos por miligrama de tecido.
4.9 Análise estatística
As variáveis analisadas foram pressão arterial média (PAM), AST, ALT, DHL e MPO hepática e pulmonar.
Foi utilizado o programa GraphPad Prism versão 3.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego California USA), para elaboração de gráficos e análises estastísticas. O nível de significância adotado foi p=0,05.
5
5.1
FIGU Grupo pré-co condi (p > 0Resulta
Peso do
O peso do dos anima
URA 1 –Pe
o A - laparoto ondicionamen cionamento em 0,05).
ados
os anima
os animais v ais entre os g
eso dos anim
omia e manipu nto em oxige m ar ambiente
ais
variou de 2 grupos (FIG
mais (n=8 a
ulação do ped enoterapia hi e hiperbárico
75 g a 391g G. 1).
animais/gru
dículo hepátic iperbárica e e isquemia/rep
g. Não houv
upo).
o, grupo B - isquemia/rep perfusão hepá ve diferença isquemia/repe perfusão hepá ática. a significati erfusão hepáti ática e grup
iva do peso
ica, grupo C -po D -
pré-o
-5.2 Análise bioquímica do sangue
Na tabela (anexo 1) estão representados, respectivamente, os valores das médias e desvio padrão do nível sérico de AST, ALT DHL, dos animais dos grupos A, B, C e D nos diferentes tempos operatórios.
5.2.1 Aspartato-aminotransferase
Na FIG. 2 e anexo 1 estão representados os valores da variável AST (UI/L), obtidos nos animais dos grupos A, B, C e D.
Não se observou diferença significante entre as médias do grupo A nos diferentes tempos P, I30 e R30.
Não se observou diferença significante entre as médias nos tempos P e I30 nos grupos B, C e D, entretanto, as médias dos grupos B,C e D no tempo R30 foram maiores em relação às médias nos tempos P e I30 dos respectivos grupos (p<0,05) e todas maiores que o grupo A.
Não se observou diferença significante entre as médias dos grupos B,C e D no tempo I30.
Figu
pr
Ante dos g condi ambie *(p < #(p < As co 5.2.2 nos a temp e I30 maio maio
ura 2 – N rocedimento
s da isquemia grupos A - lap
cionamento e ente hiperbáric
0,05) AST R3 0,05) AST R3 olunas represen
2 Alanin
Na FIG. animais dos Não se pos P, I30 e Não se o 0 nos grupo ores em rela ores que a m
Nível sérico o operatório
a (P), após 30 parotomia e m
m oxigenotera co e isquemia 30 comparado 30 comparado ntam a média
a-aminot
3 e anexo s grupos A,B
observou d R30. observou di os B, C e D ação às méd média do gru
o de aspar o (n = 8 anim
minutos de is manipulação d apia hiperbári a/reperfusão he
o a AST P e A o a AST R30 d
e desvio padr
ransferas
1 estão rep B,C e D. diferença si
iferença esta D, entretanto dias nos tem upo A.
rtato-aminot mais/grupo)
squemia (I30) do pedículo h ica e isquemia epática. AST I30 (teste
do grupo A (te rão
se
presentados
gnificante e
atisticament o, as média mpos P e I
transferase ).
) e após 30 m hepático; B -a/reperfusão h
de Kruskal-W este de Kruska
os valores
entre as mé
te significan as dos grupo 30 dos resp
(AST) do
minutos de repe isquemia/rep hepática; D - p
Wallis). al-Wallis).
da variáve
édias do gr
nte entre as os B,C e D pectivos gru
os animais
erfusão (R30) perfusão hepát pré-condicion
l ALT (UI/
rupo A nos
s médias no D no tempo upos (p<0,0
durante o
), nos animais tica; C - pré-amento em ar
/L), obtidos
s diferentes
D (p<
Figu
pr
Antes dos g condi ambie *(p < #(p < o(p < As co A média <0,05).
ura 3 – N rocedimento
s da isquemia grupos A - lap
cionamento e ente hiperbáric
0,05) ALT R 0,05) ALT R 0,05) ALT R
olunas represen
a no tempo R
Nível séric o operatório
(P), após 30 parotomia e m
m oxigenotera co e isquemia
30 comparado 30 comparado 30 do grupo C
ntam a média
R30 do grup
o de alan o (n = 8 anim
minutos de is manipulação d
apia hiperbári a/reperfusão he
o a AST P e A o a AST R30 d C comparado a
e desvio padr
po C foi ma
nina-aminotr mais/grupo)
squemia (I30) do pedículo h ica e isquemia epática.
AST I30 (teste do grupo A (te ao ALT R30 d
rão
aior que as r
ransferase ).
) e após 30 mi hepático; B -a/reperfusão h
de Kruskal-W este de Krusk dos grupos B
respectivas
(ALT) dos
inutos de repe isquemia/rep hepática; D - p
Wallis). kal-Wallis).
e D (teste de K
médias dos s animais erfusão (R30) perfusão hepát pré-condicion Kruskal-Walli
grupos B e
durante o
), nos animais tica; C - pré-amento em ar
5.2.3 Desidrogenase láctica
Na FIG. 4 e anexo 1 estão representados os valores da variável DHL (U/L), obtidos nos animais dos grupos A, B, C e D.
Não se observou diferença significante entre as médias do grupo A nos diferentes tempos P, I30 e R30.
Não se observou diferença significante entre as médias nos tempos P e I30 nos grupos B, C e D.
As médias dos Grupos B,C e D no tempo R30 foram maiores que a respectiva média do grupo A (p<0,05).
As médias dos grupos B,C e D no tempo R30 foram maiores em relação às médias nos tempos P e I30 dos respectivos grupos (p<0,05) e maiores que o grupo A.
Figu
anim
Antes dos g condi ambie
*(p < #(p <
As co
ura 4 – Nív mais/grupo).
s da isquemia grupos A - lap
cionamento em ente hiperbáric
0,05) DHL R 0,05) DHL R
olunas represen
vel sérico d
(P), após 30 parotomia e m
m oxigenotera co e isquemia
R30 comparado R30 comparado
ntam a média
de DHL do
minutos de is manipulação d apia hiperbári a/reperfusão he
o a DHL C e D o a DHL R30
e desvio padr
os animais
squemia (I30) do pedículo h ica e isquemia
epática.
DHL I30 (test do grupo A (t
rão
durante o
) e após 30 mi hepático; B -a/reperfusão h
te de Kruskal-teste de Krusk
procedimen
inutos de repe isquemia/rep hepática; D - p
-Wallis). kal-Wallis). nto operató erfusão (R30) perfusão hepát pré-condicion
ório (n = 8
), nos animais tica; C - pré-namento em ar
8
5.3 Pressão arterial média
As médias da PAM dos animais estão representadas na TAB. 1.
Não houve diferença significante nas médias de PAM dos animais no inicio do experimento entre os grupos A,B,C e D.
Não houve diferença significante nas medias de PAM durante os 60 minutos do experimento nos animais do grupo A.
Não houve diferença significante entre a pressão arterial média antes e após a oclusão parcial do pedículo hepático nos grupos B,C e D.
Houve queda significante da pressão arterial média aos cinco minutos de reperfusão no grupo B e durante toda a reperfusão nos grupos C e D (p<0,05), em comparação as médias basais.
Tabela 1 - Pressão arterial média (mmHg) dos animais durante o procedimento operatório (n = 8 animais/grupo).
Grupos: A - laparotomia e manipulação do pedículo hepático, B - isquemia/reperfusão hepática, C - pré-condicionamento em oxigenoterapia hiperbárica e isquemia/reperfusão hepática e D - pré-pré-condicionamento em ar ambiente hiperbárico e isquemia/reperfusão hepática.
Tempo de isquemia/reperfusão: 1 – antes da oclusão do pedículo hepático, 2 – aos 5 minutos de isquemia hepática, 3 – aos 10 minutos de isquemia hepática, 4 – aos 20 minutos de isquemia hepática, 5 – aos 30 minutos de isquemia hepática, 6 - aos 5 minutos de reperfusão hepática, 7 – aos 10 minutos de reperfusão hepática, 8 – aos 20 minutos de reperfusão hepática e 9 – aos 30 minutos de reperfusão hepática.
*(p < 0,05) comparado a PAM do tempo 1.
Os valores representam a média±desvio padrão
GRUPOS Pressão arterial média
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A 96,6 ± 11,4 93,1 ± 5,0 93,0 ± 14,6 99,6 ± 22,2 92,7 ± 14,0 89,5 ± 13,0 92,6 ± 11,2 94,8 ± 9,3 94,6 ± 11,4 B 106,8 ± 15,4 82,3 ± 23,6 90,9 ± 26,5 91,9 ± 19,1 85,1 ± 19,7 73,9 ± 16,2 * 77,7 ± 20,1 79,9 ± 21,9 78,0 ± 28,3 C 106,7 ± 9,0 100,8 ± 11,1 99,1 ± 12,0 97,3 ± 18,3 88,1 ± 9,7 73,8 ± 6,1 * 71,1 ± 17,9 * 71,1 ± 5,9* 68,7 ± 3,6 *
5.4
conc núme FIG. conc D. N Figu isque Grupo condi ar am *(p < As co5.5
Mielope
O acúmu entração da ero relativo 6 e descritoO pré-co entração m Não foi enco
ura 5 – Nú emia hepát
os: A - lapar cionamento e mbiente hiperbá 0,05) compar olunas represen
Mielope
eroxidas
ulo de neut a enzima M o de neutró os no anexo ondicioname média de MP
ontrada difer
úmero relat tica segmen
rotomia e ma em oxigenoter árico e isquem rado aos grupo ntam a média
eroxidas
se hepáti
trófilos no MPO no lobo
filos por m o 2.
ento hepátic PO no parên rença signif
tivo de neu ntar e 30 m
anipulação do rapia hiperbár mia/reperfusão
os A,B e D. ± desvio padr
se pulmo
ica
fígado após o lateral esq miligrama d
co por OH ( nquima hep ficante entre
utrófilos/m minutos de r
o pedículo he ica e isquemi o hepática.
rão.
onar
s a reperfus querdo do fí e tecido. O
(grupo C) p ático, em co e as médias
mg de tecid reperfusão
epático, B - i a/reperfusão h
são foi infe fígado dos a Os valores e
provocou au omparação dos grupos o hepático hepática (n isquemia/repe hepática e D
erido pela d animais exp
estão repres
umento sign com os gru s A,B e D.
após 30 m n = 8 anima
erfusão hepáti – pré-condici
dosagem da pressa como sentados na
nificativo na upos A, B e
minutos de ais/grupo).
conc relati descr nívei B (p< Figu isque Grupo em ox hiperb * (p < # (p< As co
O acúm entração de ivo de neut ritos no ane Os grup is teciduais Os grupo <0,05).
Não hou
ura 6 – Núm emia hepát
os: A - laparo xigenoterapia bárico e isque < 0,05) compa 0,05) compar olunas represen
mulo de n e MPO no l trófilos por exo 2.
os B, C e D de MPO su os C e D ap
uve diferenç
mero relativ tica segmen
tomia e manip a hiperbárica
mia/reperfusã arado aos grup rado ao grupo ntam a média
neutrófilos obo inferior
miligrama
D, de anim uperiores ao presentaram
ça significan
vo de neutr ntar e 30 m
pulação do pe e isquemia/re ão hepática. pos A e B.
A.
e desvio padr
no tecido r do pulmão de tecido.
mais submet o grupo A (P m valor médi
nte entre os
rófilos/mg d minutos de r
edículo, B - is eperfusão hep
rão.
pulmonar o direito do Os valores
idos a IR h P<0,05).
io de MPO
grupos C e
de tecido p reperfusão
quemia/reperf pática e D –
foi avali os animais e s estão repre
hepática, ap
maior em r
D. ulmonar ap hepática (n fusão hepática – pré-condicio ado pela expressa com
esentados n
presentaram
relação aos
pós 30 min n = 8 anima
a; C - pré-con onamento em
análise da mo número na FIG. 7 e
m médias de
grupos A e
nutos de ais/grupo).
ndicionamento m ar ambiente
5.6 Mortalidade
6 Discussão
A LIR do fígado, originada da privação temporária de fluxo sanguíneo e aporte de oxigênio ao parênquima hepático, baseia-se em complexa inter-relação entre os leucócitos, células de Kupffer, plaquetas e células endoteliais sinusoidais, com participação de proteases, lipoperoxidases, mediadores inflamatórios, espécies reativas de oxigênio, oxido nítrico, complemento, entre outros (Jaeschke, 1997; Yadav et al., 1999; Chan et al., 2003; Miranda et al., 2004).
Buscando inibir estas alterações inflamatórias que se originam do binômio IR, vários métodos cirúrgicos, medicamentosos ou físicos têm sido utilizados: oclusão intermitente do pedículo hepático (Makuuchi et al., 1987; Isozaki et al., 1992), pré-condicionamento isquêmico (Lloris-Carsi et al., 1993), ligadura seletiva intra-hepática do pedículo (Launois e Jamieson, 1992), resfriamento do fígado (Collins et al., 1969; Ross et al., 1976), substâncias antioxidantes (Atalla et al., 1985; Baker et al., 1985; Frederiks et al., 1995; Abdo et al., 2003), inibidores das proteases (LI et al., 1993), imunossupressores (Sakr et al., 1990; Kurokawa et al., 1992; Kawano et al., 1994), agonistas de receptores da adenosina (Nakayama et al., 1999), doadores de óxido nítrico como a L-arginina (Cottart et al., 1999), pentoxifilina (Rudiger e Clavien, 2002), inibidores da caspatase (Cursio et al., 1999) e inibidores da ação do fator de ativação plaquetária (Boin, 1997).
O pré-condicionamento isquêmico, inicialmente descrito para diminuição dos efeitos da LIR do miocárdio (Murry, 1986), é método eficaz na profilaxia da LIR do fígado (Clavien et al., 2000; 2003).
No presente estudo foi utilizado a OH como método de pré-condicionamento de ratos submetidos a isquemia hepática temporária seletiva e reperfusão e avaliou-se seu efeito na LIR do fígado por meio da dosagem sérica de AST, ALT e DHL, avaliação de variação de PAM e inferência do grau de infiltração leucocitária pela dosagem da MPO tecidual no fígado submetido à isquemia e no pulmão.
Optado por modelo experimental de isquemia hepática seletiva, como forma de se evitar os efeitos deletérios da oclusão total do pedículo, que causa congestão esplâncnica, pouco tolerada nesta espécie animal (De Baker, 1956). A oclusão total do pedículo é apropriada para estudos em que a curva de sobrevida constitui variável a ser avaliada (Kohli et al., 1999).
Estudos foram realizados com tempos de isquemia hepática que variam de 30 minutos a 4 horas e com tempos e formas de reperfusão variáveis (Marubayashi et al., 1997; Boin, 1997; Quireze, 2002). Em todos os modelos houve alterações das enzimas hepáticas poucos minutos após a reperfusão. No presente estudo foi escolhido tempo de 30 minutos de isquemia e 30 minutos de reperfusão, suficientes para causar alterações séricas de aminotransferases e infiltração leucocitária nos tecidos.
Estudos recomendam anticoagulação sistêmica por injeção endovenosa de heparina, forma de se evitar trombose vascular secundária a oclusão do pedículo hepático, (Colleti et al., 1996; Marubayashi et al., 1997). No entanto, estudos recentes contestam esta afirmativa (Kohli et al., 1999; Peralta et al., 2001). Diante da inexistência de padronização com relação ao seu emprego, e como forma de se evitar sangramento per-operatório, optou-se pela não utilização da anticoagulação sistêmica no presente estudo.
Foi realizada reposição hídrica dos animais com solução de NaCl 0,9% com o objetivo de evitar que os efeitos da hipovolemia pelas perdas originadas da exposição da cavidade peritoneal, respiração artificial, colheitas de sangue, transpiração e diurese pudessem somar aos efeitos deletérios da isquemia e da reperfusão do fígado.
As aminotransferases (AST e ALT) são enzimas que, em concentrações elevadas, indicam lesão hepatocelular, apontando alterações de permeabilidade da membrana citoplasmática. A DHL, enzima presente em quase todos os tecidos e com concentração sérica elevada em situações de agressão celular, tem alta sensibilidade, porém, baixa especificidade para indicar qual órgão está acometido (Reichling e Kaplan, 1988; Sherlock e Dooley, 1997).
no nível sérico destas enzimas nas amostras sanguíneas colhidas ao término da isquemia. Nos trabalhos citados a colheita de sangue foi realizada antes da isquemia e após a reperfusão.
São esperadas alterações dos níveis da PAM após a oclusão do pedículo hepático, mesmo que segmentar, já que a interrupção do fluxo hepático causa estase sanguínea esplâncnica e diminui o retorno venoso ao coração, com conseqüente diminuição do débito cardíaco. O retorno do fluxo sanguíneo à porção isquemiada do fígado causa liberação de substâncias vasodilatadoras na circulação sistêmica, diminuição da resistência vascular periférica e conseqüente queda da pressão arterial. No presente estudo não houve queda significativa da PAM durante a isquemia hepática. Ocorreu queda significativa da PAM após a reperfusão hepática, rapidamente revertida nos animais submetidos a IR sem pré-condicionamento, porém persistente nos animais submetidos a pré-condicionamento por OH ou ar ambiente hiperbárico. Estes achados contradizem estudo experimental prévio, em animais submetidos a IR hepática imediatamente após OH, com um período de 60 minutos de isquemia e 120 minutos de reperfusão, no qual os animais tratados apresentaram menor queda dos níveis pressóricos após a reperfusão quando comparados ao grupo controle (Chen et al., 1988). Talvez, esta diferença se explique pela utilização de períodos de IR maiores que os utilizados em nosso estudo, o que causaria lesão tecidual mais intensa, exacerbando os efeitos hemodinâmicos da LIR.
As células de Kupffer têm papel central na LIR do fígado por serem as primeiras células citotóxicas e produzirem mediadores pró-inflamatórios tais como TNF-α e IL-6. Subseqüentemente, há transmigração de neutrófilos polimorfonucleares ativados no fígado. Pode-se utilizar dosagem tecidual de MPO como método de quantificação do acúmulo leucocitária (Bradley et al., 1982; Rivera-Chaves et al., 2001; Liu et al., 2004).
pode-se inferir que esta alteração foi associada à OH e não ao aumento da pressão ambiental isoladamente. Não há na literatura estudo semelhante que avalie esta variável.
Baseado nos achados que após choque hemorrágico e síndrome do compartimento abdominal há grande infiltração de leucócitos no parênquima pulmonar (Resende Neto, 2003), o presente utilizou a infiltração de leucócitos no pulmão como variável de avaliação da OH na LIR.
A concentração tecidual da MPO foi maior no pulmão dos animais submetidos previamente à OH e ao ar ambiente hiperbárico. O resultado foi diferente do encontrado na avaliação do fígado e sugere que o ambiente hiperbárico causou aumento de infiltração leucocitária no pulmão após a reperfusão na LIR, embora não se possa excluir a participação do oxigênio. Na revisão da literatura não foram encontrados estudos da participação do pré-condicionamento OH nas alterações pulmonares da LIR hepática. Estudo experimental demonstrou que OH utilizada após a IR muscular induziu redução da concentração de leucócitos pulmonares (Zamboni et al., 1996).
7 Conclusão
8 Summary
Liver ischemia/reperfusion injury (IR injury) is a cellular and immunological insult. It occurs in various clinical situations in which blood flow to the liver is interrupted. Hyperbaric oxygenation (HO) has been used as a treatment option in several ischemic diseases. However the effectiveness of this method as protective against IR injuries is controversial.
To determine the effect of HO in IR liver injury, a model of partial warm liver ischemia was used. Hilar area of the left lateral and medial hepatic lobes were clamped for 30’ minutes followed by 30’ reperfusion.
For the study was conducted on 32 male Wistar rats which divided into four groups of eight animals each: group A – animals submitted to laparotomy and liver manipulation, group B – animals submitted to IR, group C – animals pre-treated with 90 minutes of HO before IR and group C – animals pre-treated with room air at 2,5 atm absolute before IR. Before ischemia episode and after 30 minutes of reperfusion, plasma aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) and lactate dehidrogenase (LDH) analyses were performed. Intra-arterial blood pressure was monitored continuously. Myeloperoxidase (MPO) activity in liver and lung were assessed after 30 minutes of reperfusion.
AST, ALT and LDH increased after reperfusion in all the animals. ALT values and MPO activity in the liver parenchyma of HO pre-treated animals were higher than in groups A,B and D. Lung parenchyma MPO activity was higher in HO treated animal groups C and D. HO had negative hemodynamic effects during liver IR.
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