DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR
PROSPECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE GENES
ASSOCIADOS AO PROCESSO DE INDUÇÃO FLORAL EM
CANA-DE-AÇÚCAR
CRISTIANE MIRANDA FURTADO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR
PROSPECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE GENES
ASSOCIADOS AO PROCESSO DE INDUÇÃO FLORAL EM
CANA-DE-AÇÚCAR
Cristiane Miranda Furtado
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.
Orientadora: Dra. Kátia Castanho Scortecci
AGRADECIMENTOS
A Dra. Kátia Castanho Scortecci, pela orientação, amizade, sábios conselhos e grande apoio sem os quais este trabalho não existiria.
Aos amigos Francinaldo e Raquel por terem me ajudado bastante durante todas as etapas de realização deste trabalho;
A prof. Dr. Adriana Uchoa, pela colaboração na etapa final do trabalho, transmitindo seus ensinamentos com toda sua paciência que tanto admiro;
Aos professores desta pós-graduação pelos conhecimentos e esclarecimento de dúvidas, transmitidos ao longo do período de disciplinas;
Aos amigos do grupo de Genética Molecular de Plantas: Viviane, Daiane, Thiago, Thauli, Adilson, Renata, Valeska(s) e atualmente Angélica e Andréia, pelo companheirismo e amizade construída;
Aos amigos de laboratório LBMG pela agradável convivência;
Ao Abraão, pelo apoio, compreensão, paciência, amizade, e acima de tudo pelo amor que temos um pelo outro;
Aos meus pais e irmãos que sempre estiveram do meu lado, me dando total apoio e estabilidade para que pudesse continuar seguindo em frente;
A todos aqueles, que de alguma forma, contribuíram e colaboraram para a realização deste trabalho sou bastante grata;
RESUMO
A região nordeste é responsável por 14,32% da produção nacional de cana-de-açúcar. Esta contribuição reduzida é devido às condições edafo-climáticas da região. A floração é um processo vital para a planta que consome muita energia e culmina num fenômeno denominado de isoporização do colmo. Esta isoporização pode acarretar numa redução de até 60% na produção de álcool e açúcar. Considerando que a cana-de-açúcar cultivada corresponde a um híbrido com o genoma octaploide, existem variedades com um padrão de florescimento precoce até um padrão de não florescimento. Utilizando este potencial genético natural presente nas diferentes cultivares de cana-de-açúcar na região nordeste, o objetivo do presente trabalho foi de compreender como ocorre esse processo de floração por meio da metodologia de bibliotecas subtrativas. O RNA total foi extraído utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) de ápices meristemáticos de cultivares com florescimento precoce induzida e não induzida e outra com florescimento tardio. A partir deste RNA total foram construídas as quatro bibliotecas subtrativas (B1 – florescimento precoce induzida subtraída da tardia não-induzida; B2 – florescimento tardio não-induzida subtraído da precoce induzida; B3 – precoce induzida subtraída da precoce não-induzida; B02 – precoce não-induzida subtraída da precoce induzida), utilizando os kits Super Smart cDNA syntesis e o kit BD Clontech PCR select cDNA subtraction (Clontech). Este material foi clonado no vetor pGEM T-easy (Promega) e transformados em células competentes de E. coli DH10B. A análise das seqüências
obtidas foi realizada utilizando o programa BLASTn contra o banco de dados do NCBI e do genoma de Arabidopsis thaliana, arroz e milho. Os clones foram agrupados em 9
ABSTRACT
The northeastern region is responsible to 14.32% of sugarcane national production. This lowered contribution is due to edaphoclimatic condition. Flowering is a vital process to plant which consumes lots of energy and it culminates in a process called isoporization. This one can give in a decreasing of 60% on alcohol and water production. It may consider that cropped sugarcane has a hibrid with octaploid genome, there are varieties with a flowering standard until of non flowering. Using this natural genetic potential on different croppings of sugarcane, the aim of this work was to understand as this process occurs by the usage of subtractive approaches. The total RNA was extracted using Trizol of peaks of merisematics of croppings with induced flowering and other with late flowering. From this total RNA were built four subtractives libraries (B1- induced early flowering subtracted on late flowering not induced; B2- late flowering not induced subtracted induced early flowering; B3- induced early flowering subtracted of not induced early flowering; B02- not induced early flowering subtracted from induced early flowering) using kits Super Smart cDNA synthesis and BD Clontech kit select cDNA subtraction (Clontech). This material was clone don vector pGEM T-easy(Promega) and changed in competent cells of E.coli DH10B. Given analysis sequence was carried out a program BLASTn against database of NCBI and genome of Arabidopsis thaliana, rice
LISTA DE ABREVIATURAS
µg – micrograma µL – microlitro Ad.1 – adaptador 1 Ad.2 – adatador 2
AG - AGAMOUS AGL - AGAMOUS like AP 1/2/3 – APETALA 1/2/3
ATP - adenosina trifosfato
CAL - CAULIFLOWER
CCA1 - CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED
CDD - Conserved Domain Database
cDNA - cadeia de DNA complementar a seqüência do mRNA cm - centímetros
CO - CONSTANS
CRYPTOCHROMES 1/2- CRY1/2
DEPC - diethylpyrocarbonate DNA - ácido desoxirribonucléico
dNTP - desoxirribonucleotídeos trifosfato D.O - Densidade ótica
DTT – dithiothreitol
EDTA - ácido etilenodiaminotetracético
ELF3 - EARLY FLOWERING 3 EMF - EMBRYONIC FLOWERING
EST - do inglês “expressed sequence tag”
FKF1 – FLAVIN-BINDING KELCH REPEAT F-BOX FLC - FLOWERING LOCUS C
FRI - FRIGIDA
GA - ácido giberélico GI - GIGANTEA h – hora
KCL - cloreto de potássio KOAc - acetato de potássio KV – quilovolts
LB - meio nutritivo para cultura de bactérias Lurian Bertami
LD - LUMINIDEPENDENS
LD-PCR – do ingles “Long Distance-PCR”
LEA - LATE EMBRYOGENESIS ABUNDANT LFY - LEAFY
LHY - LATE ELONGATED HYPOCOTYL
M – molar min - minuto mg – miligrama
MgCl2 - Cloreto de magnésio mL - mililitro
mM - milimolar
mRNA - RNA mensageiro n - número de cromossomo ng - nanograma
NaCl - cloreto de sódio NaOH - hidróxido de sódio nm - nanometro
PCR - reação da polimerase em cadeia
PHYTOCHROMES A/B- PHYA/B PI – PISTILLATA
RGL1 - gibberellin regulatory protein
RT-PCR -reação da polimerase em cadeia mediada pela transcriptase reversa SDS - dodecil sulfato de sódio
SEP 1/2/3 - SEPALLATA 1/2/3
SOC1 - SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANST1
SUCEST – do inglês “Sugarcane Expressed Sequence Tag” (Progeto genoma da cana-de-açúcar).
TAS3 - auxin response factor TFL 1- TERMINAL FLOWER 1
TIF5A - translation initiation factor 5A TOC1 - TIMING OF CAB
tRNA- RNA transportador
Tris - tri-hidroximetil aminometano V – volts
VIN3 - VERNALIZATION-INSENSITIVE3 VRN 1/2 - VERNALIZATION 1/2
U - unidade
UFO - UNUSUAL FLORAL ORGANS
X – vezes
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Via conhecida de genes que promovem a floração em A. thaliana. A via
relacionada ao fotoperíodo é mostrada em vermelho; a via da giberelina está apresentada em amarelo; a via autônoma e de vernalização pode ser observada na cor azul; na cor lilás observa-se a via dependente de sacarose; em verde escuro estão os genes da identidade do meristema e em verde claro estão os genes do da identidade dos órgãos e as interações mútuas (Figura retirada de Blázquez, 2000)...
06
Figura 2. Resposta ao processo de indução floral de acordo com o fotoperíodo. As plantas de dias curtos florescem quando expostas menos a luz do que ao escuro, e quando expostas a um longo período na luz (claro) escuro não florescem. Plantas de dias longos florescem apenas quando expostas a uma maior quantidade de luz do que de escuro. Cor amarela representa dia (claro) e azul a noite (escuro)...
08
Figura 3. Modelo “ABCDE” de identidade dos órgãos florais (Figura modificada de Ferrario et al., 2004). A) Os fatores transcricionais das classes A, B, C, D e E possuem atividades sobrepostas em dois verticilos florais adjacentes. B) Esquema
demonstrando as alterações homeóticas nos mutantes de cada uma das classes... 13
Figura 4. Plantação de cana-de-açúcar no mesmo período do desenvolvimento. a) Variedade que quase nunca floresce; b)Variedade com florescimento precoce, destacando a sua inflorescência... 17
Figura 5. Similaridade entre a formação dos órgãos florais em monocotiledônea (a) e dicotiledônea (b)... 18
Figura 6. Transição do meristema durante o desenvolvimento do milho. (a) Transição do meristema apical vegetativo para o meristema da inflorescência. (b) A inflorescência do milho produz três tipos de meristemas axiais. Cada meristema de ramificação produz duas espículas meristemais. As duas espículas meristemais ramificam formando o meristema floral (McSteen et al., 2000)...
19
Figura 7. Etapas de construção da Biblioteca Subtrativa... 26
Figura 8. Meristema apical da cana-de-açúcar em diferentes períodos de coleta. A) Variedade não-induzida. B) Variedade induzida. As setas indicam os meristemas apicais de variedades não induzidas (preto) e induzidas (vermelho)...
36
Figura 9. Eletroforese em gel de agarose das amostras de RNA de cana-de-açúcar. RNA total das variedades SP 81-3250 induzida (A1) e não-induzida (A2). (A3) RNA total da variedade RB 75-126. As setas indicam a presença de rRNA, e o mRNA pode ser visualizado através de rastros...
37
Figura 10. cDNA purificado e digerido com a enzima de restrição Rsa1 das amostras SP 81-3250 induzida (A1 e A3) e não induzida (A2) e RB 75-126 não-induzida (A4) visualizados através de eletroforese em gel de agarose 1,2%. (M) Marcador de peso molecular...
38
Figura 11. Eficiência da ligação aos adaptadores visualizada através de eletroforese em gel de agarose 1,2%. (A1-A6) Amostras correspondentes à variedade RB 75-126 não-induzida, (A7-A12) Variedade SP 3250 induzida; (B1-B6) Variedade SP 81-3250 induzida; (B7-B12) Variedade SP 81-81-3250 não-induzida...
Figura 12. Eletroforese em gel de agarose 1,2% das amostras de PCR após a hibridização subtrativa. As amostras A1 (subtraído) e A2 (não-subtraído – controle), e A3(subtraído) e A4 (não-subtraído) correspondem às bibliotecas B1 e B2 respectivamente; as amostras A6 (subtraído) e A7 (não-subtraído), e A8 (subtraído) e A9(não-subtraído) correspondem às bibliotecas B3 e B4 respectivamente. A5 e A10 representam o controle com subtração bem sucedida provido pelo kit (setas amarelas). (M) Marcador de peso molecular...
41
Figura 13. Classificação funcional dos clones obtidos nas bibliotecas subtrativas utilizando uma variedade precoce induzida e uma tardia não-induzida. a) 3250 induzida - B1; b) 126 não-induzida - B2... 43
Figura 14. Classificação funcional dos clones obtidos nas bibliotecas subtrativas utilizando apenas uma variedade precoce induzida e não-induzida. a) 3250 induzida – B3; b) 3250 não-induzida – B4... 45
Figura 15. Conservação dos domínios funcionais GRAS entre as seqüências analisadas. Esta figura apresenta os domínios funcionais observados como resultante da pesquisa no CDD com as possíveis seqüências de aminoácidos. Os retângulos correspondem a domínios conservados e os que aparecem incompletos, referem-se a domínios truncados...
53
Figura 16. Alinhamento da seqüência de aminoácidos de RGL1 usando o programa
ClustalW. Aminoácidos idênticos são indicados em vermelho, os fortemente similares em verde. Os gaps introduzidos pelo programa para otimizar o alinhamento são
indicados pelos traços. As regiões de conservação coincidem com uma parte do domínio GRAS...
54
Figura 17. Árvore filogenética das seqüências referentes à proteína CIGR em Cana-de-açúcar,Zea mays (milho) e Oryza sativa (arroz). Para a construção da árvore foi
utilizado o método da Parcimônia. Os valores de bootstrap são indicados em cada nó, referentes ao consenso de 1000 réplicas...
58
Figura 18. Conservação dos domínios funcionais RING entre as seqüências analisadas. Esta figura apresenta os domínios funcionais observados como resultante da pesquisa no CDD com as possíveis seqüências de aminoácidos. Os retângulos correspondem a domínios conservados e os que aparecem incompletos, referem-se a domínios truncados...
59
Figura 19. Alinhamento da seqüência de aminoácidos de zinc-finger usando o programa ClustalW. Aminoácidos idênticos são indicados em vermelho, os fortemente similares em verde e os pouco similares em azul. Os gaps introduzidos pelo programa para otimizar o alinhamento são indicados pelos traços...
60
Figura 20. Árvore filogenética das seqüências referentes uma proteína zinc-finger
em Cana-de-açúcar (Zinc-finger_cana), A. thaliana (A.thalian), Zea mays (milho) e Oryza sativa (arroz). Para a construção da árvore foi utilizado o método da
Parcimônia. Os valores de bootstrap são indicados em cada nó, referentes ao consenso de 1000 réplicas...
62
Figura 21. Conservação dos domínios funcionais AUX_IAA identificado entre as seqüências analisadas de cana-de-açúcar, arroz, milho, Medicago truncatula e Arabidopsis thaliana, resultante da pesquisa no CDD. Os retângulos correspondem a
domínios conservados e os que aparecem incompletos, referem-se a domínios truncados...
Figura 22. Alinhamento da seqüência de aminoácidos de TAS3 no programa ClustalW. Aminoácidos idênticos são indicados em vermelho, os fortemente similares em verde e os pouco similares em azul. Os gaps introduzidos pelo programa para otimizar o alinhamento são indicados pelos traços. O domínio funcional AUX_IAA estão destacados em um retângulo azul...
64
Figura 23. Árvore filogenética das seqüências referentes uma proteína TAS3 em Cana-de-açúcar (S.officinarum), A. thaliana (A.thalian), Zea mays (milho) e Oryza sativa (arroz). Para a construção da árvore foi utilizado o método da Parcimônia. Os
valores de bootstrap são indicados em cada nó, referentes ao consenso de 1000 réplicas...
69
Figura 24. Genes identificados nas bibliotecas de cana-de-açúcar (circulados pelas cor verde) que possivelmente estão associados a via fotoperiódica da indução floral proposta por Blázquez, (2000)...
72
Figura 25. Genes identificados nas bibliotecas de cana-de-açúcar (circulados pela cor verde) que possivelmente estão associados à via da giberelina da indução floral proposta por Blázquez, (2000)...
76
Figura 26. Gene identificado em uma das bibliotecas de cana-de-açúcar (circulado por cor de rosa) envolvido na via autônoma proposta por Blázquez, (2000)... 78
Figura 27. Genes identificados nas bibliotecas de cana-de-açúcar (circulados por cor de rosa) que possivelmente estão interagindo com os genes da identidade do meristema e da indução dos órgãos florais proposta por Blázquez, (2000)...
LISTA DE TABELAS
Pág.
Tabela 1. Bibliotecas Subtrativas obtidas a partir de uma variedade que nunca floresce e outra que floresce precocemente e entre uma precoce induzida e não induzida...
27
Tabela 2. Teste de eficiência de ligação de adaptadores. Cada uma das 6 reações foram realizadas para as amostras 1, 2, 3 ou 4... 29
Tabela 3. Lista dos componentes utilizados para a primeira hibridização... 30
Tabela 4. Proteínas identificadas nas bibliotecas agrupados na classe metabolismo.. 46
Tabela 5. Proteínas identificadas nas bibliotecas agrupados na classe de Transporte, Comunicação celular e mecanismos de transdução de sinais... 47
Tabela 6. Proteínas identificadas nas bibliotecas agrupados na classe de defesa celular e virulência... 47
Tabela 7. Proteínas identificadas nas bibliotecas agrupados na classe do ciclo celular (controle e desenvolvimento)... 48
Tabela 8. Proteínas identificadas nas bibliotecas agrupados na classe de fatores de transcrição... 48
Tabela 9. Proteínas identificadas nas bibliotecas agrupados na classe de síntese de proteínas e proteínas destinadas à modificação... 49
Tabela 10. Proteínas identificadas nas bibliotecas agrupados na classe energia... 49
Tabela 11. Proteínas identificadas nas bibliotecas relaciodadas a Proteínas não conhecidas ou não identificadas em bancos de dados ou com qualidade inferior a 50%...
50
Tabela 12. Índices de identidade e similaridade da seqüências RGL1 de
cana-de-açúcar com as seqüências identificadas nos bancos de dados de milho, arroz,
M.truncatula e A. thaliana...
56
Tabela 6. Índices de identidade e similaridade da proteína “zinc-finger” de
cana-de-açúcar com as seqüências identificadas nos bancos de dados de milho, arroz, e A. thaliana...
Tabela 7. Índices de identidade da proteína “TAS3” de cana-de-açúcar com as seqüências identificadas nos bancos de dados de milho, arroz, A. thaliana e M.truncatula...
SUMÁRIO
pág.
1. INTRODUÇÃO... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Cana-de-açúcar... 3
2.2 Floração... 4
2.3 Famílias gênicas envolvidos com o processo de floração... 13
2.4 Floração em cana-de-açúcar... 15
3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral... 21
3.2 Objetivos específicos... 21
4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Coleta do material... 22
4.2 Obtenção das bactérias competentes DH10B... 22
4.3 Extração do RNA total... 23
4.4 Síntese do cDNA... 24
4.5 Construção da biblioteca subtrativa... 25
4.6 Clonagem e Transformação de bactérias... 31
4.7 Extração do DNA plasmidial em pequena escala... 32
4.8. Reação de seqüênciamento... 33
4.9. Mineração dos dados... 34
5. RESULTADOS 35 5.1 Extração do RNA total, obtenção do cDNA e construção da biblioteca subtrativa... 36
5.2 Validação das bibliotecas... 41
5.3 Análise das seqüências... 41
5.4 Análise “in silico” e filogenética de alguns genes... 51
6. DISCUSSÃO... 70
7. CONCLUSÃO... 83
