Detecção molecular de Streptococus agalactiae em amostras de leite bovino obtidas de tanques de expansão

DETECÇÃO MOLECULAR DE Streptococcus

agalactiae EM AMOSTRAS DE LEITE BOVINO

OBTIDAS DE TANQUES DE EXPANSÃO.

DETECÇÃO MOLECULAR DE Streptococcus

agalactiae EM AMOSTRAS DE LEITE BOVINO

OBTIDAS DE TANQUES DE EXPANSÃO.

Tese apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, Área de Saúde Animal, Saúde Pública Veterinária e Segurança Alimentar, para obtenção do título de Doutor em Medicina Veterinária.

Orientador : Prof. Titular Helio Langoni

A U ryet h Elias:

“...que a saudade dói como um barco

que aos poucos descreve um arco

e evit a at racar no cais”

A

Aos meus pais, José e Luiza, por todas as oportunidades que me foram dadas, por respeitarem as minhas escolhas e pelo apoio incondicional. A vocês ofereço cada passo da minha vida e cada sucesso.

Ao professor Helio Langoni, mestre e, sobretudo, amigo. Aquele cuja dedicação a nós, seus pupilos, ao ensino da medicina veterinária e a saúde pública são uma inspiração. Exigente, cuidadoso e sábio, muito obrigada pela oportunidade.

Aos demais professores do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da FMVZ – Botucatu, pelo convívio e colaboração a minha formação.

Ao Prof. Dr. Leonardo José Richtzenhain, quem concedeu a oportunidade de, temporariamente, fazer parte de sua equipe no LBMAS/USP, seu trabalho e dedicação são exemplos e sua equipe, espelhos dele.

A minha irmã Beatriz e a Sérgio Lima, pelos momentos em família, apoio e compreensão nesses meses de ausência. E por terem trazido ao mundo a minha maior alegria, o pequeno José.

A Carolina Jorge e Simone Iwabe, pela amizade e amor compartilhados nesses longos anos. “Irmãs” e companheiras em todos os momentos. A distância física é sempre difícil de suportar, mas dentro nossos caminhos sempre haverá um lugar para conversas, desabafos e incentivos mútuos.

A grande amiga que esteve ao meu lado em todos os momentos desse caminho, Letícia Lyra, que fez de sua casa o “meu” lar e com isso permitiu que pudesse desfrutar de sua generosidade, sabedoria, caráter e companheirismo. Em retribuição a tudo o que vivemos durante esses anos e por ter me incentivado, com seu exemplo, a ser uma pessoa melhor, minha gratidão e amor.

A Juliana Machado, por ser simples, honesta, direta e amiga. O mundo sob seus olhos é melhor e mais justo, portanto, muito obrigada por me fazer merecedora dele.

A amigas do “G8”: Fernanda Brunsizian, Cristina Fernandes, Cristina Berreta, Débora Aguiar, Alessandra Sapoznic e Patrícia Costa. Conversas, conselhos, experiências compartilhadas e muito respeito a verdade e às individualidades, todas vocês são especiais.

Ao Professor Antônio Fernandes Filho, coordenador do curso de Medicina Veterinária da UNISA: pelo apoio e, principalmente, exemplo de bondade, dedicação e fé, em seus cinqüenta anos de vida acadêmica.

Aos professores: Enio Pedoni Bandarra, Nereu Carlos Prestes e Roberto de Oliveira Roça, pelo estímulo durante a minha graduação. Um dia quero conseguir contribuir de forma ao menos parecida, para com meus alunos.

Aos amigos do departamento: Tatiana, Melissa, Fabio, Luciano, Patrícia, Audrey, Amanda, André, Liguito, Juliano, Benedito, Marcella, Gustavo, Roberto e, especialmente, a Rodrigo, pelo auxílio na formatação desse trabalho.

Ao amigo Aristeu Vieira da Silva, sábio, amigo, incentivador e generoso. Lembrar hoje daquele primeiro dia de aula de anatomia e dos anos que se seguiram a ele só aumenta minha admiração.

Ao Prof. Dr. Paulo Eduardo Brandão, pela paciência na hora das tantas perguntas, por ensinar, estimular, compartilhar e divertir-se com meus primeiros passos dentro do “mundo molecular”.

A técnica do LABMS, Sheila Oliveira de Souza, com quem convivi diariamente durantes alguns meses e que tanto me auxiliou e incentivou. Ganhei conhecimento e uma nova e querida amiga.

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Tabela1. Resultados da reação em cadeia pela polimerase para S.agalactiae segundo o resultado do exame microbiológico para S.agalactiae (UFC/mL ≥ 1). Botucatu. 2007...53 Tabela2. Estimativas de sensibilidade, especificidade e concordância da reação em cadeia pela polimerase para S. agalactiae em relação ao resultado do exame microbiológico para S.agalactiae (UFC≥1). Botucatu. 2007...54 Tabela3. Resultados da reação em cadeia pela polimerase para S. agalactiae segundo o resultado do exame microbiológico (contagem total de bactérias). Botucatu. 2007...55 Tabela4. Resultados da reação em cadeia pela polimerase para S. agalactiae segundo o resultado do exame microbiológico (contagem total de bactérias). Botucatu. 2007...55

Tabela 5. Percentil 25 (P25), mediana (Md) e percentil 75 (P75) para os valores de UFC de Streptococcus agalactiae e UFC total de amostras de leite coletadas em tanques de expansão. Botucatu, 2007...56

L

% – por cento µL – microlitros µm – micrometros

CBT – contagem bacteriana total

CCS – contagem de células somaticas células/mL – células por mililitro

CMT – California Mastitis Test DNA – ácido desoxirribonucléico

EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético et al. – e colaboradores

g/mL – gramas por mililitro H2S – sulfeto de hidrogênio L – litro

M – Molar mg – miligrama mL – mililitro mM –milimolar o_{C – graus Celsius}

PCR – reação em cadeia pela polimerase pmols – picomols

RNA – ácido ribonucléico rpm – rotações por minuto SDS – dodecil sulfato de sódio Taq – Thermus aquaticus

TRIS – Tris (hidroximetil)-amino-metano

Tris HCL - Tris (hidroximetil)-amino-metano, com ácido clorídrico U – unidades internacionais

UFC/mL – unidades formadoras de colônia por mililitro UI – unidades internacionais

V – volts

S

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1- INTRODUÇÃO...26

2- REVISÃODELITERATURA...28

2.1 MASTITE BOVINA.....29

2.2 O GÊNERO Streptococcus......30

2.2.1 Streptococcus agalactiae de origem animal... 31

2.2.2 Características das mastites por S.agalactiae... 32

2.2.3 Prevalência da mastite bovina por S.agalactiae... 33

2.2.4 Identificação do Streptococcus agalactiae nas mastites... 34

2.2.4.1 Amostras individuais dos animais do rebanho ... 34

2.2.4.2 Amostras do leite total do rebanho (tanque de expansão)... 35

2.2.4.3 Amostras do leite total submetidas ao diagnóstico molecular... 37

2.2.5 Tratamento das mastites por S.agalactiae... 38

3 - OBJETIVOS...40

4 - MATERIALEMÉTODOS...42

4.1. Colheita das amostras...43

4.2. Análise Microbiológica...44

4.2.1. Cultivo das amostras... 44

4.2.2. Identificação microbiológica do Streptococcus agalactiae... 44

4.2.3. Amostra bacteriana padrão... 45

4.3. Contaminação experimental do leite e da solução salina... 46

4.3.1. Obtenção do inóculo de Streptococcus agalactiae ... 46

4.3.2. Contaminação experimental solução salina e cultivo microbiológico...46

4.3.3 Contaminação experimental do leite e cultivo microbiológico ... 46

4.4 Técnicas de biologia molecular para a pesquisa de S. agalactiae....47

4.4.1 Pesquisa de DNA de Streptococcus agalactiae no leite de amostras de tanque de expansão... 47

4.4.1.1 Extração de ácidos nucléicos... 47

4.4.1.3 Otimização da temperatura de annealing dos oligonucleotídeos V1

e V2 direcionados para a região 16S rRNA... 48

4.4.1.4 Amplificação do DNA de S.agalactiae utilizando os oligonucleotídeos C1 e C2 direcionados à região 16S rRNA ... 49

4.4.1.5 Visualização do produto amplificado... 49

4.4.2 Pesquisa de DNA de Streptococcus agalactiae em solução salina experimentalmente contaminada ... 50

4.4.3 Pesquisa de DNA de Streptococcus agalactiae no leite experimentalmente contaminado. ... 50

4.4.4 Controles... 50

5 - RESULTADOS...51

5.1 Resultados do cultivo microbiológico das amostras de leite do tanque de expansão...52

5.2 Resultados do cultivo microbiológico e PCR da contaminação experimental do leite e da solução salina...52

5.3 Resultados do cultivo microbiológico e PCR para amostras de leite dos tanques de expansão...53

6 - DISCUSSÃO...59

6.1 Exames microbiológicos...60

6.1.1 Método de conservação das amostras de leite a campo. ... 60

6.1.2 Presença de resíduos ... 61

6.1.3 Streptococcus agalactiae no leite ... 62

6.1.4 Unidades formadoras de colônias por mililitro de leite... 63

6.2. Resultados do exame molecular...65

6.2.1 Aplicação da técnica da PCR... 65

6.2.2 Escolha dos oligonucleotídeos... 67

6.2.3 Avaliação estatística da PCR em relação ao exame microbiológico68 7 - CONCLUSÕES...70

8 - REFERÊNCIAS...72

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ELIAS, A.O. Detecção molecular de Streptococcus agalactiae em amostras de leite bovino obtidas de tanques de expansão. Botucatu, 2007. 80p. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Botucatu, São Paulo.

índice κ=0,6686 ± 0,0477 (IC95% = 0,5752 – 0,7620), indicou substancial concordância entre as provas, sugerindo que a PCR de amostras do leite do tanque de expansão pode ser utilizada como um método auxiliar no diagnóstico de mastite contagiosa por S.agalactiae.

A

ELIAS, A.O. Molecular detection of Streptococcus agalactiae from bovine milk bulk tank samples. Botucatu, 2007. 80p. Thesis – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Botucatu, São Paulo.

1 - I

O sistema agro-industrial do leite é um dos mais importantes do país, devido a sua enorme importância social. A atividade é praticada em todo o território nacional em mais de um milhão de propriedades rurais e, somente na produção primária, gera acima de três milhões de empregos e agrega mais de seis bilhões ao valor da produção agropecuária nacional. Três importantes particularidades marcaram o setor leiteiro nacional, principalmente na última década: o aumento da produção, a redução do número de produtores e o decréscimo dos preços recebidos pelo produto (VILELA et al., 2002).

O leite bovino é um excelente alimento pelo seu valor nutritivo, conferido principalmente pela presença de proteínas, carboidratos, gorduras, sais minerais, vitaminas e água (FRAZIER; WESTHOFF, 1978). Do ponto de vista de saúde pública, tanto o leite como seus derivados ocupam lugar de destaque em nutrição humana, pois são alimentos essenciais para todas as idades, principalmente recém-nascidos (OLIVEIRA et al.,1999). No entanto, a sua composição química pode ser alterada por uma série de fatores, tais como potencial genético, idade e alimentação do animal, estágio de lactação, variações climáticas, infecções do úbere e, ainda, fatores relacionados à forma de obtenção e armazenamento (OLIVEIRA; CARUSO, 1984; MULLER, 2002). Do ponto de vista tecnológico, a qualidade da matéria prima é um dos maiores entraves ao desenvolvimento e consolidação da indústria de laticínios no Brasil (OLIVEIRA et al.,1999).

2 – R

2.1 MASTITE BOVINA

A mastite bovina é a inflamação do tecido mamário é caracterizada por alterações físico-químicas, bacteriológicas do leite e patológicas da mama, evidenciadas pelo aumento de células somáticas do leite e alterações do tecido glandular mamário (RADOSTITS et al., 2002). Pode ter várias causas, porém, a infecciosa é a mais freqüente e geralmente as bactérias são os principais agentes (LANGONI, 1995), porém fungos e algas (COSTA et al., 1992; LANGONI et al., 1992, 1998) também podem estar envolvidos.

O processo inflamatório da glândula mamária pode ser de evolução aguda a crônica, apresentar-se nas formas subclínica e clínica, na dependência dos sinais da inflamação. Epidemiologicamente, a forma subclínica é mais importante, pois pode permanecer silenciosa no rebanho, sem alterações macroscópicas do úbere e secreção (BLOOD; RADOSTITS, 1991).

A forma subclínica da mastite caracteriza-se por ocorrer numa propriedade com alta prevalência, acometendo grande parte do rebanho. Não apresenta sintomas aparentes e são diagnosticadas normalmente, pelo California Mastitis Test (CMT), segundo SCHALM; NOORLANDER (1957), pelo exame microbiológico e pela contagem de células somáticas (CCS). Os seus efeitos na composição do leite são muito significativos, embora este possa parecer normal ao exame visual (PHILPOT, 1984).

2.2 O GÊNERO Streptococcus

Nos esquemas taxonômicos tradicionais, os estreptococos pertencem à família Streptococcaceae. Esses microrganismos são bactérias gram-positivas, catalase negativas, que tendem a crescer em pares ou cadeias. Nos últimos anos, a taxonomia dos estreptococos e de bactérias similares a eles foi submetida a uma exaustiva revisão e ampliação. A localização taxonômica da família Streptococcaceae foi questionada, e os números de diferentes espécies de estreptococos e de bactérias aumentaram. As alterações foram baseadas na aplicação de técnicas genéticas que incluem hibridização DNA-DNA, hibridização DNA-RNA ribossômico (rRNA) e o sequenciamento da subunidade do rRNA (16S). O sequenciamento dessa subunidade passou a ser o procedimento mais significativo para delinear as inter-relações filogenéticas desses microrganismos. Esse método foi inicialmente utilizado para validar a divisão da família Streptococcaceae nos gêneros Streptococcus, Enterococcus e Lactococcus e, na atualidade, é aplicado às espécies individuais para determinar grupos de microrganismos relacionados aos três gêneros (GREISEN et al., 1994; BAELE et al., 2001; KONEMAN et al., 2001).

A composição da parede celular dos estreptococos é similar à de outras bactérias gram-positivas, sendo formada primariamente de glicopeptídeo, no qual estão inseridos diversos carboidratos, ácidos teicóicos, lipoproteínas e proteínas antigênicas de superfície. Algumas espécies de estreptococos podem ser classificadas sorologicamente com base nos carboidratos antigênicos superficiais. O trabalho pioneiro de Rebecca Lancefield estabeleceu o sistema de agrupamento de Lancefield para os estreptococos β-hemolíticos, que detecta antígenos constituídos de polissacarídeos de parece celular (S.agalactiae) ou ácidos lipoteicóicos (KONEMAN et al., 2001).

são denominados Ia, Ib, II, III, IV, V e VI, e o antígeno protéico é designado apenas pela letra c. A carência de anticorpos contra esses antígenos tipo-específicos é um fator fundamental para o desenvolvimento de doenças produzidas por estreptococos do grupo B. As cepas do tipo III, encontradas nos casos de mastite bovina, possuem um componente estrutural que parece estar associado ao aumento da virulência, o ácido siálico (ácido N-acetilneuroamínico). A presença do mesmo na superfície do microrganismo inibe a ativação da via alternativa do complemento e evita a fagocitose; a remoção do ácido siálico com neuraminidase leva à ativação do complemento, fagocitose e morte intracelular dos microrganismos (KONEMAN et al., 2001, TORTORA et al., 2005).

2.2.1 Streptococcus agalactiae de origem animal

O Streptococcus agalactiae (grupo B de Lancefield) é um parasito contagioso obrigatório da glândula mamária, onde pode sobreviver por longos períodos de tempo (OLIVER; MITCHELL, 1984; KEEF, 1997). Em 1889, Nocard e Mollereau fizeram o primeiro isolamento da espécie no leite de vacas com mastite e o identificaram como Streptococcus nocardi, relatos indicam que, previamente ao uso da penicilina nas mastites, os estreptococos eram reportados como causadores de 90% das mastites bovinas (KEEF, 1997).

Essa espécie estreptocócica apresenta habilidade de aderência ao tecido mamário e o microambiente específico do úbere é necessário para o crescimento bacteriano (WANGER; DUNNY, 1984). A virulência das diferentes estirpes pode ser relacionada com a diferença na habilidade de cada uma delas em aderir-se ao epitélio mamário (JAIN, 1979)

O Streptococcus agalactiae também é agente etiológico de septicemia neonatal em humanos e essas infecções geralmente são adquiridas de fontes humanas, porém, pode existir um risco associado com exposição à animais infectados ou a produtos dos mesmos. De forma geral existe uma similaridade entre as estirpes isoladas (WAGNER; DUNNY, 1984; BOHNSACK et al., 2004).

2.2.2 Características das mastites por S.agalactiae

O S.agalactiae causa em sua maioria mastites subclínicas que tendem a forma crônica. Os rebanhos com mastite contagiosa, em geral, apresentam alta CCS, marcada redução na produção e na qualidade do leite (NMC, 1996).

Relatos de Ward; Schultz (1972) e Wanasinghe; Frost (1979) apontaram respectivamente, média de 900.000 células, e valores acima de 500.000 células/mL de leite. Já Elias et al. (2005), avaliando amostras individuais de animais obtiveram uma média de 2.288.000 células/mL.

No tocante a produção de leite, Domingues (1998), observou que em quartos mamários mastíticos infectados por Streptococcus agalactiae, em comparação com seus homólogos negativos, houve uma redução de 25,2% na produção de leite, o que reafirma a sua relevância como agente nas mastites e a importância das ações de controle, especialmente aquelas relacionadas com a desinfecção, levando-se em consideração a sua alta contagiosidade.

Animais infectados pelo S.agalactiae apresentam alterações na glândula mamária que afetam a qualidade do leite. Há tendência do aumento da densidade (g/mL) acarretado pela queda na produção, o aumento da concentração protéica (%) pela presença de proteínas séricas e o aumento do teor de cloretos (%) (ELIAS et al., 2005).

A disseminação dos patógenos entre os animais ocorre principalmente pelas mãos dos ordenhadores, utensílios de uso comum e equipamentos de ordenha, contaminados a partir do leite de animais infectados (NMC, 1996).

patógenos normalmente são adotadas de forma concomitante nos rebanhos (SMITH et al., 1985).

2.2.3 Prevalência da mastite bovina por S.agalactiae

Estudos sobre a prevalência do agente vêm sendo conduzidos mundialmente desde o início dos estudos sobre as mastites. Sua prevalência é muito variada e dependente da adoção individual de medidas de controle e prevenção das mastites, especialmente das contagiosas, nas propriedades.

Em um levantamento realizado durante um período de 16 meses no Canadá, Keefe et al. (1997) avaliaram amostras de tanque em 452 rebanhos bovinos, testadas em dois momentos diferentes e seus resultados interpretados paralelamente, obtiveram uma prevalência de S.agalactiae de 17,7% e 13,1% respectivamente. Em pesquisa realizada na Alemanha Tenhagen et al. (2006) avaliaram 80 rebanhos e observaram a presença de Streptococcus agalactiae em 29% deles.

No estado de Nova York, USA, em estudo em 1.601 fazendas e 105.083 animais, a prevalência de cultivos microbiologicamente positivos foi de 48,5% e o S.agalactiae foi isolado em cultivo puro ou em associação com outros agentes em 10,1% das amostras (WILSON et al., 1997).

Em levantamento de âmbito nacional na Finlândia (PITKÄLÄ et al., 2004), com a finalidade de estabelecer a prevalência dos agentes etiológicos das mastites, vários anos após um programa nacional de controle e erradicação, um total de 12.661 amostras de 3.282 vacas em 261 propriedades apresentaram uma prevalência de 0,1%. Nos EUA, em Wisconsin, em programas semelhantes a prevalência do agente caiu de 8,1% no ano de 1994 para 3% em 2001 (MAKOVEC; RUEGG, 2003).

Em estudo realizado em Portugal, na região de Ribatejo-Oeste, por Bexiga et al. (2005), encontraram entre os 2.881 animais estudados uma prevalência de 3,9% do agente entre as amostras de leite de animais com mastite subclínica.

nas propriedades onde medidas de controle e prevenção de patógenos contagiosos são precárias.

LANGENEGGER et al. (1970) encontraram 24,7% de S.agalactiae dentre as 429 vacas com exame microbiológico positivo. Já Nader-Filho et al. (1983) obtiveram 10,42% de S.agalactiae em rebanhos produtores de leite B.

Em estudo realizado em 702 amostras de leite de vacas com mastite subclínica (LANGONI et al., 1990), o S.agalactiae foi isolado em 3,7% em cultura pura ou em associação com outros agentes. Filippsen et al. (1999), avaliaram 20 propriedades no estado do Paraná com um total de 1.319 amostras e observaram 0,61% de prevalência de S.agalactiae.

Em pesquisa realizada por Brito et al. (1999), avaliando 48 rebanhos no estado de Minas Gerais, entre as 3.919 amostras de leite microbiologicamente positivas para diversos agentes etiológicos das mastites, observaram dentre eles 6,9% de S.agalactiae.

Estudando 302 amostras de leite bovino, positivos ao teste do CMT Lucheis; Langoni (2000) obtiveram 69,2% de amostras positivas ao cultivo bacteriano, com uma prevalência de S.agalactiae de 5,5%.

Bueno et al. (2003), avaliaram rebanhos na região de Pirassununga, estado de São Paulo e dentre as 543 amostras individuais de leite cru, obtiveram taxa de isolamento para Streptococcus sp. de 17,5% e, dentre elas, 63,8% de S.agalactiae.

2.2.4 Identificação do Streptococcus agalactiae nas mastites

2.2.4.1 Amostras individuais dos animais do rebanho

obra para um número elevado de amostras, principalmente pela atual tendência dos produtores ao aumento do número de animais em lactação.

2.2.4.2 Amostras do leite total do rebanho (tanque de expansão)

Dentre os testes diagnósticos para mastites, um dos mais utilizados nas amostras do tanque de expansão é a contagem de células somáticas e a contagem bacteriana total. Uma alta e persistente CCS no leite indica problemas de mastites no rebanho. Estima-se que para cada 100.000 células/mL, aproximadamente 10% das vacas do rebanho apresentem mastite (RYAN, 1991) mas, essa prova não esclarece totalmente o tipo de patógeno envolvido na enfermidade e essa informação é fundamental para a implementação de medidas de controle nos rebanhos.

O cultivo do leite do tanque tem sido usado como um método de triagem para a presença de patógenos das mastites nos rebanhos. Uma das vantagens do método é a redução do número de amostras a serem processadas, em contrapartida, apresenta limitações como: ausência de um teste padrão para coleta e cultivo das amostras, que vão desde a forma da coleta (local do tanque a ser amostrado) volume de leite para análise, número e freqüência de amostragens. Além disso, várias técnicas e meios de cultivo podem ser utilizados, incluindo o uso de meios diferenciais e seletivos, o que pode levar a procedimentos complexos e aumento no tempo de processamento e, consequentemente, na obtenção dos resultados.

Nos EUA estudos sobre a prevalência de rebanhos infectados por S.agalactiae, utilizando o cultivo do leite total do rebanho, segundo vários autores, têm sido conduzidos há várias décadas. Assim como a detecção de patógenos contagiosos das mastites, a quantificação da UFC/mL no leite do tanque também fornece informações essenciais. Tais informações dizem respeito não apenas à presença de patógenos causadores de mastites, mas também é um indicativo da higiene com que o leite é processado na propriedade.

No Brasil, em anos recentes, tem-se adotado a coleta de leite a granel. Nesse sistema, o leite cru é armazenado em tanques de expansão a 4ºC por até 48 horas e transportado para a indústria em caminhão com tanque isotérmico (ARCURI et al., 2006).

A Instrução Normativa 51, de 18 de setembro de 2002, aprovou regulamentos técnicos de produção, identidade e qualidade do leite, assim como sua coleta e transporte. No quesito “Contagem padrão em placas (CPP), expressa em UFC/mL (mínimo de uma análise mensal, com média geométrica sobre período de três meses)” estabelece como parâmetro para as regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste, entre os anos de 2005 a 2007, uma contagem máxima de 1 x 106 UFC/mL, e a partir de 2008, 7,5 x 105 UFC/mL (BRASIL, 2002).

2.2.4.3 Amostras do leite total submetidas ao diagnóstico molecular

O desenvolvimento de técnicas de biologia molecular, como a reação em cadeia pela polimerase (PCR) propicia um método de detecção e identificação direta de patógenos (MEYER et al, 1991). Como o método não depende da presença de microrganismos viáveis, pode ser aplicado em amostras submetidas a processos inadequados de conservação, o que impossibilitaria em muitos casos o isolamento por métodos convencionais de cultivo.

A técnica de PCR apresenta três etapas distintas a saber: extração do ácido nucléico, sua amplificação e posterior visualização do produto. O desempenho satisfatório da técnica depende, entre outros, da escolha acertada dos oligonucleotídeos e da técnica utilizada na extração do ácido nucléico da amostra (COLLINS et al, 1994).

São múltiplas as ocasiões em que se pode observar um número suficiente de seqüências estáveis em regiões variáveis que permitem o desenho de oligonucleotídeos espécie-específicos que podem ser utilizados com o objetivo de diagnóstico (GREISEN et al., 1994).

Para a identificação de estreptococos de origem bovina várias técnicas de PCR, utilizando amplificações de seqüências espécie-específicas, vêm sendo testadas, como do gene sodA (ALBER et al., 2004), o gene tuf (PICARD et al., 2004) o gene do fator CAMO (MERL et al., 2003), a região intergênica 16S rRNA (BAELE et al., 2001), o gene 16S rRNA (JAYARAO et al., 1991,1992, 2001; MEIRI-BENDEK et al., 2002; MERL et al., 2003), o gene 23S rRNA (KAWATA et al., 2004) e o espaço intergênico entre esses dois últimos genes (FORSMAN et al., 1997; PHUEKTES et al., 2001).

de leite bovino, apesar de no último caso, em menor número (BOHNSACK et al., 2004).

2.2.5 Tratamento das mastites por S.agalactiae

Um bom programa de controle deve ter como metas principais, erradicar as mastites contagiosas por Streptococcus agalactiae, controlar as por Staphylococcus aureus, manter baixos os índices de mastites ambientais, contagens de células somáticas abaixo de 200.000/mL de leite, menos de 2% de episódios clínicos ao mês e 85% das vacas livres de mastite subclínica. Para alcançar estas metas é necessário atuar sobre a fonte de infecção, detectando adequadamente as vacas com mastite subclínica e clínica, tratando-as corretamente e eliminando os animais com infecções crônicas. Em relação aos animais susceptíveis procurar a seleção de vacas naturalmente mais resistentes e propiciar o fornecimento de alimentação equilibrada aos animais. Deve-se atuar ainda sobre as vias de transmissão das mastites, implantando um manejo correto e higiene de ordenha e manter as vacas em ambiente seco e limpo (MULLER, 2002).

O tratamento da mastite subclínica durante o período de lactação é considerado antieconômico devido ao custo com o diagnóstico, medicamentos, descarte do leite, proporção do medicamento que será diluído e eliminado com o leite na ordenha e subsequentemente a taxa de cura bacteriológica insatisfatória. A recomendação internacionalmente aceita, é efetuar o tratamento da mastite subclínica na última ordenha, no final do período de lactação do animal, ao iniciar-se o período seco (COSTA, 2002).

Nos casos de infecções por estreptococos ambientais podem ser observadas curas espontâneas de forma freqüente. O mesmo não acontece quando o microrganismo envolvido é o S.agalactiae, pois recomenda-se a utilização de antibióticos para a redução da prevalência de infecções crônicas, sendo o manejo considerado essencial nos casos de isolamento do agente (SEARS; MACCARTY, 2003)

publicados ainda na década de 80, sugeriam que a utilização indiscriminada dos antimicrobianos possibilitou a seleção de clones resistentes do agente (BERGHASH et al., 1983). Porém, a maioria dos antimicrobianos comerciais disponíveis no mercado, apresentam desempenho satisfatório na cura microbiológica para o agente, e a penicilina G continua sendo uma das drogas de eleição (BERGHASH et al., 1983). Owens et al. (1997) reportaram uma taxa de cura para S.agalactiae de 91% usando uma associação de penicilina G e novobiocina em tratamentos feitos durante a lactação e no momento da secagem.

A chamada “blitz terapia” pode fazer parte do programa de estratégias de controle e erradicação do Streptococcus agalactiae e baseia-se na identificação dos animais infectados, pelo cultivo microbiológico individual de cada teto, e subseqüente tratamento da mastite ou descarte. Esse procedimento necessariamente deve ser combinado com melhorias no manejo da ordenha, do equipamento de ordenha e medidas de controle para evitar a disseminação do agente. Uma vez estabelecidas estas medidas, os animais a serem introduzidos no rebanho devem ser escolhidos de forma cuidadosa e submetidos a testes diagnósticos para o agente (ANDERSEN et al., 2003). Após a erradicação do agente, o monitoramento periódico do rebanho, pela avaliação do leite do tanque de expansão, é de fundamental importância.

3 - O

1. Avaliar a prevalência do S.agalactiae nos rebanhos estudados;

2. Avaliar a contagem bacteriana total no leite do tanque dos rebanhos estudados;

3. Avaliar a eficiência da reação em cadeia pela polimerase na detecção de S.agalactiae como teste diagnóstico no leite do tanque, com relação ao cultivo microbiológico.

4 - M

4.1. Colheita das amostras

Foram colhidas 247 amostras de leite, provenientes do tanque de expansão de 247 propriedades rurais situadas no sudoeste do estado de Minas Gerais, todas fornecedoras de leite à Cooperativa Agrícola do Sudoeste Mineiro (CASMIL), sediada no município de Passos, correspondendo cada uma delas ao total de leite produzido por cada propriedade no período máximo de 24 horas.

As propriedades possuíam características diversas no tocante a raça bovina explorada, número de animais em lactação e manejo. Os critérios de seleção das propriedades basearam-se na obrigatoriedade da utilização de equipamento mecânico de ordenha para a extração do leite e do tanque de expansão, utilizado para seu o armazenamento.

4.2. Análise Microbiológica

4.2.1. Cultivo das amostras

O cultivo foi realizado no Laboratório do NUPEMAS, onde as amostras em estado puro e nas diluições 10-1 _{e 10}-2 _{e 10}-3 _{foram cultivadas em ágar} sangue bovino a 10%, espalhando-se 0,1 mL de leite por toda a superfície da placa com auxílio de bastões de vidro estéreis, permitindo a contagem das colônias após incubação à 37o_{C, com observação do desenvolvimento} microbiano às 24, 48 e 72 horas. O resultado foi multiplicado pelo fator da diluição correspondente à contagem e, assim, determinado o valor de UFC/mL das amostras.

O critério de classificação dos resultados foi assim determinado: amostras passíveis de contagem até 1x106 em todas as diluições e amostras que excederam esse valor foram categorizadas entre 1x106 e 1x107 (MORAES et al., 2005).

4.2.2. Identificação microbiológica do Streptococcus agalactiae

Dentre as colônias observadas e quantificadas no procedimento supracitado, foram selecionadas aquelas suspeitas de se tratarem de Streptococcus agalactiae. Portanto, colônias pequenas, com ao redor de 0,5 a 1 mm, translúcidas e apresentando alfa ou beta hemólise, foram repicadas para verificação microscópica, em esfregaços corados pelo método de Gram. As espécies estreptocócicas são evidenciadas pela apresentação em cocos que ocorrem isolados, em pares ou em cadeias de diferentes comprimentos. No tocante a característica tintorial, como todo microrganismo gram-positivo, sua parede celular é constituída por uma grossa camada de peptídeoglicano, que retém o corante cristal violeta (corante inicial) no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona, possibilitando a visualização de células com coloração violeta escuro (QUINN et al., 1994; KONEMAN et al., 2001).

e trealose, e o crescimento em NaCl a 6,5% e a interpretação foi realizada de acordo com o quadro abaixo (QUINN et al., 1994).

QUADRO 1 – Resultados das reações bioquímicas para identificação de Streptococcus agalactiae isolados de espécies animais (modificado de QUINN et al, 1994).

Reação Bioquímica Resultado da prova

Inulina negativo Lactose positivo Rafinose negativo

Salicina (positivo) Sorbitol negativo Trealose positivo Hipurato de sódio positivo

Hidrólise de esculina negativo Crescimento em NaCl a 6,5% negativo

( ) = maioria das estirpes positivas

4.2.3. Amostra bacteriana padrão

4.3. Contaminação experimental do leite e da solução salina para a realização da sensiblidade analítica do cultivo microbiológico e da PCR.

Os procedimentos referentes ao item 4.3 foram realizados no Laboratório de Bacteriologia e Micologia do VPS-USP.

4.3.1. Obtenção do inóculo de Streptococcus agalactiae

A amostra padrão citada no item 4.2.3 foi cultivada em agar sangue bovino a 10% e, após um período de incubação de aproximadamente 36 horas, as colônias de Streptococcus agalactiae foram transferidas com auxílio de alça de platina para tubo de vidro contento 5 mL de solução salina estéril, até se conseguir uma turvação correspondente ao valor 1,0 da escala de MacFarland.

4.3.2. Contaminação experimental da solução salina e cultivo microbiológico

Da solução obtida no item 4.3.1, após homogeneização em vórtex por 20 segundos, 0,5 mL foram transferidos a um tubo de vidro com 4,5 mL de solução salina estéril. A partir desse, da mesma forma, 0,5 mL, foram transferidos subsequentemente a outros tubos, até se atingir a diluição 10-8 _, descartando-se no final 0,5mL da suspensão.

De cada uma das oito diluições 0,1 mL foram cultivados em agar sangue bovino a 10%, volume esse espalhado por toda a superfície da placa com auxílio de bastões de vidros estéreis. Após incubação por 24 horas a 37oC observou-se o desenvolvimento bacteriano em estado puro e, feita sua quantificação, o resultado foi multiplicado pelo valor correspondente a cada diluição.

4.3.3 Contaminação experimental do leite e cultivo microbiológico

estéril, sabidamente negativo tanto ao diagnóstico microbiológico quanto molecular para o Streptococcus agalactiae. A partir desse, o mesmo volume de 0,5mL foram transferidos subsequentemente a outros tubos contendo 4,5 mL de leite estéril, procedendo-se assim até atingir uma diluição 10-8 _.

O cultivo microbiológico e a contagem bacteriana foram procedidos da mesma forma descrita no item 4.3.1

4.4 Técnicas de biologia molecular para a pesquisa de Streptococcus

agalactiae.

Todos os procedimentos referentes ao diagnóstico molecular desse experimento foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular Aplicada às Sorologias (LBMS) da FMVZ – USP – São Paulo.

4.4.1 Pesquisa de DNA de Streptococcus agalactiae no leite de amostras de tanque de expansão.

4.4.1.1 Extração de ácidos nucléicos

As 247 amostras de leite estudadas, que estavam congeladas, foram deixadas em temperatura ambiente até atingirem aproximadamente 20°C. A extração do DNA de Streptococcus agalactiae foi realizada pela lise celular por proteinase K e extração por fenol/clorofórmio (modificado de GUIDO, 2003) e consta do Anexo 1.

4.4.1.2 Oligonucleotídeos iniciadores para a detecção do S.agalactiae Os oligonucleotídeos espécie-específicos utilizados para a amplificação de Streptococcus agalactiae (V1 e V2) foram descritos por Meiri-Bendek, et al. (2002). São direcionados ao gene codificador do 16S rRNA.

QUADRO 2 - Seqüência de oligonucleotídeos para a espécie Streptococcus agalactiae e o gênero Streptococcus spp. e os respectivos tamanhos dos fragmentos esperados (MEIRI-BENDEK et al., 2002).

Oligonucleotídeos Seqüência

Tamanho do fragmento esperado em pares de bases V1 5′-TTTGGTGTTTACACTAGACTG-3′

V2 5′-TGTGTTAATTACTCTTATGCG-3′ 120 C1 5′-GCGTGCCTAATACATGCAA-3′

C2 5′-TACAACGCAGGTCCATCT-3′ 207

4.4.1.3 Otimização da temperatura de annealing dos oligonucleotídeos V1

e V2 direcionados para a região 16S rRNA

Para verificar a temperatura de annealing dos oligonucleotídeos descritos no item 4.4.1.2, o DNA de uma amostra de leite contendo 100 UFC/mL, foi extraído e a PCR foi realizada.

A reação enzimática foi realizada em um volume final de 25 µL contendo 2,5µL do DNA extraído, 200 µM de cada dNTP’s, 12,5 pmoles de cada primer V1 e V2, 1x Tampão de PCR (20mM Tris-HCl, 50mM KCl, PH 8,4), 1,5 mM MgCl2, e 1,25 U de Taq DNA polimerase platinum (Invitrogen-Gaythersburg, USA) e água ultra-pura q.s.p. em um termociclador que permite a utilização de diferentes temperaturas durante o annealing dos oligonucleotídeos. As temperaturas testadas foram 42,5ºC; 43,2ºC; 44,6ºC; 46,7ºC; 49,1ºC, 51,8ºC; 54,5ºC; 57,1ºC; 59,5ºC; 61,3ºC; 62,6ºC.

4.4.1.4 Amplificação do DNA de S.agalactiae utilizando os oligonucleotídeos C1 e C2 direcionados à região 16S rRNA

A PCR foi realizada em um volume final de 25 µL contendo 2,5µL do DNA extraído, 200 µM de cada dNTP’s, 12,5 pmoles de cada primer C1 e C 2, 1x Tampão de PCR (20mM Tris-HCl, 50mM KCl, PH 8,4), 1,5 mM MgCl2, e 1,25 U de Taq DNA polimerase platinum (Invitrogen-Gaythersburg, USA) e água ultra-pura q.s.p.

As condições da reação de PCR utilizando os oligonucleotídeos C1 e C2 foram realizadas conforme descritas por Meiri-Bendek et al. (2002), 94°C / 4 minutos, 5 ciclos de 94°C por 45 segundos, 58°C por 45 segundos e 72°C por 45 segundos, 20 ciclos de 94°C por 45 segundos, 54°C por 45 segundos e 72°C por 45 segundos, seguida por uma extensão final de 72°C por 5 minutos. A reação foi realizada em termociclador PTC-200 DNA Engine (MJ Research Inc®_).

4.4.1.5 Visualização do produto amplificado

Os produtos de amplificação foram analisados por eletroforese, em cuba horizontal com a utilização de gel de agarose a 1,5% imerso em tampão Tris-Borato-ETDA (0,04M Tris-Borato, 1mM EDTA). A corrida foi realizada em voltagem adequada às dimensões de cada gel (1 a 10V/cm2).

Após a corrida o gel foi corado em solução de brometo de etídio (5µ/mL) (SAMBROOK et al., 1989) e a visualização dos fragmentos amplificados foi realizada por transiluminação do gel em luz ultravioleta.

A avaliação comparativa dos fragmentos foi feita com um padrão de marcador molecular de 100 pares de bases, disposto no gel juntamente com todas as amostras analisadas em cada eletroforese.

4.4.2 Pesquisa de DNA de Streptococcus agalactiae em solução salina experimentalmente contaminada

A solução salina experimentalmente contaminada, assim como suas diluições foram submetidas à extração de ácidos nucléicos, amplificação do DNA bacteriano e visualização do produto amplificado utilizando-se técnicas e diluições idênticas às descritas nos itens 4.4.1.1, 4.4.1.2 e 4.4.1.3 e 4.4.1.5.

4.4.3 Pesquisa de DNA de Streptococcus agalactiae no leite experimentalmente contaminado.

As amostras de leite experimentalmente infectadas, assim como suas diluições foram submetidas à extração de ácidos nucléicos, amplificação do DNA bacteriano e visualização do produto amplificado utilizando-se técnicas e diluições idênticas às descritas nos itens 4.4.1.1, 4.4.1.2 e 4.4.1.3 e 4.4.1.5.

4.4.4 Controles

5 – R

Dentre as 247 amostras, em 13 (5,2%) não foi observado qualquer crescimento bacteriano, entretanto em 3 (1,2%) delas foi detectado o S.agalactiae pela PCR. Por outro lado em 12 (4,8%) o S.agalactiae não foi observado em crescimento bacteriano, porém foi detectado pela PCR. Em 12 (4,8%) amostras o agente foi detectado pelo cultivo bacteriano e foram, respectivamente, negativos à PCR.

5.1 Resultados do cultivo microbiológico das amostras de leite do tanque de expansão.

O resultado dos cultivos microbiológicos de todas as amostras analisadas encontram-se no Anexo 2. O resultado da média das unidades formadoras de colônias totais foi de 1,08x106 _UFC/mL.

Houve isolamento e identificação positiva para S.agalactiae em 97 das 247 amostras examinadas. A prevalência foi de 39,67% e média das contagens de S.agalactiae dos tanques onde foi isolado o agente, de 777,8UFC/mL.

5.2 Resultados do cultivo microbiológico e PCR da contaminação experimental do leite e da solução salina

As contaminações experimentais do leite e da solução salina pelo S.agalactiae resultaram na contagem de 10 x 104 UFC/mL do agente e diluições em base 10 foram feitas até o esgotamento das diluições.

A sensibilidade analítica obtida na PCR das soluções da contaminação experimental, utilizando os oligonucleotídeos V1 e V2 , direcionados para a região 16S rRNA foi de 2 UFC/mL, tanto para o leite quanto para a solução salina.

5.3 Resultados do cultivo microbiológico e PCR para amostras de leite dos tanques de expansão.

Os resultados de todas as amostras submetidas ao cultivo microbiológico e PCR com os oligonucleotídeos V1 e V2 encontram-se no Anexo 2.

As amostras com resultados negativos à PCR com os oligonucleotídeos V1 e V2 e positivos ao cultivo microbiológico foram submetidas à PCR com os oligonucleotídeos C1 e C2, apresentando também, com essa técnica, resultados negativos.

O cálculo da sensibilidade e especificidade relacionados à detecção molecular de S.agalactiae, considerando-se o cultivo microbiológico como padrão-ouro, pode ser observado na Tabela 1.

TABELA 1. Resultados da reação em cadeia pela polimerase para S.agalactiae segundo o resultado do exame microbiológico para S.agalactiae (UFC/mL ≥ 1). Botucatu. 2007.

Reação em cadeia pela polimerase

Positivo Negativo Total Positivo

(UFC ≥ 1) 84 14 98

Microbiológico

S.agalactiae Negativo

(UFC = 0) 26 123 149

Total 110 137 247

Estatística: não existe diferença significativa entre os resultados das provas, segundo o teste de McNemar (χ2_{=3,03; p=0,0820), com índice κ=0,6686 ± 0,0477 (IC95% =}

Os resultados das estimativas de sensiblidade, especificidade e concordância da PCR para o S.agalactiae em relação ao resultado do exame microbiológico pode ser observado na Tabela 2.

Tabela 2. Estimativas de sensibilidade, especificidade e concordância da reação em cadeia pela polimerase para S. agalactiae em relação ao resultado do exame microbiológico para S. agalactiae (UFC ≥ 1). Botucatu. 2007.

Resultado Estimativa ± erro-padrão

Intervalo de confiança 95%

Sensibilidade 0,8571 ± 0,0353 0,7719 – 0,9196 Especificidade 0,8255 ± 0,0311 0,7549 – 0,8827 Eficiência* 0,8381 ± 0,0234 0,7861 – 0,8817 Valor preditivo positivo 0,7636 ± 0,0405 0,6732 – 0,8394 Valor preditivo negativo 0,8978 ± 0,0259 0,8345 – 0,9430 Taxa de falsos-positivos 0,1745 ± 0,0311 0,1173 – 0,2451 Taxa de falsos-negativos 0,1429 ± 0,0353 0,0804 – 0,2281 Concordância de

resultados positivos 0,8077 ± 0,0298 0,7492 – 0,8662 Concordância de

resultados negativos 0,8601 ± 0,0219 0,8172 – 0,9031

O resultado da associação entre os valores de UFC/mL total das amostras e o resultado da PCR podem ser observados na Tabela 3 e na Tabela 4.

Tabela 3. Resultados da reação em cadeia pela polimerase para S. agalactiae segundo o resultado do exame microbiológico (contagem total de bactérias). Botucatu. 2007.

Reação em cadeia pela polimerase

Positivo Negativo Total UFC total

< 105 91 111 202

Microbiológico

UFC total

≥ 105 19 26 45

Total 110 137 247

Estatística: não foi verificada associação entre a UFC total e o resultado da PCR (χ2_{=0,0321, valor de P=0,8577).}

Tabela 4. Resultados da reação em cadeia pela polimerase para S. agalactiae segundo o resultado do exame microbiológico (contagem total de bactérias). Botucatu. 2007.

Reação em cadeia pela polimerase

Positivo Negativo Total UFC total

< 5.104 28 44 72

Microbiológico

UFC total

≥ 5.104 82 93 175

Total 110 137 247

Os valores de percentis (P25, P75) para os valores de UFC total e de S.agalactiae das amostras positivas e negtivas a PCR podem ser observados na Tabela 5 e 6.

Tabela 5. Percentil 25 (P25), mediana (Md) e percentil 75 (P75) para os valores de UFC de Streptococcus agalactiae e UFC total de amostras de leite coletadas em tanques de expansão. Botucatu, 2007.

UFC/S.agalactiae (x103) UFC/total (x103)

Amostras

P25 – Md – P75 P25 – Md – P75 Todas (n=247) 0,00 – 0,00 – 0,15 41,00 – 160,00 – 729,50 PCR + (=110) 0,03 – 0,20 – 0,83 48,50 – 160,00 – 500,00 PCR – (n=137) 0,00 – 0,00 – 0,00 30,00 – 159,00 – 802,00

Tabela 6. Percentil 25 (P25), mediana (Md) e percentil 75 (P75) para os valores de UFC de Streptococcus agalactiae e UFC total de amostras de leite microbiologicamente positivas para S. agalactiae, coletadas em tanques de expansão. Botucatu, 2007.

UFC/S.agalactiae (x103) UFC/total (x103)

Amostras

Exemplos da visualização dos produtos da amplificação podem ser observados nas Figuras 1 e 2.

Figura 1 – Reação em cadeia pela polimerase para detecção de DNA de Streptococcus agalactiae em amostras de leite bovino obtidas de tanques de expansão. Amostras amplificadas utilizando-se os oligonucleotídeos V1 e V2. Gel de agarose 1,5%. Botucatu, 2007.

Figura 2 – Reação em cadeia pela polimerase para detecção de DNA de Streptococcus spp em amostras de leite bovino obtidas de tanques de expansão. Amostras amplificadas utilizando-se os oligonucleotídeos C1 e C2. Gel de agarose 1,5%. Botucatu, 2007.

6 – D

6.1 Exames microbiológicos

6.1.1 Método de conservação das amostras de leite a campo.

Os efeitos deletérios às bactérias presentes nas amostras submetidas ao congelamento podem explicar os resultados microbiológicos negativos para UFC/mL total, observados nas amostras número: 71, 84, 122, 125, 141, 153, 210, 220, 221, 222, 223, 230, 234 (13 amostras), já que todas as amostras deste experimento foram submetidas ao congelamento por 72 horas e posterior cultivo para determinação da UFC/mL, isolamento e identificação de S.agalactiae.

As informações sobre o efeito do congelamento de amostras de leite face a viabilidade bacteriana são conflitantes. O método de congelamento viabiliza o transporte das amostras tanto das propriedades rurais, como dos centros de recebimento de leite, até o laboratório para o processamento adequado.

Segundo Schukken et al. (1989), o congelamento de amostras de leite não interferiu nos resultados de cultivo de estreptococos e S.aureus, quando as amostras foram estocadas por no máximo quatro semanas. Em outro estudo Murdogh et al. (1996), trabalhando com 45 amostras de leite que foram cultivadas a fresco, subsequentemente congeladas a menos 20°C e novamente cultivadas, semanalmente, durante seis semanas, não observaram alterações na contagem bacteriana dos patógenos causadores de mastites, incluindo o S.agalactiae, ao se compararem às amostras a fresco. Alguns estudos indicam que os coliformes e estreptococos ambientais seriam os mais afetados pelo congelamento das amostras, mas esse decréscimo no número de bactérias viáveis seria irrelevante à contagem global (DINSMORE et al., 1992).

Cocos gram-positivos apresentam crescimento em cachos ou cadeias e sugeriu-se que o congelamento poderia desfazer este agregado de células bacterianas, o que aumentaria a UFC/mL e, portanto, elevando a sensibilidade do teste microbiológico. As lises de macrófagos e neutrófilos, liberando as bactérias fagocitadas, também são citadas como possíveis causas do aumento da UFC.

Resultados de vários estudos, entretanto, afirmam que um tempo prolongado de congelamento pode afetar os resultados de cultivo, porém um período curto apresenta um impacto limitado nos resultados (SCHUKKEN et al., 1989; DISMORE et al., 1992; Murdough et al., 1996).

No presente estudo, os resultados sugerem que a conservação pelo congelamemto e o transporte do leite deve ter influenciado, ainda que em número restrito de amostras, o resultado obtido. Esse efeito pode ser minimizado se as amostras não forem submetidas à congelamento, reduzindo-se assim o tempo entre a colheita e o procedimento microbiológico. Entretanto, mesmo que esse efeito tenha ocorrido, a frequência de isolamentos está de acordo com a descrita na literatura.

6.1.2 Presença de resíduos

Outro fator que pode comprometer o crescimento bacteriano no leite é a presença de resíduos de antibióticos, que podem induzir a modificações nos resultados de análises laboratoriais, dando uma impressão errônea de boa qualidade do produto (McEWEN et al., 1991; ANDERSON et al., 1998; TALLEY, 1999; SAWANT et al., 2005).

das amostras com inibidores, sendo que em 28,0%, tratava-se da penicilina. Nascimento et al. (2001) encontraram em 96 amostras, 50% de positividade, sendo em 34% dos casos, resíduos de antibióticos beta-lactâmicos.

A correta sanitização dos equipamentos de ordenha e tanques de expansão são fundamentais para a qualidade do leite, porém durante esses processos, resíduos químicos podem permanecer tanto nas tubulações quanto no tanque. A presença dos resíduos, além de impróprios para o consumo humano, também pode levar a adulteração de provas como a de determinação da UFC/mL no leite. A escolha dos sanitizantes deve ser feita dentre aqueles comercialmente desenvolvidos com o propósito específico de limpeza e desinfecção dos equipamentos de extração e estocagem de leite. Os fabricantes dos produtos têm por dever estabelecer em suas embalagens os valores limites máximos de resíduos dos princípios ativos utilizados. Particularmente no tanque de expansão os resíduos tendem a não ser uniformes e ocasionalmente, água com resíduos de sanitizantes podem ficar acumulados e essa mistura ser incorporada ao leite (FDA, 2004).

6.1.3 Streptococcus agalactiae no leite

A presença do agente no leite total do rebanho indica que ele está sendo eliminado a partir de quartos mamários, pois seu único reservatório é o úbere infectado (OZ et al, 1985; GODKIN; LESLIE, 1993). A detecção do S.agalactiae no leite total do rebanho está condicionada a diversos fatores como a diluição, quando o leite de todo o rebanho é misturado, a quantidade de bactérias eliminadas pelas glândulas mamárias infectadas e o número de glândulas mamárias infectadas no rebanho (GODKIN; LESLIE, 1993). O padrão de eliminação dos agentes contagiosos da mastite pelas glândulas mamárias infectadas geralmente apresenta variabilidade, de modo que análises consecutivas de amostras submetidas ao exame microbiológico vem sendo preconizadas com o intuito de aumentar a sensibilidade da prova diagnóstica (SEARS et al., 1990; FARNSWORTH, 1997).

exame microbiológico, obtendo dentre elas apenas duas positivas para o S.agalactiae. No mesmo estudo, avaliando outro rebanho, composto de 55 animais em lactação, com 1,8% de animais infectados e 0,46% de quartos infectados, positividade em somente uma das três amostras analisadas.

6.1.4 Unidades formadoras de colônias por mililitro de leite

A obtenção do leite de vacas sadias, em condições higiênicas adequadas, e o seu resfriamento imediato a 4ºC são as medidas fundamentais e primárias para garantir a qualidade e a segurança do leite e seus derivados (ARCURI et al., 2006).

A média dos resultados dos cultivos microbiológicos foi de 1,08 x 106 UFC/mL, com valor mínimo de 1 x 103 a até superiores a 1 x 106.(entre 1 x 106 a 1 x 107). Essa média foi, certamente, influenciada pelas 20 amostras (8%) de leite que ficaram acima de 1x106_{. Esse tipo de resultado pode ser encontrado} com freqüência na literatura nacional. Moraes et al. (2005) avaliaram propriedades leiteiras e observaram que 25% delas apresentavam contagens acima dos padrões exigidos pela legislação e assim como neste estudo, o número máximo exato acima do padrão de 1x106 _{foi estimado, por estar acima} dos limites das diluições utilizadas. Já Beloti et al. (1999), ao avaliarem a qualidade microbiológica do leite cru no estado do Paraná, encontraram contagens médias de 7,5 x 106 _{UFC/mL. Nero et al. (2005), analisaram 210} amostras de leite cru de propriedades localizadas em quatro estados, obtiveram uma parcela significativa, 48,6% do total de amostras, com contagens acima do sugerido pela legislação e assim distribuídas: 21,3% na região de Viçosa (MG), 56,0% na região de Pelotas (RS), 47,6% na região de Londrina (PR) e 68,0% na região de Botucatu (SP). Arcuri et al. (2006), em Minas Gerais, obtiveram dentre os 24 rebanhos avaliados, 83% em concordância com a legislação vigente.

A utilização de tanques coletivos, pois a maior contaminação dessas amostras pode ser resultante da mistura de leite cru de origens e graus de contaminação diferentes. Além disso, deve-se considerar que contaminações adicionais e crescimento microbiano podem ocorrer durante o transporte do leite da propriedade até o local do tanque coletivo (PINTO et al., 2006).

O funcionamento adequado e a manutenção correta do tanque de expansão também pode influenciar a qualidade microbiológica do leite. De acordo com Bramley; McKinnon (1990), no leite refrigerado em temperatura menor ou igual a 4ºC, a multiplicação da microbiota total permaneceu controlada por no mínimo 24 horas, mantendo uma microbiota semelhante a do leite recém ordenhado.

Procedimentos de higienização inadequados no sistema de produção, considerando que resíduos de leite nas superfícies dos equipamentos constituem nutrientes para a multiplicação bacteriana, contato do leite com animais ou ambientes inadequados para a produção são também fatores que podem explicar a alta contagem bacteriana.

6.2. Resultados da PCR

6.2.1 Aplicação da técnica da PCR

No presente trabalho, houve uma concordância entre a prova microbiológica considerada padrão-ouro e a detecção molecular com concordância de resultados positivos de 0,8077 ± 0,0298 (IC95% 0,7492 – 0,8662) e de resultados negativos de 0,8601 ± 0,0219 (IC95% 0,8172 – 0,9031).

Vários autores sugerem uma tendência da PCR ser, num futuro breve, adotada como prova diagnóstica dentro dos programas de erradicação e controle das mastites, principalmente no diagnóstico das mastites contagiosas.

As vantagens associadas aos métodos microbiológicos tradicionais são que as bactérias viáveis podem ser isoladas e seguir-se a tal isolamento, um teste de sensibilidade microbiana, que fornece informações importantes para a seleção dos antibióticos utilizados no tratamento. Porém, várias desvantagens podem ser associadas à técnica: um resultado negativo ao cultivo pode ocorrer pela presença de resíduos de antibióticos no leite, por um reduzido número de patógenos viáveis na amostra ou pela presença de leucócitos no leite, nos casos de mastite clínica (PHUEKTES et al., 2001)

As limitações conferidas pelos métodos de cultivo levaram ao desenvolvimento de técnicas de PCR para a identificação dos agentes etiológicos das mastites. A técnica propicia uma opção promissora para uma rápida identificação bacteriana pela utilização de seqüências de DNA espécie-específicas, como o espaço ribossomal intergênico 16S-23S rRNA, altamente conservado. Além disso, a sensibilidade das técnicas baseadas na PCR apresenta uma tendência a ser superior que a do cultivo bacteriano tradicional (FORSMAN et al., 1997; PHUEKTES et al., 2003), permitindo a detecção de um número reduzido de microrganismos. Tais fatores são de extrema importância, principalmente quando se almeja uma identificação bacteriana acurada em tempo reduzido (CREMONESI et al., 2005).

decorrentes da inviabilidade do agente no leite ou por estar em número reduzido na amostra.

Diversos métodos de PCR para o leite têm sido desenvolvidos visando uma detecção sensível e específica de patógenos das mastites (FORSMAN et al., 1997; PHUEKTES et al., 2001; RIFFON et al., 2001; MEIRI-BENDEK et al., 2002; PHUEKTES et al., 2003; CREMONESI et al., 2005). O isolamento de um DNA de alta qualidade da bactéria alvo no leite, entretanto, é frequentemente problemático (PHUEKTES et al., 2001, RAMESH et al., 2002). Primeiramente, estas dificuldades podem ocorrer por uma amostra com pequena concentração do DNA procurado, e ainda, pelos vários fatores que influenciam o sucesso na recuperação do DNA, incluindo grau de lise celular, ligação do DNA a certos materiais e degradação ou segmentação do DNA. Particularmente no que diz respeito à microrganismos gram-positivos, como o S.agalactiae, o método de processamento das amostras considerado ótimo é aquele que promove a lise eficiente da parede bacteriana sem danificar o DNA alvo (BOOM et al., 1990). Essas informações auxiliam a interpretação dos resultados encontrados, pois dentre as amostras analisadas neste estudo, observou-se que um número reduzido apresentaram-se positivas ao cultivo microbiológico, porém negativas à PCR.

Outro fator que podem ter contribuído para a não detecção do DNA em amostras no presente estudo é que a detecção direta de bactérias patogênicas em amostras de alimentos (RAMESH et al., 2002) é prejudicada pela presença de substâncias inibidoras da PCR, frequentemente relacionadas com a própria matriz do alimento (ROSSEN et al., 1992). No leite, de forma particular, componentes como o Ca2+_{, proteinases, gordura e suas proteínas podem} bloquear o DNA e servir como um escudo, dificultando o acesso da polimerase (WILSON, 1997).

UFC/mL para o S.agalactiae, tanto em detecção na salina estéril como no leite, que consideraram suficiente para a não utilização de qualquer método de pré-enriquecimento para o agente. No presente estudo, houve uma diferença de detecção ao se utilizar a solução salina e o leite, ambos experimentalmente contaminados (1 UFC/mL em salina e 2 UFC/mL no leite).

A literatura reporta numerosos métodos para o isolamento de DNA bacteriano diretamente do leite, esses envolvem uma grande variedade de substâncias incluindo Chelex-100 (KIM et al., 2001), spin columns (PHUEKTES et al., 2001, 2003; RIFFON et al., 2001), lisozima e proteinase K (MEIRI-BENDEK et al., 2002), diatomaceous earth (MARTINEZ et al., 2001), extração alcalina (DALY et al., 2002) e pronase (ALLMANN et al., 1995; HEIN et al., 2001). Guido (2003) avaliou diversos protocolos de isolamento de DNA de Brucella abortus no leite e o protocolo com proteinase K escolhido para o presente estudo, foi o de melhor desempenho relatado pela pesquisa.

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6.2.2 Escolha dos oligonucleotídeos

Uma revisão de literatura orientou a seleção dos oligonucleotídeos, e tal escolha priorizou aquelas seqüências que haviam sido utilizadas em amostras de leite de tanque (MEIRI-BENDEK et al., 2002). Outros autores obtiveram êxito com oligonucleotídeos diferentes dos utilizados neste estudo, como Martinez et al. (2001), porém o fizeram a partir de leite experimentalmente contaminado por S.agalactiae de origem animal e/ou humana.

6.2.3 Avaliação estatística da PCR em relação ao exame microbiológico A ausência de diferença significativa entre os resultados das provas, segundo o teste estatístico utilizado, indica substancial concordância entre os resultados (χ2_{=3,03; p=0,0820), com índice κ=0,6686 ± 0,0477 (IC95% =} 0,5752 – 0,7620).

A sensibilidade é definida como a habilidade do teste identificar corretamente os rebanhos infectados e a especificidade, definida como a habilidade do teste em identificar corretamente os não-infectados (MARTIN et al., 1994). No presente estudo, considerando-se a prova microbiológica como padrão-ouro, a sensibilidade foi de 0,8571 ± 0,0353 (intervalo de confiança 95% de 0,7719 – 0,9196) e a especificidade 0,8255 ± 0,0311 (intervalo de confiança 95% de 0,7549 – 0,8827).

A sensibilidade e a especificidade são atributos intrínsecos do teste. No entanto, os indicadores de desempenho, quando aplicados em condições de campo são modificados pela proporção de casos da doença no rebanho, ou seja, pela prevalência. Assim, para estimar a validade do instrumento em condições operacionais devem-se calcular os indicadores denominados valor preditivo positivo e valor preditivo negativo, cujos valores variam com a prevalência. Entende-se por valor preditivo positivo a probabilidade de um caso identificado com determinada ferramenta ou método, ser de fato positivo. Valor preditivo negativo a probabilidade de um resultado negativo obtido, ser de fato negativo. Os resultados dessas variáveis, que são influenciados pela sensibilidade e especificidade do teste, estão, dessa forma, ligados à prevalência de S.agalactiae encontrada neste estudo, de 39,67% (LAST, 1998; MACKINNON, 2000)

Assim como ocorre com as taxas de valores preditivos, os valores referentes aos falsos positivos e negativos também são afetadas pela prevalência.

pois os resultados negativos tanto aos oligonucleotídeos V1 e V2 como ao C1 e C2 são um forte indicativo da não amplificação de qualquer produto. É sabido que no leite de vacas, principalmente naqueles que resultam de amostragem de todo o rebanho e com contagens bacterianas altas, microrganismos do gênero estreptococo são comumente encontrados e consequentemente esses microrganismos seriam detectados pelos oligonucleotídeos genéricos.

7 - C

A prevalência de S.agalactiae nos rebanhos estudados foi de 39,67%.

A média da contagem bacteriana total no leite do tanque dos rebanhos estudados foi de 1,08x106 UFC/mL e a mediana de 160,00 x103 UFC/mL de leite

7 – R

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