EFEITO DO ADUBO ORGÂNICO NA DIVERSIDADE
BACTERIANA DE SOLOS
Bernardo Petrorossi de Figueiredo
Tecnólogo em BiocombustíveisEFEITO DO ADUBO ORGÂNICO NA DIVERSIDADE
BACTERIANA DE SOLOS
Bernardo Petrorossi de Figueiredo
Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Maria Carareto Alves
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Microbiologia Agropecuária.
Figueiredo, Bernardo Petrorossi de
F475e Efeito do adubo orgânico na diversidade bacteriana de solos / Bernardo Petrorossi de Figueiredo. – – Jaboticabal, 2015
x, 103 p. : il. ; 29 cm
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2015
Orientadora: Lúcia Maria Carareto Alves
Banca examinadora: Rodrigo Matheus Pereira, Celso Antônio Jardim
Bibliografia
1.Compostagem 2. Solos 3. Enzimas 4. Diversidade microbiana I.Título II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 576.8:631.461
''No que diz respeito ao empenho, ao compromisso, ao esforço, à dedicação, não existe meio termo. Ou você faz uma coisa bem feita ou não faz.''
À Profa. Dra. Lucia Maria Carareto Alves, que como orientadora agiu de forma irrepreensível, mas que também agiu como segunda mãe desta dissertação, cobrando quando necessário ou elogiando quando merecia.
Aos amigos, discentes e docentes do Departamento de Tecnologia e do Laboratório de Biologia e Fisiologia de Microrganismos e Plantas (LBMP), UNESP-FCAV.
Ao Dr. João Carlos Campanharo, técnico do LBMP, que sempre ajudou a todos com tudo que estivesse a seu alcance.
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À Camila Cesário, técnica do LBMP, que foi de suma importância na etapa de sequenciamento.
À CAPES e FAPESP pelos recursos concedidos.
À Fundação Zoológico São Paulo e a Fazenda Zoológico São Paulo, no fornecimento de dados, bem como acesso as áreas de estudo.
SUMÁRIO
Página RESUMO ...IX ABSTRACT ...X
1 INTRODUÇÃO ... 1
2 REVISÃO DE LITERATURA ... 3
2.1 Compostagem a partir de resíduos orgânicos ... 3
2.2 Estudos com o adubo orgânico do Zoológico de São Paulo ... 5
2.3 Reaproveitamento de resíduos da matéria orgânica ... 7
2.4 Uso industrial de microrganismos e enzimas microbianas ... 8
2.5 Microrganismos úteis agronomicamente ... 10
2.5.1 Ácido indol-3-acético ... 11
2.5.2 O Fósforo e a solubilização de fosfato no solo ... 12
2.6 Técnicas de identificação e análise de microrganismos ... 14
3 MATERIAL E MÉTODOS ... 17
3.1 Caracterização das amostras de solo e composto orgânico ... 17
3.2 Análise metagenômica e sequenciamento genético ... 22
3.3 Isolamento de Microrganismos ... 23
3.4 Caracterização dos isolados quanto à produção de enzimas, AIA e solubilização de fosfato ... 24
3.5 Sequenciamento dos isolados ... 25
3.6 Bioinformática ... 25
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 28
4.1 Análise da composição química do composto orgânico e do solo ... 28
4.2 Comparação da população bacteriana das amostras de solo ... 34
4.3 Gênero e espécies e atuação em ciclos biogeoquímicos ... 46
4.4 Isolamento de bactérias do solo ... 54
5 CONLUSÕES ... 63
6 REFERÊNCIAS ... 64
EFEITO DO ADUBO ORGÂNICO NA DIVERSIDADE BACTERIANA DE SOLOS
RESUMO - O processo de compostagem é executado por diferentes populações microbiológicas e é um sistema rico para a análise da diversidade o para o uso biotecnológico. A Fundação Parque Zoológico de São Paulo possui uma estrutura para a reciclagem e aproveitamento da água e de resíduos sólidos que gera para produzir composto orgânico utilizado em sua Fazenda para a produção de alimento para os animais. Foram obtidos amostras de DNA metagenômico de uma área de horta e de produção de capim-forrageiro, submetidas ao uso de composto orgânico, e uma terceira área de mata nativa. Além disso obteve-se 42 isolados a partir das mesmas áreas. Foi analisado a capacidade de produção de enzimas, solubilização de fosfato e produção de hormônio de crescimento vegetal. Observou-se, após sequenciamento do gene 16s rRNA, tanto dos isolados quando do DNA metagenômico (realizado em Illumina Miseq), que esses microrganismos compreendem uma população de diversos gêneros e espécies bacterianas. Os isolados apresentaram características bioquímicas de grande auxílio para uso agroindustrial, considerando que foram observadas capacidades diversas da produção de enzimas como amilases, celulases e proteases, além de a maioria ser capaz de solubilizar fosfato. Ao analisar o DNA total das 3 áreas verificou-se uma maior diversidade microbiana na área de mata nativa, enquanto nas áreas submetidas ao uso de composto orgânico e ao cultivo exaustivo houve uma menor diversidade e inclusive o desaparecimento de espécies destas áreas, quando comparadas a mata nativa. Porém ao avaliar as capacidades das bactérias em participar de ciclos biogeoquímicos úteis agronomicamente, as áreas submetidas ao composto orgânico apresentaram maior capacidade principalmente em solubilizar fosfato, o que não ocorreu na área de solo nativo.
EFFECT OF ORGANIC FERTILIZER ON SOIL BACTERIAL DIVERSITY
ABSTRACT - The composting process is performed by different microbiological populations and is a rich system for the analysis of diversity for the biotechnological use. The Park Foundation Sao Paulo Zoo has a structure for recycling and use of water and solid waste generated to produce organic compound used in your farm for the production of food for animals. Metagenomic DNA samples were extracted of a garden area , a grass forage production, both subject to the use of organic compound, and a third area of native forest. Furthermore there was obtained 42 microbian isolates from the same areas. The ability to produce enzymes, phosphate solubilization and production of plant growth hormone was analyzed. There was, after sequencing of the gene 16s rRNA, both isolated when the metagenomic DNA (held in Illumina Miseq), that these microorganisms comprise a population of several genera and species of bacteria. The isolates showed biochemical characteristics of great assistance to agro-industrial use, considering they were subject to several production capabilities of enzymes such as amylase, cellulase and protease, and most are able to solubilize phosphate. When analyzing the total DNA of the 3 areas there was a higher microbial diversity in native forest, while in areas subjected to the use of organic compost and cultivation, there was less diversity and species including the disappearance of these areas when compared to native forest. But when assessing the capacity of bacteria to participate in biogeochemical cycles and agronomically useful activities, the areas subjected to organic compound showed higher capacity mainly in phosphate solubilizing, which did not occur in native soil area.
1 INTRODUÇÃO
A Fundação Parque Zoológico de São Paulo (FPZSP), entidade instituída e mantida pelo Governo do Estado de São Paulo, mantém um grande número de espécies animais sob condições de preservação que dependem diretamente do ambiente em que se encontram e dos cuidados de manejo de cada espécie. Para ajudar na manutenção e bem estar dos animais, a fundação possui uma fazenda, Fazenda Zoológico de São Paulo no interior do estado de São Paulo, onde se produz alimento para os animais como, milho, sorgo, capim-forrageiro, legumes e hortaliças. No entanto, o Zoológico produz resíduos biológicos, como restos vegetais e animais, em grande quantidade. Para reduzir o impacto ambiental que esses resíduos gerariam no ambiente a instituição possui um Sistema de Gestão Ambiental,com uma estrutura para a reciclagem e reaproveitamento da água usada e dos resíduos sólidos gerados. Todo material biológico sólido gerado no Zoológico é processado na Unidade de Produção de Composto Orgânico. Por sua vez o adubo ou composto orgânico produzido é usado na manutenção das áreas de jardinagem do próprio Zoológico e na Fazenda, para auxiliar na adubação de áreas destinadas para a produção de alimentos para os animais, frequentemente na horta e eventualmente em áreas de produção de plantas forrageiras.
no solo. Apesar de serem conhecidas as vantagens dos microrganismos do adubo orgânico, pouco foi estudado quanto às interferências que o uso desse material realiza na microbiota do solo. O uso do composto pode melhorar as características agronômicas do solo, mas esta interferência poderia alterar o equilíbrio das espécies bacterianas no local e mesmo suprimir importantes espécies encontradas naturalmente. Além disso, a matéria prima usada para a produção do adubo orgânico no Zoológico de São Paulo possui características únicas, devido a sua origem incomum, pois o composto é produzido a partir de resíduos de diversas espécies vegetais e inúmeras espécies de animais, inclusive carcaças, desta forma isso pode interferir na quantidade de organismos patogênicos ou prejudiciais às plantas e animais.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Compostagem a partir de resíduos orgânicos
Na natureza a degradação de material biológico ocorre de maneira contínua, porém quando se observa a produção de resíduos oriundos das atividades humanas, como os processos agroindustriais, o cenário muda e pode atingir consequências ambientais de grande impacto se medidas alternativas de transformação biológica não forem utilizados.
A indústria madeireira, a indústria sucroalcooleira, a produção agrícola de milho e soja gera uma grande quantidade de resíduos vegetais que poderiam ser aproveitados em outras atividades como a compostagem. Segundo Budziak et al. (2004) as madeireiras por exemplo possuem um aproveitamento de matéria prima que chega a apenas 50% do que é admitido em um processo produtivo. Essas indústrias produzem um enorme volume de rejeitos, sendo que normalmente parte é queimada e parte levada para aterros inadequados, onde pode gerar grandes danos ambientais se atingir córregos e rios devido a alta carga orgânica que a matéria vegetal possui.
Estima-se que anualmente bactérias no ambiente natural hidrolisam matéria vegetal suficiente para produzir energia equivalente a 640 bilhões de barris de petróleo. Desta forma a indústria sucroalcooleira procura por alternativas para conversão da biomassa em biocombustível. Através do uso de microrganismos com enzimas degradadoras dos resíduos vegetais, estes processos poderiam ocorrer em escala industrial e serem aplicados na produção de biocombustíveis (BUDZIAK et al., 2004; BRUCE, 2011).
minimizar a quantidade de lixo a ser depositada em aterros, deixando espaço para lixo não reciclável e não orgânico. Além disso, a compostagem é um processo baixo custo operacional e pode ser realizar em grande escala (BARREIRA, PHILIPPI JUNIOR e RODRIGUES, 2006; KOLLAH et al., 2014).
A compostagem é um processo biológico que usa a capacidade natural dos microrganismos em degradar a matéria orgânica, direcionado para decompor os resíduos desejados. No processo a matéria orgânica é decomposta pela ação das enzimas microbianas, produzidas principalmente por espécies termofílicas e mesofílicas, resultando na sua degradação gradual e oxidação dos resíduos, e ocorrendo em condições controladas de aeração e temperatura, principalmente. No processo a temperatura pode chegar de 55oC a 70oC, fator que é crucial para a eliminação de microrganismos patogênicos. Segundo Kollah et al. (2014), a compostagem não atrai moscas e animais sinantrópicos, nem gera fortes odores, e eliminação de sementes de ervas daninhas e microrganismos patogênicos.
A compostagem de resíduos vegetais e animais não só permite a redução do volume dos resíduos como também propicia a formação de um composto que pode devolver nutrientes ao solo. No entanto para que o composto produzido seja utilizado como adubo de forma segura o mesmo deve ter sido convertido a partir da matéria orgânica, para um composto estável e livre de patógenos. Vários fatores podem interferir na decomposição, maturação e qualidade final do composto durante a compostagem, como a umidade, temperatura, relação C/N e o tipo de resíduos orgânicos que foram utilizados como substrato, o que leva a conclusão que o produto final depende totalmente da matéria-prima usada e do tipo de procedimento técnico usado. Caso a matéria-prima possua resíduos contaminados será produzido um composto com teores elevados do contaminante, como por exemplo, os metais pesados. Geralmente resíduos urbanos (lixo comum), não selecionados via separação, causam este problema. (BUDZIAK et al., 2004; BARREIRA, PHILIPPI JUNIOR e RODRIGUES, 2006).
condicionador de solo. A maioria das usinas de processamento e produção de composto orgânico apresenta o uso do processo de compostagem como ocorre naturalmente, sem qualquer sistema de melhoria, com apenas revolvimento periódico das leiras para aeração, que ficam em pátios a céu aberto, sem qualquer outro cuidado específico ou controle. Em regiões mais desenvolvidas, como no Estado de São Paulo, predominam os sistemas simplificados que são superiores tecnologicamente, consistindo em um pátio de recepção, esteira de triagem, moinho ou trituradores para facilitar o processo de decomposição e pátio para compostagem, que também ocorre de maneira natural, porém com uso de lonas para cobrir e proteger as leiras de compostagem. (BARREIRA, PHILIPPI JUNIOR e RODRIGUES, 2006).
2.2 Estudos com o adubo orgânico do Zoológico de São Paulo
superficialmente. Outro fator é o uso dos resíduos das camas dos animais, os excrementos e as carcaças de animais mortos que são originárias de mais de 350 espécies selvagens diferentes, as quais podem possuir em seus organismos diferentes microbiotas, tornando única a matéria prima usada nesse processo. Todos estes resíduos após processados e convertidos para adubo orgânico são utilizados nas áreas de jardinagem do Zoo e na Fazenda do Zoológico para a produção agrícola que é revertida para os animais do próprio Zoológico.
Martins et al.(2013), realizou um estudo metagenômico com o adubo orgânico produzido na UPCO do Zoológico de São Paulo. Os autores analisaram as características da microbiota presentes em amostras do composto, através do sequenciamento de amostras de DNA metagenômico extraídos do composto em duas etapas diferentes de processamento, 8 e 60 dias de produção. Segundo os autores os filos mais abundantes foram as Proteobacteria e Firmicutes dependendo de qual o período da compostagem é analisado. O autor encontrou várias ordens como Xanthomonadalaes, Clostridiales, Burkholderiales, Actinomycetales, Bacillales, Pseudomonadales, Enterobacteriales e Lactobacillales, entre outros, sendo que os microrganismos da ordem Lactobacillales foram dominantes no final do processo de compostagem (amostras com 60 dias).Os autores não avaliaram a presença de organismos patogênicos ou fitopatogênicos no estudo.
2.3 Reaproveitamento de resíduos da matéria orgânica
Nos ciclos naturais de transformação de matéria orgânica os microrganismos responsáveis por esses processos apresentam grande capacidade em degradar biomassa complexa,de origem vegetal ou animal, em nutrientes simples e disponíveis. Desta forma a matéria orgânica pode ser decomposta até se constituir o húmus (matéria orgânica em forma coloidal) que gera vantagens diversas ao solo, bem como em processos biotecnológicos. Dentre as enzimas necessárias à degradação podemos citar os grupos das celulases, amilases, proteases, fosfatases, lípases, etc. (MARTINS et al., 2013).
resultando em glicose, que pode ser absorvida por microrganismos em processos de biocatálise (ALVIRA et al., 2010).
Ainda dentre os polissacarídeos vegetais importantes podemos ressaltar o amido. Esse biopolímero é um polissacarídeo de reserva dos vegetais, formado pela ligação de moléculas de glicose que podem ser arranjadas em dois tipos de cadeias, a amilose (cadeia linear formada por moléculas de glicose unidas por ligações α1-4) e a amilopectina (cadeia ramificada formada por moléculas de glicose unidas por ligações α1-4 e α1-6). O amido, por ser um polímero de reserva, pode ser encontrado nas sementes, caules e raízes de várias plantas. Como a celulose, o amido também pode fornecer glicose após sua degradação pela ação de diferentes enzimas (BHATTACHARYA E PLETSCHKE, 2014).
No trabalho realizado por Pascon et a. (2011), os autores isolaram do Adubo Orgânico produzido no Zoológico de São Paulo linhagens bacterianas com características amilolíticas interessantes. Esses isolados, pertencentes a diversos grupos taxonômicos, não nunca tinham sido descritos como possuidores dessa atividade hidrolítica. Os isolados apresentaram a capacidade de produzir grandes quantidades de enzima em condições extremas, como por exemplo, temperatura de cultivo de 39oC, o que pode ter de grande valor em processos biotecnológicos.
2.4 Uso industrial de microrganismos e enzimas microbianas
das enzimas consideradas comuns, Bhattacharya e Pletschke (2014), concluíram que existem ''extremoenzimas'' capazes de suportar temperaturas, pH e outros fatores, em condições extremas, mantendo sua atividade e especificidade, o que tornará tais moléculas extremamente desejadas no futuro. Ainda segundo os mesmos autores, atualmente existem técnicas para aperfeiçoar ou melhorar as características das enzimas, como mutações in vitro ou o uso de um ''mix'' de enzimas em vez de apenas uma.
As enzimas podem ser utilizadas de diversas maneiras como: aplicação dos microrganismos no processo que irão produzi-las, uso de extratos celulares, células microbianas imobilizadas, enzimas imobilizadas ou de enzimas purificadas diretamente aplicadas nos processos (GONG et al., 2012; SCHMID et al., 2001).
Quanto aos fatores econômicos, devido às inúmeras vantagens descritas, as enzimas vêm sendo há muito tempo empregadas Industrialmente em biocatálises enzimáticas, principalmente na indústria de panificação e antibióticos. No entanto apesar da maior fatia do mercado corresponder à indústria alimentícia (alimentos e bebidas), atualmente estão se descobrindo novos campos e aplicações, principalmente na indústria química, farmacêutica e biotecnológica (WOHLGEMUTH, 2010). O mercado de venda de enzimas alcançou em 2010 a cifra de 3,3 bilhões de dólares em negociações, com estimativas de que alcance mais de 4 bilhões em 2015, tornando este mercado algo relevante mundialmente, podendo citar as empresas de processamento têxtil, produção de papeis, detergentes, fármacos, couros, alimentos, alimentação animal e biocombustíveis (WOHLGEMUTH, 2010; BBC RESEARCH REPORT, 2011; ADRIO E DEMAIN, 2014).
prima, por exemplo, na produção de etanol de segunda geração. Nesse processo industrial o uso de catálise química limita muito o uso de resíduos não fermentáveis que poderiam ser aproveitados se não fosse o alto custo dos insumos para a hidrólise. As lípases são utilizadas em larga escala na indústria alimentícia para produção desde sucos a comida pré-cozida, que neste caso, as enzimas são fundamentais para a variação e aprimoramento de fragrâncias e sabores. Já na indústria de produtos para alimentação animal enzimas como, celulases, amilases e proteases podem incrementar a digestibilidade de nutrientes, favorecendo o desenvolvimento do animal. (SACCO, 2013; ALVIRA et al., 2010; SUMAN et al., 2009; CHOCT, 2006; ADRIO E DEMAIN, 2014).
Apesar de já se conhecer diversos microrganismos produtores de enzimas atualmente utilizadas na indústria, a prospecção de novos organismos pode levar a descoberta de espécies capazes de produzir enzimas semelhantes, possuindo as mesmas funções, porém poderiam apresentar características distintas e especificas para determinados processos biotecnológicos, como por exemplo, a resistência à desnaturação térmica, pH de atuação, rapidez na reação, sensibilidade a íons, etc.
Estas diferenças poderiam conferir à indústria a capacidade de substituição de processos químicos por processos biológicos, pois a temperatura, pH, presença ou não de íons e de outros produtos químicos, são fatores que variam em cada processo industrial e interferem no modo como a enzima ou microrganismo desenvolve seu metabolismo, podendo inclusive inativá-los. Portanto prospectar microrganismos para contornar características e limitações técnicas é algo extremamente desejável atualmente (BHATTACHARYA E PLETSCHKE, 2014; ADRIO E DEMAIN, 2014).
2.5 Microrganismos úteis agronomicamente
produzindo compostos úteis. Neste estudo abordamos o processo de solubilização de fosfato no solo e produção do fito hormônio ácido indol-3-acético (AIA).
2.5.1 Ácido indol-3-acético
Diversas auxinas (fito hormônios) são produzidas pelas plantas e controlam os mais diversos processos vegetais como a germinação, formação de raízes laterais, crescimento vegetativo, produção de frutos e flores. Dentre essas auxinas o AIA é uma das mais abundantes e responsáveis naturalmente por promover crescimento vegetal. (PHILIPS et al., 2011; RODRIGUEZ, et al., 2006; GROSSMANN, 2010). Este hormônio é produzido naturalmente pelas plantas, pois regula várias características, alterando tecidos vasculares, gerando dominância apical, desenvolvimento radicular e reduzindo infecções em culturas como de tomate, banana, trigo, cana-de-açúcar, milho (EGAMBERDIEVA, 2011; GRAVEL et al., 2007; SOMERS et al., 2004; FERNÁNDEZ-FALCÓN et al., 2003; BARBIERI et al., 1986).
No entanto, o AIA pode também ser produzido por várias espécies de microrganismos, principalmente quando estes colonizam a rizosfera. Vários produtos excretados pelas raízes das plantas estimulam a produção do hormônio pelos microrganismos, como um metabólito secundário, levando ambos a uma relação simbiótica (SHAHAB et al., 2009). Porém apesar das vantagens, o excesso de AIA, devido a produção vegetal e microbiana no solo, pode causar a retardo no crescimento das plantas, dependendo da quantidade de AIA produzido e por algumas plantas possuírem o tecido vegetal mais sensível (ALI et al., 2010; PATTEN E GLICK, 1996; PATTEN E GLICK, 2002).
Azotobacter e Streptomyces como sendo os principais produtores de AIA, porém outros estudos indicam que também existem outras espécies capazes de reduzir a quantidade de AIA no solo, diminuindo seu efeito negativo quando em excesso, pois o AIA pode ser degradado e usado por microrganismos como fonte de carbono e nitrogênio (SCOTT et al., 2013; LEVEAU E LINDOW, 2005).
Portanto estudar microrganismos com capacidades de produzir AIA tornou-se importante do ponto de vista agronômico, pois este hormônio é um dos principais no crescimento vegetal afetando inclusive a nodulação de raízes, podendo alterar diretamente a fixação biológica de nitrogênio. Determinar e conhecer microrganismos produtores de AIA ajuda também no desenvolvimento de novos inoculantes comerciais, produtos que são necessários para aumentar a produção de alimentos no mundo e sustentar o aumento de população mundial, onde cada vez mais faz se necessário o melhor aproveitamento das áreas produtivas e dos nutrientes, permitindo até a redução dos gastos com adubação e herbicidas (DUCA et al., 2014).
2.5.2 O Fósforo e a solubilização de fosfato no solo
destes fertilizantes não garante que o fósforo aplicado seja realmente aproveitado pelos vegetais, pois se sabe que aproximadamente 90% dos adubos químicos fosforados precipitam na forma insolúvel Ca3PO4 ou FePO4, dependendo da acidez do solo. Desta forma, o fósforo imobilizado levando ao desperdício deste nutriente, que fica acumulado no solo sem utilidade nutricional, além de geralmente percolar até corpos d'água causando eutrofização destes (BANERJEE et al., 2010).
Como resultado das baixas concentrações de fósforo, as plantas competem com os microrganismos do solo por este nutriente, podendo haver processos de precipitação, solubilização, absorção e liberação do que foi absorvido pela microfauna. Com isso parte do fósforo que poderia ser absorvido pelas plantas é aproveitado por microrganismos diminuindo ainda mais a quantidade disponível do nutriente no ambiente. Quando há morte celular destes organismos o fósforo pode ser liberado de forma solúvel, porém pode também ser em formas de difícil degradação, ocorrendo acumulação e inutilidade do nutriente (PINEDA, 2014). No entanto, apesar dos microrganismos competirem por fósforo, existem várias espécies que podem melhorar a disponibilidade do nutriente, principalmente organismos de vida livre ou aqueles que colonizam a rizosfera vegetal. Tais espécies possuem capacidade de mobilização do fosfato inorgânico e insolúvel de diversas fontes, como fosfato de cálcio e até fosfato de alumínio (GYANESHWAR et al., 2002).
leva ao desenvolvimento de possíveis maneiras de se aproveitar mais eficientemente os nutrientes aplicados no solo.
2.6 Técnicas de identificação e análise de microrganismos
A diversidade de microrganismos vem sendo alvo massivo de pesquisas com as mais diversas finalidades como, encontrar organismos úteis para processos industriais, processos agronômicos e principalmente prospecção de antibióticos e probióticos bem como isolar microrganismos patogênicos para estudo. Apesar disso, de acordo com Bruce (2011), pouco foi feito para avaliar a diversidade microbiana em no seu ambiente, seja para avaliar impacto de atividade humana ou para identificação e classificação. Ainda segundo o autor o isolamento em meios de cultivo de microrganismos vem sendo realizado exaustivamente desde seu desenvolvimento com cientistas famosos como Pasteur, Kock e Beijerinck. O isolamento é útil, pois se pode construir um estoque de diversos microrganismos que podem ser estudados quanto a características morfologias, fisiologias e bioquímicas. Essas características podem ser prontamente usadas para fins biotecnológicos, como na produção de antibióticos ou enzimas úteis (BRUCE, 2011).
Tais organismos só puderam ser acessados a partir do desenvolvimento de técnicas moleculares que permitem identificar um organismo a partir da análise de seu material genético. Tais técnicas se desenvolveram com o tempo, e Pace (2009), a partir de comparações genéticas elaborou uma ''arvore da vida'' com suas análises filogenéticas com técnicas moleculares atuais.
Os microrganismos além de possuírem diferenças morfológicas como a forma, cor, tipo de colônia, produção de moléculas especificas, entre outros, possuem diferenças genéticas que só podem ser acessadas por análise de seu DNA ou RNA. Tais diferenças pequenas e pontuais, mesmo que em um só gene, irão determinar que um microrganismo é diferente do outro (ALBERTS et al., 2008), sendo que para ler as sequencias genéticas de um organismo é necessário sequenciamento do material genético do mesmo.
O sequenciamento de DNA é amplamente usado no estudo de diversidade microbiana, seja de amostras de DNA metagenômico, extraídos de amostras ambientais ou de indivíduos, principalmente após o desenvolvimento dos sequenciadores baseados no método de Sanger (SANGER E COULSON, 1975). Intensificou-se mais ainda o uso, após o desenvolvimento de equipamentos e técnicas de segunda e terceira geração (piro sequenciamento e íon sequenciamento) que permitem o estudo das populações microbianas praticamente inteiras. Quando se diz que diretamente das amostras ambientais ou de um grupo inteiro é possível realizar estudo, é da metagenômica que está se falando. Esta abordagem é baseada na análise da mistura de DNA extraído diretamente das amostras ambientais, como de solo, água ou algum consórcio específico.
reações de PCR (''polymerase chain reaction'') de maneira a multiplicar esse gene inteiro e facilitar o seu sequenciamento, ao mesmo tempo em que esse gene possui regiões variáveis, que variam de cada microrganismo. Tais diferenças é que são usadas para diferenciar um organismo de outro mais facilmente, permitindo assim classificar e identificar os microrganismos presentes nas diversas amostras, algo que foi proposto pela primeira vez por Woese e Fox (1977).
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Caracterização das amostras de solo e composto orgânico
O solo foi coletado em área pertencente à Fazenda da Fundação Parque Zoológico de São Paulo (FPZSP), em Araçoiaba da Serra-SP (latitude 23º30'19" sul e a uma longitude 47º36'51" oeste). Os locais da coleta (Figura 1, 2 e 3) apresentavam diferentes manejos, sendo coletadas amostras em uma área de solo de mata ciliar nativa (N) e em duas áreas produtivas, sendo uma para produção de hortaliças (H) e outra de capim-forrageiro(C)da espécie Pennisetum purpureum cv. (Capim-Napier roxo), totalizando 3 ambientes estudados. A área da horta é submetida à aplicação de composto orgânico (aplicação a cada novo cultivo a mais de 5 anos) enquanto a área do capim-forrageiro recebe o composto orgânico esporadicamente e sem intervalos regulares. Ambas as áreas recebem anualmente complementação nutricional com adubação química de acordo com as necessidades. O composto (adubo orgânico) é proveniente da unidade de produção de composto orgânico (UPCO) do Parque Zoológico de São Paulo (figura 4).
Figura 2: Área da horta com plantio de vegetais, Araçoiaba da Serra-SP.
Figura 4: Unidade de produção do composto orgânico no zoológico: À esquerda cela de compostagem; à direita produto pronto para uso.
Tabela 1: Coordenadas dos pontos de coleta das amostras de solo da horta (H), da mata ciliar nativa (N) e da área de capim forrageiro (C):
Área Pontos
Horta(H) 1 2 3
Long. 47°35'12.02"O 47°35'12.41"O 47°35'13.01"O
Latit. 23°34'47.17"S 23°34'46.59"S 23°34'46.53"S
Mata ciliar(N)
Long. 47°35'10.83"O 47°35'11.17"O 47°35'11.52"O
Latit. 23°34'47.90"S 23°34'48.03"S 23°34'47.71"S
Capim (C)
Long. 47°35'7.56"O 47°35'7.40"O 47°35'6.81"O
Latit. 23°34'42.64"S 23°34'43.06"S 23°34'43.09"S
Figura 6: Gráfico do regime de chuvas e temperatura média da região estudada com os valores médios nos meses de abril (coleta 1) e setembro (coleta 2). Dados obtidos junto ao CIIAGRO na região de Sorocaba.
Amostras de solo das duas épocas analisadas, coletadas em triplicata, foram reunidas e homogeneizadas, resultando em uma amostra composta de cada área para cada época. As 6 amostras compostas das áreas estudadas foram analisadas quanto a sua composição química em macro e micronutrientes no Laboratório de Análise de Solo e Plantas do Departamento de Solos e Adubos da UNESP-FCAV.
O composto orgânico, produzido pela UPCO do zoológico de São Paulo foi analisado para determinar o teor de nutrientes, minerais e metais pesados no Laboratório de Bioquímica dos Solos de Departamento de Tecnologia FCAV- UNESP Jaboticabal, conforme os métodos estabelecidos na resolução CONAMA 375/2006. A amostragem foi feita na leira, como o composto fica acondicionado na fazenda, sendo retirada 3 amostras, sendo da superficial e duas do interior da leira, que foram homogeneizadas resultando em uma amostra composta. A amostragem foi realizada nos dois períodos em que se coletou solo e feita uma média dos dois períodos.
22,0
21,8
26,5
4,5
0
10
20
30
40
50
60
0
5
10
15
20
25
30
J F M A M J J A S O N D
Precipitaçã
o
(mm
)
Temp
er
atu
ra
M
éd
ia
(
oC
)
Mês
3.2 Análise metagenômica e sequenciamento genético
As amostras de solo de cada área obtidas em triplicata foram utilizadas para a extração de DNA metagenômico, conduzido também em triplicata (resultando em 27 extrações de DNA) usando-se o ''Soil Spin Kit'' (MoBio, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. A qualidade do DNA foi aferido através de leitura em espectrofotômetro para verificar sua concentração e relação 260/280nn. Também foi realizada eletroforese em gel de agarose 0,8% em tampão TBE 1X(Tris 89 mM; Ácido Bórico 89 mM e EDTA 2.5 mM, pH 8,3) contendo 0,5 μg mL-1 de brometo de etídeo, com 3μL do padrão ''1Kb ladder'' (Invitrogen), 80V durante 1 hora. Após a eletroforese o gel foi analisado em um foto documentador Gel Doc 1000, com luz UV (BioRad, USA). O DNA metagenômico foi submetido, quando necessário, a uma preparativa, que foi realizada com a aplicação das amostras em gel de agarose 0,8%, eletroforese a 60V, por 4 horas. A região do gel contendo DNA de alto tamanho molecular foi retirada e o DNA purificado através do uso do kit ''Promega DNA Purifing''.
O sequenciamento do gene 16S rRNA foi realizado utilizando um sequenciador Illumina MiSeq. Nesse processo as bibliotecas foram construídas usando DNA Nextera kit Preparação de Amostras (Illumina ®). As bibliotecas foram misturadas com ''Illumina-generatedPhiX (v3) controllibraries'' e desnaturadas usando NaOH fresco. A biblioteca foi sequenciada usando protocolo ''pairedend 250'' (pares de base 2x250bp),por síntese com o reagente MiSeq kit v2 (IIlumina ®) em um equipamento MiSeq IIlumina. A obtenção e avaliação de qualidade dos dados foram realizadas pelo próprio equipamento MiSeq Illumina.
3.3 Isolamento de Microrganismos
Os microrganismos analisados foram isolados do solo coletado nas mesmas áreas onde foram retiradas as amostras para análise metagenômica, em profundidade de 0 - 20 cm, porém as triplicatas de cada área foram reunidas e homogeneizadas, resultando em 3 amostras compostas, porém em apenas um período.
Estas amostras foram colocadas, na proporção de 1g de solo para 100 mL em solução salina autoclavada (NaCl a 0,85%) e foram misturadas em mesa agitadora horizontal a 120 rpm, durante 30 minutos, a fim de desagregar células e partículas do solo. Em seguida, uma alíquota de 100 μL do sobrenadante foi utilizada para a realização de diluições seriadas de10-2 a 10-5 em solução NaCl 0,85%. Alíquotas de 40 μL de cada solução diluída foram inoculadas, em triplicatas, em placas de Petri com meio de cultura PEG (SACCO, 2013) contendo ciclohexamida (1mg/ml) e espalhadas com o auxílio de pérolas de vidro estéreis. As placas foram incubadas em estufa tipo BOD a 30ºC por 96 horas.
3.4 Caracterização dos isolados quanto à produção de enzimas, AIA e solubilização de fosfato
Para caracterizar os isolados microbianos quanto à capacidade de produção de amilase e celulase, atividade proteolítica e solubilização de fosfato foram realizados testes com o uso dos seguintes meios de cultivo: Meio ágar-amido (SOUZA et al., 2008) e Meio BHB contendo CMC (WOOD, et al., 1975). Para análise da atividade proteolítica o meio Skim-milk (WEHR & FRANK, 2004) e o meio NBRIP (NAUTYAL, 1999) para a avaliação da capacidade de solubilização de fosfato.
Os meios específicos foram vertidos em placas de petri, e inoculados com 25ul de suspensão bacteriana crescida previamente em meio PEG por dois dias, 100 rpm, 28ºC. As placas foram incubadas em estufa tipo BOD a 28ºC por 5 dias. As placas com ágar-amido e meio BHB contendo CMC (Carboximetilcelulose) foram coradas respectivamente com solução de lugol e solução de vermelho congo ambos a 0,1 eq.1-1 (1N). A formação de halo claro ao redor das colônias determina a produção de amilases e celulases nos dois meios especificamente, sendo que para os demais meios de cultivo apenas observa-se a formação de halo mais claro ao redor das bactérias para a determinação de atividade proteolítica e capacidade de solubilizar fosfato.
amostra. Foram utilizadas três repetições para cada estirpe bacteriana além de um meio de cultura estéril como controle. Considerou-se como positivo qualquer amostra que apresentasse resultado maior que o controle (branco) considerando margem de erro de 5% e em 3 leituras.
3.5 Sequenciamento dos isolados
Para identificação de cada isolado bacteriano, realizou-se o sequenciamento total do gene 16S rRNA. A extração do DNA genômico das bactérias foi realizada segundo o método modificado de Marmur (1961). Com o DNA genômico dos isolados foi realizada um reação de PCR utilizando oligonucleotídeos iniciadores para o gene 16S rRNA (Wilson, 1990): pAF (5’ AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3’) e o pc5B-R (5’- TCA CTT GTT ACG ACT T --3’). A reação de PCR foi realizada utilizando-se 40 ng de DNA, Tampão PCR 1X [20 mmol1-1 Tris-HCl (pH 8,4)], 50mM KCl, 1,5mmol1-1 de MgCl2 0,2 mmol1-1 de dNTP, 10 pmols de cada oligonucleotídeo iniciador, 1,0µl de Taq DNA polimerase e água ultra pura para completar o volume final de 20μL na reação. A reação foi realizada em um termociclador Mastercycle gradiente (Eppendorf), com o perfil térmico: 2 minutos a 94ºC, 30 ciclos de 30 segundos a 94°C, 60 segundos a 50ºC, 60 segundos a 72ºC, seguido por uma incubação final de 5 minutos a 72ºC. Em seguida, com os fragmentos amplificados de aproximadamente 1500pb foi realizado sequenciamento utilizando-se os oligonucleotídeos iniciadores internos do gene 16S rRNA, primer 362, 786 e 1203 (INUI-KISHI, 2012; MENNA et al., 2006). As reações foram feitas em duplicata e em condições conforme descritas por Sacco (2013). O sequenciamento foi realizado em um Sequenciador Applied Biosystems 3100.
3.6 Bioinformática
através dos programas Phred/Phrap (GORDON, 1998) com nível de exigência mínima de 400 bases com qualidade Phred acima de 20 (1 erro para cada 100 bases). Em seguida, com as sequencias fasta obtidas realizou-se alinhamento local com a ferramenta Blast, com parâmetros em Blastn e opções em padrão, no NCBI, para então obter a possível identificação de cada isolado considerando o primeiro resultado, com maior pontuação (score), maior identidade de ao menos 98% e melhor ''e-value''. As sequências do gene 16S rRNA dos isolados foram posteriormente submetidas ao banco de dados GenBank do NCBI (nucleotide collection nr/nt).
As sequencias geradas pelo sequenciador Illumina Miseq, a partir do DNA metagenômico (gene 16s rRNA), foram processadas no CLC Genomics Workbench 7.0.3 (Arhaus, Dinamarca) para retirada de bases ambíguas e regiões de baixa qualidade. Os reads com alta qualidade foram analisados com o software EMIRGE (MILLER et al., 2011; MILLER 2013) que reconstrói sequencias de 16S rRNA. O EMIRGE foi executado por 40 interações com parâmetros padrão (-join_threshold = 0,97) e com mais de 97% de identidade. As sequencias FASTA obtidas foram submetidas a análises comparativas em bancos de dados de genes 16SrRNA. Foram realizadas análises com a ferramentas: RDP Classifier em definição padrão (default), para identificação de filos e o RDP LibCompare para comparar as amostras entre si e em relação ao banco de dados do RDP. Posteriormente foram realizadas também analises pela ferramenta Blastn Megablast (highly similar sequences - sequencias de alta similaridade), onde as sequencias obtidas após a montagem foram alinhadas com o banco de dados ''nucleotide collection (nr/nt)'' do NCBI, usando-se de linha de comando para realizar o processo de todas as sequencias de cada amostra de uma vez só, com os parâmetros em padrão (default), sendo os seguintes: ''Threshold'' 10, ''Word size'' 10, ''Match score'' 1, ''Mismatch score'' -2, ''gap costs linear'' e otimização para ''short queries''.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Análise da composição química do composto orgânico e do solo
O composto orgânico produzido no Zoológico e utilizado na Fazenda foi analisado quanto aos seus nutrientes e contaminantes químicos. Elementos como cálcio, nitrogênio, potássio, ferro e enxofre apresentaram valores elevados, enquanto elementos que podem ser tóxicos, dependendo da quantidade,como mercúrio, selênio, bário, chumbo, arsênio, zinco, níquel e cromo foram encontrados em teores menores (Tabela 2). Para avaliar a qualidade do adubo,os resultados foram comparados com a legislação brasileira quanto a teores máximos e mínimos permitidos de cada elemento em adubos orgânicos e similares (Tabela 2). Foram consideradas duas normas vigentes no Brasil, uma para os teores máximos de nutrientes e metais pesados como arsênio, bário, cádmio, chumbo, cobalto, cobre, cromo, mercúrio, níquel, selênio e zinco e outra para de teor mínimo permitido em produto comercializado referente aos nutrientes boro, cálcio, cobalto, cobre, enxofre, ferro, manganês, níquel, nitrogênio, selênio e zinco.Os elementos considerados possíveis contaminantes devem sempre estar abaixo do máximo permitido, mesmo que o adubo não seja comercializado, enquanto o teor mínimo permitido é obrigatório somente para a comercialização do composto orgânico. Foram consideradas para efeito de qualificação do composto orgânico utilizado as seguintes normas legais brasileiras:
Instrução Normativa MAPA Nº 46, de 6 de Outubro de 2011
“Estabelece regras para produção orgânica de vegetais e animais, determinando limites máximos admitidos em compostos orgânicos, resíduos de biodigestor, excremento de sistemas de criação animal.”
Instrução normativa MAPA / SDA no 25, de 23 de julho de 2009
registro, a embalagem e a rotulagem dos fertilizantes orgânicos simples, mistos, compostos, organominerais e biofertilizantes destinados à agricultura, na forma dos Anexos a presente Instrução Normativa.”
Resolução CONAMA no375, de 29 de agosto de 2006.
“ efine critérios e procedimentos, para o uso agrícola de lodos de esgoto gerados em estações de tratamento de esgoto sanit rio e seus produtos derivados, e d outras providências.”
Tabela 2: Composição química do adubo composto.
Elemento
Composto (mg.kg-1 )
Teor máximo
permitido (mg.kg-1)
Teor mínimo permitido (mg.kg-1)***
Arsênio 0,04 20*/30** --
Chumbo 13,3 45*/41** --
Cromo 2,2 70*/154** --
Mercúrio 0,1 0,4*/1,2** --
Níquel 7,7 25*/74** 5
Selênio 0,1 --*/12** --
Cádmio 1,0 0,7*/4** --
Zinco 30,0 200*/445** 100
Bário 0,04 --/265** --
Boro 8,1 --/-- 30
Cálcio 31200,0 --/-- 1.000
Fósforo 27,3 --/-- --
Cobre 3,86 70*/137** 50
Nitrogênio 2581,1 --/-- 500
Enxofre 4536,6 --/-- 1.000
Cobalto 4,14 --/-- 5
Ferro 2344,1 --/-- 200
Manganês 189,2 --/-- 50
Potássio 6750,0 --/-- --
Molibdênio 1,2 --*/13** 5
Magnésio 3351,1 --/-- 1.000
* Ministério da agricultura, pecuária e abastecimento. Instrução normativa nº 46, de 6 de outubro de 2011. **Ministério do Meio Ambiente. CONAMA. Resolução No 375 , de 29 de agosto de 2006. *** MAPA-SDA Instrução Normativa N 25 de 2009. -- não especificado.
orgânico MAPA 46/2011 e a norma CONAMA 375/2006 para efeito de comparação. O composto orgânico do zoológico apresentou tais teores abaixo do máximo permitido para todos os elementos analisados satisfazendo a legislação atual para substâncias consideradas tóxicas,uma das principais preocupações, pois o processo de compostagem pode elevar a concentração de metais tóxicos dependendo da origem do material base usado (FAGNANO et al., 2011).Ressalta-se que de acordo com a MAPA 25/2009 o composto orgânico pode ser classificado como Classe A, pois é usado apenas material de origem orgânica (animal e vegetal).
As amostras de solo de cada área foram analisadas quanto aos macro nutrientes e micronutrientes os resultados são apresentados na Tabela 3. Quando se compara as análises do período de chuvas com o período de seca, observam-se pequenas diferenças. O teor de P (mg/dm3)oscilou de 14 para 15 no solo nativo, de 730 para 770 na horta, e de 61 para 35 no capim-forrageiro. O potássio permaneceu praticamente estável, só variou na horta de 8,7 para 3,3 (mmolc/dm3). Cálcio e magnésio também permaneceram praticamente estáveis. Os micronutrientes, boro, cobre, ferro, manganês e zinco também pouco alteraram de um período para o outro, bem como o nível de matéria orgânica (M.O.), soma de bases trocáveis (SB), capacidade de trocas catiônicas a pH 7 (T), saturação por bases (V%).
7mmolc/dm3) (RAIJ et al., 1996). Quanto aos micronutrientes: para o Boro, a horta e a área nativa apresentaram valores semelhantes (mg/dm3), considerados médios, sendo 0,52 para a horta nos dois períodos e 0,44 e 0,50 para o solo nativo enquanto o capim apresentou 0,3 valor considerado médio a baixo; para o ferro (Fe) todos os ambientes foram considerados com muita alta concentração (Fe > 12mg/dm3), porém a horta ( 81 e 85 mg/dm3) e a área nativa (74 e 87 mg/dm3) apresentaram resultados muito próximos entre si e distantes do que foi obtido na área do capim-forrageiro ( 68 e 62 mg/dm3)(RAIJ et al., 1996).Observando a saturação por bases (V%), os resultados mostraram que a área de solo nativo e da horta são semelhantes entre si e distantes da área do capim, pois os resultados variaram de 82 a 73 (saturação alta) na horta, 75 a 67 (saturação alta e média) na área nativa e variando de 34 a 48 (saturação baixa) na área do capim (RAIJ et al., 1996). O valor de V% é usado como importante indicador da qualidade dos solos,pois solos com saturação por bases em cerca de 50% geram produção de massa vegetal menores quando comparados a solos com saturação por bases em torno ou maiores que 70%, que são solos mais férteis e mais benéficos para a absorção e disponibilização de nutrientes para as plantas (RAIJ et al., 1996; MUNHOZ E SILVEIRA, 1998).
Quanto ao pH solo, as áreas apresentaram pH (pH em CaCl2) variando no primeiro e segundo período, de 5,8 a 5,4 na horta, de 5,5 a 5,1 na área nativa e de 4,5 a 4,8 na área de capim-forrageiro, o que indica pH (ideal) na área da horta e na área nativa, enquanto a acidez da área do capim é considerada alta e fora do ideal (RAIJ et al., 1996).
enquanto que a área do capim-forrageiro mesmo com a incorporação da palhada e do composto orgânico após a colheita, obteve teores menores.
Tabela 3: Análise química das amostras de solo.
P resina mmolc/dm3 g/dm3
Amostras P K Ca Mg H+Al SB T M.O.
H1 730 8,7 108 22 31 138,7 169,7 49
C1 61 0,7 26 6 64 32,7 96,7 27
N1 14 2.8 90 20 38 112,8 150,8 56
Mg/dm3 (ppm) mmol/100cm3 pH em CaCl2
Amostras B Cu Fe Mn Zn S-SO4 Al pH V(%)
H1 0,52 0,9 81 3,5 11,2 20 0 5,8 82
C1 0,30 0,5 68 0,7 0,6 29 3 4,5 34
N1 0,44 0,7 74 2,8 1,7 8 0 5,5 75
P resina mmolc/dm3 g/dm3
Amostras P K Ca Mg H+Al SB T M.O.
H2 770 3,3 117 21 52 141,3 193,3 56
C2 35 0,6 31 7 42 38,6 80,6 25
N2 15 3,1 84 20 58 107,1 165,1 52
mg/dm3 (ppm) mmol/100cm3 pH em CaCl2
Amostras B Cu Fe Mn Zn S-SO4 Al pH V(%)
H2 0,52 0,8 85 4,9 14 41 0 5,4 73
C2 0,29 0,6 62 0,7 0,7 27 1 4,8 48
N2 0,50 0,8 87 2,8 2,1 9 0 5,1 67
H-Horta; C-Capim-forrageiro; N-Solo nativo; 1-período de chuvas; 2-período de seca.
4.2 Comparação da população bacteriana das amostras de solo
O DNA metagenômico extraído de cada de cada amostra de solo foi quantificado e avaliado quanto à qualidade por eletroforese em gel de agarose. As amostras de DNA apresentaram boa qualidade com bandas de alto tamanho molecular e sem degradação, conforme se observa na Figura 7.
A quantificação do material foi realizada por espectroscopia revelando uma concentração (ng/µl) satisfatória, porém os dados relativos a relação 260/280nm (média das triplicatas), conforme na Tabela 4 foram considerados fora do ideal que varia entre 1,80 a 2,00. Para solucionar este problema foi realizada uma eletroforese preparativa de DNA metagenômico, seguida de purificação que resultou em um DNA com melhor relação da absorbância 260/280nm, sendo todas dentro da faixa ideal conforme a Tabela 4.
Tabela 4: Valor médio da quantificação do DNA metagenômico extraído e qualidade dada pela relação da absorbância em 260 e 280nm antes e após eletroforese preparativa.
Amostra Concentração antes (ng/ul)
Concentração após (ng/ul)
[260/280] antes
[280/260] após
N1 455,1 55,1 1,46 1,86
N2 427,5 127,5 1,52 1,92
H1 336,3 36,3 1,41 1,81
H2 422,9 22,9 1,33 1,83
C1 423,1 23,1 1,40 1,90
C2 348,2 48,2 1,38 1,98
Após a purificação as tentativas de amplificação do gene 16S rRNA obtiveram êxito em todas as suas réplicas, conforme imagem na Figura 8, porém essa análise revelou que houve a formação de bandas inespecíficas, maiores e menores que o produto amplificado de 1500 pares de base.
Figura 8: Eletroforese em gel de agarose dos produtos de cada amostra em duplicata após as reações de PCR com os oligonucleotídeos iniciadores para o gene 16S rRNA. P representa o padrão (DNA Ladder) e a seta indica o padrão de 1500pb. Legenda: N- Solo nativo; C - capim-forrageiro; H - Horta; 1 - indica primeiro período de coleta; 2 - indica segundo período de coleta.
Para o sucesso do sequenciamento os produtos de PCR devem apresentar bandas únicas e não ter resíduos de reação. A purificação das bandas de 1500pb amplificadas foi realizada através de eletroforese preparativa dos produtos de PCR
de cada amostra, com a mesma metodologia usada para a purificação do DNA metagenômico. Após a purificação foi realizada uma nova eletroforese em gel de agarose para confirmar a remoção das bandas inespecíficas (Figura 9). Observa-se assim o produto único da PCR de aproximadamente 1500pb e que pode ser utilizado para o sequenciamento do gene 16SrRNA.
Os resultados do sequenciamento dos ''amplicons'' (fragmentos amplificados) do gene 16SrRNA podem ser observados na Tabela 5. O número das sequencias obtidas variaram de 3 a 9 milhões, com comprimento médio de 150 a 230pb. Essas sequencias após processamento originaram sequencias com boa qualidade e tamanho de 150 a 220pb.
As sequencias obtidas foram usadas para a reconstrução das sequencias dos genes 16SrRNA. As sequencias reconstruídas apresentaram tamanho de 1426 a 1486pb e a quantidade de sequencias em cada amostra variou de 120 para amostras C2 a 2141 para a N1 (Tabela 5).
Figura 9: Eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR para o gene 16S rRNA após a purificação. A seta indica o padrão de 1500pb.Legenda: N- Solo nativo; C - capim-forrageiro; H - Horta; 1 - indica primeiro período de coleta; 2 - indica segundo período de coleta.
O gráfico da curva de rarefação (Figura 10) das amostras sequenciadas, gerado através do programa (Megan 5.2.3) foi realizado usando os dados sequenciados normalizados.
Tabela 5: Resultados brutos do sequenciamento. Legenda: N- Solo nativo; C - capim-forrageiro; H - Horta; 1 - indica primeiro período de coleta; 2 - indica segundo período de coleta.
Amostras Número sequencias de (in
pair)
Comprimento
médio (pb) Comprimento médio após
filtragem (pb)
Número de sequencias reconstruídas
Tamanho
médio das
sequencias reconstruídas
N1 8.089.734 235 215 2141 1486
N2 3.476.706 237 216 437 1447
H1 9.346.648 165 153 469 1436
H2 9.383.196 157 150 326 1426
C1 7.288.144 183 173 806 1450
C2 3.276.212 239 220 120 1466
O gráfico demonstrou que as amostragens e o sequenciamento das amostras foram suficientes para detectar as espécies nos ambientes da forma mais próxima da realidade. Quando as curvas de cada amostra se aproximam do platô, indica que provavelmente caso fossem realizadas novas amostragens e sequenciamentos, há a probabilidade de se repetir os resultados e as espécies encontradas nas análises, sem que fossem detectadas outras espécies diferentes. Utilizando o mesmo programa (Megan 5.2.3), foi elaborado o gráfico PCoA dos dados normalizados (Figura 11). O gráfico confirma, visualmente, que os ambientes da horta (H1 e H2) e do capim-forrageiro (C1 e C2) são próximos biologicamente entre si quando comparados a área de solo nativo (N1 e N2). No entanto as amostras N1 e N2 também são distantes biologicamente entre si (HUSON et al., 2007).
Figura 10. Gráfico da curva de rarefação indica que as amostras atingiram ou se aproximaram do platô estatístico.
Tabela 6: Número de sequencias diferentes observadas e Índice de Shannon calculado para as amostras N1, N2, H1, H2, C1 e C2. Legenda: N- Solo nativo; C - capim-forrageiro; H - Horta; 1 - indica primeiro período de coleta; 2 - indica segundo período de coleta.
Amostra Número de sequencias diferentes Índice de Shannon
N1 714 4,836
N2 152 4,503
H1 132 3,908
H2 71 3,691
C1 91 3,686
C2 22 3,664
Tabela 7: Porcentagem de sequencias obtidas das amostras N, H e C no período de chuva (1) e de seca (2) classificadas em filos por comparação com as depositadas no banco de dados do RDP. Legenda: N- Solo nativo; C - capim-forrageiro; H - Horta; 1 - indica primeiro período de coleta; 2 - indica segundo período de coleta.
Filo (%) N1* N2* H1 H2 C1 C2
Acidobacteria 2,8 44,4 0 0 0 0
Actinobacteria 17,7 4,8 8,7 9,8 4 8,3
Bacteroidetes 0,8 1,1 0 0 0 0
Chloroflexi 0 0,5 0 0 0 0
Cyanobacteria 0,7 0 0 0 0 0
Firmicutes 6,7 2,3 1,7 0 0,6 0
Nitrospira 0,5 1,1 0,6 0,3 0,1 0
Proteobacteria 36,6 31,4 84,6 81 90,7 85
Verrucomicrobia 0,3 4,1 0 0 0 0
Não Classificadas 33,9 10,3 4,4 8,9 4,6 6,7
*Diferença significativa entre N1 e N2 quando comparadas com as demais
Os dados da análise comparativa feita pelo Blastn quanto à porcentagem de filos encontrados pode ser observada na Figura 12. Os filos em maior quantidade (Proteobacteria e Actinobacteria) apresentaram resultados similares entre as análise feitas com o RDPe o Blastn, porém a análise pelo Blastn revelou grupos não detectados e não classificados pelo RDP. Como a grande maioria das sequencias apresentaram ''score'' alto e número de bases similares maiores de 500pb, optou-se por estudar o gênero e espécie da população bacteriana nas amostras, com a identificação de cada organismo, dada pela comparação com o banco de dados do NCBI. Da mesma forma, esse banco também foi usado para as análises das funções biológicas de cada uma das espécies encontradas nos ambientes estudados.
sequencias no período de seca (N2), e uma maior concentração em poucos filos na época chuva (N1). As Acidobacteria e Actinobacteria apresentaram diferenças significativas, sendo a primeira em menor número na época de chuva e a segunda em maior quantidade no período de seca (Figura 12).
A horta (H1 e H2) apesar de ter mais de 80% das sequencias sendo do filo Proteobacteria. Observou-se alteração na quantidade de Actinobacteria em ambos os períodos, e na época de chuvas (H2) foram detectados Firmicutes e Nitrospira, mesmo que com baixa proporção (Figura 12). O mesmo foi observado na área de produção de capim forrageiro, pois alguns filos foram somente encontrados no período de chuvas. Quando comparados a época de seca (C1)e chuvas (C2), ambos apresentaram diferença na proporção dos filos Proteobacteria e Actinobacteria. (Figura 12).
Ao comparar os 3 ambientes entre si, o solo sob mata ciliar nativa (N1 e N2) mostrou-se o ambiente com maior número de espécies diferentes quando comparado ao solo obtido da horta (H1 e H2) e do capim (C1 e C2).
As amostras N1 e N2 possuem grande quantidade Proteobacteria, Actinobacteria, Acidobacteria e Firmicutes, além de outros grupos menores, que na horta e na área da capim pouco ou se quer foram detectados. Ainda ressalta-se que no solo nativo (N1 e N2) puderam ser observados organismos não encontrados nos outros ambientes e que ainda não estão totalmente classificados como o grupo Candidatus, com as espécies C. accumulibacter, C. koribacter, C. methylomirabilise C. solibactere o filo Acidobacteria. Candidatus é composto por diversas espécies, possuindo várias patogênicas, porém algumas possuem características benéficas.
Figura 12: Gráfico da comparação da porcentagem de sequencias obtidas das amostras N, H e C no período de chuva (1) e de seca (2) classificadas em filos pela ferramenta Blastn do NCBI.
As duas bactérias citadas anteriormente são espécies com características recentemente descobertas e pouco elucidadas, portanto um cuidado especial deve ser tomado com relação a elas, considerando que só foram encontradas nas amostras da mata ciliar, indicando que o manejo do solo pode estar interferindo negativamente, proporcionando o desaparecimento dessas espécies ainda pouco conhecidas.
0% 50% 100%
N1 N2 H1 H2 C1 C2
N1 N2 H1 H2 C1 C2
Acidobacteria 2,3 15,2 0,0 0,0 0,0 0,0
Actinobacteria 27,3 7,5 12,5 19,6 5,6 15,0
Aquificae 0,0 0,2 0,0 0,0 0,0 0,0
Bacteroidetes 0,4 0,9 0,0 0,0 0,0 0,0
Chloroflexi 0,0 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0
Cyanobacteria 6,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Firmicutes 12,0 5,4 3,4 0,3 1,1 0,0
Nitrospira 0,1 1,4 0,2 0,3 0,0 0,0
Proteobacteria 48,3 46,9 83,7 78,9 93,2 85,0
Spirochaetes 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Tenericutes 0,0 0,0 0,0 0,9 0,0 0,0
Thermodesulfobacteria 0,0 0,2 0,0 0,0 0,0 0,0
Verrucomicrobia 0,1 3,9 0,0 0,0 0,0 0,0
Candidatus 3,4 17,9 0,2 0,0 0,1 0,0
Ao avaliar mais detalhadamente as sequencias do filo Proteobacteria, o filo com mais sequencias presentes nas amostras, verificou-se que há uma variação dos subgrupos de acordo com o período em cada área (Figura 13). Claramente a proporção entre os grupos de Proteobacterias se alterou na seca e no período de chuva, ao menos no solo nativo. As demais amostras apresentaram alterações percentuais na quantidade de betaproteobacteria. Com 89,6% de betaproteobacterias na amostra H1 até 98% na amostra C2, indicando a grande dominância dos organismos do grupo Betaproteobacteria em relação aos demais nas amostras da horta e da área do capim-forrageiro (Figura 13). Espécies da classe das Betaproteobacteria são ligadas principalmente a ordem das: Burkholderiales, Neisseriaceae e Hydrogenophilaceae. A ordem Burkholderiales inclui as espécies do gênero Burkholderia e Bordetella que são conhecidas por sua patogenicidade a plantas e animais. O gênero Neisseria pertence a ordem Neisseriaceae, este gênero possui espécies patogênicas ligadas a doenças importantes como meningite e gonorreia. Já a Hydrogenophilaceae é um grupo pequeno, e os gêneros desta ordem como o Thiobacillus não são patogênicos, sendo que algumas espécies podem até ajudar a combater doenças e pragas em vegetais, como também ter aplicação na recuperação de materiais como o cobre. A recuperação de metais já foi descrita e estudada, sendo que consiste em técnicas de bioprocessamento para recuperar de rejeitos de mineração ou sucata utilizando microrganismos que capturaram e concentram os metais desejados. (BEVILAQUA et al., 2009; MADIGAN e MARTINKO, 2005; RYAN e RAY, 2004; GODOY et al., 2003; ).
Figura 13: Gráfico detalhado do filo de Proteobacteria.
Nossos resultados mostram a presença desse filo bacteriano apenas nas amostras de solo da mata ciliar nativa sendo que os organismos observados pertencem a cinco subdivisões (Tabela 8) sendo a maioria da subdivisão 1.
Dentre o filo Acidobacteria, ressaltamos as espécies mais encontradas (mais de 10 sequências no total): Acidobacterium capsulatum, Granulicella tundricola, Edaphobacter aggregans e Geothrix fermentans. A A. capsulatum é uma espécie ainda pouco estudada e apesar de estar presente na rizosfera em diversos ambientes, foi isolada pela primeira vez em uma área contaminada por água ácida de mineração, ambiente rico em ferro e com alta acidez (KISHIMOTO et al., 1991). Esta espécie atua no ciclo do nitrogênio, é capaz de metabolizar ferro e vive em condições de grande estresse ambiental. As elevadas quantidades de ferro no solo nativo podem estar ligadas a presença desta espécie no ambiente, porém a espécie não foi detectada nos ambientes da horta e capim-forrageiro, indicando possivelmente que as atividades agrícolas e o uso do composto orgânico podem ter interferido negativamente no desenvolvimento da espécie. (WARD et al., 2009).
N1 N2 H1 H2 C1 C2
N1 N2 H1 H2 C1 C2
Alphaproteobacteria 13,8 53,6 7,3 2,3 2,9 2,0
Betaproteobacteria 48,9 3,9 89,6 94,6 96,7 98,0
Deltaproteobacteria 13,8 30,0 0,8 0,4 0,0 0,0
Gammaproteobacteria 23,5 12,6 2,3 2,7 0,4 0,0
Tabela 8–Número de sequencias, relacionadas ao filo Acidobacteria, observadas nas amostras de solo da mata ciliar nativa.
Espécies Número de sequencias
Subdivisão N1 N2
Acidi capsaligni 1 3 6
Acidi pilarosea 1 0 1
Acidobacterium capsulatum 1 13 8
Granulicella aggregans 1 0 1
Granulicella mallensis 1 1 1
Granulicella pectinivorans 1 1 0
Granulicella tundricola 1 1 10
Telmatobacter bradus 1 3 4
Edaphobacter aggregans 1 22 5
Edaphobacter modestus 1 3 4
Terriglobus roseus 1 0 1
Terriglobus saanensis 1 0 1
Bryobacter aggregatus 3 0 1
Holophaga foetida 4 1 5
Geothrix fermentans 8 1 18
Thermoanaerobaculum aquaticum 23 0 1
aggregans foram detectadas em um ambiente com clima completamente diferentes quando comparado aos ambientes onde foram descritas inicialmente, porém já foi descrito a ocorrência destas espécies, bem como de outras acidobacterias no solo de diversos biomas brasileiros e a ocorrência de ambas estaria ligada a fatores como baixo pH do solo e não pelo clima (CATÃO et al., 2014).
G. fermentans foi isolada em ambientes semelhantes a A. capsulatum, ou seja, áreas contaminadas ou com excesso de metais, ou água de mineração. É anaeróbia e geralmente está ligada a degradação de Fe, sendo conhecida por ser parte do grupo de bactérias com capacidade de respiração usando óxido de Fe (3+) para gerar ATP, além de produzir pequenos campos elétricos (BOND E LOVELY, 2003; COATES et al., 1999.).
4.3 Gênero e espécies e atuação em ciclos biogeoquímicos
carbono, metabolismo de enxofre, processo de solubilização de fósforo, degradação de matéria orgânica em geral, atuação em processos de biorremediação, capacidade de reduzir Fe/Mn, produção de compostos biotecnológicos (goma xantana, PHB, etc.), capacidade de produzir antimicrobianos (atuando como antibióticos e/ou suprimindo doenças) e patogenicidade .
Tabela 9: Quantidade de Sequencias obtidas, o número de espécies diferentes após comparação ao banco de dados do NCBI e o número de espécies com características metabólicas conhecidas.Legenda: N- Solo nativo; C - capim-forrageiro; H - Horta; 1 - indica primeiro período de coleta; 2 - indica segundo período de coleta.
Amostra Sequencias Espécies Espécies com características conhecidas
Taxa de espécies com características
conhecidas
H1 469 133 89 67,0%
H2 326 73 54 73,9%
C1 809 91 69 75,8%
C2 114 23 19 82,6%
N1 2142 715 319 44,6%
N2 437 154 86 55,8%
Deve-se ressaltar que uma mesma espécie pode participar em mais de uma atividade ao mesmo tempo e que as amostras com menos espécies identificadas foram as da mata nativa que possuíram aproximadamente metade das espécies identificadas sem conhecimento de suas atividades.Apesar de diferenças na quantidade de sequências iguais de uma mesma espécie foram consideradas somente o número de espécies diferentes presentes nos resultados. Tal forma de classificar foi usada para as análises e para os gráficos das Figuras 14, 15 e 16. Desta forma evitou que existisse uma distorção nos resultados finais, pois cada ambiente obteve números diferentes de sequencias montadas pelos programas de montagem genômica, tendo algumas espécies mais de 100 sequencias encontradas enquanto outras apenas 1.
