TATIANA MOREIRA DOMINGUES
SÍNTESE, ESTUDOS CONFORMACIONAIS E DO MECANISMO DE AÇÃO DA GOMESINA
Dissertação apresentada à Universidade Federal de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Biologia Molecular
SÃO PAULO
Domingues, Tatiana Moreira
Síntese, estudos conformacionais e do mecanismo de ação da gomesina
São Paulo, 2010 113 páginas
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) – Escola Paulista de Medicina
“A coisa mais bela que o homem pode experimentar é o Mistério. É esta emoção fundamental que está na raiz de toda Ciência e de toda Arte.”
Dissertação preparada no Departamento de Biofísica durante o curso de Pós-graduação em Biologia Molecular e apresentada à Universidade Federal de São Paulo como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Biologia Molecular
Dedicatórias
Agradecimentos
Agradecimentos
À Professora Doutora Patrícia T. Campana, por sua atenção e dedicação em ensinar-me muito mais que Dicroísmo Circular e Fluorescência.
Aos meus colegas de laboratório que, cada um a sua maneira, contribuíram para meu crescimento tanto profissional quanto pessoal.
Aos técnicos e à Kátia, que prontamente me ajudaram durante meu Mestrado.
Aos Professores Doutores Clóvis R. Nakaie, Sirlei Daffre e Guita N. Jubilut, por suas participações em meu projeto.
Índice
8
Índice
Abreviaturas ... 11
Índice de Esquemas ... 13
Índice de Tabelas ... 13
Índice de Figuras ... 13
Resumo ... 16
Summary ... 17
1) Introdução ... 18
1.1) Peptídeos antimicrobianos ... 19
1.1.1) Modo de ação ... 21
1.2) Gomesina ... 24
1.2.1) Acanthoscurria gomesiana e gomesina ... 24
1.2.2) Síntese e atividade da D-gomesina ... 30
1.2.3) Pontes de dissulfeto na atividade da gomesina ... 30
1.2.4) Substituição de pontes de dissulfeto por pontes de lactama ... 32
1.2.5) Relação estrutura/atividade da gomesina através da Alanina-Scan ... 35
1.2.6) Síntese e atividade dos análogos lineares que mimetizam o beta-hairpin ... 36
1.3) Estudos conformacionais por espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência ... 37
1.4) Modelo de interação peptídeo/vesícula – GUVs ... 41
2) Objetivos ... 44
3) Materiais e Métodos ... 46
3.1) Materiais ... 46
3.1.1) Aminoácidos, solventes e reagentes ... 47
3.2) Métodos ... 47
3.2.1) Síntese dos peptídeos ... 47
3.2.1.1) Teste de Kaiser ... 48
3.2.1.2) Síntese dos peptídeos pela estratégia t-Boc ... 48
Índice
9
3.2.1.4) Formação das pontes de dissulfeto (Ciclização) ... 52
3.2.1.5) Liofilização dos peptídeos ... 53
3.2.2) Purificação dos peptídeos ... 53
3.2.3) Caracterização dos peptídeos ... 54
3.2.3.1) Cromatografia líquida de fase reversa acoplada a um Espectrômetro de Massas (CL/EM-IES) ... 54
3.2.3.2) Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE – Analítica) ... 54
3.2.3.3) Análise de aminoácidos (AAA) ... 55
3.2.4) Ensaios de atividade biológica ... 56
3.2.4.1) Ensaio de atividade antimicrobiana ... 56
3.2.4.1.1) Micro-organismos ... 56
3.2.4.1.2) Meios de cultura ... 56
3.2.4.1.3) Inibição de crescimento dos micro-organismos em meio líquido ... 56
3.2.4.1.4) Determinação das concentrações-estoques por densidade ótica (DO) ... 58
3.2.4.2) Ensaio de atividade hemolítica ... 61
3.2.4.2.1) Preparação dos eritrócitos ... 61
3.2.4.2.2) Avaliação da atividade hemolítica dos peptídeos ... 61
3.2.5) Análises estruturais dos peptídeos ... 62
3.2.5.1) Espectroscopia de fluorescência ... 62
3.2.5.2) Espectroscopia de dicroísmo circular (CD) ... 64
3.2.6) Estudos de interação peptídeo/vesícula ... 64
3.2.6.1) Ensaios quantitativos ... 65
3.2.6.2) Ensaios qualitativos ... 67
4) Resultados e Discussão ... 68
4.1) Síntese dos peptídeos ... 68
4.2) Purificação dos peptídeos ... 72
4.3) Caracterização dos peptídeos ... 73
4.4) Atividades Biológicas ... 79
Índice
10
4.4.2) Determinação das atividades hemolíticas dos peptídeos ... 79
4.5) Análises estruturais dos peptídeos ... 81
4.5.1) Estudos conformacionais por espectroscopia de dicroísmo circular (CD) ... 81
4.5.2) Espectroscopia de fluorescência ... 83
4.6) Estudos de interação peptídeo/vesícula ... 85
4.6.1) Ensaios quantitativos ... 85
4.6.2) Ensaios qualitativos ... 98
5) Conclusões ... 106
Abreviaturas
11
Abreviaturas
2-Br-Z 2-Bromo-benziloxicarbonila AAA Análise de aminoácidos Acm Acetamidometila
ACN Acetonitrila AcOH Ácido acético Bzl Benzila
CD Dicroísmo circular
CL/EM-IES Cromatografia líquida de fase reversa acoplada a um espectrômetro de massas (ionização por “electrospray”)
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
CLAE-FR Cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa CMC Concentração micelar crítica
CMD Concentração mínima de destruição CMI Concentração mínima inibitória DCM Diclorometano
DIC N,N-Diisopropilcarbodiimida
DiIC18 1,19-dioctadecil-3,3,39,39-tetrametilindocarbocianina perclorato DIPEA N,N-Diisopropiletilamina
DMF N,N-Dimetilformamida DMS Dimetilsulfeto
DMSO Dimetilsulfóxido EDT 1,2-Etanoditiol
Fmoc 9-Fluorenilmetiloxicarbonila For Formila
Gm Gomesina
GUV Vesícula unilamelar gigante HOBt 1-Hidroxibenzotriazol
i-PrOH Álcool isopropílico LPC Lisofosfatidilcolina LPS Lipopolissacarídeo LTA Ácidos lipoteicóicos
Abreviaturas
12
MBAR Metilbenzidrilamino-resina MeOH Metanol
NMP N-Metil-2-pirrolidona PAM Peptídeo antimicrobiano
PB Meio de cultura pobre em nutrientes PBS Solução salina fosfato-tamponada PC Fosfatidilcolina
PDB Dextrose de batata pGlu, Z Ácido piroglutâmico
POPC 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina
POPG 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-[fosfo-rac- (1-glicerol)]
Rh Rodamina
Rh-DPPE 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(Lissamine Rhodamine B Sulfonyl)
RMN Ressonância magnética nuclear SDS Dodecil sulfato de sódio
t-Boc Butiloxicarbonila
t-Boc-aa Nα-terc-butiloxicarbonil-L-aminoácidos
TBTU 2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio tetrafluoroborato TEA Trietilamina
TEAP Trietilamôniofosfato TFA Ácido trifluoroacético Tos Tosila
Índice de Esquemas, Tabelas e Figuras
13
Índice de Esquemas
Esquema 1. Etapas da síntese peptídica em fase sólida manual pela estratégia t-Boc. ... 50
Índice de Tabelas
Tabela1. Atividade antimicrobiana da Gm e de seus análogos lineares e monocíclicos. ... 31Tabela2. Sequências peptídicas utilizadas no desenvolvimento deste projeto... 45
Tabela 3. Cálculos de concentração peptídica feitos por medida de DO para a Gm. ... 60
Tabela4. Resultados das sínteses de Gm e da [Ser2,6,11,15]-Gm. ... 69
Tabela5. Caracterização da Gm e de seus análogos. ... 78
Tabela 6. Resultados das análises de aminoácidos dos peptídeos. ... 78
Índice de Figuras
Figura1. Reação inflamatória conhecida como paroníquia (ou “unheiro”). ... 18Figura 2. Estruturas secundárias em 3D apresentadas por alguns PAMs. ... 20
Figura 3. PAM atravessando a membrana externa de uma bactéria Gram-negativa... 22
Figura4. Modelos de mecanismos de ação dos PAMs. ... 23
Figura5. Aranha caranguejeira Acanthoscurria gomesiana. ... 25
Figura 6. Representações da estrutura secundária da Gm. ... 27
Figura7. Comparação estrutural entre PAMs semelhantes. ... 28
Figura8. Vistas ortográficas dos potenciais hidrofóbicos da superfície da Gm com diferentes orientações (0, 90, 180 e 270 graus). ... 29
Figura9. Gráfico da atividade hemolítica da Gm, de seus análogos lineares e monocíclicos, contendo Cys (Acm) ou Ser. ... 33
Figura10. Gráfico da cinética de degradação enzimática da Gm, de seus análogos lineares e monocíclicos, contendo Cys (Acm) ou Ser. ... 33
Índice de Esquemas, Tabelas e Figuras
14
Figura12. Representação das possibilidades de ciclização via lactama. ... 34
Figura13. Representação dos resíduos importantes para a atividade da Gm através do método alanina-scan. ... 35
Figura14. Comparação das estruturas obtidas por RMN da Gm e de seu análogo linear [D-Thr2,6,11,15, Pro9 ]-D-Gm. ... 36
Figura 15. Espectros de CD de peptídeos em dobra beta. ... 38
Figura16. Dicroísmo circular de polipeptídeos desordenados. ... 38
Figura 17. Diagrama de Perrin-Jablonski. ... 40
Figura18. Vesícula unilamelar gigante com bicamada fosfolipídica em destaque. ... 41
Figura19. Diagrama de morfologias de vesículas lipídicas unilamelares na fase fluida. ... 43
Figura20. Formação do complexo de Ruheman pelo teste de Kaiser. ... 49
Figura 21. Etapas de obtenção dos peptídeos em fase sólida pela estratégia t-Boc. ... 51
Figura22. Aparelhagem utilizada para a formação das pontes de dissulfeto. ... 52
Figura 23. Ilustração da montagem do ensaio antimicrobiano na placa de Elisa. ... 57
Figura24. Ilustração da determinação da concentração mínima inibitória (CMI) do ensaio de atividade antimicrobiana. ... 58
Figura 25. Diagrama de absorção de um feixe de luz atravessando cela de tamanho ℓ. ... 60
Figura 26. Espectros de excitação e emissão do triptofano e da tirosina. ... 63
Figura 27. Estrutura química do dodecil sulfato de sódio (SDS). ... 63
Figura28. Esquema ilustrado de contagem de GUVs. ... 66
Figura29. Cromatogramas obtidos no acompanhamento da ciclização (formação das pontes de dissulfeto) da Gm. ... 70
Figura30. Espectros de massas obtidos durante o acompanhamento da ciclização da Gm. ... 71
Figura31. Cromatograma (A), varredura de massas (B) e espectro de massas (C) da Gm após as etapas de purificação. ... 74
Figura32. Cromatograma (A), varredura de massas (B) e espectro de massas (C) do análogo [Ser2,6,11,15 ]-Gm após as etapas de purificação. ... 75
Figura33. Cromatograma (A), varredura de massas (B) e espectro de massas (C) do análogo [Rh-Lys8]-Gm puro. ... 76
Figura 34. Cromatograma (A), varredura de massas (B) e espectro de massas (C) do análogo [Ser2,6,11,15, Rh-Lys8 ]-Gm puro. ... 77
Índice de Esquemas, Tabelas e Figuras
15
Figura36. Atividades hemolíticas da Gm e de seus análogos... 80
Figura 37. Espectros de dicroísmo circular da Gm em diferentes meios. ... 82
Figura 38. Espectros de dicroísmo circular da [Ser2,6,11,15]-Gm em diferentes meios. ... 82
Figura 39. Espectros de fluorescência da Gm em diferentes meios. ... 84
Figura 40. Espectros de fluorescência da [Ser2,6,11,15 ]-Gm em diferentes meios. ... 84
Figura 41. GUVs compostas de 25 mol% de POPG em POPC em deposição no fundo da cela de observação ao longo de 15 minutos na ausência de peptídeo. ... 86
Figura42. Destruição das GUVs compostas de 25 mol% de POPG em POPC pela ação da Gm em variadas concentrações. ... 87
Figura43. GUVs compostas de POPC em interação com Gm (A e B) e [Ser2,6,11,15]-Gm (C e D). ... 90
Figura44. GUVs compostas de 15 mol% de POPG em POPC em interação com Gm (A e B) e [Ser2,6,11,15]-Gm (C e D). ... 91
Figura 45. GUVs compostas de 25 mol% de POPG em POPC em interação com Gm (A e B) e [Ser2,6,11,15]-Gm (C e D). ... 92
Figura 46. GUVs compostas de 55 mol% de POPG em POPC em interação com Gm (A e B) e [Ser2,6,11,15]-Gm (C e D). ... 93
Figura 47. GUVs compostas de 40 mol% de colesterol em POPC em interação com Gm (A e B) e [Ser2,6,11,15 ]-Gm (C e D). ... 94
Figura 48. Mínima concentração de Gm (■) e [Ser2,6,11,15 ]-Gm (○) capaz de provocar a lise de 90% das GUVs (CMD) em diferentes composições lipídicas comparativamente. ... 95
Figura 49. A) GUV íntegra; B-D) GUVs compostas de 15 mol% de POPG em POPC que perderam o contraste de fase em diferentes graus. ... 97
Figura 50. GUVs compostas de 50 mol% de POPG em POPC em microscopia de fluorescência com objetiva 63x; barras de escala de 20 μM. ... 98
Figura 51. Sequências de GUVs compostas de 50 mol% de POPG em POPC que apresentaram a formação de domínios em sua superfície. ... 99
Figura 52. Mudanças morfológicas apresentadas pelas GUVs de POPC em presença de 50 μM de Gm. ... 100
Figura 53. A) Ruptura da GUV compostas de 50 mol% de POPG em POPC na presença de 50 μM de Gm marcada com o fluoróforo Rh, B) e da GUV POPC marcada com 1 mol% de DiIC18 na presença de 50 μM de Gm. ... 101
Figura54. Pontos de alto contraste em GUVs compostas de 50 mol% de POPG em POPC com marcação fluorescente na membrana por 1% Rh-DPPE. ... 103
Resumo
16
Resumo
A gomesina (Gm) é um potente peptídeo antimicrobiano catiônico. Este peptídeo e seu análogo linear [Ser2,6,11,15]-Gm, com menor atividade lítica, foram sintetizados pela metodologia da fase sólida, empregando-se a estratégia t-Boc. Neste estudo, investigamos a interação da Gm e da [Ser2,6,11,15]-Gm com vesículas unilamelares gigantes (GUVs), compostas por membranas lipídicas de POPC ou POPC/POPG, através
de microscopias óticas de contraste de fase e fluorescência. As análises se dividiram em
duas diferentes partes. Na primeira, observou-se o efeito da injeção de uma solução
peptídica, com micropipeta, na vizinhança das GUVs. Como resultado da interação
peptídeo/lipídio, as GUVs foram desestabilizadas e romperam-se rapidamente, sem
observação de formação de poros estáveis durante todo o experimento. Nos estudos
controles, em ausência de peptídeo, as GUVs não romperam de forma espontânea.
Peptídeos marcados com a sonda fluorescente rodamina (Rh) foram injetados e mostram
que a Gm primeiramente acumula-se na superfície da vesícula, na qual, então, pequenas
partículas de alto-contraste são formadas e ocorre, eventualmente, a destruição das
GUVs. Este fato leva-nos a especular que a Gm rompe as membranas via modo carpete.
Na segunda parte, uma solução contendo GUVs foi misturada a crescentes
concentrações peptídicas para quantificação da ação lítica destes peptídeos em vesículas
de diferentes composições lipídicas. O efeito de atividade lítica observado foi maior que
90% em baixas concentrações tanto de Gm quanto de [Ser2,6,11,15]-Gm em GUVs
compostas de POPC, lipídio eletricamente neutro, e de uma mistura de POPG,
negativamente carregados, a POPC em diferentes proporções. Estudos conformacionais
foram feitos por duas técnicas espectroscópicas distintas: dicroísmo circular (CD) e
fluorescência. A Gm e seu análogo linear aparentemente interagiram com as cargas
negativas de SDS nas concentrações acima e abaixo da CMC. Os espectros de CD da
[Ser2,6,11,15]-Gm em água apresentaram uma banda fortemente negativa em 198 nm,
indicando tratar-se de uma estrutura desordenada, como esperado para peptídeos livres
em solução, e não de uma dobra beta como apresentada pela Gm. A partir dos resultados
obtidos, foi possível concluir que ambos os peptídeos analisados interagem com vesículas
compostas por fosfolipídios e induzem o vazamento de seu conteúdo interno
dependentemente da carga de membrana destas, o que corrobora estudos prévios que
sugerem que as interações eletrostáticas com a bicamada lipídica dos micro-organismos
Summary
17
Summary
Gomesin (Gm) is a potent cationic antimicrobial peptide. Gm and its low active
linear analogue, [Ser2,6,11,15]-Gm, were synthesized by the solid-phase methodology using
the t-Boc strategy. In this study, we investigated the interaction of Gm and [Ser2,6,11,15]-Gm
with Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) composed by POPC or POPC/POPG lipid
membranes using phase-contrast and fluorescence microscopies. Two different setups
were used. First we observed the effect of injecting a peptide solution with a micropipette
placed at the vicinities of the GUVs. As a result of peptide-lipid interaction, GUVs burst
suddenly and stable pores were hardly ever observed. As control, in the absence of
peptide, the GUVs were never spontaneously disrupted. Injection of fluorescently labeled
peptide shows that Gm first accumulates on the vesicle surface, then small high-contrast
particles are formed and eventually the vesicle burst. These facts leads us to speculate
that Gm disrupt the membrane via carpeting mode. In the second setup, a GUV solution
was mixed with increasing concentration of peptides to quantify their lytic action against
GUVs of different lipid compositions. The observed effect on the lytic activity was >90%
with low concentrations of Gm or [Ser2,6,11,15]-Gm on GUVs composed of a mixture of
electrically neutral phosphatidylcholine (POPC) and negatively charged
phosphatidylglycerol (POPG) in various ratios. Conformational studies were performed by circular dichroism and fluorescence spectroscopies. Gm and its linear analogue seems to interact with negatively charged SDS both above and below the detergent's critical micellar concentration (CMC). CD spectra of the linear analogue [Ser2,6,11,15]-Gm in water showed a negative band at 198 nm, indicating a high unordered structure content, as expected for a small peptides in solution, instead of a β-turn conformation like Gm. From our results we conclude that both peptides interact with phospholipids vesicles and induce leakage of
Introdução
18
1) Introdução
Apesar de cânceres e doenças cardiovasculares serem considerados os maiores problemas de saúde dos países desenvolvidos, doenças infecciosas ainda são grandes causas comuns de mortes em países em desenvolvimento, tais como o Brasil (Figura 1). Embora tratamentos eficazes estejam disponíveis para o combate da maior parte destas infecções, décadas de mal uso de antibióticos levaram à transferência horizontal de genes entre micro-organismos, estimulando, assim, o potencial evolutivo e o conseqüente desenvolvimento de resistência por parte destes aos antimicrobianos convencionais (Palffy e cols., 2009).
Diante deste cenário alarmante, fármacos que hoje lideram as listas dos mais vendidos correm o risco de se tornarem obsoletos, devido ao aumento da resistência bacteriana. Desta forma, a comunidade médica e científica vem procurando compreender os fenômenos responsáveis pelos mecanismos adaptativos de resistência, de forma a criar alternativas e novas estratégias para o combate às bactérias resistentes. A demanda crescente por novas substâncias(Barreiro, 2002; Barreiro e cols., 2002), capazes de inibir, em concentrações baixas, processos vitais de uma ou mais espécies de micro-organismos resistentes, tem provocado uma verdadeira corrida em busca de agentes antibacterianos de origem natural, semissintética ou sintética, cada vez mais eficientes. Portanto, o descobrimento de novos antibióticos potentes e mais seguros representa não apenas o avanço para uma melhor qualidade de vida, mas também a participação em um mercado em crescimento(Sutclife, 2003) e que movimenta cerca de 25 bilhões de dólares.
Figura1. Reação inflamatória conhecida como paroníquia (ou “unheiro”).
É causada por bactérias Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa ou Streptococcus, ou mais comumente por espécies do gênero Candida.
Introdução
19
1.1) Peptídeos antimicrobianos
Peptídeos antimicrobianos (PAMs) são componentes-chave do sistema imune de inumeros organismos multicelulares(Andreu e Rivas, 1998). Os PAMS são polipeptídeos contendo em sua estrutura primária até 100 resíduos de aminoácidos(Ganz e Lehrer, 1995) e que possuem largo espectro de ação, característico para cada molécula peptídica, podendo atacar simultaneamente vários organismos como bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos, parasitas em geral, vírus envelopados e até mesmo células tumorais(Suttmann e cols., 2008).
Dentre os primeiros PAMs descritos na literatura estão os chamados de defensinas, devido a sua função fundamental de defesa nos organismos em que foram descritos por Zeya e Spitznagel em 1966(Zeya e Spitznagel, 1966). Desde então, mais de 1.000 PAMs produzidos por organismos multicelulares (plantas, invertebrados e vertebrados) têm sido isolados e caracterizados em sua estrutura primária
Hancock e cols., 2006).
Uma classificação para os peptídeos antimicrobianos torna-se difícil já que estes apresentam considerável diversidade. Considerando-se, no entanto, homologias estruturais entre esses, pode-se dividi-los em duas grandes famílias principais de PAMs eucarióticos: catiônicos e não-catiônicos(Marshall e Arenas, 2003). Os PAMs catiônicos, maior grupo, incluem, por exemplo, as defensinas. São definidos como peptídeos contendo de 12 a 50 resíduos de aminoácidos e de duas a sete cargas positivas pelo excesso de aminoácidos básicos (arginina, histidina e/ou lisina) em relação aos aminoácidos ácidos (ácido aspártico e ácido glutâmico). Apesar de serem peptídeos pequenos, apresentam variadas estruturas secundárias, dentre as quais a dobra beta, estabilizada por pontes de dissulfeto(Hancock e Diamond, 2000).
Com base em sua estrutura secundária, os PAMs podem ser agrupados em quatro subdivisões(Van 'T Hof e cols., 2001):
1) Peptídeos lineares em hélice alfa. Os peptídeos desta classe geralmente assumem estruturas desordenadas em solução aquosa, apresentando estruturação em hélice alfa somente quando em contato com solventes hidrofóbicos ou com a superfície de uma bicamada composta por lipídios negativamente carregados. Um exemplo de peptídeo com esta estruturação é a magainina(Zasloff, 1987) (Figura 2A).
Introdução
20
Polifemusina I
Indolicidina
Magainina
Tanatina
B
C
A
D
Figura 2. Estruturas secundárias em 3D apresentadas por alguns PAMs.
peptídeos e proteínas, sendo a indolicidina(Selsted e cols., 1992) (Figura2B) um de seus poucos exemplos.
3) Peptídeos cíclicos em dobra beta. Esta classe de moléculas é composta por peptídeos estabilizados por uma única ponte de dissulfeto, e cuja estrutura é aqui exemplificada pela tanatina(Fehlbaum e cols., 1996) (Figura2C).
4) Peptídeos cíclicos em beta-hairpin. Os PAMs deste grupo apresentam conformação restrita devido à presença de duas ou mais pontes de dissulfeto. Dentre os peptídeos que apresentam estrutura do tipo beta-hairpin (duas fitas betas antiparalelas conectadas por um dobra)(Branden e Tooze, 1999), pode-se citar a polifemusina I(Powers e cols., 2004) (Figura2D).
Introdução
21
outros parâmetros também são considerados, como: 1) conformação espacial adotada na interação com as membranas dos patógenos; 2) carga, uma vez que os micro-organismos são geralmente negativamente carregados e peptídeos positivos teriam uma maior interação eletrostática com a membrana destes; 3) anfipaticidade, com resíduos hidrofílicos e hidrofóbicos que ajudam na manutenção da atividade peptídica; 4) hidrofobicidade; e 5) ângulo polar, definido como a medida relativa entre resíduos polares e apolares na molécula do peptídeo, que, quanto menor, maior a capacidade deste permeabilizar a membrana do micro-organismo alvo(Dathe e cols., 1997; Wieprecht e cols., 1997).
1.1.1) Modo de ação
O mecanismo molecular de permeação e rompimento das membranas dos micro-organismos alvos provocado pela ação dos PAMs depende, portanto, de vários parâmetros, tais como seqüência de aminoácidos, conformação espacial, carga, anfipaticidade, hidrofobicidade, concentração peptídica e composição lipídica da membrana do patógeno. No entanto, o modo de ação preciso dos peptídeos antimicrobianos ainda permanece desconhecido. A maioria dos experimentos descritos na literatura enfoca, principalmente, a interação de peptídeos catiônicos com sistemas modelos de membrana. E muitos destes modelos propõem a formação de canais na membrana bacteriana seguida ou não do rompimento desta(Chan e cols., 2006; Dawson e Liu, 2008).
Introdução
22
íons magnésio. Desta forma, os PAMs se uniriam fortemente aos sítios de ligação do magnésio presentes na superfície da parede celular, resultando num processo de desestruturação da mesma. Assim, os peptídeos antimicrobianos tornar-se-iam capazes de se inserir na membrana bacteriana externa e transpor esta barreira em direção ao espaço periplasmático (Figura 3B), podendo interagir com a membrana plasmática (ou interna) pelos processos citados a seguir(Hancock e Diamond, 2000).
Introdução
23
Os modelos mais bem estabelecidos de formação de poro nas membranas alvos pelos PAMs são: poro do tipo barril(Ehrenstein e Lecar, 1977) (Figura 4A), poro do tipo toroidal(Mor e Nicolas, 1994) (Figura 4B) e mecanismo carpete (detergente)(Pouny e cols., 1992) (Figura4C).
Figura4. Modelos de mecanismos de ação dos PAMs.
A) poro do tipo barril; B) poro do tipo toroidal; e C) mecanismo carpete (adaptado de PÁLFFY, 2009).
No mecanismo de formação de poro do tipo barril (do termo em inglês barrel-stave), a face hidrofóbica dos peptídeos, em forma de hélice alfa e/ou de fita beta, ficam em contato com as caudas da bicamada lipídica, enquanto a face hidrofílica forma o poro transmembranal(Shai, 1999). Desta forma, ocorre o extravasamento do conteúdo citoplasmático, causando a destruição do micro-organismo.
Folheto externo
Introdução
24
Já na formação dos poros toroidais, os resíduos hidrofóbicos dos peptídeos deslocam as cabeças polares dos fosfolipídios induzindo a formação de uma curvatura na membrana, que desestabiliza a sua superfície e permite uma maior interação com estes peptídeos(Hara e cols., 2001). Assim, há a formação do poro transmembranal no qual os lipídios permanecem intercalados com as moléculas dos peptídeos. Este mecanismo permite a formação de poros com um tamanho pequeno e seletivo quanto à passagem de íons.
De acordo com o modelo carpete (derivado do inglês carpet-like), os peptídeos se ligam à membrana do micro-organismo por atração eletrostática, e só começam a agir ao atingirem uma concentração crítica na superfície da mesma. Desta forma, os peptídeos deslocam de maneira difusa os fosfolipídios componentes da membrana plasmática das bactérias, alterando a sua fluidez, o que propicia a desestruturação e colapso da mesma. Diferentemente dos modelos anteriores, neste mecanismo não há a formação de poros, pois a membrana se desintegra em forma de micelas, como pela ação detergente(Oren e Shai, 1998; Shai, 1999; Yang e cols., 2000; Hara e cols., 2001). Com a presença de colesterol nas membranas alvos, normalmente ocorre uma redução da atividade dos PAMs, devido a uma maior estabilização da bicamada lipídica e/ou por possíveis interações entre os peptídeos antimicrobianos e o colesterol(Matsuzaki, 1998).
Além dos mecanismos acima descritos, alguns PAMs podem simplesmente translocar-se para o interior da célula do patógeno, interagindo com alvos intracelulares específicos desta, tais como DNA, RNA e enzimas, ou podem, ainda, atuar diretamente no mecanismo de síntese protéica destes micro-organismos, ocasionando a sua morte(Subbalakshmi e Sitaram, 1998; Otvos e cols., 2000; Park e cols., 2000; Cudic e Otvos, 2002). Também são capazes de atuar sobre alvos específicos no interior das células atacadas, como alguns peptídeos que trabalham juntamente com a lisozima na destruição de bactérias, o que foi demonstrado em ensaios realizados in vitro(Yan e Hancock, 2001). Desta forma, os PAMs apresentam múltiplos mecanismos de ação para inibir o crescimento ou destruir uma grande variedade de micro-organismos, o que os tornam excelentes candidatos para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos.
1.2) Gomesina
1.2.1) Acanthoscurria gomesiana e gomesina
Introdução
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aranhas diversas tem despertado o interesse de muitos pesquisadores. Isto porque o veneno destes aracnídeos, diferentemente de outros venenos animais, é heterogêneo; ou seja, é constituído de proteínas, polipeptídeos, enzimas, ácidos nucléicos, monoaminas, sais inorgânicos e toxinas poliaminas(Jackson e Parks, 1989). Assim, inúmeros peptídeos antimicrobianos foram isolados a partir de neurotoxinas presentes no veneno destes invertebrados, como licotoxina I e II, da aranha Lycosa carolinensis(Yan e Adams, 1998), cupienina 1, da aranha Cupiennius salei(Kuhn-Nentwig e cols., 2002), e oxiopininas, da aranha Oxyopes kitabensis(Corzo e cols., 2002).
Em um trabalho pioneiro de Silva e colaboradores(Silva e cols., 2000), quatro peptídeos foram isolados a partir da hemolinfa da aranha caranguejeira Acanthoscurria gomesiana, a qual pertence à família Theraphosidae (Figura 5). Dentre os peptídeos caracterizados, três foram obtidos dos hemócitos deste aracnídeo, que são os PAMs gomesina, acanthoscurrina e theraphosinina. Já o quarto peptídeo, a poliamina mygalina, foi encontrado no plasma da A. gomesiana. Esta caranguejeira é particularmente interessante porque apresenta uma expectativa de vida que pode ser superior a vinte anos. E, considerando-se que estes aracnídeos sofrem ecdises periódicas em ambientes variados, supõe-se uma resposta imune bastante ampla e eficaz, uma vez que o animal estaria exposto a inúmeros tipos de patógenos diferentes.
Figura5. Aranha caranguejeira Acanthoscurria gomesiana.
Introdução
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A gomesina (Gm) contém 18 resíduos de aminoácidos e apresenta a seguinte estrutura primária: pGlu1-Cys-Arg-Arg-Leu5-Cys-Tyr-Lys-Gln-Arg10-Cys-Val-Thr-Tyr-Cys15 -Arg-Gly-Arg-NH2. Peptídeo fortemente catiônico (pIcalculado = 9,86)(Mandard e cols., 2002), contêm em sua estrutura primária seis resíduos positivamente carregados (cinco argininas e uma lisina) e quatro cisteínas que formam duas pontes de dissulfeto entre os resíduos Cys2,15 e Cys6,11 (Figura 6). Além disto, este peptídeo possui duas modificações pós-traducionais: i) ciclização do resíduo de glutamina N-terminal em ácido piroglutâmico (pGlu); e ii) amidação da arginina C-terminal. A sequência de aminoácidos da Gm exibe grande similaridade com a de outros peptídeos antimicrobianos já descritos na literatura
(Figura 7), tais como a taquiplesina(Nakamura e cols., 1988), a polifemusina(Miyata e
cols., 1989), a androctonina(Ehret-Sabatier e cols., 1996) e a protegrina(Kokryakov e cols., 1993).
Estudos feitos de RMN(Mandard e cols., 2002) mostraram que a Gm em meio aquoso adota uma conformação em forma de grampo de cabelo (beta-hairpin), como pode ser observado nas Figuras 6 a 8, estrutura esta composta por duas fitas betas pregueadas antiparalelas conectadas por uma dobra não-canônica.
Nos ensaios antimicrobianos realizados por Silva e colaboradores(Silva e cols., 2000), a Gm mostrou-se efetiva contra o crescimento de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, sendo que das 27 bactérias testadas, 24 foram suscetíveis a este peptídeo, com CMI (concentração mínima inibitória) abaixo de 1,6 µM para a metade delas (Aerococcus viridans, Bacillus megaterium, Listeria monocytogenes, Micrococcus luteus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Escherichia coli 1106, Escherichia coli D22, Escherichia coli D31,
Escherichia coli SBS363, Salmonella thyphimurium). Além disto, quando a Gm foi incubada com Micrococcus luteus e Escherichia coli D31, em concentração 12,5 vezes mais alta do que as CMIs correspondentes, nenhuma bactéria sobreviveu após um minuto de incubação. Esta característica representa uma vantagem significativa desta molécula sobre outros agentes antimicrobianos não peptídicos que, em geral, requerem um tempo de exposição prolongado para a destruição dos patógenos(Steinberg e cols., 1997). A Gm
também foi eficiente contra o crescimento de fungos filamentosos (Alternaria brassicola,
Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Nectria haematococca,
Tricoderma viridae e Tricophyton mentagrophytes) e de leveduras (Candida albicans e
Introdução
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Figura 6. Representações da estrutura secundária da Gm.
Introdução
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Figura7. Comparação estrutural entre PAMs semelhantes.
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H ID R O FÍL IC A 270o 180o 90o 0o H IDR O FÓ B IC A H ID R O FÍL IC A H IDR O FÓ B IC AFigura8. Vistas ortográficas dos potenciais hidrofóbicos da superfície da Gm com diferentes orientações (0, 90, 180 e 270 graus).
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40% na concentração de 100 µM do peptídeo foi observado. Apesar dos muitos resultados até aqui obtidos para a Gm, mais estudos sobre a relação entre estrutura/atividade deste peptídeo se fazem necessários, principalmente visando à elucidação dos mecanismos de interação da Gm com as membranas de células alvos, bem como seu modo de ação lítica, buscando otimizar sua atividade antimicrobiana e atenuar sua atividade hemolítica.
1.2.2) Síntese e atividade da D-gomesina
Com o objetivo de se entender um pouco melhor o mecanismo de ação da Gm, que poderia ser, de forma menos específica, via desestruturação da membrana ou, mais complexa e especificamente, através da ligação a receptores presentes nas membranas dos micro-organismos, a D-Gm foi sintetizada, caracterizada e testada. Neste análogo, que tem todos os resíduos de aminoácidos na configuração D-, encontraram-se exatamente as mesmas atividades antimicrobianas, hemolítica e de resistência à degradação enzimática(Rodrigues e cols., 2008), como observado para a Gm. Estes dados confirmam a hipótese de que a atividade deste peptídeo antimicrobiano deve ser, inicialmente, via interação eletrostática com alguns componentes aniônicos presentes na membrana dos micro-organismos, levando a desestruturação da membrana alvo e consequente morte do patógeno.
1.2.3) Pontes de dissulfeto na atividade da gomesina
Introdução
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Tabela1. Atividade antimicrobiana da Gm e de seus análogos lineares e monocíclicos.
a
As CMIs foram expressas como um intervalo [a]-[b], onde [a] é a mais alta concentração testada na qual os micro-organismos ainda crescem e [b] é a mais baixa concentração
que causa 100% de inibição de crescimento dos mesmos; Z: ácido piroglutâmico; C: resíduo de cisteína com a cadeia lateral protegida com o grupo acetamidometila; e R: CMI
análogo/CMI Gm (Fázio e cols., 2006).
Ainda com base nos resultados mostrados na Tabela 1, pode-se notar que os análogos monocíclicos da Gm, tanto com substituições por Cys(Acm) como por Ser, tiveram os mesmos efeitos biológicos, independentemente da posição da ponte de dissulfeto alterada. Como a atividade destes análogos foi somente um pouco menor (entre duas a quatro vezes) do que as obtidas com Gm, conclui-se que a presença de pelo menos uma ligação do tipo dissulfeto é necessária para a manutenção da atividade antimicrobiana destes peptídeos.
Introdução
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Tanto os análogos lineares como os monocíclicos tiveram, também, suas
atividades hemolíticas determinadas (Figura9). Uma nítida correlação entre as atividades
antimicrobianas e a hemolítica para cada peptídeo analisado foi observada: ou seja, os
análogos com menores atividades antimicrobianas foram menos hemolíticos. Este fato
seria muito interessante, pois se estaria obtendo análogos que, embora menos potentes,
não seriam tão hemolíticos. Entretanto, a ausência de uma ou duas das pontes fez com
que os análogos fossem quase que completamente degradados em poucos minutos pelas
enzimas plasmáticas humanas (Figura10).
1.2.4) Substituição de pontes de dissulfeto por pontes de lactama
Devido à importância das ligações de dissulfeto, já descrita no item anterior, Fázio e colaboradores(Fázio e cols., 2006) estudaram, ainda, se as ligações de dissulfeto poderiam ser substituídas por outro tipo de ligação intracadeia. E, para tanto, foi escolhida a ligação de lactama. Em tal modelo de ciclização é possível restringir a configuração da molécula de escolha através de uma ligação peptídica entre duas cadeias laterais de resíduos de aminoácidos presentes na estrutura primária do peptídeo. No entanto, esta ligação ocorre apenas entre aminoácidos que tenham uma porção N-terminal ou C-terminal, de forma a possibilitar o encontro destas duas porções, disponível nas extremidades de suas cadeias laterais. A idéia principal de se estudar este tipo de substituição foi a de conferir aos análogos da Gm uma maior estabilidade química, já que há no sistema biológico enzimas capazes de promover a redução das ligações de dissulfeto em meio fisiológico. O emprego de ligações de lactama também possibilita investigar a influência do tamanho do anel (Figura 11) e da quiralidade dos aminoácidos constituintes da ligação (Figura12) na expressão da atividade biológica e conformacional destes novos análogos obtidos. Além disto, existe a vantagem do ponto de vista sintético, pois a formação das ligações de lactama pode ser realizada com o peptídeo ainda ligado à resina, o que minimiza a formação de dímeros, trímeros, etc.
Introdução
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Figura9. Gráfico da atividade hemolítica da Gm, de seus análogos lineares e monocíclicos, contendo Cys (Acm) ou Ser.
Adaptado de Fázio e cols., 2006.
Figura10. Gráfico da cinética de degradação enzimática da Gm, de seus análogos
Introdução
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Cys-Cys Dap-Asp Glu-Lys
Cys-Cys Dap-Asp Glu-Lys
Figura11. Comparação do tamanho da ligação de dissulfeto (Cys-Cys) com o das pontes
de lactama (Dap-Asp) e (Glu-Lys).
D- ou L-Asp D- ou L-Glu
Componentes Carboxílicos
D- ou L-Dap D- ou L-Orn D- ou L-Lys
Componentes Amínicos
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1.2.5) Relação estrutura/atividade da gomesina através da Alanina-Scan
Com o objetivo de se estudar a importância das cadeias laterais na atividade biológica da Gm, Lamas e colaboradores(Lamas e cols., 2004) sintetizaram análogos deste peptídeo em que cada resíduo de aminoácido foi substituído individualmente por uma alanina (Ala). Este aminoácido foi escolhido por apresentar a cadeia lateral menos volumosa dentre os demais aminoácidos. Cabe aqui ressaltar que, neste tipo de estudo, não se escolhe a glicina, pois, além da alteração de cadeia lateral desejada, uma segunda variável não desejada, que são as alterações conformacionais, seria introduzida. Como a glicina não apresenta um carbono alfa (ou central) assimétrico, ter-se-ia uma maior flexibilidade da cadeia peptídica, o que poderia reproduzir alterações conformacionais maiores que as esperadas e de forma descontrolada.
Os peptídeos foram sintetizados, caracterizados e tiveram suas atividades biológicas (antimicrobianas e hemolítica) determinadas. Possíveis alterações conformacionais na estrutura secundária destes peptídeos foram avaliadas por dicroísmo circular em diferentes sistemas de solvente. Conforme os resultados obtidos, as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, Leu5, Tyr7, Val12 e Tyr14, mostraram-se mais importantes, uma vez que sua remoção implicou na diminuição das atividades antimicrobianas em todos os micro-organismos testados. A atividade hemolítica e os espectros de dicroísmo circular foram praticamente idênticos para todos os análogos analisados. Estes resultados mostram a importância e o envolvimento da região hidrofóbica da molécula de Gm (Figura 13) no mecanismo de morte dos pátogenos alvos.
Figura13. Representação dos resíduos importantes para a atividade da Gm através do
Introdução
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1.2.6) Síntese e atividade dos análogos lineares que mimetizam o beta-hairpin
Na tentativa de se baratear o processo de síntese peptídica, tornando-a mais fácil e mais rápida, Fázio e colaboradores(Fázio e cols., 2007) estudaram diferentes análogos lineares da Gm. Neste trabalho, os autores fizeram as seguintes considerações: 1) a conformação em grampo de cabelo – beta-hairpin – é essencial para a manutenção das atividades antimicrobianas; 2) os análogos deveriam apresentar boas atividades antimicrobianas e baixa atividade hemolítica; e 3) estes também deveriam ser estáveis à degradação em plasma humano. Assim sendo, no desenho dos análogos lineares, resíduos de D-prolina, nas posições oito e nove da seqüência primária da Gm, foram adicionados com a intenção de se mimetizar a dobra do tipo beta presente na molécula nativa. E, para estabilização dos peptídeos nesta conformação em grampo de cabelo, os resíduos de cisteína foram substituídos por resíduos de serina ou treonina, já que estes são capazes de estabelecer pontes de hidrogênio e, finalmente, conferir estabilidade contra a degradação enzimática. Dentre os análogos analisados, destacamos o [D-Thr2,6,11,15, Pro9]-D-Gm, que apresentou um índice terapêutico de 4,88; 19,53 e 78,12 contra S. aureus, E. coli e C. albicans, respectivamente, e foi tão estável quanto a Gm no plasma humano. Como pode ser observada na Figura 14, a estrutura deste análogo é muito parecida com a da Gm nativa(Fázio e cols., 2007).
Figura14. Comparação das estruturas obtidas por RMN da Gm e de seu análogo linear
[D-Thr2,6,11,15, Pro9]-D-Gm. Adaptado de Fázio e cols., 2007.
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1.3) Estudos conformacionais por espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência
Dentre as técnicas disponíveis para estudos conformacionais de proteínas e peptídeos em solução, destacaram-se, nos últimos 40 anos, as espectroscopias de dicroísmo circular (Circular Dichroism, CD) e de fluorescência. Isto se deve, principalmente, ao desenvolvimento da instrumentação destas espectroscopias, tornando as medidas muito mais sensíveis. Diferentemente da técnica de difração de raios X, a qual necessita de cristalização, e da de ressonância magnética nuclear, na qual a água dificulta as análises, tanto a espectroscopia de CD quanto a de fluorescência utilizam-se de pouca quantidade de amostra e esta é, na maioria das vezes, completamente recuperada.
Brevemente, a técnica de dicroísmo circular baseia-se no desvio da luz, circularmente polarizada à esquerda e à direita, incidente em compostos quirais (ou assimétricos). Em proteínas e peptídeos, o carbono alfa de cada aminoácido, por possuir uma vizinhança assimétrica, desviará a luz polarizada, resultando em um sinal de CD. Este sinal dependerá essencialmente do enovelamento da cadeia principal na formação da estrutura secundária. Assim, esta técnica é capaz tanto de identificar quanto de revelar mudanças na estrutura secundária de proteínas e peptídeos. O espectro de CD entre 180 e 260 nm, região ultravioleta distante, pode identificar estruturas como hélices alfa, folhas betas paralelas e anti-paralelas, dobras betas e estruturas randômicas. Além disto, ligações de dissulfeto e aminoácidos aromáticos, Phe, Tyr e Trp, contribuem para bandas na região de 230 nm(Fasman, 1996).
No caso da Gm, devido a estudos de NMR que evidenciam sua estruturação em grampo de cabelo, como descrito anteriormente, os estudos de dicroísmo circular serão centrados na teoria que envolve estes tipos de estruturas (dobras e folhas betas). Estudos com peptídeos modelos demonstraram que tais estruturas em dobras betas (tipos I e II) possuem um mínimo negativo centrado em 205 nm e um máximo positivo em torno de 190 nm, como mostra a Figura 15. Já nas estruturas em folhas betas (paralelas e antiparalelas) este mínimo negativo se encontra em 215 nm.
Introdução
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Figura 15. Espectros de CD de peptídeos em dobra beta.
(──) Gly-Pro-Ser (OtBu)-Gly-NH- (CH2)4-CO, dobra beta I; e (···) Gly-Pro-Gly-Gly-NH- (CH2)4-CO, dobra beta II (adaptado de FASMAN, 1996).
acomodar interações hidrofóbicas, eletrostáticas e outras que interferem na conformação final(Campana, 1998). A Figura 16 ilustra alguns destes espectros.
Figura16. Dicroísmo circular de polipeptídeos desordenados.
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As medidas de dicroísmo circular, em geral, são feitas em miligraus. No entanto, para que o espectro resultante possa ser comparado mais facilmente com os dados da literatura, convencionou-se exibir os resultados de forma independente dos valores de concentração e tamanho do peptídeo ou da proteína e do tamanho do caminho ótico. Para isto, os dados são convertidos em elipticidade molar média por resíduo ([θ]MRW) em grau.cm2.dmol-1. Esta conversão é realizada de acordo com a equação abaixo:
[θ]MRW = (θ* MRW) / (ℓ * c * 10)
Na qual, θ é o ângulo medido em miligraus a cada comprimento de onda, ℓ é o caminho ótico da cela utilizada em cm, c é a concentração da amostra analisada em mg/mL e MRW, peso molecular médio por resíduo (do inglês Mean Residue Weigth), é o peso molecular do peptídeo em razão de seu número de resíduos.
Outra técnica bastante utilizada é a espectroscopia de fluorescência. Este fenômeno ocorre em compostos particulares, denominados fluoróforos que, quando excitados em um dado comprimento de onda (em geral, em seus máximos de absorção), emitem luz em comprimentos de onda diferentes. Assim, tal fenômeno pode ser definido como a emissão que resulta do retorno de um elétron que foi excitado para um orbital de nível mais baixo; mais especificamente, é a luz emitida quando o estado excitado singleto (S1) decai para o estado singleto fundamental (S0)(Lackowicz, 1983).
Esta técnica espectroscópica teve um rápido desenvolvimento nas últimas décadas devido a sua aplicação em estudos de proteínas e peptídeos, os quais geralmente possuem fluoróforos intrínsecos (como resíduos de Tyr, Trp e Phe). Uma grande vantagem desta técnica é a possibilidade de utilizarem-se baixas concentrações protéicas (ou peptídicas) para a realização das medidas de fluorescência(Lackowicz, 1983). Estas medidas de fluorescência podem ser estáticas ou dinâmicas (resolvidas no tempo). Para este projeto adotamos as medidas estáticas.
Introdução
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Figura 17. Diagrama de Perrin-Jablonski.
Adaptado de LACKOWICZ, 1983.
Os resíduos de Trp são os mais fluorescentes, geralmente responsáveis por 90% da fluorescência nas proteínas e peptídeos. Sendo assim, este fluoróforo é altamente sensível mesmo a pequenas mudanças ocorridas no meio, tais como interações com sistemas miméticos de membrana. Já a Tyr é altamente fluorescente em solução, mas sua emissão é geralmente fraca em proteínas e peptídeos.
Assim, estas espectroscopias se mostram adequadas para a caracterização tanto da Gm quanto de seu análogo linear [Ser2,6,11,15]-Gm, bem como para detectar possíveis interações destes peptídeos com os solventes empregados.
