NATÁLIA MARIA ESPÍNDOLA SALLES
CARACTERÍSTICAS DOS ESPERMATOZOIDES EM ESPÉCIES DE
LEPTODACTYLUS (ANURA, LEPTODACTYLIDAE)
Orientadora: Prof. Dra. Cynthia Peralta de Almeida Prado Co-orientador: Prof. Dr. Fernando José Zara
Rio Claro 2014
NATÁLIA MARIA ESPÍNDOLA SALLES
CARACTERÍSTICAS DOS ESPERMATOZOIDES EM ESPÉCIES DE
LEPTODACTYLUS (ANURA, LEPTODACTYLIDAE)
Comissão examinadora:
Dra. Cynthia Peralta de Almeida Prado (orientadora) Dra. Cinthia Aguirre Brasileiro
Dra. Ana Cristina Prado Veiga-Menoncello
Rio Claro, 30 de Setembro de 2014
Agradecimentos
Especialmente gostaria de agradecer aos meus pais, Sylvia e Carlos, que me ensinaram a lutar pela vida e pelos meus objetivos, me apoiando e respeitando minhas decisões, sempre com muito carinho e paciência. À minha irmã, Nívea, sempre ao meu lado, mesmo que distante, me garantindo sempre que está tudo bem... Amo muito vocês! Sinto saudades todos os dias.
À toda minha família pelos poucos mas ótimos momentos! Sempre me esperando com festa e alegria quando estou de volta, vocês são a força que me faz voltar! Obrigada.
Aos amigos do Vale, pelos longos anos de amizade verdadeira, em especial à Ieda, Amanda, Felipe, Thiago e Alice, o reencontro é cada vez mais difícil, mas vale cada minuto de espera.
Aos amigos conquistados nesse período de quase 10 anos em Jaboticabal, em especial à República Abduzidas, por me ensinar a conviver e a compartilhar comigo os momentos únicos vividos até aqui! À essa nossa família que sempre estará gravada em nossos corações!
À República WoodsHouse, Gilas, Ermão, Karen, Franguinho e Fabrício, pelos momentos de descontração e alegria! Em especial à Valderrama, pela sincera amizade e parceria nesses anos todos! À República Arrankabaço, Pelotas, Bandida, pela amizade. A Verinha... A vida em Jabuca não seria a mesma sem vocês! Valeu!
Ao Daniel, pela paciência, companheirismo e amor!
À Tavani, pela amizade construída em casa e no laboratório, compartilhando experiências, angústias e também os bons momentos!
Aos amigos conquistados nos laboratórios, Tavani, Maria Alice, Avatar, Veja, Cilene, Nimal, Ana Paula, e à querida técnica Márcia, pela confiança, amizade e palavras sábias que me permitiram continuar a caminhada um dia de cada vez, meus mais sinceros agradecimentos! À Magrela, presente em um dos momentos mais difíceis do mestrado, que com sua alegria e amizade tornou os dias, tardes e noites no laboratório muito mais fáceis!
À minha orientadora, Cynthia Prado, pelas orientações e principalmente pela confiança e amizade construídas nesses anos.
Ao Fernando Zara, pela amizade e orientação, muito importantes para o desenvolvimento deste trabalho.
Ao Depto de Biologia Aplicada – FCAV/Unesp, juntamente ao IML por permitirem a realização deste trabalho.
Aos amigos do Jacarezário, meu muito obrigada pelos ótimos momentos e pela experiência compartilhada! Obrigada por ter sido tão bem recebida na “casa” de vocês.
À Pedrita, Thais, Fernanda, Nadya e Lú pela casa propriamente dita! Obrigada pela hospedagem e companhia!
Ao Thiago Gazoni, pela incansável jornada em busca dos Leptodactylus, e pelas importantes contribuições a este trabalho.
Ao Xiru Biru, pela amizade e seu empenho nos baldes que renderam parte importante dos espécimes analisados.
À todos aqueles que me ajudaram no campo, compartilhando as aventuras e perrengues inesquecíveis desta melhor etapa do trabalho.
À Música, por me acompanhar de forma inspiradora e relaxante no universo da Microscopia.
À banca examinadora pelas correções.
À FAPESP, CNPq e CAPES pelo suporte financeiro e a CAPES pela bolsa de mestrado concedida.
Muito Obrigada a Todos!
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SUMÁRIO
Resumo...7
Abstract...8
Introdução Geral...9
Referências Bibliográficas...13
Capítulo I: MORFOLOGIA E ULTRAESTRUTURA DOS ESPERMATOZOIDES EM ESPÉCIES DA SUBFAMÍLIA LEPTODACTYLINAE (ANURA, LEPTODACTYLIDAE)...15
Resumo...16
Introdução...17
Material e Métodos...18
Resultados...20
Documentação fotográfica...24
Discussão...41
Referências Bibliográficas...45
Capítulo II: CARACTERÍSTICAS DAS GÔNADAS E ESPERMATOZOIDES EM ESPÉCIES DO GÊNERO LEPTODACTYLUS (ANURA, LEPTODACTYLIDAE) E A INFLUÊNCIA DA POLIANDRIA...49
Resumo...50
Introdução...51
Material e Métodos...53
Resultados...58
Discussão...71
Referências Bibliográficas...75
Conclusões...81
Resumo
As espécies da subfamília Leptodactylinae apresentam grande diversidade de modos reprodutivos, acompanhada de diferentes estratégias reprodutivas, dentre elas os acasalamentos poliândricos. A análise da morfologia de gônadas e espermatozoides em um contexto filogenético é uma importante ferramenta para se compreender a evolução desta estratégia reprodutiva alternativa em anuros. Assim, neste estudo descrevemos a morfologia e ultraestrutura de espermatozoides de 11 espécies de Leptodactylus e de Lithodytes lineatus, bem como investigamos as relações entre as características das gônadas e espermatozoides em espécies poliândricas e não poliândricas de Leptodactylus, utilizando métodos comparativos filogenéticos. Nossa análise ultraestrutural mostrou que os espermatozoides dos leptodactilíneos são semelhantes aos de outros anuros. As principais diferenças ocorreram na região do complexo acrossomal. Além disso, detectamos dois tipos morfologicamente distintos de espermatozoide, sendo um deles observado em todas as espécies poliândricas analisadas. As espécies poliândricas de Leptodactylus apresentaram maior comprimento e densidade de espermatozoides, além de maior massa relativa de testículo e diâmetro do túbulo seminífero em comparação com as não poliândricas. O teste de correlação de caracteres evolutivos mostrou que estas características, todas com valores acima da média, foram correlacionados com a ocorrência de poliandria no gênero. Dessa forma, nossos resultados sugerem que a competição de esperma em espécies de Leptodactylus exerce importante pressão de seleção, levando, principalmente, a um aumento no tamanho e densidade de espermatozoides e aumento no investimento em gônadas, provavelmente como forma de aumentar o sucesso de fertilização dos machos.
Abstract
Species in the subfamily Leptodactylinae exhibit a great diversity of reproductive modes and adopt different reproductive strategies, including polyandrous matings. The analysis of the gonad and sperm morphology in a phylogenetic context is crucial to understand the evolution of this alternative reproductive strategy in anurans. Here, we describe the sperm morphology and ultraestructure of 11 Leptodactylus species and that of Lithodytes lineatus and investigated the relationship between gonad and sperm morphology in polyandrous and non polyandrous Leptodactylus species using phylogenetic comparative methods. Our analysis revealed that the sperm ultraestructure of the leptodactylines was very similar to that of other anurans. The main differences occurred at the acrosomal complex region. Furthermore, we detected two distinct sperm morphotypes, one of them observed in all polyandrous species analyzed. Polyandrous Leptodactylus species produced larger sperm at higher densities and presented larger relative testes mass and seminiferous tubules compared to non polyandrous species. The correlated character evolution test showed that these gonad and sperm traits, all with values above the mean, correlated with the presence of polyandry in the genus. Thus, our results suggest that the sperm competition is an important selective pressure, leading to an increase in sperm size and density in Leptodactylus males, also increasing gonad mass allocation, probably as a way to increase fertilization success.
Introdução geral
A família Leptodactylidae possui cerca de 200 espécies, distribuídas, principalmente, na América do Sul (Frost, 2014). Atualmente os leptodactilídeos estão divididos em três subfamílias: Paratelmatobiinae, com 13 espécies, Leiuperinae, com 90 espécies, e Leptodactylinae, com 98 espécies (Pyron e Wiens, 2011; Frost, 2014). Na subfamília Leptodactylinae encontram-se os gêneros Adenomera, Lithodytes, Hidrolaetare e
Leptodactylus, este último o mais especioso com 76 espécies descritas (Pyron e Wiens, 2011;
Frost, 2014). As rãs desse gênero apresentam desde modo reprodutivo completamente aquático, até modos reprodutivos terrestres, com espécies que apresentam passos intermediários quanto à reprodução (Heyer, 1969; Prado et al., 2002). De maneira geral, a reprodução totalmente dependente da água é mais difundida entre os anuros e considerada um modo reprodutivo ancestral, porém, é possível identificar muitas estratégias reprodutivas derivadas, com desova e desenvolvimento de girinos fora do ambiente aquático (Gomez-Mestre et al., 2012).
Em relação à Leptodactylus, todas as espécies depositam seus ovos em ninhos de espuma, podendo estes ser depositados na superfície da água, no solo às margens de corpos d’água ou em câmaras subterrâneas, próximas ou distantes da água (Heyer, 1969; Prado et al., 2002). Foi sugerido que a presença de espuma confere proteção aos ovos e embriões contra danos físicos e desidratação, permitindo aos girinos sobreviverem por mais tempo, mesmo em períodos de estiagem prolongada, podendo conduzi-los a uma menor dependência de água (e.g., Heyer, 1969; Prado et al., 2002; Prado et al., 2005).
Com base em modos reprodutivos e características morfológicas, Heyer (1969) sugeriu cinco grupos fenéticos para as espécies desse gênero: grupo de Leptodactylus fuscus, de L.
marmoratus, de L. melanonotus, de L. latrans (referido como L. ocellatus) e de L.
pentadactylus. Posteriormente, Heyer (1974) realocou as espécies de Leptodactylus do grupo
marmoratus no gênero Adenomera. A relação filogenética das espécies do grupo de L.
marmoratus em relação às demais espécies de Leptodactylus têm sido controvertida na
L. fuscus (ver Ponssa, 2008; Ponssa et al., 2010; Pyron e Wiens, 2011). Desta forma, seguindo
a filogenia recentemente publicada com base em dados moleculares para todos os Amphibia (Pyron e Wiens, 2011), onde aparecem representados todos os grupos de Leptodactylus, consideramos para este estudo as espécies incluídas nos grupos de L. melanonotus, de L.
latrans, de L. pentadactylus e de L. fuscus.
A grande diversidade de espécies de Leptodactylus é acompanhada também por uma grande diversificação de modos reprodutivos (Pombal e Haddad, 2007). As espécies incluídas no grupo de L. latrans depositam seus ovos em ninhos de espuma sobre a água e os girinos são aquáticos. No caso de L. podicipinus (grupo de L. melanonotus), os machos constroem pequenas depressões no solo contendo água, onde os ovos são depositados, e os girinos são aquáticos (Prado et al., 2002). Este modo reprodutivo também é conhecido para L. natalensis (Santos e Amorim, 2006), que também pertence ao grupo de L. melanonotus, e é possível que também ocorra em outras espécies deste mesmo grupo.
Já nas espécies pertencentes ao grupo de L. fuscus, os machos constroem tocas subterrâneas às margens de corpos d’água, onde são depositados os ovos em ninhos de espuma, restringindo o acesso de outros machos no momento da desova (Martins, 1988, Prado e Haddad, 2003; Oliveira Filho et al., 2005). Após chuvas ou alagamentos, os girinos exotróficos são carregados até os corpos de água, onde completam seu desenvolvimento. Em espécies do grupo de L. pentadactylus as desovas podem ser terrestres ou depositadas em depressões contendo água nas margens de corpos d´água (Prado et al., 2002). As larvas podem chegar até a água no início de seu desenvolvimento ou após extenso período de tempo, ou ainda podem completar seu desenvolvimento nos ninhos de espuma, totalmente independentes do ambiente aquático (Heyer, 1969; Gibson e Buley, 2004). Como observado em L. labyrinthicus (grupo de L. pentadactylus), os casais depositam os ninhos de espuma próximos das margens de corpos d’água (Silva et al., 2005). Na presença da fêmea, o macho inicia a escavação de uma depressão no solo que, após o amplexo, finalizam a construção do ninho. Durante o período em que permanecem no ninho, os girinos podem se alimentar de ovócitos tróficos, podendo completar a metamorfose sem ter acesso à água, no caso de estiagens prolongadas (Prado et al., 2005; Silva et al., 2005). Dessa forma, é possível identificar dentre as espécies do gênero Leptodactylus, diferentes modos reprodutivos, desde a forma totalmente aquática até as mais terrestres (Heyer, 1969; Prado et al., 2002).
2012). No gênero Leptodactylus, a ocorrência de poliandria simultânea já foi relatada para L.
chaquensis (grupo de L. latrans) e L. podicipinus (grupo de L. melanonotus) (Prado e Haddad,
2003). Nessas duas espécies, o tamanho relativo dos testículos foi bem maior quando comparado com aqueles de espécies não poliândricas (Prado e Haddad, 2003). Mais recentemente, o comportamento de acasalamento envolvendo uma única fêmea e dois machos foi observado para L. bufonius (grupo de L. fuscus) (Faggioni et al., 2011). O sistema poliândrico pode conferir benefícios para a fêmea, reduzindo o esgotamento de esperma disponível ou diminuindo as chances de problemas relacionados à incompatibilidade de gametas (Reynolds, 1996; Byrne e Whiting, 2008). Porém, custos relacionados à poliandria também foram sugeridos, tais como o aumento do risco de predação e a possibilidade de transmissão de doenças, tornando o tema bastante discutido (e.g., Birkhead, 1998; Ashby e Gupta, 2013).
Em relação aos machos, o sistema poliândrico pode levar à competição de esperma, visto que dois ou mais machos competem pela fertilização dos ovócitos de uma única fêmea (Parker, 1970). Assim, a competição espermática pode influenciar tanto na morfologia do sistema reprodutor e tamanho das gônadas, quanto na morfologia dos espermatozoides e fisiologia dos indivíduos (e.g., Jennions e Passmore, 1993; Birkhead, 1998; Prado e Haddad, 2003). Espécies sob competição de esperma podem produzir espermatozoides com diferenças morfológicas que podem estar relacionadas ao investimento para obter maior eficiência reprodutiva (Snook, 1998). Em aves, por exemplo, há significativa variação quanto ao comprimento total dos espermatozoides em passeriformes que apresentam comportamento poliândrico (Birkhead, 1998). Em anuros, foi sugerida a evolução de espermatozoides mais longos em espécies poliândricas (Byrne et al., 2003; Zeng et al., 2014). Porém, apesar desses trabalhos já realizados, o conhecimento da ultraestrutura dos espermatozoides e, adicionalmente sua relação com diferentes estratégias reprodutivas, é pequeno se comparado a grande diversidade dos anuros (Frost, 2014).
O uso de métodos filogenéticos comparativos vem sendo cada vez mais utilizados na tentativa de se testar hipóteses sobre a evolução de características e comportamentos reprodutivos em anuros (e.g.,Byrne et al., 2002; Gomez-Mestre et al., 2012; Zeng et al.;
Diante do exposto acima, esta dissertação, dividida em dois capítulos, teve como objetivos investigar a relação entre a poliandria e as características dos espermatozoides e testículos em espécies da subfamília Leptodactylinae. No primeiro capítulo descrevemos a morfologia e a ultraestrutura de espermatozoides de 11 espécies de Leptodactylus e de
Lithodytes lineatus, buscando diferenças em características morfológicas que possam estar
Referências Bibliográficas
BYRNE, P. G; ROBERTS, J. D.; SIMMONS, L. W. Sperm competition selects for increased testes mass in Australian frogs. Journal of Evolutionary Biology, v. 15, p. 347-355, 2002.
FROST, D. R. Amphibian Species of the World: an Online Reference. Version 6.0 (Date of
access).Electronic Database accessible at http://research.amnh.org/herpetology/amphibia/index.html. American Museum of Natural
History, New York, USA, 2014.
FROST, D.R.; GRANT, T; FAIVOVICH, J.; BAIN, R. H.; HASS, A.; HADDAD, C. F. B.; SÁ, R. O.; CHANNING, A.; WILKINSON, M.; DONNELLAN, S. C.; RAXWORTHY, C.; CAMPBELL, J. A.; BLOTTO, B. L.; MOLER, P.; DREWES, R. C.; NUSSBAUM, R. A.; LYNCH, J. D.; GREEN, D. M.; WHEELER, W. C. The amphibian tree of life.Bulletin of the American Museum of Natural History, v. 297, p. 1-370, 2006.
GIBSON, R. C.; BULEY, K. R. Maternal care and obligatory oophagy in Leptocatylus fallax: a new reproductive mode in frogs. Copeia, v. 2004, p. 128-135, 2004.
GOMEZǦMESTRE, I.; PYRON, R. A.; WIENS, J. J. Phylogenetic analyses reveal
unexpected patterns in the evolution of reproductive modes in frogs. Evolution, v. 66, p. 3687-3700, 2012.
HARVEY, P. H.; PAGEL, M. D.The comparative method in evolutionary biology.Oxford University Press, New York, 1992.
HEYER, W. R. The adaptive ecology of the species groups of the genus Leptodactylus (Amphibia, Leptodactylidae). Evolution, v. 23, p. 421-428, 1969.
HEYER, W. R. Relationships of the marmoratus species group (Amphibia, Leptodactylidae) within the subfamily Leptodactylinae. Contribution in Science Natural History Museum of Los Angeles County, v.253, p. 1-46, 1974.
MARTINS, M. ReproductivebiologyofLeptodactylus fuscus in Boa Vista, Roraima (Amphibia: Anura). Revista Brasileira de Biologia, v. 48, p. 969-977, 1988.
NALI, R. C.; ZAMUDIO, K. R.; HADDAD, C. F. B.; PRADO, C. P. A. Size-dependent selective mechanisms on males and females and the evolution of sexual size dimorphism in frogs. American Naturalist, in press. 2014.
OLIVEIRA FILHO, J. C.; COSTA, H. C. M.; BRAGA, U. M. L. Egglayingfoam-beating in Leptodactylus fuscus (anura, leptodactylidae). Biota Neotropica, v. 5, p. 319-320, 2005.
POMBAL Jr, J. P.; HADDAD, C. F. B. Estratégias e modos reprodutivos em anuros. In: Nascimento, L. B.; Oliveira, M. E. (Org.). Herpetologia no Brasil II. Belo Horizonte: Sociedade Brasileira de Herpetologia, p.101-116, 2007.
PONSSA, M. L.; JOWERS, M. J.; SÁ, R. O. Osteology, natural history notes, and phylogenetic relationships of the poorly known Caribbean frog Leptodactylus nesiotus (Anura, Leptodactylidae). Zootaxa, v. 2646, p. 1-25, 2010.
PRADO, C. P. A.; HADDAD, C. F. B. Testes size in leptodactylid frogs and occurrence of multimale spawning in the genus Leptodactylus in Brazil. Journal of Herpetolology,v. 37, p. 354-362. 2003.
PRADO, C. P. A.; TOLEDO, L. F.; ZINA, J.; HADDAD, C. F. B. Trophic eggs in the foam nests of Leptodactylus labyrinthicus(Anura, Leptodactylidae): an experimental approach. Herpetological Journal, v. 15, p. 279-284, 2005.
PRADO, C. P. A.; UETANABARO, M.; HADDAD, C. F. B. Description of a new
reproductive mode in Leptodactylus (Anura, Leptodactylidae), with a review of the reproductive specialization toward terrestriality in the genus. Copeia, Estados Unidos, v. 2002, p. 1128-1133, 2002.
PYRON, R. A.; WIENS, J. J.A large-scale phylogeny of Amphibia including over 2800 species, and a revised classification of extant frogs, salamanders, and caecilians.Molecular Phylogenetics and Evolution, v. 61, p. 543-583, 2011.
SANTOS, E. M.; AMORIM, F. O. Cuidado parental em Leptodactylus natalensis (Amphibia, Anura, Leptodactylidae). Iheringia, Sér. Zool., v. 96, p. 491-494.
SILVA, W. R.; GIARETTA, A. A.; FACURE, K. G. On the natural history of the South American pepper frog, Leptodactylus labyrinthycus (Spix, 1824) (Anura: Leptodactylidae), Journal of Natural History, v. 1, p. 1-12, 2005.
Capítulo I
MORFOLOGIA E ULTRAESTRUTURA DOS ESPERMATOZOIDES EM ESPÉCIES DA
SUBFAMÍLIA LEPTODACTYLINAE (ANURA, LEPTODACTYLIDAE)
Natália Maria Espíndola Salles, Fernando José Zara e Cynthia Peralta de Almeida Prado
Resumo
Os espermatozoides são as células morfologicamente mais diversas conhecidas e contem particularidades únicas, com adaptações específicas para cada tipo de fertilização. Neste contexto, a ultraestrutura vem sendo uma importante ferramenta para correlacionar a morfologia do espermatozoide com os modos reprodutivos e sistemas de acasalamento. Em anfíbio anuros, a competição espermática atua como uma das principais pressões seletivas responsáveis por modificações nas características dos espermatozoides. Dessa forma, o presente estudo analisou a ultraestrutura de espermatozoides em espécies da subfamília Leptodactylinae, 11 do gênero Leptodactylus e na espécie monotípica Lithodytes lineatus, tentando relacionar a morfologia dos espermatozoides com a ocorrência de poliandria no grupo. Nossa análise ultraestrutural revelou que os espermatozoides dos leptodactilíneos são muito semelhantes aos dos outros anuros, principalmente em relação à peça intermediária e cauda. Porém, encontramos dois padrões morfológicos distintos quanto à região da vesícula acrossomal até o início da peça intermediária, sendo que um deles ocorreu em todas as espécies poliândricas analisadas, além de algumas espécies para quais a poliandria ainda não foi registrada. Sugerimos que estas diferenças possam sinalizar adaptações relacionadas à poliandria na subfamília Leptodactylinae, direcionando estudos futuros quanto às estratégias reprodutivas.
Introdução
A espermiogênese é o processo pelo qual a célula germinativa haploide, i.e. espermátide, reduz drasticamente seu volume celular (Roosen-Runge, 1977). Em diferentes grupos animais, esta redução produz elaboradas estruturas, tais como a cauda e a membrana ondulatória (Swan et al., 1980; Lin et al., 1997; Beguelini et al., 2011). O processo de espermiogênese, ainda que similar em diferentes grupos animais, contem particularidades únicas, com adaptações específicas para cada tipo de fertilização, influenciando diretamente na morfologia do espermatozoide (Jamieson et al., 1993; Lee e Jamieson, 1993; Pitnik et al., 2009). Como os espermatozoides são as células morfologicamente mais diversas conhecidas (Klaus e Brandis, 2011), suas características vem sendo utilizadas como ferramenta em estudos de taxonomia e sistemática em diferentes táxons (Jamieson, 1987; Jamieson, 1991; Klaus e Brandis, 2011), incluindo anuros (e.g., Scheltinga e Jamieson, 2003; Garda et al., 2002; Aguiar-Jr et al., 2006; Veiga-Menoncello et al., 2006).
O interesse no estudo da morfologia do espermatozoide advém também do fato de que a variação na sua estrutura exerce influência sobre características, tais como mobilidade, velocidade e longevidade, as quais, sob determinadas pressões, podem ser responsáveis pelo sucesso de fertilização e evolução do gameta (Pitnik et al., 2009). Por exemplo, em espécies com sistema de acasalamento poliândrico, onde uma fêmea se acasala com vários machos, a competição de esperma é apontada como uma das principais pressões seletivas responsáveis por modificações nas características dos espermatozoides (e.g., Gomendio e Roldan, 1991; Snook, 1998; Byrne et al., 2003; Snook, 2005; Zeng et al., 2014). Portanto, algumas variações entre espécies quanto à morfologia do espermatozoide e outras características do ejaculado podem estar relacionadas à alocação estratégica de recursos relevantes para o acasalamento, bem como podem ser influenciadas pelo risco e intensidade de competição de esperma a que os machos podem estar sujeitos (Parker 1990a, 1993; Stockley e Purvis, 1993; Gage, 1995; Parker et al., 2010).
Estudos têm revelado a ocorrência de acasalamentos poliândricos em diferentes espécies de anuros (e.g., Jennions e Passmore, 1993; Byrne et al., 2003;Prado e Haddad,
conhecimento da ultraestrutura dos espermatozoides e, adicionalmente sua relação com diferentes estratégias reprodutivas, é pequena se comparada a grande diversidade dos anuros (Frost, 2014).
A família Leptodactylidae possui cerca de 200 espécies neotropicais, distribuídas, principalmente, na América do Sul (Frost, 2014). Atualmente os leptodactilídeos estão divididos em três subfamílias: Paratelmatobiinae, com 13 espécies, Leiuperinae, com 90 espécies, e Leptodactylinae, com 98 espécies (Pyron e Wiens, 2011; Frost, 2014). Na subfamília Leptodactylinae encontram-se os gêneros Adenomera, Lithodytes, Hidrolaetare e
Leptodactylus, este último com 76 espécies descritas (Pyron e Wiens, 2011; Frost, 2014). Os
leptodactilíneos possuem fertilização externa, desovas depositadas em ninhos de espuma e exibem uma grande diversidade de modos e estratégias reprodutivas (Heyer, 1969; Prado et al., 2002; Fouquet et al., 2013). Acasalamentos poliândricos já foram descritos para as espécies Leptodactylus chaquensis, L. podicipinus (Prado e Haddad, 2003) e Leptodactylus
bufonius (Faggioni et al., 2011). Porém, são poucos os trabalhos que descrevem a morfologia
e ultraestrutura do espermatozoide em espécies da família (Amaral et al., 1999; Amaral et al., 2000; Jamieson, 2003), o que impede o avanço de estudos que tentam correlacionar as características dos espermatozoides com o comportamento e sucesso reprodutivo em machos. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo descrever a morfologia e a ultraestrutura do espermatozoide de 11 espécies do gênero Leptodactylus e de Lithodytes lineatus, buscando discutir a relação entre as características do espermatozoide e a ocorrência de poliandria. Material e métodos
Machos de 11 espécies de Leptodactylus foram coletados em diferentes regiões do Brasil e machos de Lithodytes lineatus foram coletados no norte do estado de Mato Grosso (Tabela 1). Para L. syphax e Li. lineatus, coletamos um único macho de cada espécie. Com base na literatura sobre a ocorrência de comportamentos poliândricos (Prado e Haddad, 2003; Faggioni et al., 2011), para este estudo, consideramos como poliândricas as espécies L.
bufonius, L. chaquensis e L. podicipinus. Como não há registros de acasalamentos
poliândricos para as demais espécies aqui analisadas, estas foram consideradas como não poliândricas.
em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,3) à 4°C por no mínimo 4 horas. Após a fixação, o material foi lavado no mesmo tampão (3X, 10 min) e pós-fixado com tetróxido de ósmio 2% durante duas horas. Após lavagens no mesmo tampão, as amostras foram contrastadas “En bloc” com solução aquosa de acetato de Uranila 1% (“overnight”), desidratadas em séries crescentes de acetona (70-100%), embebidas e incluídas em resina Epon-Araldite. Os cortes ultrafinos (50 nm) foram obtidos com navalha de diamante no ultramicrótomo (Leica UC7) e recolhidos em grades de cobre (100 mesh). As grades foram contrastadas em Acetato de Uranila 2% em água por 45 minutos e, posteriormente, em Citrato de Chumbo 0,4% em NaOH 0,1M por 10 minutos. As imagens digitais foram obtidas no microscópio eletrônico de transmissão JEOL – JEM 1010 com potência de 80Kv do Laboratório de Microscopia Eletrônica, UNESP, FCAV – campus de Jaboticabal, São Paulo.
Fragmentos restantes do testículo dissecado foram utilizados para a observação dos espermatozoides testiculares com uso de microscópio de contraste interdiferencial de fase (DIC). Para tal, cada fragmento foi mecanicamente dissociado em 10 μl em fixador paraformaldeído 4%, sendo posteriormente, pipetado 5 ȝl de amostra, a qual foi depositada em lâmina e recoberto por lamínula. As imagens digitais dos espermatozoides foram adquiridas no fotomicroscópio Zeiss® Axio Imager Z2, sempre com objetiva 100 x.
As coletas foram devidamente autorizadas pelo ICMBio (licenças 19269-1, 30202-2, 37820-3 e 35566-4) e o protocolo de experimentação foi aprovado pela CEUA - Comissão de Ética no Uso de Animais do campus da UNESP de Jaboticabal (certificado N° 016549/09). Os indivíduos coletados foram depositados na Coleção de Anfíbios CFBH (Célio F. B. Haddad), do Departamento de Zoologia da UNESP, campus de Rio Claro, São Paulo.
Tabela 1. Grupos fenéticos (Heyer, 1969), espécies, N de machos e local de coleta dos indivíduos utilizados para a análise ultraestrutural dos espermatozoides. Em negrito espécies poliândricas.
Grupo Espécie N Local de coleta por estado
Grupo de L. fuscus Leptodactylus bufonius 14 MS
Leptodactylus furnarius 10 MG
Leptodactylus fuscus 14 MG, MT, SP
Leptodactylus latinasus 2 RS
Grupo de L. latrans Leptodactylus chaquensis 15 MS
Leptodactylus latrans 7 MG, SP
Grupo de L. melanonotus Leptodactylus petersii 4 MT
Leptodactylus podicipinus 10 MS, MT, SP
Grupo de L. pentadactylus Leptodactylus labyrinthicus 7 MG, MT, SP
Leptodactylus paraensis 5 MT
Leptodactylus syphax 1 MG
Lithodytes lineatus 1 MT
Resultados
Microscopia de contraste interdiferencial de fase (DIC)
Os espermatozoides do presente estudo apresentaram aspecto filiforme, com as três típicas regiões distintas observadas em vertebrados, a saber: cabeça, peça intermediária e cauda. Adicionalmente, todas as espécies aqui estudadas apresentaram membrana ondulatória, claramente visível (Fig. 1 e 2).
A morfologia geral do espermatozoide, por meio do DIC, permitiu a separação dos espermatozoides em dois grupos: I) espermatozoides com a cabeça triangular, afilada apicalmente e com complexo acrossomal discreto e de difícil observação da margem posterior (Fig 1A-F); e II) espermatozoides com a cabeça alongada, com clara presença do complexo acrossomal em forma de capuz apical espesso, com margem posterior observável (Fig 2A-G). Adicionalmente, pode-se observar que os espermatozoides do tipo II mostram, ao longo da cabeça alongada, uma região onde ocorre citoplasma delgado e o núcleo. Esta região é aqui denominada arbitrariamente como “região cito-nuclear livre”, e estende-se desde a base do capuz acrossomal até antes da peça intermediária, a qual é marcada pelo aumento do volume citoplasmático. As espécies poliândricas, L. bufonius, L. chaquensis e L. podicipinus, e as espécies L. latrans, L. syphax, L. petersii e Li. lineatus apresentaram os espermatozoides do tipo II (Tabela 2; Fig 2). Por sua vez, as demais espécies não poliândricas, L. furnarius, L.
fuscus, L. latinasus, L. labyrinthicus e L. paraensis, possuem a morfologia geral típica do
espermatozoide do tipo I (Tabela 2; Fig 1).
As espécies da subfamília Leptodactylinae estudadas apresentaram espermatozoides com comprimento total variando de 34 μm até 75 μm (Tabela 2). As espécies do grupo de L.
fuscus apresentaram os menores espermatozoides, exceto na espécie poliândrica L. bufonius,
Tabela 2. Características da cabeça, tipo de espermatozoide e comprimento total (média ± DP) dos espermatozoides de leptodactilíneosao DIC. Em negrito as espécies poliândricas.
Espécies Cabeça Spz Vesícula acrossomal Região cito-nuclear Tipo Spz N Spz Total (μm)
L. bufonius Filiforme Espessa Sim II 194 51,9 ± 4,2
L. furnarius Triangular Estreita Não I 199 39,4 ± 4,3 L. fuscus Triangular Estreita Não I 238 34,7 ± 4,1 L. latinasus Triangular Estreita Não I 20 38,9 ± 5,8
L. chaquensis Filiforme Espessa Sim II 297 50,9 ± 3,6
L. latrans Filiforme Espessa Sim II 116 49,5 ± 3,6
L. petersii Filiforme Espessa Sim II 68 50,3 ± 2,9
L. podicipinus Filiforme Espessa Sim II 214 51,5 ± 4,9
L. labyrinthicus Triangular Estreita Não I 113 44,8 ± 4,1 L. paraensis Triangular Estreita Não I 104 46,6 ± 4,6 L. syphax Filiforme Espessa Sim II 20 62,3 ± 6,2 Li. lineatus Filiforme Espessa Sim II 23 75,1 ± 4,9
Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
Os espermatozoides das espécies estudadas apresentaram vesícula acrossomal na região da cabeça, com espaço subacrossomal adjacente. O núcleo apresenta ápice cônico arredondado, com cromatina em diferentes graus de compactação. A peça intermediária de todas as espécies contem mitocôndrias, fossa nuclear e, como esperado, centríolos proximal e distal. A cauda apresenta único axonema com organização 9+2, ou seja, 9 pares de microtúbulos periféricos organizados em círculo, com 2 microtúbulos centrais. Associado a cauda, todos os leptodactilíneos estudados apresentaram bastão paraxonemal, membrana ondulatória, fibras axial e justaxonemal. Os detalhes da ultraestrutura dos espermatozoides são descritos abaixo.
Complexo acrossomal e núcleo
O complexo acrossomal dos espermatozoides está localizado na porção anterior da cabeça, sobre o núcleo (Fig 3A, G), e contem vesícula acrossomal e espaço subacrossomal. A vesícula acrossomal das espécies estudadas apresentaram dois aspectos claros ao MET, sendo ou estreita e discreta (Fig 3) ou dilatada e espessa, formando um capuz destacado na margem posterior desta estrutura (Fig 5 e 6). As espécies L. fuscus, L. furnarius, L. latinasus (grupo de
L. fuscus), L. paraensis e L. labyrinthicus (grupo de L. pentadactylus) apresentaram vesícula
todas as espécies do grupo de L. melanonotus (Fig 7A, G-H) e do grupo de L. latrans (Fig 5A, H). Entre as espécies do grupo de L. fuscus, somente L. bufonius apresentou este padrão (Fig 4A-C),assim como a espécie L. syphax, do grupo de L. pentadactylus (Fig 6F),e Li. lineatus (Fig 8A). Nestas espécies, após a margem posterior da vesícula acrossomal, ocorre uma faixa muito delgada de citoplasma, tendo como limite externo a membrana plasmática do espermatozoide e interno o envoltório nuclear, aqui denominada região cito-nuclear, que é caracterizada pela ausência de qualquer organela visível, conferindo a morfologia alongada da cabeça. A região cito-nuclear se encerra na altura do início da peça intermediária, onde o citoplasma torna-se volumoso com a presença de mitocôndrias (Fig 4A-E; 5A-D, H-K; 6F; 7A, G; 8A, E). Tais espermatozoides apresentam cabeça alongada e afilada (espermatozoide tipo II).
Em relação ao espaço subacrossomal, este é constituído de material pouco eletrondenso, disperso entre o núcleo e a vesícula acrossomal. O espaço subacrossomal encontra-se reduzido a uma área estreita e contínua nas espécies L. latinasus (Fig 3A e C) L.
furnarius (Fig 3G e I), L. labyrinthicus (Fig 6A e B) e L. paraensis (Fig 6J). Contudo, nas
espécies L. bufonius (Fig 4A-C), L. fuscus (Fig 4I-L), L. chaquensis (Fig 5A), L. latrans (Fig 5H-J), L. syphax (Fig 6F e G), L. petersii (Fig 7A-C), L. podicipinus (Fig 7H) e em Li.
lineatus (Fig 8A-C) esta região forma uma área mais volumosa, claramente externa ao
envoltório nuclear sobre o ápice do núcleo (Fig 4J).
O núcleo não mostra espaço nuclear apical e é preenchido com cromatina condensada e eletrondensa. No entanto é possível observar diversas e variáveis lacunas eletronlúcidas (Fig 3B-C, G-J; 4C, K-L; 5A, H; 6A, F, K-L), as quais estão ausentes em L. petersii (Fig 7A) e Li.
lineatus (Fig 8A) e muito reduzidas em L. podicipinus (Fig 7G,J-L). A região posterior do
núcleo, em geral, mostra uma expansão do citoplasma perinuclear, contendo fileiras de mitocôndrias, tal configuração do citoplasma pode ser observada em todas as espécies em cortes transversais (Fig 3D-E, J; 4N; 5D,K; 6C, L; 7D; 8E) e em cortes longitudinais (Fig 3A-B, K- L; 4A, E, O; 5A, E, H; 6D, F, H, I,M; 7E, G, K, L; 8F)
Peça intermediária
eletrondenso, o material pericentriolar (Fig 3K; 4F; 7L). O bastão paraxonemal está inserido na fossa nuclear, logo após o centríolo proximal e se encontra paralelo ao axonema (Fig 3K, 4O; 5E, L; 6H, M; 7J; 8H). Em corte transversal observamos a base da cauda, com a presença de axonema e bastão paraxonemal justapostos (Fig 4H, 5G; 6N; 7M). As espécies aqui analisadas apresentaram uma expansão de mitocôndrias ao redor da margem posterior do núcleo, configurando-se em um discreto colar de mitocôndrias (Fig. 3E).
Cauda
A cauda das espécies analisadas consiste de axonema e bastão paraxonemal na região mais anterior, envolta por mitocôndrias (Fig 5E; 6M; 8F). Após esta região, o bastão paraxonemal diferencia-se em fibra justaxonemal, membrana ondulatória e fibra axial. A fibra justaxonemal variou em eletrondensidade, sendo pouco eletrondensa nas espécies do grupo de
L. fuscus (Fig 3F, M; 4G) e de L. melanonotus (Fig 7D, F) e eletrondensa nas espécies do
grupo de L. latrans (Fig. 5F, M) e de L. pentadactylus (Fig 6E). Em comparação com as outras espécies, Li. lineatus apresentou variação morfológica da região onde ocorre a fibra justaxonemal. Esta área encontra-se bastante volumosa, lembrando uma taça, sem estrutura eletrondensa característica da fibra (Fig 8I). A membrana ondulatória seguiu o mesmo padrão em todas as espécies e está conectada a fibra axial (Fig 3F; 4P; 5F, M; 6E; 7D, F; 8I), cuja morfologia varia de esférica (Fig 7M; 8I) a forma de gota (Fig 3F; 4P; 5F, M; 6E).
Figura 1.
Figura 2. Micrografia de contraste de fase (DIC) dos espermatozoides de Leptodactylus. A: Lithodytes lineatus. B: Leptodactylus latrans. C: L. bufonius. D: L. syphax. E: L. chanquensis. F: L. podicipinus. G: L. petersii. Note as regiões da cabeça, PI e cauda. Ae: Acrosomal edge; Escala: 5 μm.
Figura 2.
Figura 3. Ultraestrutura do espermatozoide do grupo de L. fuscus.Leptodactylus latinasus (A-F) e L. furnarius (G-M). Escala: A-B: 2 μm; D: 1 μm; C-E-F-H-K-L: 0,5 μm; G-I-J: 0,2 μm. (A) Região anterior da cabeça mostrando vesícula acrossomal e espaço subacrossomal delgados. Note a borda posterior da vesícula em contato com a peça intermediária. (B) Peça intermediária com mitocôndrias na região posterior do núcleo e anterior à cauda. (C e D) Cortes transversais da região apical posterior do núcleo e do colar de mitocôndrias. (E e F) Seção transversal do colar de mitocôndrias na base da cauda e cauda livre. (G-I) Ápice da cabeça mostrando a vesícula acrossomal moderadamente eletrondensa, em contato com a peça intermediária. Em G e I nota-se o detalhe do espaço subacrossomal em corte longitudinal e transversal. (J-L) Peça intermediária em diferentes planos de corte mostrando aumento do volume citoplasmático e diversas mitocôndrias ao redor do núcleo. Em K e L nota-se o centríolo proximal junto à fossa nuclear e a inserção do bastão paraxonemal junto à peça intermediária. (M) Detalhe do axonema com a fibra justaxonemal eletrondensa e parte da membrana ondulatória. Ax. Axonema; bP. bastão paraxonemal; cP. centríolo proximal; eS. espaço subacrosomal; fA. fibra axial; fJ. fibra justaxonemal; fN. fossa nuclear; Mit. mitocôndrias; MO. membrana ondulatória; N. núcleo; vA. vesícula acrossomal; Seta branca: lacunas nucleares eletronlúcidas; Cabeça de seta: acrosomal edge.
Figura 3.
Figura 4. Ultraestrutura de espermatozoides do grupo de L. fuscus. Leptodactylus bufonius (A-H) e L. fuscus (I-P). Escala: A-B-O: 1 μm; C-E-F-I-N-P: 0,5 μm; L: 0,25 μm; D-J-K-M-Q: 0,2 μm; G-H: 0,1 μm. (A-C) Ápice alongado da cabeça mostrando volumosa vesícula acrossomal e espaço subacrossomal dilatado sobre o núcleo. Em A e C nota-se a borda da vesícula acrossomal dilatada formando capuz interrompendo-se abruptamente na delgada faixa de citoplasma que compreende a região cito-nuclear. (D) Seções transversais em diferentes alturas da vesícula acrossomal. (E) Transição da região cito-nuclear com a peça intermediária, com citoplasma volumoso e muitas mitocôndrias. (F-H) Seção longitudinal e transversais da base da cauda, mostrando a disposição do axonema e bastão paraxonemal no início da formação da membrana ondulatória. Em G a membrana ondulatória já está formada. (I-J) Ápice da cabeça mostrando a vesícula acrossomal volumosa e espaço subacrossomal dilatado sobre o núcleo, delimitado pelo envoltório nuclear. (K) Detalhe da borda posterior da vesícula acrossomal em contato com a peça intermediária, sem saliência suficiente para formação de capuz. (L-N) Seções transversais da vesícula acrossomal e, início e final da peça intermediária. (O) Detalhe do colar de mitocôndrias e a inserção da cauda. (P e Q) Corte transversal da cauda e suas estruturas. Em detalhe o axonema e a fibra justaxonemal. Ax. Axonema; bP. bastão paraxonemal; cP. centríolo proximal; eS. espaço subacrosomal; fA. fibra axial; fJ. fibra justaxonemal; fN. fossa nuclear; Mit. mitocôndrias; MO. membrana ondulatória; N. núcleo; vA. vesícula acrossomal; *: região cito-nuclear; Seta branca: lacunas nucleares eletronlúcidas; Cabeça de seta: acrosomal edge.
Figura 4.
Figura 5. Ultraestrutura dos espermatozoides do grupo de L. latrans. L. chaquensis (A-G), L. latrans (H-M) Escala: A-D-E-F-H-I-J-K-L: 0,5 μm; G-M: 0,2 μm; B-C: 0,1 μm. (A-D) Corte longitudinal e transversal da cabeça onde se destaca a ampla região cito-nuclear, detalhe em C. (E) Detalhe da fossa nuclear mostrando o centríolo proximal, bastão paraxonemal e colar de mitocôndrias. (F) Seção transversal da cauda na porção anterior dentro do colar mitocondrial (G) Região posterior da cauda com suas estruturas típicas. (H-K) Corte longitudinal e transversais com a sequência de alturas do ápice da cabeça à peça intermediária. Observa-se em H a região cito-nuclear pouco extensa em relação à L. chaquensis. (L e M) Corte longitudinal da transição entre a peça intermediária e a cauda. Em M nota-se o detalhe da cauda e suas estruturas. Ax. Axonema; bP. bastão paraxonemal; cP. centríolo proximal; cD. centríolo distal eS. espaço subacrosomal; fA. fibra axial; fJ. fibra justaxonemal; fN. fossa nuclear; Mit. mitocôndrias; MO. membrana ondulatória; N. núcleo; vA. vesícula acrossomal; *: região cito-nuclear; Seta branca: lacunas nucleares eletronlúcidas; Cabeça de seta: acrosomal edge.
Figura 5.
Figura 6. Ultraestrutura dos espermatozoides do grupo de L. pentadactylus. L. labyrinthicus (A-E), L. syphax (F-H), L. paraensis (I-N).Escala: I: 2 μm; F-H: 1 μm; A-B-C-D-E-G-J-L-M: 0,5 μm; K: 0,2 μm. (A-E) Seções longitudinais e transversais da região da cabeça à cauda em espermatozoides do tipo I e do tipo II (F-H). Em F o espermatozoide do tipo II apresenta uma evidente borda posterior da vesícula acrossomal dilatada formando um capuz e pequena região cito-nuclear. (J-L) Seção longitudinal da região da cabeça do espermatozoide do tipo I. Em I e J a cabeça de seta indica o contato da delgada vesícula acrossomal com o início da peça intermediária sem saliência que leve a formação de capuz. (M e N) Colar de mitocôndrias e detalhe da base da cauda. Ax. Axonema; bP. bastão paraxonemal; cP. centriolo proximal; cD. centríolo distal; eS. espaço subacrosomal; fA. fibra axial; fJ. fibra justaxonemal; fN. fossa nuclear; Mit. mitocôndrias; MO. membrana ondulatória; N. núcleo; vA. vesícula acrossomal; *: região cito-nuclear; Seta branca: lacunas nucleares eletronlúcidas; Cabeça de seta: acrosomal edge.
Figura 6.
Figura 7. Ultraestrutura dos espermatozoides do grupo de L.melanonotus. L. petersii (A-F), L. podicipinus (G-M). Escala: G: 2 μm; A-J: 0,5 μm; D-K-L-M: 0,2 μm; B-C-E-I: 0,1 μm; F: 0,08 μm. Espermatozoides do tipo II com vesícula acrossomal dilatada em forma de capuz e região cito-nuclear livre. (A-D) Seções da cabeça até a peça intermediária. (E e F) Detalhes da inserção da cauda e axonema. (G) Vista geral do espermatozoide com ampla região cito-nuclear livre. Nota-se evidente borda posterior da vesícula acrossomal. (H) Detalhe da vesícula acrossomal dilatada com espaço subracossomal volumoso no ápice do núcleo. (I) Seção transversal da vesícula acrossomal, mostrando as unidades de membrana plasmática do espermatozoide e da vesícula acrossomal. (J-M). Vista geral e detalhes da fossa nuclear e região anterior da cauda do espermatozoide tipo II, mostrando o colar mitocondrial, axonema e bastão paraxonemal. Ax. Axonema; bP. bastão paraxonemal; cP. centríolo proximal; cD. centríolo distal; eS. espaço subacrosomal; fA. fibra axial; fJ. fibra justaxonemal; fN. fossa nuclear; Mit. mitocôndrias; MO. membrana ondulatória; ME. membrana do espermatozoide; MV. membrana da vesícula acrossomal N. núcleo; vA. vesícula acrossomal; *: região cito-nuclear; Cabeça de seta: acrosomal edge.
Figura 7.
Figura 8.Ultraestrutura do espermatozoide de Lithodytes lineatus. Escala: A-G: 2 μm; D-E-F-H-I: 0,5 μm; B-C: 0,1 μm. (A) Corte longitudinal da cabeça com evidência de espaço cito-nuclear e nítida formação de capuz na porção posterior da vesícula acrossomal espessa. (B-E) Seções transversais em diferentes alturas do ápice da cabeça ao início da peça intermediária. Em E nota-se o espessamento do citoplasma nuclear. (F-H) Cortes longitudinais da transição entre a peça intermediária e o início da cauda com evidência do bastão paraxonemal e axonema. (I) Cauda com axonema, membrana ondulatória e fibras acessórias. Note a fibra justaxonemal dilatada e pouco eletrondensa. Ax. Axonema; bP. bastão paraxonemal; cD. centríolo distal; eS. espaço subacrosomal; fA. fibra axial; fJ. fibra justaxonemal; fN. fossa nuclear; Mit. mitocôndrias; MO. membrana ondulatória; N. núcleo; vA. vesícula acrossomal; Cabeça de seta: acrosomal edge.
Figura 8.
Discussão
A ultraestrutura dos espermatozoides aqui estudados representa um aporte significativo ao conhecimento da família Leptodactilydae, a qual é bastante diversa (Frost, 2014), porém, com espermatozoides descritos apenas para espécies da subfamília Leiuperinae (Amaral et al., 1999, 2000; Zieri et al., 2008) e para a espécie Leptodactylus wagneri (ver Jamieson, 2003). Os resultados deste trabalho mostraram que os espermatozoides são semelhantes entre si, principalmente em relação à composição da peça intermediária e a cauda, destacando-se, porém, dois padrões morfológicos distintos associados à cabeça e início da peça intermediária. Um grupo de espécies apresentou uma região cito-nuclear livre após a vesícula acrossomal espessa (Tipo II), enquanto que no outro grupo esta região foi ausente, apresentando vesícula acrossomal estreita e próxima ao início da peça intermediária (Tipo I). A presença de uma região cito-nuclear livre está diretamente associada ao comprimento total do núcleo e, consequentemente, da cabeça do espermatozoide. Os espermatozoides do tipo I foram observados apenas nas espécies para as quais não se tem registro de comportamento poliândrico. Já os espermatozoides do tipo II foram encontrados em todas as espécies poliândricas, L. chaquensis, L. bufonius e L. podicipinus (Prado e Haddad, 2003; Faggioni et al., 2011), e também em L. petersii, L. shyphax, L. latrans e Li. lithodytes, espécies cuja a presença de poliandria não foi observada.
Em anuros, diferenças no espermatozoide podem ser explicadas pela variedade dos locais de desova (Byrne et al., 2003; Muto e Kubota, 2012), o que se aplica no caso de espécies de leptodactilíneos. Apesar de desovarem em ninhos de espuma, estas espécies apresentam desde modos reprodutivos mais dependentes da água, até aqueles mais terrestres (Prado et al., 2002; Fouquet et al., 2013), proporcionando diferentes ambientes de fertilização, o que poderia influenciar na morfologia dos espermatozoides. No entanto, a variação na morfologia do espermatozoide também pode ser explicada por outros fatores, como, por exemplo, tamanho e morfologia dos ovócitos das fêmeas (Byrne et al., 2003; Pitnick et al., 2009). Tais hipóteses ainda precisam ser testadas em espécies de Leptodactylidae (ver discussão adiante).
Os espermatozoides de Leptodactylinae foram semelhantes ao de outros anuros, exceto quanto ao complexo acrossomal que, diferentemente da maioria das espécies descritas, não apresentou cone subacrossomal e estrutura perfuradora (ver Jamieson et al., 1993). A presença de cone subacrossomal é considerada uma condição plesiomórfica em anuros, sendo observada na maioria de anuros basais como Leiopelma hochstetteri, Discoglossus pictus e
2001; Scheltinga e Jamieson, 2003). Entre famílias mais derivadas, esta característica já foi reportada para espécies das famílias Dendrobatidae, Hylidae e Hylodidae (Garda et al., 2002; Costa et al., 2004; Aguiar-Jr et al., 2006, respectivamente). Além das espécies de Leptodactylinae aqui analisadas, o cone subacrossomal também está ausente em membros das famílias basais Pipidae e Pelobatidae, além de algumas espécies da família mais derivada Rhacophoridae (Lee e Jamieson, 1993). Mesmo na família Leptodactylidae, que representa um táxon derivado na filogenia de anuros (Frost et al., 2006; Pyron e Wiens, 2011), existem espécies da subfamília Leiuperinae que possuem espermatozoides sem cone subacrossomal (Jamieson, 1993) e espécies com a presença de cone subacrossomal (Aguiar-Jr et al., 2006). Desta forma, os resultados aqui encontrados indicam, preliminarmente, que os espermatozoides da subfamília Leptodactylinae não possuem cone subacrosomal. Porém, não analisamos espécies do gênero Adenomera e Hydrolaetare. Adicionalmente, sugerimos que a perda dessa característica ou seu surgimento deve ter ocorrido independentemente em diferentes clados de anuros.
A presença de região cito-nuclear livre observada nos espermatozoides do tipo II, bem como o espessamento da vesícula acrossomal, ocorreu em diferentes espécies de Leptodactylinae, as quais poderiam ser consideradas características plesiomórficas no grupo. Porém, para confirmar esta predição seriam necessários estudos da ultraestrutura de representantes do gênero Adenomera, clado irmão de Lithodytes (Pyron e Weins, 2011). Outra hipótese seria considerar estas características como sendo uma convergência evolutiva. Neste caso, as espécies poliândricas, independente do grupo ao qual pertencem, apresentariam espermatozoide do tipo II. Dando suporte a esta hipótese, a região cito-nuclear livre, apesar de não descrita, foi notada nas imagens ultraestruturais de espermatozoides de uma espécie poliândrica de Rhacophoridae (Muto e Kubota, 2012). Além disso, esta região cito-nuclear é coincidente com o alongamento da cabeça do espermatozoide, produzindo a morfologia filiforme, o que não ocorre nos espermatozoides do tipo I (cabeça triangular). Desta maneira, a presença desta característica nos espermatozoides do tipo II poderia indicar uma relação com a poliandria. Contudo, comparações sobre a eficiência hidrodinâmica e viabilidade entre os diferentes tipos de espermatozoide de Leptodactylinae deverão ser realizados.
(Lee e Jamieson, 1993; Swan et al., 1980), Dendrobatidae (Garda et al., 2002) e Odontophrynidae (Báo et al., 1991). Entretanto, dados da literatura indicam que a espécie L.
wagneri, não possui colar de mitocôndrias (ver Jamieson, 2003), porém trata-se de um
trabalho de revisão, o qual não disponibiliza a imagem da ultraestrutura desse espermatozoide. Sendo assim, não descartamos a hipótese de que nas espécies analisadas ocorra presença de colar de mitocôndrias, porém de forma discreta em relação ao observado em outras famílias. Espécies mais basais (e.g. Leiopelma hochstetteri, Scheltinga, et al., 2001) apresentam colar de mitocôndrias pouco desenvolvido, o que pode ser considerada uma característica plesiomórfica em Anura, porém, necessita maiores investigações (Scheltinga e Jamieson, 2001; Aguiar-Jr et al., 2006; Veiga-Menoncello et al., 2006).
O flagelo é filiforme, com axonema, bastão paraxonemal e membrana ondulatória, apresentando fibras acessórias (axial e justaxonemal). A fibra axial tem uma forma globular, com fibra justaxonemal reduzida (exceto em Lithodytes lineatus). Tais características também foram observadas em Crossodactylus sp.(Hylodinae: Aguiar-Jr et al., 2006), Odontophrynus
cultripes (Odontophrynidae: Báo et al., 1991) e Physalaemus sp. (Leiuperinae: Amaral et al.,
2012). Em nossos resultados, a disposição do axonema, bem como a presença de membrana ondulatória e fibras axial e justaxonemal foi conspícua em todas as espécies da subfamília Leptodactylinae analisadas.
De maneira geral, o padrão dos espermatozoides de Leptodactylinae é semelhante à maioria dos anfíbios anuros para os quais se tem estudos da ultraestrutura (e.g., Báo et al.,1991; Garda et al., 2004; Aguiar-Jr et al., 2006; Veiga-Menoncello et al., 2006). Garda et al. (2004) afirmam que a família Leptodactylidae é a mais estudada quanto à análise ultraestrutural de espermatozoides, no entanto, esta extensa família sofre constantes alterações quanto sua composição (Pyron e Wiens, 2011; Frost, 2014), sendo que, muito do que foi descrito como sendo da família Leptodactylidae, hoje sabe-se que pertencem a famílias diferentes. Em relação à subfamília Leptodactylinae, esta ainda é pouco estudada quanto à ultraestrutura do espermatozoide, sendo encontrados apenas trabalhos com a espécie L.
wagneri (ver Jamieson, 2003) e a espécie L. chaquensis, esta últimaem relação à formação do
acrossoma (Raisman e Kabada, 1977; Raisman et al., 1980). Em nosso estudo, a principal diferença observada intra-gênero refere-se ao complexo acrossomal e região do núcleo, porém, pelo fato da família Leptodactylidae conter muitas espécies (Frost, 2014), mais estudos sobre a morfologia e ultraestrutura do espermatozoide são necessários para uma melhor compreensão da variação morfológica deste gameta e elucidação de fatores relacionados a sua evolução.
Nossos resultados sugerem que as características observadas em espécies de Leptodactylinae, principalmente relacionadas a diferenças no complexo acrossomal, podem estar relacionadas à poliandria. Além dos ambientes de desova e das características dos ovócitos das fêmeas, mencionados acima, o sistema de acasalamento poliândrico pode levar à competição de esperma, sugerida como uma das mais fortes pressões influenciando no tamanho dos testículos e morfologia do espermatozoide (Byrne et al., 2002; Byrne et al., 2003; Byrne e Roberts, 2012). Por exemplo, as espécies poliândricas do gênero
Leptodactylus, além de apresentarem testículo muito maior que o esperado, com a massa dos
testículos representando entre 0,7% e 4% da massa do corpo (Prado et al., 2003), também produzem espermatozoides maiores e em maior densidade (Salles et al., em prep.). No presente estudo, todas as espécies poliândricas do gênero Leptodactylus, bem como L.petersii,
L. syphax, L. latrans e Li. lineatus, para as quais a poliandria é desconhecida, apresentaram
Na vesícula acrossomal localizam-se enzimas, que após liberadas, são importantes para a dissolução dos envelopes primários (cório ou envoltório vitelínico) e secundários, sendo, assim, cruciais para a fusão dos gametas (Raisman e Cabada, 1977; Raisman et al., 1980). Desta forma, nossos resultados sugerem que o espessamento da vesícula acrossomal observado nos espermatozoides do tipo II, podem significar uma variação morfológica relacionada à competição espermática, no sentido de aumento de volume enzimático armazenado. Evidências que reforçam nossa hipótese é que tanto os machos de L. petersii quanto os de Li. lineatus possuem grande tamanho relativo de testículos (Salles et al., em prep.) e apresentaram espermatozoides longos (presente estudo). Porém, estudos de história natural devem ser conduzidos para a confirmação da ocorrência de poliandria nessas espécies, bem como em L. syphax e L. latrans, que também possuem morfologia do espermatozoide semelhante à das espécies poliândricas e espermatozoides longos.
Referências bibliográficas
AGUIAR-JR., O.; GIARETTA, A. A.; RECCO-PIMENTEL, S. M. The sperm of Hylodinae species (Anura, Leptodactylidae): Ultrastructure characteristics and their relevance to interspecific taxonomic relationships. Journal of Biosciences, v. 31, p. 379-388, 2006.
AMARAL, M. J. L. V.; FERNADES, A. P.; BÁO, S. N.; RECCO-PIMENTEL, S. M. An ultrastructural study of spermiogenesis in three species of Physalaemus (Anura, Leptodactylidae); Biocell, v. 23, p.211-221, 1999.
AMARAL, M. J. L. V., FERNANDES, A. P., BÁO, S. N., RECCO-PIMENTEL, S. M. The ultrastructure of spermatozoa in Pseudopaludicola falcipes (Anura, Leptodactylidae). Amphibia-Reptilia, v. 21, p. 498-502, 2000.
BÁO, S. N.; DALTON, G. C.; OLIVEIRA, S. F. Spermiogenesis in Odontophrynus cultripes (Amphibia, Anura, Leptodactylidae): ultrastructural and cytochemical studies of proteins using E-PTA. Journal of Morphology, v. 207, p. 303-314, 1991.
BEGUELINI, M. R.; PUGA, C. C.; TABOGA, S. R.; MORIELLE-VERSUTE, E. Ultrastructure of spermatogenesis in the white-lined broad-nosed bat, Platyrrhinus lineatus (Chiroptera: Phyllostomidae). Micron, v. 42, p. 586-599, 2011.
BYRNE, P. G.; ROBERTS, J.D. Evolutionary causes and consequences of sequential polyandry in anuran amphibians. Biological Reviews, v. 87, p. 209-228, 2012.
BYRNE, P. G; ROBERTS, J. D.; SIMMONS, L. W. Sperm competition selects for increased testes mass in Australian frogs. Journal of Evolutionary Biology, v. 15, p. 347-355, 2002.
COSTA, G. C.; GARDA, A. A.; TEIXEIRA, R. D.; COLLI, G. R.; BÁO, S. N. Comparative analysis of the sperm ultrastructure of three species of Phyllomedusa (Anura, Hylidae). Acta Zoologica, v. 85, p. 257-262, 2004.
FAGGIONI, G. P.; PRADO, C. P. A.; SOUZA, F. L.; UETANABARO, M.; LANDGREF FILHO, P. Leptodactylus bufonius (Vizcacheras' White-lipped Frog). Spawning behavior. Herpetological Review, v. 42, p. 260-261, 2011.
FOUQUET, A.; BLOTTO, B. L.; MARONNA, M. M.; VERDADE, V. K.; JUNCÁ, F. A.; de SÁ, R.; RODRIGUES, M. T. Unexpected phylogenetic positions of the genera Rupirana and Crossodactylodes reveal insights into the biogeography and reproductive evolution of leptodactylid frogs. Molecular Phylogenetics and Evolution, v. 67, p. 445-457, 2013.
FROST, D. R. Amphibian Species of the World: an Online Reference. Version 6.0 (4
September 2014). Electronic Database accessible at http://research.amnh.org/herpetology/amphibia/index.html. American Museum of Natural
History, New York, USA, 2014.
FROST, D. R.; GRANT, T.; FAIVOVICH, J.; BAIN, R. H.; HADDAD, C. F. B.; SÁ, R. O.; CHANNING, A.; WILKINSON, M.; DONNELLAN, S. C.; RAXWORTHY, C. J.; CAMPBELL, J. A.; BLOTTO, B. L.; MOLER, P.; DREWES, R. C.; NUSSBAUM, R. A.; LYNCH, J. D.; GREEN, D. M.; WHEELER, W.C. The amphibian tree of life. Bulletin of the American Museum of Natural History, v. 297, p.1-370, 2006.
GARDA, A. A.; COLLI, G. R.; AGUIAR, O. JR.; RECCO-PIMENTEL, S. M.; BÁO, S. N. The ultrastructure of the spermatozoa of Epipedobates flavopictus (Amphibia, Anura, Dendrobatidae), with comments on its evolutionary significance. Tissue Cell v. 34, p. 356-364, 2002.
GARDA, A. A.; COSTA, G. A.; COLLI, G. R.; BÁO, S. N. Spermatozoa of Pseudinae (Amphibia, Anura, Hylidae), with a test of hypothesis that sperm ultrastructure correlates with reproductive modes in anurans. Journal of Morphology, v. 261, p. 169-205, 2004.
GOMENDIO, M.; ROLDAN; E. E. S. Sperm competition influences sperm size in mammals. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, v. 242, p. 181-185, 1991.
HEYER, W. R. The adaptive ecology of the species groups of the genus Leptodactylus (Amphibia, Leptodactylidae). Evolution, v. 23, p. 421-428, 1969.
JAMIESON, B. G. M. The ultrastructure and phylogeny of insect spermatozoa. Cambridge University Press, Cambridge. 1987.
JAMIESON, B. G. M. Phylogeny of the Brachyura with particular reference to the Podotremata: evidence from a review of spermatozoal ultrastructure (Crustacea, Decapoda). Philosophical Transactions of the Royal Society of London, v. 345, p. 373-393, 1994.
JAMIESON, B. G. M.; LEE, M. S. Y.; LONG K. Ultrastructure of the spermatozoon of the internally fertilizing frog Ascaphus truei (Ascaphidae: Anura: Amphibia) with phylogenetic considerations. Herpetologica, v. 49, p. 52-65, 1993.
KLAUS, S.; BRANDIS, D. Evolution of sperm morphology in potamid freshwater crabs (Crustacea: Brachyura: Potamoidea). Zoological Journal of the Linnean Society, v. 161, p. 53-63, 2011.
LEE, M. S. Y.; JAMIESON, B. G. M. The ultrastructure of the spermatozoa of bufonid and hylid frogs (Anura, Amphibia): implications for phylogeny and fertilization biology. Zoologica Scripta, v. 22, p. 309-323, 1993.
LIN, M.; HARMAN, A.; RODGER, J. C. Spermiogenesis and spermiation in a marsupial, the tammar wallaby (Macropus eugenii). Journal of anatomy, v. 190, p. 377-395, 1997.
McDIARMID, R. W. Preparing amphibians as scientific specimens. In: HEYER, W.R., DONNELLY, M.A., MCDIARMID, R.W., HAYEK, L.C., FOSTER, M.S., Measuring and Monitoring Biological Diversity. Standard Methods for Amphibians, Smithsonian, Washington, p. 289-297, 1994.
MUTO, K.; KUBOTA, H. Y. Ultrastructure and motility of the spermatozoa of Polypedates leucomystax (Amphibia, Anura, Rhacophoridae). Cytoskeleton, v. 70, p. 121-133, 2013.
PARKER, G. A. Sperm competition games: sneaks and extra-pair copulations. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, v. 242, p. 127-133, 1990.
PARKER, G. A. Sperm competition games: sperm size and sperm number under adult control. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, v. 253, p. 245-254, 1993.
PITNICK, S.; HOSKEN, D. J.; BIRKHEAD, T. R. Sperm morphological diversity. Sperm biology: an evolutionary perspective, p. 69, 2008.
PRADO, C. P.; HADDAD, C. F. B. Testes size in leptodactylid frogs and occurrence of multimale spawning in the genus Leptodactylus in Brazil. Journal of Herpetolology,v. 37, p. 354-362. 2003.
PRADO, C. P. A.; UETANABARO, M.; HADDAD, C. F. B. Description of a new reproductive mode in Leptodactylus (Anura, Leptodactylidae), with a review of the reproductive specialization toward terrestriality in the genus. Copeia, v. 2002, p. 1128-1133, 2002.
PYRON, R. A.; WIENS, J. J. A large-scale phylogeny of Amphibia including over 2800 species, and a revised classification of extant frogs, salamanders, and caecilians. Molecular Phylogenetics and Evolution, v. 61, p. 543-583, 2011.
RAISMAN, J. S.; CUNIO, R. W.; CABADA, M. O.; PINO, E. J.; MARIANO, M. I. Acrosome breakdown in leptodactylus chaquensis (Amphibia: anura) spermatozoa. Development, Growth e Differentiation, v. 22, p. 289-297, 1980.
RODRIGUES, D. J.; UETANABARO, M.; LOPES, F. S. Reproductive patterns of Trachycephalus venulosus (Laurenti, 1768) and Scinax fuscovarius (Lutz, 1925) from the Cerrado, Central, Brazil. Journal of Natural History, v. 39, p. 3217-3226, 2005.
ROOSEN-RUNGE, E. C. The process of spermatogenesis in animals. Cambridge University Press, v. 1, 1977.
ROUSE, G. W.; JAMIESON, B. G. M. An ultrastructural study of the spermatozoa of the polychaetes Eurythoe complanata (Amphinomidae), Clymenella sp. and Micromaldane sp. (Maldanidae), with definition of sperm types in relation to reproductive biology. Journal of Submicroscopic Cytology and Pathology, v. 19, p. 573-584, 1987.
SCHELTINGA, D. M.; JAMIESON, B. G. M. Spermatogenesis and the mature spermatozoon: Form, function and phylogenetic implications; in Reproductive biology and phylogeny of Anura,ed. New Hampshire: Science Publishers, p. 119-251, 2003.
SCHELTINGA, D. M.; JAMIESON, B. G, M.; EGGERS, K. E.; GREEN, D. M. Ultrastructure of the spermatozoon of Leiopelma hochstetteri (Amphibia, Anura, Leiopelma). Zoosystema, v. 23, p. 157-171, 2001.
SNOOK, R. R. The risk of sperm competition and the evolution of sperm heteromorphism. Animal Behaviour, v. 56, p. 1497-1507, 1998.
SNOOK, R. R. Sperm in competition: not playing by the numbers. Trends in Ecology and Evolution,v. 20, p. 46-53, 2005.
SWAN, M. A.; LINCK, R. W.; ITO, S.; FAWCETT, D. W. Structure and function of the undulating membrane in spermatozoan propulsion in the toad Bufo marinus. Journal Cell Biology, v. 85, p. 866-880, 1980.
VEIGAǦMENONCELLO, A. C. P.; LIMA, A. P.; RECCOǦPIMENTEL, S. M. Sperm
morphology of five species of Colostethus (Anura, Dendrobatidae) from Brazil, with phylogenetic comments. Acta Zoologica, v. 87, p. 147-157, 2006.
ZENG, Y.; LOU, S. L.; LIAO, W. B.; JEHLE, R. Evolution of sperm morphology in anurans: insights into the roles of mating system and spawning location. BMC Evolutionary Biology, v. 14, p. 104, 2014.
Capítulo II
CARACTERÍSTICAS DAS GÔNADAS E ESPERMATOZOIDES EM ESPÉCIES DO GÊNERO LEPTODACTYLUS (ANURA, LEPTODACTYLIDAE) E A INFLUÊNCIA DA
POLIANDRIA
Resumo
A poliandria simultânea é um sistema de acasalamento onde mais de um macho tenta fertilizar os ovócitos de uma única fêmea, levando à competição espermática. A competição de esperma pode influenciar tanto no tamanho dos testículos quanto na morfologia dos espermatozoides. Estudos em anfíbios anuros revelam que, em espécies poliândricas, os machos exibem maior tamanho de testículos e espermatozoides maiores. No presente trabalho analisamos os espermatozoides e gônadas de 13 espécies do gênero
Leptodactylus, incluindo espécies poliândricas. Utilizando métodos filogenéticos
comparativos, testamos a hipótese de que espécies poliândricas exibem testículos proporcionalmente maiores, espermatozoides maiores e em maior densidade. Como o esperado, as espécies poliândricas apresentaram maior densidade e comprimento de espermatozoides e maior tamanho de gônadas em comparação com as espécies não poliândricas. Além disso, análises comparativas filogenéticas indicaram que a massa de testículos está diretamente relacionada com a produção e o comprimento do espermatozoide, e que tais características se correlacionam com a ocorrência de poliandria no gênero. Sendo assim, sugerimos que a competição espermática em Leptodactylus exerce importante pressão seletiva, moldando características das gônadas e dos espermatozoides de machos poliândricos.
Introdução
No Brasil, muitos estudos sobre a história natural e o comportamento reprodutivo em anuros têm sido publicados, revelando diferentes comportamentos, dentre eles os acasalamentos poliândricos (e.g., Prado e Haddad, 2003; Rodrigues et al., 2005; Dias et al., 2012). O sistema poliândrico, no qual uma única fêmea se acasala com mais de um macho durante o período reprodutivo, pode conferir benefícios para a fêmea, reduzindo o esgotamento de esperma disponível ou diminuindo as chances de problemas relacionados à incompatibilidade de gametas (Reynolds, 1996; Byrne e Whiting, 2008). A poliandria também pode garantir o sucesso reprodutivo da fêmea, gerando proles mais viáveis, visto que o contato da fêmea com vários machos pode aumentar as chances de encontrar parceiros com maior qualidade genética (Fischer et al., 2006). Em contrapartida, a poliandria pode gerar custos aos indivíduos, como o aumento do risco de predação e a possibilidade de transmissão de doenças, tornando a ocorrência e a evolução da poliandria temas bastante discutidos (e.g., Birkhead, 1998; Ashby e Gupta, 2013).
