Ferramentas de análise molecular
e os agentes das grandes endemias
Molecular analysis tools and the agents
of great en dem ic diseases
1 Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBPM) e Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz. Rua Algacyr Munhoz Mader, 3.775 81350-010 Curitiba PR. sgoldenb@tecpar.br Samuel Goldenberg 1
Abstract Recent developm ents in the field of m olecular biology pave the way for the study, diagnostics and therapeutics of endem ic dis-eases that affect m ainly developing countries. Gene m anipulation techniques allow the large scale expression of pathogen genes with a po-tential use in diagnostics or vaccine produc-tion. In addition, these techniques m ight re-sult in new attenuated vaccines. On the other hand, the determ ination of the nucleotide se-quence of the genom e of pathogens m ight lead to new targets for drug rational design with a potential use in chem otherapy. However these progresses will not be available to developing countries unless a continuous program for re-search funding and hum an resources form a-tion in these new technologies is adopted.
Key wo rds Biotechnology, Molecular Analy-sis, Endem ic Diseases
Resu m o Os desenvolvim entos recentes no cam po da biologia m olecular abrem novas perspectivas para o estudo, diagnóstico e tera-pêutica das grandes endem ias que afetam so-bretudo as nações em desenvolvimento. As téc-nicas de manipulação de genes permitem a ex-pressão de antígenos de patógenos em larga es-cala, com a potencial utilização com o reagen-tes para diagnóstico ou im unógenos. Adicio-nalm ente, essas técnicas poderão levar à ob-tenção de novas vacinas vivas atenuadas. Por outro lado, a determ inação da seqüência dos genomas de patógenos poderá levar a novos al-vos para o desenho racional de drogas com po-tencial quimioterápico. Entretanto, esses avan-ços só estarão à disposição dos países em de-senvolvim ento se houver um program a contí-nuo de investim ento e de form ação e valoriza-ção de recursos hum anos com petentes nessas novas tecnologias.
Introdução
As con dições de saúde da população m un dial podem ser paradoxais. En quan to em algun s países a expectativa de vida da popu lação u l-trapassa os 80 anos, em m uitos outros ela m al chega aos 40 an os (Sin ger & Daar, 2001). No caso de grande parte dos países em desenvolvi-mento, as desigualdades sociais e as políticas de governo em saúde descontinuadas acabam ge-rando uma situação caótica, onde convivem in-divíduos portadores de en ferm idades típicas das populações dos países desenvolvidos e in -divíduos portadores de doenças já erradicadas ou inexistentes naqueles países. Exemplifican -do, em um grande centro urbano, como a cida-de cida-de São Paulo, temos indivíduos com insufi-ciência cardíaca provocada pelo estresse e pela alim entação rica em lipídios convivendo com pacientes com insuficiência cardíaca provoca-da pela doença de Chagas.
Todavia, a saúde pública pode dar um im -portante salto qualitativo pelo uso de ferramen-tas poderosas desenvolvidas na últim a década com o em prego de técn icas da biologia m ole-cular. As técn icas de clon agem e de expressão de gen es perm itiram gran des avan ços para a produção de reagentes para diagnóstico e vaci-n as, evaci-n qu avaci-n to as técvaci-n icas de am plificação de DNA perm itiram consideráveis progressos no diagnóstico de enfermidades congênitas e doen-ças causadas por patógenos de diferentes natu-rezas. Mais recentemente, com a maior difusão da técnica de m icroarranjos de alta densidade ou “chipde DNA”, novas perspectivas se abrem para o diagnóstico m olecular para estudos re-lacionados à resistência de patógenos a drogas e para o campo da farmacogenômica.
D iagnóstico
O diagnóstico preciso e rápido é essencial para várias doenças, tanto para permitir uma even -tu al qu im ioprofilaxia, com o para evitar su a disseminação. A transmissão e aquisição de pa-togenias por via transfusional é de extrema re-levância para a saúde pública. H ouve recente-m en te, n a Ásia, a n otificação de recente-m ais de 500 m il casos de pacien tes in fectados com o vírus HIV por terem doado ou recebido sangue com agulhas con tam in adas (Cohen , 2001). Aqui mesmo, no Brasil, tivemos um grande número de hem ofílicos que contraiu Aids por transfu -são com sangue contaminado. A transfu-são é o
segu n do m ecan ism o m ais im portan te para a aquisição da doença de Chagas (Dias & Scho-field, 1999), e, há alguns anos, os casos de aqui-sição de doença de Chagas por via transfusio-nal suplantavam em nosso país os novos casos por infecção com o inseto vetor, vulgarm ente conhecido com o barbeiro. Foi som ente com a obrigatoriedade do con trole do san gue pelos bancos de sangue estatais que esse quadro pôde ser parcialm en te con trolado (Moraes-Souza, 1999).
Em geral, o diagnóstico de doenças teve um grande avanço nos últimos anos com a técnica de PCR (polym erase chain reactionou reação em cadeia da polimerase) (Weiss, 1995). A rea-ção de PCR perm ite que um a dada seqüên cia de ácido nucléico (geralm ente, DNA ou então um RNA que deve ser previam en te copiado n um a m olécula de DNA, pela técn ica de RT-PCR) seja am plificada m ilhares de vezes m e-diante o uso de reagentes adequados; pequenas seqüências de DNA (oligonucleotídeos) com -plementares ao DNA-alvo que se quer amplifi-car qu e u m a vez hibridadas com a seqü ên cia alvo através da com plem entaridade do parea-mento de bases do DNA são copiadas milhares de vezes com a enzima DNA polimerase extraí-da de bactérias term o-resistentes. Após a exe-cução de vários ciclos de am plificação a eleva-das tem peratu ras, o produ to fin al obtido é a m olécula-alvo am plificada m ilhares de vezes, permitindo sua detecção e caracterização. Hoje em dia, há u m gran de n ú m ero de testes para diagnóstico comercialmente disponível que uti-liza a tecnologia da PCR.
Vários kitscomerciais para diagnóstico, que utilizam a PCR, foram desen volvidos, sen do am plam en te u tilizados por laboratórios de análises clínicas (Pfaller, 2001). A despeito das desvantagens mencionadas para o uso da PCR, a precisão no diagnóstico positivo não deixa dú-vidas, permitindo a pronta intervenção do clí-nico. Adicionalmente, essa metodologia é bas-tante adequada para a detecção de genes de re-sistên cia a drogas em patógen os, perm itin do que se ataque de maneira mais precisa os casos de infecção persistente ou infecção hospitalar. No caso de algumas moléstias causadas por ví-rus, a utilização da PCR é importante não ape-nas para a detecção, mas para a mensuração da carga viral. De fato, a decisão de se iniciar um tratamento ou mesmo a dosagem do quimiote-rápico depende da carga viral. O procedimento é particu larm en te relevan te n o caso da Aids, u m dos gran des problem as de saú de pú blica mundial.
Algu m as m oléstias são cau sadas por m i-croorgan ism os que n ão podem ser cultivados facilm ente ou que levam longos períodos para crescerem em cultura, como é o caso de micro-bactérias que causam a hanseníase ou a tuber-culose, ou ainda o Helicobacter pyloriassociado a vários tipos de úlcera. Nesses casos, as técni-cas de amplificação são úteis não apenas para o diagn óstico m as tam bém para a tipagem do patógeno ou até para evitar intervenções cirúr-gicas (no caso de úlcera).
Vacinas
Estim a-se que a próxim a década trará grandes desenvolvimentos na área de vacinas. A produ-ção de antígenos vacinais por técnicas de DNA recombinante e a conjugação de múltiplos an -tígen os perm itirão a m u ltivacin ação em u m a única dose. Assim, é essencial que os países em desenvolvimento invistam recursos para a for-m ação de recu rsos hu for-m an os capacitados n as n ovas tecn ologias para que possam desen vol-ver os produtos de que n ecessitam para san ar os problemas de saúde regionais. Duas aborda-gens interessantes do ponto de vista tecnológi-co poderão ganhar a escala industrial. Uma de-las é a vacinação via DNA (Gurunathan et al., 2000). No caso de vacinas DNA, a imunização é feita pela injeção diretam ente com o gene (a seqüência de DNA) que codifica um antígeno vacin al. Este DNA, um a vez in troduzido n as células do indivíduo, é expresso
funcionalmen-te, resultando na apresentação do antígeno vacinal ao sistema imune do hospedeiro. A gran -de vantagem -dessa vacina é que antígenos que devem sofrer m odificações especiais pós-tra-ducionais características de células de eucario-tos superiores serão convenientemente proces-sados. O problema que ainda se coloca quanto a esse tipo de metodologia é o risco de integra-ção deste DNA exógeno no DNA do hospedei-ro, que pode levar a m an ifestações de difícil previsibilidade, incluindo a indução de câncer ou ain da a in du ção de doen ças au to-im u n es (Robertson & Griffiths, 2001). Todavia, desen -volvim en tos im portan tes estão sen do feitos n essa área e os en saios com vacin as an im ais permitirão que se estabeleçam as condições de segurança para a futura im unização de hum a-nos com vacinas DNA.
Uma segunda abordagem interessante trata da obten ção de vacin as vivas com patógen os aten uados. Os avan ços recen tes n a gen ética molecular de microorganismos (Waters & Jan-se, 1999) permitem imaginar a obtenção de va-cinas vivas, isto é, parasitas modificados gene-ticamente de tal forma que genes de virulência ten ham sido elim in ados do gen om a, fazen do com que os possíveis antígenos vacinais sejam apresentados ao sistem a im une do hospedeiro sem que a doença se manifeste. Como alterna-tiva, há atualm en te um gran de esforço para a obtenção de insetos vetores de doenças trans-gênicos (Beerntsen et al., 2000), ou seja, cujos gen es foram m an ipulados de tal form a que o parasita que utiliza o inseto com o hospedeiro in term ediário n ão possa m ais desen volver-se no mesmo, eliminando, portanto, o ciclo da do-en ça. Estudos recdo-en tes com m osquitos tran s-m issores da s-m alária se s-m ostras-m bastante pro-missores. Entretanto, o problema que se coloca n esta ú ltim a abordagem é a do im pacto am -biental de se lançar uma espécie modificada na natureza.
Quimioterapia
ge-rados com os pou cos gen om as com pletados m ostra que grande parte dos genes seqüencia-dos é, na realidade do momento, desconhecida. É muito provável que haja genes que codificam enzimas que poderiam ser alvos potenciais pa-ra o desenvolvimento de novas drogas quimio-terápicas. De fato, várias iniciativas, compreen-dendo projetos genoma de patógenos, estão em curso e a an álise fun cion al dos gen es seqüen -ciados deverá revelar n ovos horizon tes para a melhor compreensão dos mecanismos de pato-gênese, dos m ecanism os de evasão do sistem a imune do hospedeiro e dos mapas metabólicos de patógenos (Carucci, 2001).
Além dos avanços nos projetos genoma, vá-rios esforços estão sendo concentrados nos pro-jetos proteom a que visam m apear e caracteri-zar a totalidade das proteín as de um organ is-m o. O con jun to de dados gerado, associado com os avanços obtidos na expressão de genes utilizando técnicas de DNA recombinante, per-mite hoje a obtenção de dados cristalográficos de u m a gran de qu an tidade de proteín as (As-hton et al., 2001). De posse desses dados estru-turais, pode-se iniciar a verdadeira farmacoge-n ôm ica, qu e cofarmacoge-n siste farmacoge-n o desefarmacoge-n ho raciofarmacoge-n al de drogas. Estas drogas poderiam ser aplicadas, por exemplo, para a quimioterapia de doenças, para as quais não há vacinas disponíveis; e de-veriam ser efetivas contra o patógeno e absolu-tamente inócuas para o hospedeiro.
Um dos problem as relacionados à necessi-dade de desenvolvim ento de novas drogas ba-seadas em desenho racional é o da existência de patógenos que ao longo dos anos desenvolve-ram resistência m últipla a drogas, agravando, em m uito, o quadro clínico e podendo levar o paciente infectado a óbito. O caso da malária é típico, onde cepas de P. falciparumresistentes à cloroquina resultam em um grave problema de saúde pública. Grave também é o problema das in fecções hospitalares por cepas de bactérias resistentes à meticilina.
Microarranjos de alta densidade:
chips
de D NAO avan ço recen te da gen ôm ica estrutural, le-vando à determ inação da seqüência dos genes de vários organ ism os, perm itiu o acúm ulo de uma enormidade de dados, havendo a necessi-dade de se com preender a funcionalinecessi-dade dos gen es estocados n os ban cos de dados. Atual-m en te estão sen do desen volvidas estratégias
que permitem a análise simultânea de milhares de genes e a elucidação de sua possível função pelo estudo de sua expressão ao longo da dife-ren ciação ou desen volvim en to de um a célula ou um in divíduo. Tecn ologias apropriadas e n ovos in strum en tos torn am possível colocar em uma simples lâmina de microscópio milha-res de genes e analisar a sua expmilha-ressão em dife-rentes situações. Esses genes im obilizados são analisados por hibridação com genes isolados das células em estudo em diferentes situações e m arcados com fluoróforos de tal m aneira que a partir da observação da cor e da intensidade do sin al após a hibridação pode-se estim ar a expressão de um gen e particular qualitativa e quantitativamente. Essas lâminas com milhares de seqüências gênicas identificáveis e expostas ordenadam ente são denom inadas de m icroar-ranjos de alta densidade, chips de DNA ou ain -da biochips (Schena et al., 1995; Watson et al., 1998; Jain, 2001). O potencial dessa metodolo-gia é fan tástico, pois em um sim ples experi-m ento é possível analisar, por exeexperi-m plo, os ge-nes que são expressos quando um parasita pas-sa de um a form a n ão-in fectiva para um a for-m a in fectiva, ou ain da os gen es que são dife-rencialmente expressos em células resistentes a drogas, ou ainda que genes das células dos ma-m íferos têma-m su a expressão alterada qu an do a célula é invadida por um patógeno. Assim , es-pera-se que a compreensão da biologia funda-m en tal de patógen os, befunda-m cofunda-m o a dos funda-m eca-n ism os de patogeeca-n icidade, teeca-n ha um graeca-n de avanço nos próxim os anos, resultando no de-senvolvimento de novos reagentes para a profilaxia de doen ças in fectocon tagiosas (Cu m -m in gs &a-mp; Rel-m an 2000). O avan ço n essa área tem sido tão vigoroso que podemos prever que em cu rto espaço terá dispon ível n o m ercado biochipsque perm itirão detectar a propen são de um indivíduo em adquirir certas patologias.
Considerações finais
apoio ao desenvolvimento científico e à forma-ção de recursos humanos é muito provável que as nações menos desenvolvidas possam não só acompanhar, de maneira competitiva, os avan-ços das nações economicamente desenvolvidas, m as resolver seus próprios problem as sem a n ecessidade de pagar ôn us exorbitan tes à in -dústria farm acêutica in tern acion al. Ao lon go do últim o século tivem os a revolução in dustrial, a revolução atôm ica e a revolução da in -formática. A revolução da biotecnologia ainda está em seus primórdios e através dela podere-mos dar um grande passo para resolverpodere-mos os problem as de saúde e alim entação da popula-ção brasileira. Se saúde e educapopula-ção são deveres
do Estado, nos tempos modernos, ciência e tec-n ologia devem ser som adas a esse bitec-n ôm io. É nossa responsabilidade apresentar soluções pa-ra os problem as de saúde que afligem a m aior parte de n ossa população e, assim , con tribuir para diminuir as enormes diferenças sociais da nação. É preciso criar programas voltados para o estudo de nossos grandes problem as de saú -de. A u n iversidade brasileira e a com u n idade cien tífica com o um todo estão, n o m om en to, ociosas frente ao seu potencial, quadro que só será revertido mediante uma política de valorização dos recursos humanos e de fomento con -tin uado e con sisten te à atividade de pesquisa científica e tecnológica.
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