CRISTINA EUSTÁQUIA FERREIRA
POLIMORFISMO DOS RECEPTORES 3 ADRENÉRGICOS E SUA
CORRELAÇÃO COM A SÍNDROME DE BEXIGA HIPERATIVA
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo para a obtenção do Título de Mestre em Ciências
CRISTINA EUSTÁQUIA FERREIRA
POLIMORFISMO DOS RECEPTORES 3 ADRENÉRGICOS E SUA
CORRELAÇÃO COM A SÍNDROME DE BEXIGA HIPERATIVA
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo para a obtenção do Título de Mestre em Ciências
Orientador: Prof. Dr. Manoel João Batista Castello Girão Co-orientadores: Prof. Dr. Rodrigo de Aquino Castro
Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva
Ferreira, Cristina Eustáquia
Polimorfismo dos receptores 3 adrenérgicos e sua correlação com a síndrome de bexiga hiperativa./ Cristina Eustáquia Ferreira – São Paulo, 2011.
xii, 51f.
Tese (Mestrado): Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação do Departamento de Ginecologia.
Título em inglês: 3 adrenoceptors and its overactive bladder syndrome correlation.
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
Departamento de Ginecologia
Chefe do Departamento:
Prof. Dr. Afonso Celso Pinto Nazário
iv
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
Departamento de Ginecologia
BANCA EXAMINADORA
Presidente da Banca: Prof. Dr. Manoel João Batista Castello Girão
Prof. Dr. Cássio Luís Zanettini Riccetto
Profa. Dr. Rogerio de Fraga
Profa. Dra. Andréa Moura Rodrigues
Suplente: Profa.Dra. Raquel Martins Arruda
v
Dedico este trabalho principalmente a quem eu amo.
Minha Família, pai, mãe, irmã, sobrinhos e marido.
Pessoas que sempre entenderam os momentos de ausência pelo
cumprimento de mais um objetivo de vida.
A todos que, em algum momento, se privaram da minha compania para que
esta etapa fosse concluída.
Dedico aos meus professores,
que acreditaram em mim,
mesmo quando eu parecia não ter muito a oferecer.
Às minhas pacientes,
que tão cordialmente se dispuseram a participar deste estudo
vi
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Manoel João Batista Castello Girão, por ser exemplo de dedicação ao saber e por ter me dado a oportunidade de Ingressar no meio acadêmico.
Ao Prof. Dr. Rodrigo de Aquino Castro, por toda a paciência, dedicação, empenho e amizade. As nossas conversas sempre foram de grande valia em minha vida.
À Prof. Dra. Marair Gracio Ferreira Sartori, pelos ensinamentos que contribuíram para a minha formação minha vida.
À Dra. Raquel Arruda, que me ensinou o que é o cuidado com as portadoras de Bexiga Hiperativa. Obrigada pelo exemplo de dedicação, de paciência, de humildade e de sabedoria.
Ao Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva pelas orientações.
Ao grupo de bexiga hiperativa, berço do meu trabalho e aos tão queridos colegas, Raquel, Simone, Marcinho, Ivani e Edney, que me proporcionaram momentos de agradável convivência e aprendizado.
Ao grupo A, que por tanto tempo fez parte de minha vida e que me ensinou o que é a Uroginecologia na prática.
À Dra. Letícia Maria de Oliveira, por tudo que me ensinou no Ambulatório de Uroginecologia.
Às minhas amigas Carol e Déa, por estarem comigo nos bons e maus momentos deste percurso. Déa, espero que você tenha idéia do quão importante você foi nessa jornada.
Aos funcionários do setor de Climatério e, em especial ao Prof. Mauro Abi Haidar. Sem vocês, a realização deste trabalho não seria possível.
vii
Às funcionárias da Urogineco, em especial a Carol e Hélia que, com sua boa-vontade, tantas vezes me auxiliaram com as pacientes.
Aos funcionários do Laboratório de Ginecologia Molecular Ana e Elenir, pela enorme ajuda na execução das reações. Agradeço, especialmente, a bióloga Profa Dra. Cristina Valletta de Carvalho, que muito me ensinou sobre biologia molecular.
viii SUMÁRIO
Dedicatória... v
Agradecimentos... vi
Listas... ix
Resumo... xii
1. INTRODUÇÃO... 1
2. PROPOSIÇÃO... 9
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS... 11
3.1 Casuística... 12
3.1.1 Grupo-Caso... 12
3.1.2 Grupo-Controle... 13
3.1.3 Características do Grupo-Caso... 16
3.1.4 Características do Grupo-Controle... 17
3.2 Métodos... 21
3.2.1 Coleta de dados clínicos...…... 21
3.2.2 Coleta de material biológico e extração de DNA... 22
3.2.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR)... 22
3.3 Análise estatística... 24
4. RESULTADOS... 26
4.1 Análise do Polimorfismo... 28
4.2 Análise dos Genótipos... 29
4.3 Análise de Alelos... 30
4.4 Estimativa dos fatores de risco independentes... 31
4.5 Relação entre polimorfismo e obesidade... 32
5. DISCUSSÃO... 34
6. CONCLUSÃO... 40
7. ANEXOS... 42
8. REFERÊNCIAS... 50
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Eletroforese em gel de agarose para produtos de PCR-
Transcriptase Reversa de adrenoreceptores 1, 2 e 3 usando RNA de bexigas humanas... 6
Figura 2 – Regiões do domínio transmembrana do receptor 3... 8
Figura 3 – Gel de agarose com fragmentos digeridos pela enzima de
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Comparação entre Grupo-caso e Grupo-controle. Variáveis quantitativas: 18
Tabela 2 – Análise descritiva das variáveis qualitativas e o valor de p correspondente para comparação entre os grupos, por meio do teste exato de Fisher
em relação à raça... 19
Tabela 3 – Análise descritiva das variáveis qualitativas e o valor de p correspondente para comparação entre os grupos, por meio do teste exato de Fisher em relação à história familiar... 19
Tabela 4 – Análise descritiva das variáveis qualitativas e o valor de p correspondente para comparação entre os grupos, por meio do teste exato de Fisher em relação às morbidades mais prevalentes... 20
Tabela 5 – Parâmetros urodinâmicos das pacientes-caso ... 20
Tabela 6 – Números observados e esperados de genótipos nos grupos casos e controles para o polimorfismo em estudo. Valores de Qui-Quadrado para desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg ... 28
Tabela 7 – Distribuição genotípica dos polimorfismos em estudo no grupo de casos e controles, assim como os valores de p correspondentes ao Teste Exato de Fisher... 29
Tabela 8 – Distribuição alélica do polimorfismo em estudo no grupo de casos e controles, assim como os valores do Teste Exato de Fisher... 30
Tabela 9 – Fatores de risco analisados por meio de regressão logística multivariada com o método Forward Stepwise, o qual adicionou as variáveis uma a uma até o momento em que as variáveis não incluídas no modelo têm valores de p >0,05... 31
Tabela 10 – Análise comparativa entre presença de polimorfismo e obesidade... 32
Tabela 11 – Avaliação da freqüência genotípica e IMC... 32
xi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA Arginina / Arginina ATP Adenosina Trifosfato IMC Índice de Massa Corporal
IUU Incontinência urinária de urgência SBH Síndrome da Bexiga Hiperativa TA Triptofano / Arginina
xii RESUMO
A Síndrome da Bexiga Hiperativa (SBH) é definida como presença de urgência miccional, com ou sem urge-incontinência, geralmente acompanhada de aumento de freqüência urinária e noctúria, na ausência de infecções ou afecções vesicais subjacentes. Deve-se ressaltar que urgência, chave diagnóstica desta síndrome, é definida pela Sociedade Internacional de Incontinência como desejo forte de urinar e de difícil controle (Abrams et al, 2002).
A síndrome de Bexiga Hiperativa é uma doença crônica, debilitante que atinge pessoas de todas as idades, embora seja mais comum na fase tardia da vida, afetando cerca de 41% dos homens e 31% das mulheres acima dos 75 anos (Milsom et al, 2001). Ela pode ter efeito deletério em vários aspectos da vida, incluindo isolamento social, diminuição de produtividade no trabalho, depressão, distúrbios do sono e comprometimento do desempenho doméstico e sexual (Abrams et al, 2000). A presença de urge-incontinência faz com que as pacientes tentem alcançar rapidamente o toalete, aumentando significativamente o risco de quedas e fraturas, principalmente em pacientes idosas (Brown et al, 2000).
Estudos populacionais demonstraram que a SBH é uma morbidade comum. O estudo EPIC avaliou 19.000 adultos no Canadá, Alemanha, Reino Unido, Itália e Suécia e apontou uma prevalência de SBH de 11,8% (10,8% em homens e 12,8% em mulheres). As taxas eram similares entre homens e mulheres, aumentando com a idade (Irwin et al, 2006). Recente estudo americano, o EpiLUTS, estimou a prevalência desta síndrome em americanos e estimou que cerca de 18,6% de sua população adulta sofre deste problema, sendo maior entre mulheres (26,1%) do que homens (10,7%). Este estudo indica que cerca de 42,2 milhões de adultos nos EUA sofrem de SBH. O custo desta doença totalizou cerca de 24,9 bilhões por ano (Onukwugha et al, 2009; Sexton et al, 2009).
No Brasil, a prevalência encontrada para a doença foi de 5,1% em homens e de 10% em mulheres (Neves, 2007).
podendo levar aos sintomas característicos de urgência, aumentos de freqüência e incontinência urinária de urgência. A hiperatividade do detrusor associada a estes sintomas nem sempre pode ser demonstrável ao estudo urodinâmico (Abrams et al, 2003). O contrário também pode ocorrer, pois uma parcela dos indivíduos que apresentam hiperatividade do detrusor pode ser assintomática.
As causas da SBH ainda não foram identificadas. Em parte, isso se deve ao fato de que esta síndrome seja de diagnóstico clínico baseado em sintomas, o que impede o desenvolvimento de modelos animais confiáveis. Sendo assim, as pesquisas acabam se voltando para mecanismos subjacentes à hiperatividade do detrusor e ao uso de hipóteses que transformem observações científicas em aplicações clínicas (Hashim, Abrams, 2007).
A fisiopatologia para a hiperatividade do detrusor pode ser neurogênica, miogênica, ou, nos casos em que os sintomas não podem ser claramente atribuídos a nenhuma causa, idiopática (Steers, 2002).
espinhais leva à reorganização das vias aferentes com as fibras C não-mielinizadas assumindo predominância no arco reflexo da micção. A sensibilização destas fibras provoca aumento da excitabilidade vesical e diminui o limiar de dor (Fowler, 2002).
Com relação às causas miogênicas, sugere-se que alterações na musculatura lisa são responsáveis pela produção de contrações involuntárias no detrusor. A denervação parcial do detrusor, independente de sua etiologia, pode alterar as propriedades do músculo liso, levando à maior excitabilidade assim como à maior comunicação elétrica entre as células. Sendo assim, uma contração local pode ocorrer em qualquer parte do detrusor e se espalhar por toda a bexiga, resultando em contração miogênica coordenada por toda a bexiga. A hiperatividade do detrusor é também associada a modificações estruturais nas células musculares incluindo protrusão de suas junções, uma maior aproximação entre elas, além de aumento do número de “gap junctions”, o que leva a facilitação da propagação de contrações a um espaço maior do que o habitual. Uma vez, ocorrida esta modificação celular, sintomas de urgência e freqüência podem acontecer. Quando a contratilidade está prejudicada, o esvaziamento incompleto pode resultar em agravamento da disfunção (Elbadawi et al, 1993; Brading, 1997).
2001). Disfunções uretrais e da musculatura pélvica podem também ter o seu papel na etiologia da SBH, sendo evidenciados pelas contrações não inibidas encontradas em pacientes com defeito esfincteriano e fraqueza do assoalho pélvico (Messelink, 1999). Portanto, faz-se necessária a distinção entre hiperatividade do detrusor “primária” idiopática da hiperatividade secundária a outras disfunções (Dmochowski, 2006). Cabe lembrar que ainda hoje, o tipo mais comum de hiperatividade do detrusor é idopático (Fowler, 2006). A origem desta doença, possivelmente multifatorial, as várias teorias existentes para explicá-la e as múltiplas drogas com efeitos que variam do sucesso terapêutico com efeitos colaterais mínimos a múltiplos efeitos colaterais sem o efeito terapêutico esperado, ressaltam que ainda há muito que se descobrir acerca desta doença.
Baseado nessa origem multifatorial,coube ao presente estudo ressaltar a importância dos receptores adrenérgicos ( -AR) presentes no detrusor de diversos mamíferos, incluindo os humanos, que apresentam a função de mediar o relaxamento vesical durante o armazenamento urinário (Morita et al, 1990; Li et al, 1992; Andersson, 1993). Inicialmente, foram identificados dois tipos de receptores, os 1 e os 2, sendo que, na maioria das espécies, os receptores 2 possuíam a função mais importante no relaxamento vesical (Maggi, Meli, 1982; Levin et al, 1988). Em humanos, a hipótese de que o relaxamento vesical dependeria de um terceiro tipo de receptor adrenérgico resultou do fato de que a substância comumente utilizada para induzir o relaxamento vesical (isoproterenol), não era inibido pelo practolol (antagonista seletivo 1) e nem pela butoxamina (antagonista seletivo 2), sugerindo que havia um terceiro subtipo envolvido nessa função (Nergardh et al, 1977; Larssen, 1979). Como já se sabia da existência de um terceiro tipo de receptor adrenérgico envolvido na mediação de funções metabólicas de lipólise, termogênese e processos de motilidade gastrointestinal, este terceiro receptor começou a ser investigado também na bexiga (Arch et al, 1984; Bond, Clark, 1988).
Eles demonstraram também a relevância destes receptores no relaxamento vesical.
Figura 1 – Eletroforese em gel de agarose para produtos de PCR- Transcriptase Reversa de adrenoreceptores 1, 2 e 3 usando RNA de bexigas humanas (Takeda et al, 1999)
Yamaguchi, em 2002, usou um método indireto para quantificar os receptores adrenérgicos presentes na bexiga. Foi realizada uma análise quantitativa de RNAm dos diferentes receptores adrenérgicos de pacientes com câncer de bexiga submetidos à cistectomia radical. Foi encontrada a predominância de RNAm de receptores 3 adrenérgicos neste tecido (97% de receptores 3, 1,5% de 1 e 1,4% de 2). Como o total de RNAm reflete a quantidade de proteínas dos receptores, ele concluiu que o mais abundante dos receptores seria o subtipo 3.
A evidência funcional do papel dos 3-AR veio de estudos que utilizaram agonistas e antagonistas seletivos para os diferentes receptores adrenérgicos em tiras de detrusor humano. Foi demonstrado que o relaxamento induzido pelos estímulos adrenérgicos era mediado, principalmente, pelos receptores 3 adrenérgicos (Ygawa et al, 1999; Takeda et al, 1999).
O receptor 3 humano está localizado no cromossomo 8p11-8p12 (Emorine et al, 1989) e há alguns anos ele tem sido identificado como polimórfico. Este polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) está presente no códon 64 do gen do 3-AR; consiste na troca de um Triptofano (Trp) pela Arginina (Arg) – Trp64Arg e tem recebido considerável atenção (Clement et al, 1995). Ele ocorre numa freqüência que varia de 8% a 40% em diferentes populações (Arner, Hoffstedt, 1999) e encontra-se relacionado à obesidade abdominal, resistência insulínica, capacidade aumentada em ganhar peso, dificuldade em perder peso e índice de massa corporal (IMC) elevado (Widen et al, 1995; Clement et al, 1995; Yoshida et al, 1995). Leineweber, em seu artigo de revisão sobre os polimorfismos existentes nos adrenoceptores concluiu que o polimorfismo Trp64Arg dos 3-ARs pode afetar a responsividade funcional in vivo, ex vivo e in vitro, podendo, desta forma, contribuir para acelerar o desenvolvimento de desordens metabólicas (Leineweber et al, 2004).
Recentemente, um estudo preliminar publicou a associação deste polimorfismo à hiperatividade do detrusor de origem idiopática (Honda et al, 2006).
Todas as etapas deste trabalho seguiram as normas de boas práticas em estudos clínicos envolvendo seres humanos, de acordo com a resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde, e foram aprovadas previamente pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo / Escola Paulista de Medicina (UNIFESP / EPM) (Anexo 1).
Trata-se de estudo caso controle no qual foram selecionadas 218 mulheres do setor de Uroginecologia / Ambulatório de Bexiga Hiperativa e no setor de Climatério, todos pertencentes ao Departamento de Ginecologia da UNIFESP-EPM, no período de Dezembro de 2007 a julho de 2009. As pacientes foram recrutadas pelo pesquisador principal e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP-EPM (Anexo 2).
Todas as pacientes submeteram-se a anamnese dirigida, exame ginecológico, preenchimento do questionário OAB-V8 validado na língua portuguesa (Acquadro et al, 2006)..
O questionário OAB-V8 foi usado como ferramenta diagnóstica para pacientes com sintomas clínicos de bexiga hiperativa, sendo considerado positivo quando obtinha pontuações maiores do que 8 (Coyne et al, 2004).
O estudo Urodinâmico e diário Miccional (formulado para atender condições sócio-culturais das pacientes atendidas no ambulatório) foram realizados somente em pacientes que preenchiam critérios para a Síndrome de Bexiga Hiperativa (SBH).
3.1 Casuística
3.1.1 Grupo-Caso
Critérios de Inclusão:
• Ter o diagnóstico clínico de SBH segundo a ICS e questionário V8; • Ausência de cirurgias de incontinência urinária;
• Prolapso genital ausente ou até o estadio II, não ultrapassando a carúncula himenal.
• Freqüência urinária média 8 micções em 24 h e média de episódios de urgência 2 em 24 h no diário miccional de 5 dias.
Critérios de não-inclusão:
• IUM com predomínio de sintomas de Incontinência Urinária de Esforço e com VLPP 60 mmHg, sinais de obstrução (Pdet Max 20 cm H2O e Q Max 12 cm H2O) e resíduo 100 mL (Schäfer et al, 2002)ao Estudo Urodinâmico;
• Freqüência urinária média < 8 micções em 24 h e média de episódios de urgência < 2 em 24 h no diário miccional de 5 dias;
• Cirurgia de Incontinência Urinária;
• Doenças neurológicas ou degenerativas;
• Não permissão da paciente em realizar a coleta sangüínea após ter sido esclarecida sobre o estudo;
• Prolapso de órgãos pélvicos ultrapassando a carúncula himenal. • Enfermidades pélvicas que pudessem comprometer o diagnóstico
clínico (tumores pélvicos, fístulas, infecções do trato urinário, cistite intersticial, etc)
3.1.2 Grupo-Controle
Critérios de Inclusão:
• Ausência de sintomas urinários • Pós-menopausa
• Ausência de reposição hormonal há pelo menos um ano • Idade maior ou igual a 60 anos.
Critérios de não-inclusão
• Não permissão da paciente em realizar a coleta sangüínea após ter sido esclarecida sobre o estudo.
• Uso de TH
• Doenças Neurológicas ou Degenerativas
• Prolapso de órgãos pélvicos ultrapassando a carúncula himenal.
• Cirurgia de Incontinência Urinária há menos de cinco anos.
• Enfermidades pélvicas que pudessem comprometer o diagnóstico clínico, tais como, tumores pélvicos, fístulas, Infecções do trato urinário, cistite Intersticial, etc.
Características dos grupos
Durante a anamnese as pacientes foram interrogadas sobre comorbidades e antecedentes familiares para incontinência urinária. Elas citavam, de forma espontânea, as suas enfermidades e de seus familiares. São importantes algumas considerações sobre a caracterização das doenças mais prevalentes entre os grupos (Tabela 4):
polimorfismo e os diferentes tipos de lipoproteínas, não nos preocupamos em caracterizar o tipo de dislipidemia.
• Diabetes: as pacientes classificadas como diabéticas faziam uso de algum tipo de medicação hipoglicemiante. Não fizemos distinção entre o tipo medicação usada se hipoglicemiante oral ou insulina.
3.1.3 Características do Grupo-Caso
• O grupo caso era composto por 49 pacientes com diagnóstico clínico de SBH (Definição da ICS, 2002)
• Idade: média de 62,3 anos (Tabela 1).
• Raça: 32 (65,3%) pacientes foram classificadas como “não-brancas”. Esta categoria foi composta por pacientes que haviam sido individualmente registradas como pardas ou como negras e que, pela possível imprecisão dos dados em um país onde predomina a miscigenação racial, como o Brasil, foi reclassificada apenas como “não-branca”. O restante, 17 pacientes (34,7%) foram classificadas como brancas (Tabela 2).
• Índice de massa corporal: média de 29,2 (Tabela 1).
• História familiar de incontinência urinária de urgência: 11 (22,4%) pacientes referiram ter parente de primeiro grau com esta doença (Tabela 3).
• Gestações: mínimo 0 e máximo 10, com média de 3 gestações (Tabela 1).
• Hipertensão arterial sistêmica (HAS): 31 pacientes (63,3%) eram portadoras de HAS (Tabela 4).
• Dislipidemia: 22 pacientes (44,9%) eram portadoras de dislipidemia (Tabela 4)
• Diabetes: 11 pacientes (22,4%) referiram ser portadoras de diabetes (Tabela 4)
• Questionário V8: média de 26,4 (Tabela 1).
• Freqüência urinária diária: média de 7,2 micções/dia (Tabela 1) • Noctúria/dia: média de 3,3 micções/noite (Tabela 1)
3.1.4 Características do Grupo-Controle
• O grupo controle era composto por 169 pacientes sem qualquer sintoma urinário.
• Idade: média de 64,3 anos (Tabela 1).
• Raça: 86 (50,9%) pacientes “não-brancas” e 83 pacientes (49,1%) brancas (Tabela 2).
• Índice de massa corporal: média de 27,8 (Tabela 1).
• Hipertensão arterial sistêmica: 98 pacientes (58%) eram portadoras de HAS (Tabela 4).
• Diabetes: 21 pacientes (12,4%) referiram-se como portadoras de diabetes (Tabela 4).
• Dislipidemia: 38 pacientes (22,5%) dos controles possuíam algum tipo de disfunção lipídica (Tabela 4).
• História familiar de incontinência urinária de urgência: 12 (7,1%) pacientes referiram ter parente de primeiro grau com esta doença (Tabela 3).
• Gestações: mínimo 0 e máximo 12, com média de 3,7 gestações (Tabela 1).
• Questionário V8: média de 0,8 (Tabela 1).
• Freqüência Urinária diária: média de 5,1 micções/dia (Tabela 1). • Noctúria/dia: média de 0,67 micções/noite (Tabela 1).
Tabela 1 – Comparação entre Grupo-caso e Grupo-controle – variáveis quantitativas:
Grupo Controle n = 169 Grupo Caso n = 49 Valor de p
Idade 64.27 ± 3.46 62,27 ± 10.48 0.22
IMC (Kg/ m2) 27.78 ± 4.81 29.17 ± 4.47 0.01
Gestações (variação) 3.68 ± 2.59 ( 0-12) 3,71 ± 2.59 ( 0-10) 0.97
Idade da Menopausa 48.40 ± 5.53 47.09 ± 5.48 0.10
V8q (média) 0,85 ± 1,54 26,39 ± 6,87 0,001
Freq. Diurna 5,1 ± 1,76 7,21 ± 3,06 0,001
Noctúria 0,67 ± 8,86 3,31 ± 2,35 0,001
Tabela 2 – Análise descritiva das variáveis qualitativas e o valor de p correspondente para comparação entre os grupos, por meio do teste exato de Fisher em relação à raça
Raça Branca Não-Branca Total p
Controle N 83 86 169
0,10
% 49,11 50,89
Caso N 17 32 49
% 34,69 65,31
Total N 100 118 218
% 45,87 54,13
Tabela 3 – Análise descritiva das variáveis qualitativas e o valor de p correspondente para comparação entre os grupos, por meio do teste exato de Fisher em relação à história familiar
Historia Familiar IUU Não Sim Total
Controle N 157 12 169
0,01
% 92,9% 7,1% 100,0%
Caso N 38 11 49
Tabela 4 – Análise descritiva das variáveis qualitativas e o valor de p correspondente para comparação entre os grupos, por meio do teste exato de Fisher em relação às morbidades mais prevalentes
DM Não Sim Total Teste Exato de Fisher
Controle N 148 21 169
0,11
% 87,6% 12,4% 100,0%
Caso N 38 11 49
% 77,6% 22,4% 100,0%
Dislipidemia Não Sim Total Teste Exato de Fisher
Controle N 131 38 169
0,003
% 77,5% 22,5% 100,0%
Caso % N 55,1% 27 44,9% 22 100,0% 49
HAS Não Sim Total Teste Exato de Fisher
Controle N 71 98 169
0,62
% 42,0% 58,0% 100,0%
Caso N 18 31 49
% 36,7% 63,3% 100,0%
Tabela 5 – Parâmetros urodinâmicos das pacientes-caso:
Parâmetros Média
Resíduo (ml) 5.45 ± 2.22
Primeiro desejo (ml) 75.82 ± 9.81
Capacidade Cistométrica Máxima 280.10 ± 23.10
Fluxo Máximo (ml/s) 74.2 ± 4.1
Fluxo Médio ml/s 31.6 ± 2.8
Valsalva leak point pressure (VLPP) 92.7 ± 10.4
3.2 Métodos
3.2.1 Coleta de dados clínicos
As pacientes submeteram-se à anamnese com registro do nome, número do registro hospitalar, idade, raça, história familiar de incontinência urinária, antecedentes obstétricos (número de gestações, partos vaginais, cesarianas, idade da menopausa, uso de terapia hormonal, comorbidades, doenças ginecológicas prévias e atuais. O exame ginecológico era realizado a fim de se determinar se havia prolapso genital e diagnosticar possíveis afecções do trato genito-urinário. Todas as pacientes respondiam o questionário V8, e se submetiam à coleta de sangue. As pacientes do grupo-controle relatavam as suas freqüências urinárias com base em estimativa retrospectiva.
3.2.2 Coleta de material biológico e extração de DNA
Foram colhidos 5 ml de sangue venoso de cada participante, em punção periférica de membro superior, utilizando vacutainer com anticoagulante EDTA. O sangue foi centrifugado a 2.000 rpm/4ºC (Eppendorf modelo5804R), durante 5 minutos e extraiu-se a fase leucocitária que era armazenada no freezer a 80ºC negativos até a realização da extração do DNA.
A extração do DNA genômico foi realizada após o descongelamento da fase leucocitária, utilizando-se o kit Illustra (GE Healthcare). As reações foram processadas da seguinte forma:
Adicionou-se 200µl da fase leucocitária previamente separada em um tubo juntamente com 400 µl de solução de lise. Deixado no vórtex por 15 segundos. Incubado em temperatura ambiente por 10 minutos. Transferência do material para coluna cromatográfica e centrifugação a 14000 rpm. Acrescentado mais 500 µl de solução de lise na coluna e centrifugado novamente a 14.000 rpm por três minutos. O centrifugado foi desprezado.
Adicionado mais 500 µl de tampão de lavagem e centrifugado a 14000 rpm por 3 minutos. O centrifugado foi desprezado.
A coluna foi transferida para um microtubo limpo e adicionado mais 60 µl de tampão de eluição pré-aquecido a 70°C no centro da coluna. O material foi incubado por 1 minuto em temperatura ambiente. Em seguida, centrifugado a 14000 rpm por 1 minuto. Esta etapa era repetida a fim de se ter um volume final de 120 µl de DNA genômico. O DNA assim obtido mantinha-se acondicionado em freezer a –20oC até, posterior utilização na reação de PCR.
3.2.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR - RFLP)
A determinação do polimorfismo foi feita por reação de polimerase em cadeia usando de 200 a 400ng de DNA. Para a amplificação, foi usada uma Taq DNA polimerase e primers de oligonucleotídeos obtidos comercialmente.
(5’CCACCAGGAGTCCCATCACC). As reações foram incubadas em termociclador (DNA Engine MJ Research - PTC 200) nas seguintes condições:
O produto gerado continha 210Pb.
O produto final foi digerido pela enzima Fast DigestTM MvaI
(Fermentas Life Science) a 37ºC durante 1h. As quantidades usadas foram as seguintes: Tampão - 1µL, Enzima - 1µL, Água - 2µL,Produto da PCR – 7,5µL.
Enzima MvaI – Sítio de reconhecimento
5’...CC AGG...3’ 3’...GG T CC...5’
Os produtos da digestão foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 3%.
Em relação ao polimorfismo do receptor beta 3 podemos observar pelo RFLP que nas mulheres cuja enzima MvaI encontrou sítios de reconhecimento
aparecem as bandas de 99, 62, 30,12 e 7pb, o que indica a homozigozidade dos alelos e, portanto são denominados homozigotos triptofano.
As que apresentam as bandas 161, 99, 62, 30,12 e 7pb são aquelas em que a enzima não reconheceu os sítios nos alelos, chamadas portanto de heterozigotos triptofano/arginina.
Figura 3 – Gel de agarose apresentando reações de PCR contendo homozigotos triptofano (Trp/Trp) e heterozigotos triptofano/agrinina (Trp/Arg). Nesta figura, não havia homozigotos Arginina Arg/Arg.
3.3 Análise estatística
As análises foram realizadas utilizando o pacote estatístico SPSS – Statistical Package for Social Sciences (v16.0).
Para comparação de variáveis qualitativas, ou seja, freqüências e proporções, foi utilizado o Teste de Qui-Quadrado.
A estimativa de Odds Ratio e Intervalos de Confiança foi realizada por
meio de regressão logística binária.
As freqüências genotípicas esperadas foram estimadas a partir das freqüências alélicas observadas e desvios no equilíbrio de Hardy-Weinberg foram calculados pelo Teste de Qui-Quadrado.
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Os grupos foram heterogêneos quanto a IMC, questionário V8, freqüência urinária, noctúria, urgência miccional e história familiar de incontinência urinária de urgência (Tabela1).
Quando comparamos as variáveis quantitativas encontramos:
• IMC maior para os casos;
• Questionário V8 com média de pontuação de 26 enquanto que nos controles esta média era de 0,8;
• Casos apresentando freqüência urinária significativamente maior que os controles;
• Noctúria nos casos cerca de três vezes maior que nos controles; • Urgência Miccional ausente nos controles enquanto nos casos
apresentava uma média de dois episódios/dia.
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4.1 Análise do Polimorfismo
A distribuição genotípica do polimorfismo não se encontra em equilíbrio de Hardy-Weinberg no grupo de casos (p<0,05).
Tabela 6 – Números observados e esperados de genótipos nos grupos casos e controles para o polimorfismo em estudo. Valores de Qui-Quadrado para desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg
Selvagem (TT)
Heterozigoto (TA)
Homozigoto Polimórfico
(AA)
Qui 2 Teste Exato de Fisher (p)
Controles Observado 128 40 1 1,29 0,26
Esperado 129,6 36,8 2,6
Casos Observado 24 25 0 5,75 0,02
Esperado 27,2 18,6 3,2
Valor de p referente a 1 grau de liberdade.
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4.2 Análise dos Genótipos
Foi observada diferença estatística entre grupo de casos e de controles para a distribuição genotípica do polimorfismo p=0.001. O Teste Exato de Fisher foi utilizado face ao pequeno tamanho amostral dos genótipos mutados. O teste de qui-quadrado deixa de ser válido, quando mais de 20% das células tem n menor que 5.
Tabela 7 – Distribuição genotípica dos polimorfismos em estudo no grupo de casos e controles, assim como os valores de p correspondentes ao Teste Exato de Fisher
Selvagem (TT)
Heterozigoto (TA)
Homozigoto Polimórfico
(AA)
Total p
Controle N 128 40 1 169
0,001
% 75,7% 23,7% 0,6% 100,0%
Caso N 24 25 0 49
!
4.3 Análise de Alelos
Foi observada diferença estatística entre grupo de casos e de controles para a distribuição alélica dos polimorfismos em estudo (p<0,05).
Tabela 8 – Distribuição alélica do polimorfismo em estudo no grupo de casos e controles, assim como os valores do Teste Exato de Fisher
Alelo Triptofano (T) Arginina (A) Total P
Controle N 296 42 338
0,002
% 87,6% 12,4% 100,0%
Caso N 73 25 98
!
4.4 Estimativa dos fatores de risco independentes
Foram incluídos no modelo todos os fatores de risco que foram significantes em análises individuais.
Tabela 9 – Fatores de risco analisados por meio de regressão logística multivariada com o método Forward Stepwise, o qual adicionou as variáveis uma a uma até o momento em que as variáveis não incluídas no modelo têm valores de p >0,05.
Odds Ratio 95,0% C.I. for EXP(B) P
História Familiar de IUU 3,23 1,20 8,71 0,02
!
4.5 Relação entre polimorfismo e obesidade
Tabela 10 – Análise comparativa entre presença de polimorfismo e obesidade
IMC N Média IMC DP Mediana Mínimo Máximo P
Homozigoto Selvagem 150 27,8 4,6 27,4 19,2 43,1
0,24 Hetero+Homozigoto
Mutado 65 28,7 5,1 28,3 18,8 42,9
Tabela 11 – Avaliação da freqüência genotípica e IMC
IMC Homozigoto selvagem Homozigoto Hetero+
Mutado Total P
Menor 25 N 42 17 59
% 71,2 28,8 0,87
Maior 25 N 108 48 156
!
Tabela 12 – Avaliação da tendência entre os grupos
Homozigoto selvagem Hetero+Homozigoto Mutado Total P
IMC<25 *
Controle N 39 13 52
% 75,0 25,0 0,18
Caso N 3 4 7
% 42,9 57,1
IMC>25
Controle N 87 27 114
% 76,3 23,7 0,0
Caso N 21 21 42
% 50 50
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A replicação do DNA é um processo extremamente acurado, mas não é absolutamente perfeito. Erros cometidos pela DNA polimerase podem resultar na incorporação de bases nitrogenadas erradas e esses erros serem a causa de mutações espontâneas, fonte de variações genéticas (Omoto, Lurquin, 2004).
Os polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) são as mais abundantes seqüências de variação do DNA encontradas na espécie humana. São locais no DNA em que um único par de bases nitrogenadas varia de pessoa para pessoa, servindo, então, como marcadores genéticos que podem ser transmitidos de pai para filho. Os SNP vêm ganhando popularidade e estão sendo considerados os marcadores genéticos de escolha para se estudar os complexos tratos genéticos (Kwok, Gu, 1999). Além disso, os SNP são ferramentas valiosas para se localizar e identificar genes que predispõem a doenças e para se entender os mecanismos moleculares das mutações (Zhao et al, 2003). Recentemente, alguns estudos tem tentado associar polimorfismos a desordens do assoalho pélvico como incontinência urinária e distopias (Skorupski et al, 2006; Rodrigues et al, 2008).
Como conseqüência de modificações no DNA, pode ocorrer a incorporação de aminoácidos incorretos nas proteínas. Proteínas com seqüências de aminoácidos alteradas podem resultar em disfunção, gerando um fenótipo alterado (Omoto, Lurquin, 2004). No caso de pacientes com SBH idiopática, tem-se levantado a hipótetem-se de que receptores 3 alterados levem ao relaxamento vesical insuficiente durante o armazenamento urinário, diminuindo a capacidade vesical e favorecendo às contrações não inibidas (Yamaguchi, 2002).
O conjunto de sintomas: urgência associada ou não a urge-incontinência, aumento de freqüência urinária e noctúria foi comparado entre casos e controles. Pudemos verificar uma diferença estatisticamente significante (p<0,001) para todos estes sintomas entre os grupos. Observamos uma média de freqüência urinária, noctúria e urgência miccional maior nos casos (7,21; 3,31 e 2,23, respectivamente) em relação aos controles (5,10; 0,67 e 0, respectivamente).
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única exceção Naurua (Oceania), onde a freqüência alélica foi zero. A população com maior freqüência alélica foi a de “Pima Indians”, excedendo os 30%. De acordo com nossos dados, observamos uma freqüência alélica de 12,4% dentre os controles, número que está de acordo com a maioria das populações do mundo que apresentam freqüência alélica situada entre 4,7% e 13% (Strosberg, 1997). Já com relação ao grupo caso, 51% das pacientes avaliadas eram portadoras do gene polimórfico (25/49), sendo o polimorfismo cerca de duas vezes mais frequente do que no grupo controle (24,3%, com p=0,001). O presente estudo concorda com os dois únicos estudos divulgados até o momento com a finalidade de medir a freqüência deste polimorfismo em pacientes com SBH. No primeiro estudo foi encontrada freqüência de 49% de gens mutados em portadores de SBH (Yamagushi, 2002). Já no segundo estudo foi encontrada freqüência de 47% de polimorfismo em pacientes com desta síndrome (Honda et al, 2006). A frequência alélica do polimorfismo também foi estatisticamente diferente entre o grupo de casos e controles (25,5% e 12,4%, respectivamente) sendo a freqüência do gen mutado duas vezes maior entre o grupo caso ( p=0,002)
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pode variar dependendo da região do país, da qual a amostra é proveniente (Alves-Silva et al, 2000 e Carvalho-Silva et al, 2001).
Acreditamos que a disfunção dos receptores 3 resultantes deste polimorfismo pode contribuir na fisiopatologia da SBH. No entanto, o fato de existirem pacientes com doença que não apresentam tal polimorfismo e pacientes sadias portadoras de tal alteração faz levantar a hipótese da existência de mecanismos compensadores para o relaxamento insuficiente causado pelos receptores 3 mutados. Supõe-se que estes mecanismos, possivelmente hormônio-dependentes tornam-se desativados em pacientes mais idosas, levando ao desenvolvimento da doença em portadoras deste polimorfismo (Honda et al, 2006).
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Como a obesidade não se configurou neste trabalho como fator de risco individual à SBH, restaram nesta categoria apenas a presença do polimorfismo (OR: 3,11; IC: 1,49-6,49 e p=0,002) e de história familiar de IUU. O fato de o polimorfismo ter se configurado como um fator de risco individual ao desenvolvimento de SBH concorda com os achados de Honda et al, 2006, que consideraram o polimorfismo do receptor 3 como um marcador genético para esta síndrome.
No que diz respeito à hereditariedade, a história familiar de IUU (OR: 3,23; IC:1,20- 8,71 e p=0,02) em nosso estudo aumentou em cerca de três vezes a chance de se ter síndrome de bexiga hiperativa. Não foram encontrados dados na literatura que concordem ou não com estes achados, pois os estudos epidemiológicos avaliam em sua maioria a idade de aparecimento da doença, (em torno de 60 anos) e as comorbidades a ela associadas, sendo as mais comuns as infecções urinárias e dermatológicas locais, e a depressão. A atividade sexual se mostra mais comprometida em homens do que em mulheres com o problema, mas o impacto na qualidade de vida mostra-se elevado (Diaz et al, 2009). Além do mais, cabe a nós colocarmos este achado como um possível viés, uma vez que as pacientes estudadas poderiam saber mais ou se recordar mais facilmente de parentes que apresentassem sintomas semelhantes aos seus.
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Anexo 2 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Polimorfismo nos Receptores B3 Adrenérgicos e sua Correlação Síndrome da Bexiga Hiperativa e com a Hiperatividade do Detrusor
O objetivo deste estudo é avaliar uma possível causa para uma doença chamada “Síndrome da Bexiga Hiperativa” que se manifesta através de urgência urinária (ter que ir ao banheiro logo que aparece a vontade de urinar), aumento da freqüência urinária (número de vezes que vai ao banheiro) e noctúria (acordar à noite para urinar).
Vamos verificar se mulheres que sofrem deste problema apresentam um determinado tipo de alteração genética dos receptores B3 Adrenérgicos localizados na bexiga. Esta mutação pode levar a uma diminuição do relaxamento da bexiga e originar por conseqüência os sintomas desta síndrome.
Para efeito de comparação, também será colhido sangue de pacientes que não possuem queixas urinárias com o intuito de verificar se existe esta possível mutação em mulheres que não sejam portadoras de Síndrome de Bexiga Hiperativa.
O procedimento consistirá no seguinte:
Mulheres com Síndrome de Bexiga Hiperativa (pacientes Caso)
1) será colhido 5ml de sangue em uma veia do antebraço; o desconforto causado será o da dor da picada da agulha;
2) será realizado o estudo urodinâmico, que consiste na passagem de uma sonda pelo canal da urina com o posterior enchimento da bexiga com soro para avaliar o funcionamento da mesma. Este exame provoca um certo desconforto devido à passagem da sonda pela uretra e tem como risco a possibilidade de se adquirir infecção urinária que, no entanto, é diminuído pela administração de antibiótico após o procedimento.
Mulheres sem Síndrome de Bexiga Hiperativa (pacientes Controles)
1) será colhido 5ml de sangue em uma veia do antebraço e o desconforto causado será o da dor da picada da agulha;
Serão usamos técnicas de engenharia genética para estudar o DNA contido no sangue colhido das amostras.
A importância deste estudo encontra-se na identificação das causas desta doença ajudando no desenvolvimento de drogas mais específicas que causem menos efeitos colaterais e proporcionem uma melhor qualidade de vida aos pacientes portadores deste problema.
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É garantida a liberdade da retirada do consentimento a qualquer momento e você poderá deixar de participar do estudo, sem qualquer prejuízo à continuidade de seu tratamento na Instituição.
As informações obtidas serão analisadas em conjunto com as de outros pacientes. Não será divulgada a identificação de nenhum paciente.
Você tem o direito de ser manter atualizada sobre os resultados parciais da pesquisa. Para isto, basta entrar em contato com a investigadora responsável (Dra. Crisitna).
Você não terá despesas com exames e consultas e não terá compensações financeiras relacionadas à sua participação. Se existir qualquer despesa adicional, ela será absorvida pelo orçamento da pesquisa.
Em caso de dano pessoal, causado pelo procedimento proposto (coleta de sangue), você terá direito a tratamento médico na Instituição, bem com à indenizações legalmente estabelecidas.
Os dados e o material coletados serão utilizados exclusivamente nesta pesquisa. Acredito ter sido suficientemente informada a respeito do que li ou do que foi lido para mim a respeito do estudo “Polimorfismo nos Receptores B3 Adrenérgicos e sua Correlação Síndrome da Bexiga Hiperativa e com a Hiperatividade do Detrusor”. Discuti com a Dra. Cristina Eustáquia Ferreira sobre a decisão em participar nesse estudo. Ficaram claros para mim quais são os objetivos da pesquisa, os procedimentos que serão realizados, seus desconfortos e riscos, as garantias de confidenciabilidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que a minha participação é isenta de despesas e que tenho garantia de acesso a tratamento hospitalar quando necessário. Concordo voluntariamente em participar deste estudo e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento, sem penalidades, sem prejuízos ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido.
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Assinatura do paciente ou responsável legal Data / /
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Assinatura da testemunha Data / /
Para os casos de pacientes analfabetas, semi-analfabetas ou portadoras de deficiência auditiva ou visual.
Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido deste paciente ou responsável legal para a participação neste estudo.
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Abstract
Objective: to evaluate if the polymorphism at codon 64 of the adrenergic 3 receptor gene with the replacement of a triptophan by Arginine represents a risk factor for the Hyperactive Bladder Syndrome. Casuistic and Methods: case study control involving 218 patients from the Climacteric Ambulatory and the Hyperactive Bladder Ambulatory. The case group comprised 49 patients who met the clinical criteria for the hyperactive bladder syndrome. Now, the control group comprised 169 patients without any type of urinary symptom. 5 ml of venous blood were collected from each participant in order to extract the genomic DNA, followed by the determination of the polymorphism by PCR.
Results: The groups were heterogeneous regarding the IMC, V8 questionnaire, urinary frequency, nocturia, mictional urgency and family history of urgency urinary incontinence. The genotypic distribution for the control group was comprised of 128 savages (75.7%) 40 heterozygote (23.7%) and 01 Muted (0.6%). In the case group, 24 savages (49%), 25 heterozygote (51%) and none muted (p<0.05). The allelic analysis found was of 12.4% of muted genes for the controls and 25.5% for the cases (p<0.05). After multivariate logistic regression an OR of 3.23 (p<0.05) was found for those who present a family history of Urgency Urinary Incontinence of 3.11 (p<0.05) for those who present the polymorphism discussed here.
