Proteinas do liquido cefalorraqueano: I. Estudo comparativo entre metodos de concentração.

PROTEINAS DO LIQUIDO CEFALORRAQUEANO

I. E S T U D O C O M P A R A T I V O E N T R E M E T O D O S D E C O N C E N T R A Ç Ã O

LUCIA M. SINGER VERMES

Doenças do sistema nervoso central são freqüentemente acompanhadas de

variações nos perfis eletroforéticos das proteínas do líquido cefalorraqueano

(LCR), e o conhecimento destas variações têm muitas vezes valor diagnóstico.

No entanto, sendo o LCR fluído com baixo teor protéico, há necessidade de

concentrá-lo previamente para que o conteúdo protéico seja suficiente alto para

ser corado de forma visível após separação eletroforética (assim como para se

fazer estudos imuno-eletroforéticos e quantificar várias proteínas específicas).

Os níveis de proteínas totais devem atingir 2 a 8 g/100 ml, os valores relativos

das várias frações devem ser semelhantes àqueles encontrados no fluído original

e não deve ocorrer desnaturação das proteínas durante o processo de

con-centração

»

.

São numerosos os procedimentos indicados para a concentração do LCR.

Muitas destas técnicas acham-se descritas na revisão feita por Lemmen e col.

,

tais como a diálise (do material contido em sacos de celulose ou de celofane)

contra soluções macromoleculares de dextrana, goma-arábica, polivinilpirrolidona,

ultrafiltração sob pressão, precipitação com acetona, ultrafiltração sob vácuo

e liofilização.

Mais recentemente foram descritos novos procedimentos ou modificações dos

já existentes, para concentração, mediante diálise contra soluções

macromole-culares

»

ou contra polímeros secos

»

»

, precipitação de proteínas com

ace-tona

, álcool

ou ácido tânico

»

e pervaporação

»

. Sistemas de

centrífu-go-ultrafiltração também têm sido adotados

, assim como a concentração por

meio de bastonetes de gel hidrofílico seco de poliacrilamida que, colocados

dire-tamente no recipiente que contém o fluído, absorvem substâncias de peso

mole-cular menor que 20.000 daltons

Visando encontrar o método mais satisfatório para concentração de fluídos

biológicos diluídos, vários pesquisadores efetuaram estudos comparativos entre

os diferentes procedimentos. Estes estudos geralmente têm seguido metodologia

que consiste em reconcentrar soros previamente diluídos (a 1:100 ou 1:200),

efetuar eletroforese de proteínas destes materiais concentrados e comparar as

composições relativas das frações protéicas àquelas obtidas por eletroforese do

soro original. As conclusões a que chegaram os diferentes autores não foram

concordantes, como se pode observar pelo resumo de alguns destes trabalhos,

na tabela 1.

Por isto, propusemo-nos comparar a precisão e exatidão de quatro

procedi-mentos de concentração de simples aplicação em laboratórios de rotina:

ultra-filtração sob pressão positiva, absorção de substâncias de baixo peso molecular

por gel hidrofílico seco de poliacrilamida, centrífugo-ultrafiltração e diálise

con-tra solução de goma-arábica.

M A T E R I A L Ε M É T O D O S

U m a m i s t u r a d e s o r o s h u m a n o s ( c o n t r o l e ) c o m t e o r p r o t é i c o d e 7,1 g/100 ml, d e t e r m i n a d o p e l o m é t o d o d e b i u r e t o β , foi s u b m e t i d a 20 v e z e s à s e p a r a ç ã o e l e t r o f o r é t i c a d e p r o t e í n a s , e m d i f e r e n t e s d i a s . P a r t e d o c o n t r o l e foi d i l u í d o a 1:200 ( e m s o l u ç ã o f i s i o l ó g i c a ) , c o n g e l a d o e m a l í q u o t a s d e 10 m l , q u e f o r a m u t i l i z a d a s n o s e s t u d o s s o b r e m é t o d o s d e c o n c e n t r a ç ã o .

-f o r m e d e s c r i t o p o r W i n d i s c h & B r a c k e n 21;

u l t r a f i l t r a ç ã o s o b p r e s s ã o p o s i t i v a d o m a t e -rial c o n t i d o e m s a c o s d e c e l u l o s e ; m é t o d o d e a b s o r ç ã o d e s u b s t â n c i a s d e b a i x o p e s o m o l e c u l a r p o r b a s t o n e t e s d e g e l h i d r o f í l i c o s e c o d e p o l i a c r i l a m i d a (Lyphogel-Gruelman), s e g u n d o i n s t r u ç õ e s d o f a b r i c a n t e .

E m d i f e r e n t e s d i a s a m o s t r a s d o c o n t r o l e d i l u í d o (1:200) f o r a m c o n c e n t r a d a s p e l o s p r o c e d i m e n t o s a c i m a r e l a c i o n a d o s e s u b m e t i d a s , e m s e g u i d a , a o f r a c i o n a m e n t o e l e t r o f o -r é t i c o d e p -r o t e í n a s . Os p e -r f i s e l e t -r o f o -r é t i c o s e a s p e -r c e n t a g e n s d e c a d a f -r a ç ã o p -r o t é i c a o b t i d o s n o s m a t e r i a i s c o n c e n t r a d o s f o r a m c o m p a r a d o s à q u e l e s o b t i d o s p o r e l e t r o f o r e s e d o c o n t r o l e .

A s e l e t r o f o r e s e s f o r a m f e i t a s s o b r e m e m b r a n a s d e a c e t a t o d e c e l u l o s e e m e q u i p a -m e n t o Miikrophor-Boska-mp, u t i l i z a n d o o -m e d i d o r d e e x t i n ç ã o e i n t e g r a d o r c o -m b i n a d o s d e f a b r i c a ç ã o Zeiss, m o d e l o E I - 3 , s e g u n d o o m é t o d o d e K o h n n , m o d i f i c a d o p o r V a z e col. 19.

A p r e c i s ã o d o s r e s u l t a d o s o b t i d o s p o r e l e t r o f o r e s e d o c o n t r o l e e d o s c o n c e n t r a d o s p o r d i f e r e n t e s p r o c e d i m e n t o s foi a v a l i a d a , p a r a c a d a f r a ç ã o p r o t é i c a , p e l o c o e f i c i e n t e d e v a r i a ç ã o d e P e a r s o n , e x p r e s s o e m p e r c e n t a g e m . P a r a v e r i f i c a r a e x a t i d ã o d o s m é t o d o s d e c o n c e n t r a ç ã o , o s v a l o r e s p e r c e n t u a i s o b t i d o s p a r a c a d a f r a ç ã o p r o t é i c a , d o c o n -trole e d o s c o n c e n t r a d o s , f o r a m t r a n s f o r m a d o s e m a r c o - s e n o y p e r c e n t a g e m d e S n e d e c o r e s u b m e t i d o s à a n á l i s e d e variância. N o s c a s o s e m q u e e s t a a n á l i s e d e m o n s t r o u h a v e r d i f e r e n ç a s e s t a t i s t i c a m e n t e s i g n i f i c a n t e s , foi a p l i c a d o o t e s t e d e T u k e y p a r a verificar q u a l ( i s ) p r o c e d i m e n t o ( s ) d e c o n c e n t r a ç ã o g e r a v a ( m ) r e s u l t a d o s q u e , e m m é d i a , d i f e r i a m d o c o n t r o l e e s e o s m é t o d o s d e c o n c e n t r a ç ã o f o r n e c i a m v a l o r e s m é d i o s d i f e r e n t e s e n t r e si. O n í v e l d e r e j e i ç ã o e s t a b e l e c i d o p a r a e s t a s a n á l i s e s foi d e 5%.

R E S U L T A D O S

Os p r i m e i r o s r e s u l t a d o s r e v e l a r a m q u e t a n t o o m é t o d o d e u l t r a f i l t r a ç ã o s o b p r e s s ã o p o s i t i v a , c o m o a q u e l e e m q u e s e u t i l i z a g e l h i d r o f í l i c o s e c o d e p o l i a c r i l a m i d a , n ã o s ã o r e c o m e n d á v e i s p o r i n d u z i r e m , c o m f r e q ü ê n c i a , d e s n a t u r a ç ã o d a s p r o t e í n a s . E s t e f e n ô -m e n o é o b s e r v á v e l p e l a f o r -m a ç ã o d e r a s t r o s e a c ú -m u l o d e -m a t e r i a l n o p o n t o d e a p l i c a ç ã o n a f i t a d e a c e t a t o d e c e l u l o s e . P o r i s t o e s t e s d o i s p r o c e d i m e n t o s f o r a m e x c l u í d o s d a s a n á l i s e s e s t a t í s t i c a s p a r a a v e r i g u a ç ã o d e r e p r o d u t i b i l i d a d e e e x a t i d ã o d o s m é t o d o s d e c o n c e n t r a ç ã o .

A s m é d i a s e d e s v i o s p a d r ã o c a l c u l a d o s p a r a c a d a fração, e l e t r o f o r e t i c a m e n t e s e p a -rada, d o c o n t r o l e e d o s c o n c e n t r a d o s p o r g o m a - a r á b i c a e p o r c e n t r í f u g o - u l t r a f i l t r a ç ã o , a c h a m - s e n a t a b e l a 2.

Os c o e f i c i e n t e s d e v a r i a ç ã o d e P e a r s o n ( e x p r e s s o s e m p e r c e n t a g e m ) c a l c u l a d o s p a r a a s f r a ç õ e s p r o t é i c a s d o c o n t r o l e e d o s c o n c e n t r a d o s p e l o s d o i s p r o c e d i m e n t o s s u b m e t i d o s a t r a t a m e n t o e s t a t í s t i c o , e n c o n t r a m s e n a t a b e l a 3. P e l a a n á l i s e d e s t e q u a d r o o b s e r -v a - s e q u e a -v a r i a ç ã o é m a i o r q u e a q u e l a o b t i d a n a e l e t r o f o r e s e d o s e x p e r i m e n t o s c o n t r o l e , n a s f r a ç õ e s p r é a l b u m i n a e g l o b u l i n a s β d o s c o n c e n t r a d o s p o r d i á l i s e c o n t r a g o m a a r á -b i c a e n a s f r a ç õ e s p r é - a l -b u m i n a , g l o -b u l i n a s β e

A a n á l i s e d e v a r i â n c i a d e m o n s t r o u h a v e r d i f e r e n ç a s e s t a t i s t i c a m e n t e s i g n i f i c a n t e s , e n t r e o s 3 g r u p o s e s t u d a d o s , q u a n t o a o s n í v e i s p e r c e n t u a i s d e g l o b u l i n a s a^ β e γ , n ã o

o c o r r e n d o t a i s d i f e r e n ç a s q u a n t o à s o u t r a s f r a ç õ e s . Os r e s u l t a d o s d e s t a s a n á l i s e s e s t a t í s t i c a s a c h a m s e n a t a b e l a 4, n a qual p o d e s e v e r i f i c a r q u e o v a l o r m é d i o d e g l o b u l i -n a s a í d o m a t e r i a l c o n c e n t r a d o p o r c e n t r í f u g o - u l t r a f i l t r a ç ã o d i f e r i u s i g n i f i c a t i v a m e n t e

d a q u e l e s o b t i d o s p o r e l e t r o f o r e s e d o c o n t r o l e e d o c o n c e n t r a d o por d i á l i s e c o n t r a g o m a --arábica. A t a x a m é d i a d e g l o b u l i n a s β foi s i g n i f i c a n t e m e n t e m a i s b a i x a , e m relação ao c o n t r o l e , q u a n d o o m a t e r i a l foi p r e v i a m e n t e c o n c e n t r a d o p o r d i á l i s e c o n t r a g o m a a r á -bica, n ã o o c o r r e n d o p o r é m d i f e r e n ç a s i g n i f i c a n t e , q u a n t o a o s v a l o r e s m é d i o s d e s t a f r a ç ã o protéica, q u a n d o f o r a m c o m p a r a d o s o s d o i s p r o c e d i m e n t o s d e c o n c e n t r a ç ã o . T a n t o o m é t o d o d e d i á l i s e c o n t r a g o m a - a r á b i c a c o m o o d e c e n t r í f u g o - u l t r a f i l t r a ç ã o f o r n e c e r a m

v a l o r e s m é d i o s d e g l o b u l i n a s γ m a i s e l e v a d o s q u e a q u e l e o b t i d o p o r e l e t r o f o r e s e d o c o n t r o l e , n ã o h a v e n d o , p o r é m , d i f e r e n ç a s i g n i f i c a n t e e n t r e a s m é d i a s o b t i d a s , p a r a e s t a fração, a p ó s c o n c e n t r a ç ã o d o m a t e r i a l p e l o s d o i s p r o c e d i m e n t o s e s t u d a d o s .

C O M E N T Á R I O S

mesma mistura de soros foi diluída a 1:200 de forma a conter taxa de proteínas

totais dentro da faixa de normalidade do LCR

; amostras deste material

diluído foram então concentrados 100 a 200 vezes pelos 4 diferentes

procedi-mentos estudados e submetidos à eletroforese de proteínas.

A ultrafiltração sob pressão positiva acarretou, com alta freqüência,

desna-turação de proteínas verificável por grande acúmulo de material no ponto de

aplicação da eletroforese e pela formação de rastros. Estas alterações na

estrutura das proteínas, tanto poderiam ser devidas à lentidão deste processo,

pois para concentrar 100 a 200 vezes, 10 ml do fluído diluído, são necessárias

cerca de 48 horas, como ao fato da pressão ter sido efetuada mediante ar

comprimido, ao invés de nitrogênio que é mais inerte.

A concentração efetuada por absorção de substâncias de peso molecular

menor que 20.000 daltons por gel hidrofílico seco de poliacrilamida, adicionado

diretamente ao material que se deseja concentrar, apesar de ser método

pro-missor pela sua simplicidade, revelou ser ineficiente por também causar, com

freqüência, desnaturação de proteínas. Cumpre ressaltar no entanto, que

alte-rações grosseiras no perfil eletroforético devido ã desnaturação de proteínas não

foram observadas quando o material era concentrado menos de 100 vezes.

Foram obtidos perfis eletroforéticos apresentando 6 frações proteicas

nitida-mente separadas, quando a eletroforese foi realizada nos concentrados por diálise

contra solução de goma-arábica e por centrífugo-ultrafiltração.

Os coeficientes de variação de Pearson calculados para albumina dos

concen-trados por diálise contra goma-arábica (3,31%) e por centrífugo-ultrafiltração

(4,39%) são comparáveis ao coeficiente de variação de Pearson calculado para

albumina de controle (4,95%). O mesmo ocorreu em relação às globulinas γ :

o coeficiente de variação de Pearson do controle foi de 7,07% e dos

concen-trados por diálise contra solução de goma-arábica e por

centrífugo-ultrafiltra-ção foram de 5,55 e 7,42%, respectivamente. Assim, a reprodutibilidade de

ambos os métodos é satisfatória, levando em consideração as duas frações mais

importantes na prática neurológica: albumina e globulinas γ . Quanto às outras

frações proteicas, foi verificado que principalmente a pré-albumina do material

concentrado por diálise contra solução de goma-arábica e as globulinas β do

concentrado por centrífugo-ultrafiltração apresentaram reprodutibilidade inferior

à do controle.

Os estudos sobre exatidão dos métodos no tocante à pré-albumina e

globuli-nas a

não revelaram diferenças significantes entre as médias obtidas por

eletro-forese do controle e dos concentrados pelos dois procedimentos em questão. A

diálise contra solução de goma-arábica, no entanto, acarretou valor médio de

globulinas β inferior àquele obtido por eletroforese do controle, embora não

haja diferença significante entre as médias destas globulinas quando são

com-parados os dois procedimentos de concentração. Foi ainda observada diferença

significante entre os valores médios obtidos para globulinas «

, dos materiais

submetidos à diálise contra solução de goma-arábica e à

centrífugo-ultrafiltra-ção; este último procedimento também acarretou valores médios

significante-mente mais elevados de globulinas «

, em relação ao controle

Em linhas gerais pode-se afirmar que, embora não dispondo de um método

de concentração que possa ser considerado ideal, tanto a

centrífugo-ultrafiltra-ção como a diálise contra solucentrífugo-ultrafiltra-ção de goma-arábica são métodos de simples

execução e reprodutíveis, devendo-se no entanto ressaltar que a diálise contra

solução de goma-arábica é procedimento bem menos oneroso que a

centrífugo--ultrafiltração.

R E S U M O

No intuito de escolher entre métodos de concentração, aplicáveis ao LCR,

aquele que, não provocando desnaturação de proteínas, seja o mais exato,

pre-ciso e de fácil aplicação em laboratórios de rotina, foram estudados quatro

procedimentos: diálise contra solução de goma-arábica, centrífugo-ultrafiltração,

absorção de substâncias de baixo peso molecular por gel seco de poliacrilamida

e ultrafiltração sob pressão positiva. Concluiu-se que a diálise contra solução

de goma-arábica, por ser preciso, relativamente exato, simples e pouco oneroso,

é o mais satisfatório dentre os métodos estudados.

S U M M A R Y

Cerebrospinal fluid proteins: I. Comparison of protein concentration methods.

Four protein concentration methods, applicable to cerebrospinal fluid, were

compared in order to choose a procedure that not causing protein denaturation,

is accurate, precise and easy to perform in routine laboratories. The studied

methods were: dialysis against arabic-gum solution, centrifuge-ultrafiltration,

absorption of low molecular weight substances by dry polyacrylamide gel and

pressure ultrafiltration. Blood serum was diluted, then concentrated by these

procedures and analyzed by cellulose acetate electrophoresis; the undiluted serum

served as control.

It was observed that two methods: pressure ultrafiltration and absorption

of low molecular weight substances by polyacrylamide hydrogel, are not suitable

for concentrating diluted fluids because they frequently cause protein denaturation.

R E F E R E N C I A S

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17. M E J B A U M - K A T Z E N E L L E N B O G E N , W . ; D O B R Y S Z Y C K A , W . ; B O G U S L A W L K A ¬ - J A W O R S K A , J . & MORAWTECKA, B . — R e g e n e r a t i o n of p r o t e i n f r o m i n s o l u b l e p r o t e i n - t a n n i n c o m p o u n d s . N a t u r e 184:1799, 1959.

18. S P I N A - F R A N Ç A , A. — E l e t r o f o r e s e e m p a p e l d a s p r o t e í n a s d o l í q u i d o c e f a l o r r a ¬ q u i d i a n o . I I I . t é c n i c a . Arq. N e u r o - P s i q u i a t . ( S ã o P a u l o ) 16:236, 1958.

19. VAZ, C. A. C , F E R R I , R. G.; G E I S H O V E L , N . & C A M P O S , A. N . P . — E l e t r o -f o r e s e s o b r e a c e t a t o d e c e l u l o s e ( C A F ) . R e p r o d u t i b i l i d a d e e v a l o r e s n o r m a i s . R e v . I n s t . A d o l f o L u t z ( S ã o P a u l o ) 31:71, 1971.

20. V E R M E S , L. M. S . ; F E R R I , R. G.; A I S E N , J . & M A R L E T , J . M. — P r o t e í n a s t o t a i s d o l í q u i d o c e f a l o r r a q u e a n o o b t i d o p o r p u n ç ã o d a c i s t e r n a m a g n a : v a l o r e s

n o r m a i s ( v a r i a ç õ e s l i g a d a s a o s e x o ) . Arq. N e u r o - P s i q u i a t . ( S ã o P a u l o ) 34:315, 1976. 21. W I N D I S C H , R. M. & B R A C K E N , Μ , Μ . — C e r e b r o s p i n a l f l u i d p r o t e i n s : c o n c e n

-t r a -t i o n b y m e m b r a n e u l -t r a f i l -t r a -t i o n a n d f r a c -t i o n a -t i o n b y e l e c -t r o p h o r e s i s o n c e l l u l o s e a c e t a t e . Clin. C h e m . 16:416, 1970.