UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS, FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
BRIGIDA GOMES DE ALMEIDA SCHIRMER
Participação do receptor do fator de ativação de plaquetas (PAFR) na
revascularização de membros posteriores isquêmicos em modelo experimental e nas funções de células progenitoras do endotélio
BRIGIDA GOMES DE ALMEIDA SCHIRMER
Participação do receptor do fator de ativação de plaquetas (PAFR) na
revascularização de membros posteriores isquêmicos em modelo experimental e nas funções de células progenitoras do endotélio
Belo Horizonte 2015
Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de doutor em Ciências Biológicas: Fisiologia e Farmacologia Área de concentração: Fisiologia
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, que conduz e ilumina os meus passos. A Ele toda honra e louvor!!! Agradeço a Deus pela vida do meu marido Guilherme que sempre me apoiou com grande amor e confiança. Ao meu filho Arthur que alegra os nossos dias, trazendo mais leveza nos momentos de estresse. Aos meus pais, Moisés e Sandra que, juntamente com a minha avó, irmãos e sogros sempre me apoiaram e torceram pelo meu sucesso profissional. A todos os irmãos e amigos da Quarta Igreja Presbiteriana de Belo Horizonte pelas orações; tenho certeza de que foram instrumento para que a benção de Deus estivesse sobre mim nos momentos difíceis.
À prof. Dra. Lucíola da Silva Barcelos que me orientou desde o mestrado, muito me ensinou e apoiou durante todo esse período, contribuindo em muito para meu crescimento científico e intelectual.
A todos os colegas do grupo LanCet, especialmente à Jousie e ao Alan, que sempre me apoiaram e contribuíram para o desenvolvimento do meu trabalho de pesquisa, seja diretamente ou com palavras de incentivo.
À Prof. Dra. Silvia Passos pelo apoio e incentivo e a todos do laboratório de angiogênese pela amizade.
Ao pesquisador Dr. Carlos Malamut pela colaboração e suporte durante os experimentos realizados no CDTN para obtenção de imagens de microPET.
Ao CNPQ e a CAPES, pela concessão da bolsa de doutorado e pelo apoio financeiro para a realização desta pesquisa. Além da concessão da bolsa PDSE do programa do governo Ciência sem fronteiras que tornou o doutorado sanduíche possível.
“Não temas, porque eu sou contigo; não te assombres, porque eu sou o teu Deus; eu te
fortaleço, e te ajudo, e te sustento com a minha destra fiel. ” Isaias 41.10
“Uns confiam em carros, outros, em cavalos; nós, porém, nos gloriamos em nosso
RESUMO
O Fator de Ativação de Plaquetas (PAF) é um regulador endógeno da angiogênese em microambientes inflamatórios e tumorais, mas o seu papel durante a isquemia permanente é pouco conhecido. O objetivo do presente estudo foi avaliar o papel do receptor de PAF (PAFR) na revascularização espontânea de membros posteriores isquêmicos em modelo murino, bem como sob as funções de células endoteliais e de células progenitoras de endotélio (EPCs) in vitro. A isquemia de membro posterior foi
induzida pela oclusão permanente da artéria femoral (OAF) em camundongos selvagens (WT) e knockout para o PAFR (PAFR-KO). Inicialmente, observou-se aumento da expressão do mRNA do PAFR em músculos isquêmicos, 3 dias após a OAF. Além disso, a ausência de PAFR resultou em redução da perfusão sanguínea, observada por imagem de perfusão por laser Doppler. e/ou por ultrassom realçado por contraste de microbolhas. A angiogênese e a arteriogênese foram significativamente reduzidos nos animais PAFR-KO. Além disso, observou-se um aumento do número de populações de células-tronco angiogênicas, tais como c-kit+/Sca-1+ e c-kit+/VEGFR2+, na medula óssea de animais
PAFR-KO e, ao contrário, número reduzido dessas células no sangue. Observamos também redução no número de monócitos circulantes após a OAF em animais PAFR-KO, especialmente da população angiogênica CD11b+F4/80+Ly6G-Ly6C-. Além disso, foi
observado redução nos níveis de VEGF e CXCL12/SDF-1α nos músculos isquêmicos de animais PAFR-KO em comparação com animais WT. De forma interessante, a ausência do PAFR, tanto nas células doadoras quanto no indivíduo receptor de transplante celular, aboliu a melhora da perfusão sanguínea estimulada pela terapia com células mononucleares da medula óssea (BMMNC) transplantadas por via i.v.. Corroborando os dados in vivo, observamos que o bloqueio de PAFR com o antagonista PCA-4248
prejudica a migração e a formação de estruturas do tipo tubo por células endoteliais. Além disso, o bloqueio de PAFR reduz a adesão, a migração e a produção de óxido nítrico, bem como aumenta a apoptose de células progenitoras do endotélio isoladas, em cultura, a partir de células mononucleares do sangue periférico (EOCs – PBMNC-derived early
participa da promoção da revascularização espontânea de membros posteriores isquêmicos, bem como nas funções angiogênicas das células endoteliais e EPCs. PAFR parece também contribuir para o sucesso da terapia celular.
ABSTRACT
The Platelet Activating Factor (PAF) is an endogenous regulator of angiogenesis in inflammatory and tumor microenvironments, but their role during permanent ischemia is not well understood. The aim of this study was to evaluate the role of PAF receptor (PAFR) in the spontaneous revascularization of ischemic hindlimbs in mice as well as in endothelial cells and endothelial progenitor cells (EPCs) functions in vitro. The hindlimb ischemia was induced by permanent femoral artery occlusion (FAO) in wild-type (WT) and knockout mice for PAFR (PAFR-KO). Initially, we observed an increase in the PAFR mRNA expression in ischemic muscles 3 days post-FAO. The absence of PAFR expression resulted in reduction of blood perfusion in the ischemic hindlimbs of PAFR-KO animals as analysed by laser Doppler perfusion imaging and/or by contrast-enhanced ultrasound. Angiogenesis and arteriogenesis were significantly reduced in PAFR-KO animals. Besides, we observed an increased number of populations of angiogenic stem cells, such as c-kit+/Sca-1+ and c-kit+/VEGFR2+, in the bone marrow of PAFR-KO animals. In contrast, we observed a reduced number of these cells in the bloodstream. Likewise, we also observed a reduction in the number of circulating monocytes after FAO in PAFR-KO animals, especially the angiogenic population CD11b+F4/80+Ly6G-Ly6C-. Furthermore, we observed reduced levels of VEGF and CXCL12/SDF-1α in the ischemic
hindlimbs as well as in the angiogenic functions of endothelial cells and EPCs. PAFR also seems to contribute to the success of cell therapy.
