INSTITUTO DE FÍSICA DE SÃO CARLOS
JOSÉ FERNANDO RUGGIERO BACHEGA
Estrutura cristalográfica da hemoglobina gigante de Glossoscolex paulistus, um complexo de 3,6 mega Daltons
Estrutura cristalográfica da hemoglobina gigante de Glossoscolex paulistus, um complexo de 3,6 mega Daltons
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Física do Instituto de Física de São Carlos da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de concentração :Física Aplicada Opção: Física Biomolecular
Orientador: Richard Charles Garratt
Versão Corrigida
(Versão original disponível na Unidade que aloja o Programa)
Ruggiero Bachega e José Alberto Bachega, pelo
Ao Prof. Dr. Richard Charles Garratt, pela orientação, pelo vasto conhecimento compartilhado, pela amizade e pelo exemplo de ética e caráter.
Ao Prof. Dr Marcel Tabak, pela coorientação e amizade, sem as quais esse trabalho jamais poderia ter sido realizado.
Ao prof. Dr Eduardo Rebordero Horjales, pela amizade, trabalho em conjunto e conhecimento compartilhado.
Ao prof. Dr. Otavio Thiemann, pela ajuda e aconselhamento.
Ao meu amigo e colaborador Fernando Vasconcelos Maluf, cujas as habilidades e energias somadas a esse projeto resultaram em enormes avanços, dos quais muito me orgulho.
À Dra. Ana Cristina Puhl pelo companheirismo, paciência, carinho e amizade.
À Dra. Sandra Martha Gomes Dias e ao Dr. Marcelo Falsarella Carazzolle, que foram os grandes responsáveis pelo sequenciamento da HbGp.
Aos colaboradores, Dr. Allen Orville e Andi Babak do BNL.
À Dra. Adriana Paes Leme, Marcel Nakahira e Francieli Colussi, pela ajuda nos experimentos de espectrometria de massas.
À Dra. Inês Maria Basso Bernardi pelas análises de ICP
Ao pessoal da secretaria de pós-graduação, pela enorme ajuda e orientação, e às funcionárias da biblioteca, Cris e Neusa, pela grande ajuda na correção deste trabalho.
Aos técnicos e funcionários do CBME em especial a Dra Susana Andréa e o Dr. Humberto Muniz, grande ajuda e amizade.
A todo o time de desenvolvedores do GTKDynamo, Dr. Martin J. Field, Dr. Troy Wymore, Lucas Assirati, Dr. Leonardo Ruggiero Bachega e Msc. Luis Fernando Saraiva.
A todos os meus amigos e companheiros de treino, em especial ao Marcos Rodrigues, o Marcão, que colaborou disponibilizando as amostras E.andrei para as etapas finais desse projeto.
“A melhor forma de ter uma boa ideia é ter muitas ideias.”
BACHEGA, J.F.R. Estrutura cristalográfica da hemoglobina gigante de Glossoscolex paulistus, um complexo de 3.6 mega Daltons. 2013. 165 p. Tese (Doutorado em Ciências) - Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2013.
Eritrocruorinas são hemoglobinas gigantes compostas por uma bicamada hexagonal de massa molecular total entre 3,0 e 4,0 MDa. A sua estrutura é baseada em unidades básicas chamadas protômeros. Doze destes compõem a partícula inteira, seis em cada camada hexagonal, resultando numa estrutura contendo 180 subunidades. Nas eritrocruorinas do tipo I, o protômero é constituido por quatro tipos de cadeias de globina: a, b, c, e d, e por três tipos de cadeias de linkers, L1, L2 e L3. A compreensão atual do seu mecanismo da ação está atualmente prejudicada pela resolução limitada das estruturas cristalográficas disponíveis. Para abordar esta questão procuramos cristalizar uma série de eritrocruorinas de espécies diversas visando a determinação das suas estruturas a mais alta resolução. Na primeira parte deste trabalho a eritrocruorina de Glossoscolex paulistus (HbGp) teve suas subunidades sequenciadas e a estrutura da partícula inteira resolvida a uma resolução de 3,2Å, a mais alta até o momento. Na estrutura da HbGp as quatro cadeias de globina se associam na forma de um heterotetrâmero, que se repete três vezes formando uma estrutura dodecamérica denominada cap. A estrutura do cap associada a um heterotrímero de linkers forma o então mencionado protômero. A estrutura completa permite uma descrição mais detalhada dos contatos entre subunidades que são essenciais para a manutençao da partícula como um todo. Além disto descrevemos sítios de ligação a metais (Zn2+ e Ca2+) e sítios de glicosilação, alguns
dois quais são inéditos. Em seguida, a subunidade d isolada da HbGp foi cristalizada e resolvida a 2.1Å. Uma análise dos contatos cristalinos demonstra um arranjo completamente diferente daquilo visto para a subunidade d no complexo inteira. Ao invés de associar-se na formar trímeros, como acontece no complexo, a cadeia d isolada forma dímeros cristalográficos, com interface similar a aquela observada entre as cadeias d e a. Estas observações contribuíram para a compreensão de como são os possíveis mecanismos de associação das globinas para a montagem do cap. Finalmente, as eritrocruorinas de quatro outras espécies foram cristalizadas, que resultou na obtenção de uma estrutura cristalográfica preliminar para a eritrocruorina de Eisenia andrei a uma resolução de 4.7Å.
BACHEGA, J.F.R. Crystallographic structure from the giant hemoglobin from Glossoscolex paulistus, a 3.6 mega dalton complex. 2013. 165 p. Tese (Doutorado em Ciências) - Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2013.
Erythrocruorins are giant haemoglobins in the form of a hexagonal bilayer of total molecular mass between 3 and 4 MDa. Their structures are based on a basic unit called the protomer. Twelve of these comprise the entire particle, six in each hexagonal layer, resulting in a structure containing 180 subunits. In the type I erythrocruorins the protomer is composed of four types of globin chains: a, b, c e d, and three types of linker; L1, L2 e L3. Our current understanding of their mechanism of action is limited by the resolution of the crystal structures available. To address this question we have attempted to crystallize a series of erythrocruorins from different species with a view to determining a crystal structure at higher resolution. In the first part of this thesis all chains of the erythrocruorin from Glossoscolex
paulistus were completely sequenced and the structure of the full particle solved at 3.2Å, the highest reported to date. In the structure the four globin chains associate to form a hetero-tetramer, three of which unite to form a dodecameric cap. The latter associates with a heterotrimer of linkers to form the aforementioned protomer. The full structure permits a more detailed description of the contacts between subunits which are essential for particle stability. Furthermore, we describe metal binding sites (Zn2+ e Ca2+) and glycosylation sites,
some of which are have not been reported previously. Subsequently the isolated d chain was crystallized and solved to 2.1Å. An analysis of the crystal contacts shows an arrangement which is completely different to that seen in the full particle. Instead of forming trimers, as seen in the complex, the isolated d chain associates to form a dimer across a crystallographic twofold axis making use of the interface normally used to associate with subunit a. These observations contributed to our understanding of the possible mechanisms of association of globin chains during the formation of the cap. Finally, the erythrocruorins from four other species were crystallized, which resulted in the preliminary determination of the structure of that from Eisenia andrei at 4.7Å.
Figura 1.1.1 - Os pioneiros da cristalografia de proteínas: (a) John Cowdery Kendrew e (b) Max Ferdinand Perutz. (c) Primeiro modelo da estrutura da subunidade beta da hemoglobina de cavalo (2dhb), apresento por Perutz. Letras são atribuída a cada uma das 8 hélices do modelo, consolidando uma notação estrutural específica para globinas. ...32 Figura 1.2.1.-.Estrutura do grupo heme. O átomo de ferro é coordenado por 4 grupos
pirrolínicos...33 Figura 1.2.2 - As diferentes classes de globinas. (a) globina (2dhb subunidade A), (b)
globinas-sensor acoplada (2W31 – apenas o domínio globina está disponível) (c) globinas truncadas (1IDR) e (d) Flavo hemoglobina (4GLV). ...34 Figura 1.2.3 - Estrutura de um globina (em representação Chainbow) contendo todas a 8
hélices descritas por Perutz, sítio de ligação do heme, que usualmente é um ambiente químico hidrofóbico, salvo pela presença das histidinas, proximal e distal...35 Figura 1.2.4 - (a), sobreposição da cadeia alfa da Hb humana com a globina de L.luteus.
(b) um dendrograma demostrando a divergência evolutiva entre as globinas mostradas no alinhamento (c) contendo espécies diversificadas. ...37 Figura 1.3.1 - (a) Comparação entre o comportamento da hemoglobina e mioglobina
humana. (b) Alterações no espectro de Uv-vis da Hb humana e virtude da entrada e saída do oxigênio. A transição da forma oxi para a forma deoxi é acompanhada de alterações no perfil das bandas Q...38 Figura 1.3.2 - Conformação dos grupos hemes na forma oxi(a) a deoxi(b). Note que
existe um deslocamento do íon ferroso para fora do plano do anel com a saída do oxigênio (transição d forma oxi para deoxi). Na hemoglobina humana, as perturbações estruturais desses processo estendem-se para a estrutura terciária, com a reorientação da hélice F (c), até ao arranjo quaternário (d) resultando em uma rotação relativa entre os dímeros alfa-beta, como foi determinado por Perutz nos trabalhos pioneiras sobre estruturas de hemoglobinas...40 Figura 1.5.1 - (a) As duas teorias sobre a origem das hemoglobinas extracelulares em
anelídeos. (b) Estrutura da HbLs. de Oligobrachia mashikoi. O complexo é formado por 24 subunidade de globinas. ...44 Figura 1.5.2 - Uma comparação dos modelos gerados por microscopia eletrônica das
Hbs/Eritrocruorinas. Unidade da HbLt (a) e (b), com simetria D6 (ou 622), contendo 12 protômeros. Ao todo são 144 cadeias de globinas e 36 cadeias tipo linkers. O protômero (c) por sua vez é composto por 4 diferentes tipos de globinas que primeiramente formam um heterotetrâmero abcd, e em seguida são associadas em uma estrutura dodecamérica (d) - cap ([abc]3[d]3). O cap por sua vez, está associado a um heterotrímero de
linkers...48 Figura 1.6.2 - Visão geral da estrutura dos linkers. A cadeia é constituída de 4 domínios,
(1) Hélice 1, (2) hélice 2, (3) LDL-A e (4) β-barril. O domínio LDL-A possui um sítio de ligação de Ca2+, assim como para o receptor de LDL
humano, onde o Ca2+ é hexacoordenado...49
Figura 1.7.1 - Foto de um dos indivíduos coletados durante o período de 2010 e 2011. O Glossosocolex paulistus se destaca pelo seu tamanho incomum...52 Figura.1.7.2 - (a) Perionyx excavatus, também conhecida como violeta do Himalaia,
(b) Eudrilus eugeniae - gigante africana, (c) Eisenia andrei – vermelha da Califórnia, é a que atinge o menor tamanho entre as espécies utilizadas neste trabalho.(d) Rhinodrilus alatus – minhocuçu, espécie nativa do vale do Paraopéba em Minas Gerais...54 Figura 2.3.1 - Representação do experimento de cristalização por difusão de vapor em
gotas suspensas. A gota contendo a proteína em solução apresenta igual composição ao reservatório do poço, porém, com metade da concentração, dessa forma, esta, tende a perder solvente lentamente, até que as concentrações da gota e do poço adquiram uma condição de equilíbrio...62 Figura 3.1.1 - Etapas da purificação da HbGp. (a) corte na região ventral, (b) coleta da
hemolinfa (c) centrifugação, eliminando o particulado sólido indesejável. (d) aplicação na coluna cromatográfica Superdex 200. (d) Perfil da curva obtida na separação pelo processo cromatográfico, evidenciando a saída da HbGp no volume de exclusão. (f) Gel de SDS PAGE (16%), demostrando a composição do complexo da HbGp. Sete tipos básicos de cadeias de proteínas fazem parte do complexo. Três linkers (L1, L2 e L3) com massa de aproximadamente 25 kDa e quatro tipos de globinas, a, b, c e d, com massas entre 14 e 20 kDa...69 Figura 3.1.2 - Espectros de absorção da HbGp na forma oxi (vermelho) e na forma
ciano (azul). O processo de oxidação de Fe2+ para Fe3+ é acompanhado
oligoquetas. Observa-se que as sequências da HbGp apresentam um padrão de resíduos similares ao das outras globinas. Isso inclui a conservação dos resíduos de cisteína, responsáveis pelas ligações dissulfeto entre subunidades (posições 3, 4, 129 e 134) presentes na HbGp. É importante mencionar que as sequências da HbEa e HbPe estão disponíveis apenas de forma parcial. A figura mostra também as regiões em conformação de hélice...74 Figura 3.2.2 - Alinhamento geral dos linkers obtidos para a HbGp e outros anelídeos.
Observa-se que as sequências da HbGp apresentam um padrão de resíduos similares ao dos outros linkers. As posições 65 e 66 do alinhamento são marcadas pela abertura de um “gap” entre as sequências de eritrocruorinas do tipo I (não eclipsadas). Lmarinho corresponde as sequências de linkers de espécies marinhas, A.marina (HbAm) e A.pompojana (HbAp)...77 Figura.3.3.1.-.Cristais da ciano-HbGp obtidos em duas diferentes condições de
cristalização (escala em μm). (a) 10% PEG8000 CaCl2 50mM Tris/HCl pH7,5, frágeis e (b) que apresentam uma vida útil muito curta (imagem coletada 5 dias após ao aparecimento dos cristais). (c) Cristais obtidos na condição 1,4M Tris/HCl 0,1M pH 8,0. (d) Mono cristal obtido na otimização da condição de cristalização (1,2M citrato de sódio 2,5mN CaCl2 50mM Tris/HCl pH7,5). ...80 Figura 3.4.1.-.Imagem do padrão de difração referente ao cristal da ciano-HbGp. Foram
coletadas 220 imagens com uma oscilação de 0,5o. Cada imagem
apresentou aproximadamente 13.800 reflexões e uma mosaicidade estimada de 0,55o. A predição de cela atribuída ao sistema cristalino
ortorrômbico esta em boa concordância com as reflexões no padrão de difração, onde predominam reflexões parciais. A intensidade das reflexões sofre uma queda súbita, entre as regiões de 7 a 5Å no padrão de difração. Esses danos causados a rede são fruto do elevado teor de solvente (estimado em ~74%) que esses cristais possuem, maximizando os danos causados pelo resfriamento...82 Figura.3.5.1.-.A unidade assimétrica é composta por três protômeros, cada um deles é
os elementos de estrutura secundária assumidos na HbGp. (b) Omit map calculado para a região das globinas, confirmando a presença do heme/ferro na região. (c) Omit map na região dos linker L3, correspondente a um sítio de ligação de cálcio (nível de contorno em 2 sigma)...86
Figura 3.5.3 - Evolução do mapa de densidade eletrônica. A figura mostra a densidade mostra o mapa 2Fo – Fc, calculado em 1,5σ para a região do TRP132 da cadeia A. (a) mapa do modelo inicial e (b) mapa calculado para o modelo final, após o processo de refinamento...87 Figura.3.5.4.-.Diagrama de Ramachandran para a estrutura da ciano-HbGp (1.01% de
resíduos fora da região permitida)...88 Figura.3.5.5.-.Mapas calculados para algumas regiões das subunidades tipo a, ainda
com a sequencia da isoforma a1 (estruturas em cinza), evidenciando que a sequência de a2 (estruturas em azul) melhor concorda com a densidades eletrônica. (2Fo-Fc – mapa cinza – sigma = 1.0 e Fo-Fc em verde – sigma = 3 / vermelho – sigma = -3)...89 Figura 3.5.6 - Mapa de densidade eletrônica (2Fo-Fc) calculado para a região da globina
a. Detalhes importantes podem ser observados como: (a), grupo heme, (b) ligações dissulfeto intramoleculares, (c) ligações dissulfeto intermoleculares. (d) Modificação no espectro de absorção após a exposição ao raio X, a amostra inicia-se como um típico espectro da forma
cianometa, evoluindo para a uma configuração semelhante a da forma reduzida oxi-HbGp. ...90 Figura.3.5.7.-.A alta qualidade dos mapas de densidade eletrônica resultaram na
determinação de novos grupos químicos ligados ao Linker L3: (a) Íon Zn2+ coordenado internamente no domínio LDL-A (sítio de zinco 1). (b) Íon Zn2+ coordenado na interface entre linker L3 e linker L2 do protômero adjacente (sítio de zinco 2), (c) Glicosilação – NAG; e (d) Íon de cálcio ligado ao domínio LDL-A...91 Figura.3.5.8.-.Densidades eletrônicas do modelo cristalográfico da HbGp onde não
foram atribuídos espelhadores. (a) região equivalente ao sítio de Zn2+ encontrado na subunidade L2 da estrutura da HbLt. A presença dos resíduos de arginina é conflitante com a coordenação de um cátion metálico nessa posição. (b) Região do β-barril das subunidades L3. (c) Interface entre o domínio LDL-A e o β-barril das subunidades L3. (d) Interface entre os domínios LDL-A das subunidades L1 e L2 do mesmo protômero...92 Figura.3.6.1.-.Partícula inteira da HbGp (simetria 622), com um diâmetro de
são 144 cadeias de globinas e 36 estruturas tipo linkers. Os protômeros são constituídos por um dodecâmero de globinas (cap) e um heterotrímero de linkers (L1, L2 e L3). As cores utilizadas para diferenciar os tipos de subunidades que compõem o complexo da HbGp foram adotadas como padrão neste trabalho...94 Figura 3.6.3 - Sobreposição das globinas da HbGp (em cores), com suas homólogas
equivalentes da HbLt (em cinza). Logo abaixo estão representados os fatores de temperatura. As cores “quentes”, como amarelo, laranja e vermelho, representam as regiões de maior desordem...95 Figura.3.6.4.-.Primeira esfera de resíduos ao redor do sexto sítio de coordenação do
grupo heme. (a) globinas tipo a, (b) globinas tipo b, (c) globinas tipo c e (d) globinas tipo d. Existe uma predominância de resíduos hidrofóbicos...96 Figura.3.6.5.-.Os dímeros formados a/d e b/c, possuem uma interface de contato
conservada. Tal interface é conhecida para outras estruturas de hemoglobinas, como mencionado anteriormente89. Área total entre
a/d(HbGp) = 910,5Å2 e área total entre b/c (HbLt) = 1146,9Å2...97
Figura.3.6.6.-.Formação do heterotetrâmero. Para a formação desta estrutura, cada dímero contribui com um sulco, formado pelas hélices B e G, e uma protuberância, formada pela hélice A. Os resíduos de cisteína presentes nos loops que conectam as hélices G e H das subunidades tipo a e b, formam uma ligação dissulfeto conectando os dois dímeros...98 Figura 3.6.7 - Hierarquia de associação das subunidades de globinas pra a formação do
cap. As quatro subunidades básicas se associam inicialmente nos dímeros
a/d e b/c, que posteriormente formam os heterotetrâmero abcd, onde a primeira ligação dissulfeto é formada. Três heterotetrâmeros se associam formando a estrutura do cap, onde a segunda ligação dissulfeto é formada...99 Figura.3.6.8.-.Comparação entre as estruturas dos caps da HbGp, HbLt, HbLRp e
HbLOm. Apesar da baixa identidade sequencial na comparação entre as sequências que formam esses sistemas, a estrutura quartenária é altamente conservada. As HbL apresentam sítios de ligação de metais que não são
conservados para os caps das eritrocruorinas de oligoquetas...101 Figura 3.6.9.-.Uma sobreposição dos pares de subunidades linkers da HbGp (cores) e
HbLt (cinza). As estruturas revelam que as porções N-terminais apresentam as maiores divergências na sobreposição. Os domínios LDL-A e β-barril apresentam enovelamentos muito conservados, com as ligações dissulfeto e sítios de ligação de Ca2+ estruturalmente equivalentes. ...103
zinco 1, interno ao domínio LDL-A e (b) sítio de zinco 2, interfacial entre a subunidade L2 e L3. (c) glicosilação e (d) sítio ativo da enzima Cu/ZnSOD humana. Os sítios de zinco encontrados na HbGp não são equivalentes/similares ao da enzima Cu/ZnSOD...105 Figura.3.6.12.-.Formação do hetrotrímero de linkers, (a) associação das subunidades L1,
L2 e L3. (b) Os principais contatos entre as subunidades que formam o heterotrímero acontecem na região do coiled-coil. Não há um padrão claro de β-ramificações e/ou resíduos não ramificados nas posições “a” e “d”, o que é consistente com a formação de um coiled-coil trimérico...107 Figura.3.6.13.-.Sítios de interação entre as porções globulares dos linkers no
heterotrímero. Os sítios de interação ocorrem através dos mesmos domínios, mas não há conservação dos resíduos envolvidos. Esses fracos contatos sugerem que a porção coiled-coil é a que de fato atua mantendo as subunidades dos linkers unidos...108 Figura.3.6.14.-.O protômero é uma associação da estrutura dodecamérica de globinas
(cap) com o heterotrímero de linkers. Na junção dessas duas estruturas oligoméricas forma-se uma grande cavidade com volume de 39.207 Å3, o
que equivale ao volume de duas subunidades de globina...109 Figura.3.6.15.-.Sítios de interação entre as porções globulares dos linkers no
heterotrímero. Os sítios de interação ocorrem através dos mesmos domínios mas não há conservação dos resíduos envolvidos nesta região. A interação entre o domínio LDL de cade linker com a subunidade tipo b
ocorre via a ponte salina formada entre os resíduos Arg34 da subunidade b
com os resíduos Asp 88-L1/ 95-L2 / 85-L3 das subunidades linkers...111 Figura.3.6.16.-.Os cinco grupos de canais de acesso a grande cavidade central formada
pela interação entre a estrutura do cap e o heterotrímero de linkers. (a) canais de acesso formados na estrutura do cap (grupos 1 e 2). (b) canais de acesso formados no heterotrímero de linkers (grupos 3 e 4). (c) canais de acesso formados pela interação entre a estrutura do cap e o heterotrímero de linkers, grupo 5...113 Figura.3.6.17.-.Interações entre protômeros de uma mesma camada hexagonal. (a)
Estrutura da monocamada hexagonal onde metade dos caps foram removidos, expondo a porção globular dos linkers de cada protômero. (b) Interação entre protômeros vizinhos envolvendo a porção globular dos
melhor visualização, parte das estruturas dos caps foram removidas. (a) visão frontal (b) visão lateral. (c) Interações entre os protômeros parcialmente sobrepostos, que ocorrem através do domínio β-barril das subunidades L1 e (d) através das porções coiled-coil da subunidades L2 e L3. (e) Interação entre um protômero com o protômero adjacente ao sobreposto da outra camada hexagonal. Este contato ocorre através dos resíduos Thr12, Gln17 e Asn16, presentes no primeiro domínio das subunidades L1. ...117 Figura.4.1.1.-.Resultados da purificação da subunidade d da HbGp (d-HbGp). (a) Gel
filtração, com destaque para o pico coletado entre 70-85 mL que contém a
d-HbGp. (b) SDS PAGE, 1 – marcador de massa molecular, 2 – HbGp na forma íntegra e 3 –Fração coletada entre os volumes 70 e 85 de gel filtração contendo a d-HbGp. (c) Análise espectroscópica da d-HbGp isolada, as bandas Q evidenciam que a forma reduzida (oxi) é a que predomina na amostra...119 Figura 4.2.1.- Cristais obtidos para a d-HbGp na condição 1,4 citrato de sódio, Tris/HCl
pH7,5, com dimensões próximas a 0.5μm...120 Figura.4.3.1.- Imagem de difração do cristal da d-HbGp com resolução de 2.1 Å na
borda, 0,4o de oscilação e mosaicidade inicial estimada de 0.64o. A imagem
apresenta alguns pontos incoerentes com a predição, resultados da presença de um cristal satélite (pequeno cristal, ou fragmento de, anexado ao cristal que está sendo coletado) mas que não comprometeu a qualidade dos dados obtidos. ...121 Figura 4.4.1 - Algumas das posições importantes nos mapas de densidade (cinza –
2Fo-Fc e δ = 1.0, vermelho – Fo-2Fo-Fc e δ = -3.0, verde –Fo-2Fo-Fc e δ = 3.0) comprovando que a sequencia d1 melhor descreve o modelo. As fases dos mapas em questão foram calculadas com a sequencia d2...123 Figura 4.4.2 - Principais parâmetros que validam a qualidade do modelo final obtido. (a)
diagrama de Ramachandran, onde nenhum resíduo encontra-se fora das regiões permitidas, e (b) Uma comparação dos valores obtidos ao final do refinamento com outras estruturas depositadas no banco de dados PDB. Os valores em cor vermelha referem-se ao mínimo é máximo encontrado para o dado parâmetro (considerando a faixa de resolução em questão). A estrutura da d-HbGp apresenta valores dentro dos considerados aceitáveis em todos os aspectos em questão...124 Figura 4.4.3 - Mapa de densidade eletrônica calculado (2Fo - Fc) para o modelo da
da d-HbGp. (a) ao longo do eixo a, (b) ao longo de eixo b, formando o dímero d/d, que é equivalente ao dímero a/d na estrutura da HbGp e (c) ao longo do eixo c, que resulta no rearranjo dos loops que conectam as hélices A e B, e G e H. ...127 Figura.4.5.2.-.Sobreposição da d-HbGp com a subunidade d presente na unidade
biológica. (a) Existe grande coerência na sobreposição dessas duas estruturas com uma pequena diferença para a posição do resíduo Trp 32, que para a forma oxi da d-HbGp sofre um pequeno deslocamento. (b) Orientação do plano do anel imidazólico do resíduo de His94 em relação ao plano do grupo heme comparado com a Hb humana em (c)...129 Figura 4.5.3 -.O Mecanismo mostra as interfaces em que a subunidade d esta envolvida.
Na estrutura do cap, o trímero dx3 faz contatos através das hélices B e G.
Quando a subunidade d é isolada, seus frágeis contatos se desfazem, prevalecendo em solução a forma monomérica. Com o aumento da concentração, a d-HbGp se associa formando um dímero, que interage através das hélices E e F (incluindo o grupo heme). Essa interface é equivalente ao dímero a/d encontrado na estrutura do cap...130 Figura.5.1.1.-.(a) Análise de SDS PAGE das frações purificadas contendo as
hemoglobinas, HbPe, HbEe, HbEa e HbRa. A HbEa é a que apresenta um padrão de massa que mais diverge das outras Hbs purificadas neste trabalho. (b) Resultado da análise por UAC, a amostra de HbEa apresentam dois picos em S=10 ( referentes ao cap isolado) e S~65, que equivale ao coeficiente de sedimentação da partícula inteira...132 Figura 5.2.1 - Cristais obtidos para as eritrocruorinas de 4 novas espécies. (a) Os cristais
da HbRa, obtidos em 10% PEG8000 e 50mM Tris/HCl pH7,0. (b) Os cristais de HbEe, obtidos na condição 20 % MPD Tris/HCl pH7,0. (c) Os cristais de HbEa obtidos em sulfato de amônio 1,4 M, cacodilato pH 6,5. (d) Cristais de HbEa, obtidos em PEG 3350 10% cacodilato pH 7,0. ...134 Figura 5.3.1 - Imagens dos padrões de difração coletados e estatística do processamento
(Rmerge e Intensidade) por faixa de resolução para (a) HbPe, onde é possível ver a orientação do eixo maior, c=608,17Å, que é caracterizado pela proximidade dos spots. (b) HbEa...135 Figura 5.4.1 - A unidade assimétrica é composta por quatro protômeros, cada um deles
sigma = 1,5) para a HbEa (4,7Å) e ciano-HbGp (3,2Å). (a) região do coiled-coil. (b) domínio β-barril da subunidade L1 e (c) Região do sítio de ligação da globina tipo d.....138 Figura 5.4.3 - Mapa de densidade eletrônica (2Fo-Fc – sigma = 1,5) calculados para o
Tabela.3.2.1.-.Comparação das propriedades físico-químicas preditas paras as sequências da HbGp e as da HbLt. Os valores preditos pra a HbLt são mostrados entre parênteses. Nota-se que as isoformas d2 e L1b apresentam as propriedades preditas mais divergentes em relação aos grupos as quais pertencem. As sequências de peptídeos sinais são caracterizadas pela alta concentração de resíduos hidrofóbicos, o símbolo “.” é usado para designar a posição de clivagem predita pelo servidor signalP4.1...73 Tabela.3.2.2.-.Uma comparação da identidade entre as sequências homólogas de
globinas pra as eritrocruorinas HbGp, HbLt, HbEa e HbPe. O simbolo * significa que a sequencia em questão esta incompleta...74 Tabela.3.2.3.-.Uma comparação entre as identidades das sequências homólogas de
linkers pra as eritrocruorinas HbGp, HbLt e HbEa. Não existe sequências disponíveis referentes aos linkers da HbPe...79 Tabela 3.4.1.-.Principais resultados obtidos nos procedimentos de indexação, integração
e processamento dos dados. Os valores entre parênteses referem-se a última faixa de resolução (3.2 Å)...84 Tabela.3.5.1.-.Simétricos relacionados. O modelo da HbGp possui uma unidade
assimétrica com 45 subunidades. As letras na tabela correspondem a nomenclatura das cadeias no arquivo PDB. ...88 Tabela 3.5.2 - Estatísticas do refinamento e estereoquímica do modelo...89 Tabela 3.6.1.-.Mostra os valores de rmsd resultantes da sobreposição entres as
subunidades de globina. Os valores preditos para as globinas através da equação de Chothia e Lesk (mostrados entre parenteses) são maiores do que os encontrados na sobreposição das estruturas...97 Tabela.3.6.2.-.Mostra os valores de rmsd resultantes da sobreposição entres as
subunidades linkers. Valores com * indicam que não foi considerada a porção do coiled-coil para a sobreposição e cálculo do rmsd...107 Tabela 4.3.1 - Principais resultados obtidos nos procedimentos de indexação, integração
e processamento dos dados. Os valores entre parênteses referem-se a última faixa de resolução...123 Tabela 4.4.1 - Estatísticas do refinamento e geometria do modelo...125 Tabela 5.1.1 - Massas obtidas por UAC para as hemoglobinas gigantes utilizadas neste
e processamento dos dados. Os valores entre parênteses referem-se a última faixa de resolução...137 Tabela 5.4.1 - Valores obtidos de LLG e R para cada etapa do processo de atribuição
Hb - Hemoglobina Mb – Mioglobina
2,3-DPG - 2,3-difosfoglicerato GSC - globinas-sensor acopladas FHbs – flavohemoglobinas
LDL-A - Low-density lipoprotein receptor domain class A
SDS-PAGE - sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
ICP-AES - Inductively Coupled Plasma -Atomic Emission Spectrometry
HbGp - Hemoglobina de Glossoscolex paulistus
d-HbGp - Subunidade d isolada da HbGp HbEa - Hemoglobina de Eisenia andrei. HbPe - Hemoglobina de Perionyx excavatus
HbRa - Hemoglobina de Rhinodrilus alatus
HbLt - Hemoglobina de Lumbricus terrestris
Hbp - hemoglobinas “pesadas” - eritrocruorinas de vestimentíferos com ~3,6MDa
1 INTRODUÇÃO
1.1 Proteínas e a biologia estrutural.
Em 1953, Max F. Perutz mostrou que o problema das fases em cristalografia de proteínas poderiam ser resolvido comparando-se os dados obtidos na presença e na ausência de átomos pesados na rede cristalina (método conhecido como substituição isomórfica múltipla)1. Em março de 1958 John Kendrew e colaboradores reportaram a estrutura
cristalográfica da mioglobina (Mb) de baleia cachalote2,3(sperm whale - Physeter
macrocephalus - códico de acesso: 1MBO) com a modesta resolução de 6Å. Apesar disso foi possível pela primeira vez “enxergar” a estrutura tridimensional de uma proteína. Detalhes sobre o enovelamento permitiram responder várias questões propostas pela comunidade científica da época, como por exemplo a existência do modelo de estrutura secundária do tipo alfa hélice, proposta pelo químico norte americano Linus Pauling. Em 1959, Perutz reportou a estrutura da hemoglobina (Hb) de equinos4,5 (Equus caballus - código de acesso: 2DHB).
Essa estrutura era ainda mais desafiadora do que a reportada anteriormente por Kendrew, uma vez que se trata de um tetrâmero. Perutz foi ainda mais longe, determinando as estruturas cristalográficas Hb na forma oxi-Hb, ligada a oxigênio e na forma deoxi-Hb6, não ligada a
1.2 Globinas
As globinas constituem uma das famílias de proteínas mais estudadas. Essas proteínas incorporam um enovelamento característico (globin folding) bastante conservado. Devido a grande e variada quantidade de sequências que apresentam o mesmo enovelamento característico, globinas são um bom exemplo de que a estrutura terciária é uma propriedade mais conservada do que a identidade sequencial. Seu enovelamento consiste basicamente em um arranjo de seis/oito α-hélices, formando uma estrutura do tipo sanduíche α-hélice 3/3 (lê-se três sobre três). Um subgrupo especial de globinas, conhecidas com globinas truncadas, apresentam deleções em algumas regiões da estrutura e resultam em um enovelamento diferente, do tipo sanduíche α-hélice 2/27. As globinas apresentam uma cor vermelha
característica, devido à presença do grupo prostético heme (figura 1.2.1). São encontradas em
todos os reinos conhecidos8, desempenhando funções diversificadas de acordo com o
organismo em questão. O conceito mais aceito é que as globinas evoluíram de um ancestral comum em torno de 3,5 bilhões de anos atrás9,10, dividindo-se em três subgrupos básicos
(figura 1.2.2): globinas de um único domínio (incluem hemoglobinas, mioglobinas e globinas
truncadas), flavohemoglobinas (FHbs) e globinas-sensor acopladas (GSC). Bactérias possuem todos os três tipos de globinas, enquanto archea não dispõem de flavohemoglobinas, e por fim, eucariotos não dispõem de globinas-sensor acopladas11.
Globinas contendo um único domínio, são majoritariamente conhecidas por desempenharem o papel de carreadoras de oxigênio (embora algumas também atuem em outras vias, como no metabolismo do óxido nítrico - NO). Em leguminosas, são encontradas subclasses de globinas denominadas leghemoglobinas12. São responsáveis por armazenar o
oxigênio que será posteriormente utilizado pela maquinaria simbiótica de fixação de nitrogênio. Apesar dessas globinas apresentarem em média somente 20% de identidade quando comparadas à suas homólogas nos vertebrados, estas compartilham um enovelamento muito similar. Foi reportado também a existência de globinas não simbióticas em raízes, caules e sementes germinadas de muitas outras plantas, mostrando que essas proteínas também estendem-se amplamente no reino vegetal14,15. Globinas truncadas por sua vez,
desempenham um papel diferente no meio biológico, como no caso do patógeno
Mycobacterium tuberculosis (trHbN), onde estão associadas a patogenicidade desse organismo e atua como NO-dioxigenase, metabolizando óxido nítrico gerado pelos macrófagos16. As proteínas do subgrupo das FHbs são compostas de dois domínios, que
podem fazer parte ou não de uma mesma cadeia. O primeiro domínio é o do tipo globina, e no caso de proteínas que apresentam os dois domínios em uma mesma cadeia, este encontra-se na porção N-terminal. O segundo domínio pertence à família das proteínas ferrodoxína NADP- redutases (FNR), cujo enovelamento não tem relação com o apresentado pelas globinas. As FHbs com domínios fusionados possuem um tamanho médio de 400 aminoácidos. As FHbs atuam como potentes dioxigenases no metabolismo do óxido nítrico, com atividade vinte vezes maior do que a desempenhada pela Mb dos vertebrados para essa função17,18.
O subgrupo das GSC abrange globinas fusionadas a outros domínios, o que resultam em tamanhos variados (300 a 700 resíduos de aminoácidos). A região N-terminal apresenta o enovelamento característico de globinas (semelhante a Mb) e a região C-terminal apresenta um domínio homólogo ao domínio sinalizador citoplasmático de quimiorreceptores bacterianos. Sua possível função seria ligar-se ao oxigênio diatômico ou outros ligantes gasosos e transmitir o sinal através de um domínio sinalizador. Esse grupo de proteínas foi reportado recentemente e sua caracterização estrutural é ainda escassa. O banco de dados, PDB, conta com apenas uma única estrutura depositada, e esta, refere-se apenas ao domínio globina da globina-sensor acoplada de Geobacter sulfurreducens19.
Com a resolução da estrutura cristalográfica da Mb e logo em seguida, da Hb, Perutz propôs uma notação específica para o enovelamento característico de globinas. A estrutura é composta de oito hélices em um arranjo do tipo 3/3, que forma uma cavidade hidrofóbica onde o grupo heme se encaixa. As hélices são denotadas em A, B, C (onde C é uma hélice do
tipo 310), D, E, F (em mamíferos essa hélice é fragmentada em duas hélices consecutivas, F', e
F), G e H. Várias globinas não apresentam a pequena hélice D. A vizinhança do grupo heme é comumente constituída de resíduos hidrofóbicos, com exceção de duas histidinas, a distal (E7, sétimo resíduo da hélice E) e a proximal (F8, oitavo resíduo da hélice F), como mostra a figura 1.2.3.
A figura 1.2.4 mostra um alinhamento envolvendo diferentes globinas e a divergência evolutiva entre elas. As cadeias alfa e beta da Hb humana partilham entre si, 42% de identidade. Quando comparadas com a sequência paróloga (homólogos dentro de um mesmo organismo) da Mb humana, as cadeias alfa e beta da Hb partilham somente 25% de identidade. A diferença torna-se ainda mais crítica a medida que sequências homólogas de espécies mais distantes evolutivamente são comparadas. A princípio, esperaríamos que estruturas de sequências mais conservadas entre si, fossem também conservadas, e que estas iriam se diferenciando conforme a diferenciação das sequências. Apesar de sequências pouco conservadas, as globinas partilham de enovelamentos muito próximos. A subunidade alfa da Hb humana por exemplo, partilha apenas 16,6% de identidade com a homóloga do vegetal
Lupinus luteus, no entanto quando as estruturas dessas duas proteínas são sobrepostas espacialmente, mostram um enovelamento altamente conservado (rmsd = 3.4Å).
Então, como sequências tão pouco conservadas podem resultar em enovelamentos tão próximos? A resposta à essa pergunta esta na própria maneira como ocorre o enovelamento de globinas. Estruturas de proteínas são estabilizadas pelo empacotamento de resíduos no seu interior (sendo estes majoritariamente hidrofóbicos). No caso das globinas, grande parte dos resíduos no interior da estrutura estão nas interfaces entre as hélices. Dessa forma cinco empacotamentos entre hélices comumente ocorrem: A/H, B/E, B/G, F/H e G/H, porém outros contatos menos gerais podem ocorrer. Dessa forma, globinas de domínio único do tipo 3/3, apresentam um padrão conservado para as interfaces entre hélices, que ocorre de acordo com o modelo denominado “cristas em sulcos” (do inglês: ridges-into-grooves), Empacotamentos de hélices em proteínas globulares geralmente obedecem a esse modelo20.
1.3 Hemoglobinas e mioglobinas
Sem dúvida alguma, os membros mais proeminentes da família das globinas são a mioglobina (Mb) e a hemoglobina (Hb). Ambas apresentam como papel principal, ligar-se ao oxigênio de forma reversível, atuando como proteínas carreadoras. Apesar de partilharem de funções e características semelhantes, o comportamento bioquímico de cada uma é singular. A mioglobina, é uma proteína monomérica, conténdo aproximadamente 150 resíduos de aminácidos (massa em torno de 16 kDa) e é uma das proteínas mais abundantes nos tecidos musculares, o que confere a este, uma cor vermelha intensa. Nos mamíferos, ela armazena oxigênio nos tecidos, que posteriormente será utilizado no metabolismo aeróbico das células. Mamíferos que vivem em grande/total contato com ambientes aquáticos possuem mioglobinas em altas concentrações em seus tecidos musculares, retendo oxigênio por grandes períodos durante o mergulho. A Mb não é uma enzima, mas se encaixa perfeitamente no comportamento cinético descrito por Michaelis–Menten21. A hemoglobina por sua vez, possui
a função de transportar o oxigênio coletado do meio externo, dessa forma facilitando o processo de difusão, permitindo que o oxigênio supra a demanda exigida pelos tecidos do organismo. As Hbs são encontradas em diversos estados oligoméricos quando observamos gama ampla de organismos que as possui. Nos vertebrados inferiores, como lampreias por exemplo, a hemoglobina ligada ao oxigênio é encontrada na forma monomérica e torna-se dimérica com a liberação do mesmo22. Por outro lado, em vertebrados superiores, as
hemoglobinas são simétricas. Nos seres humanos adultos, a hemoglobina é uma estrutura tetramérica, intracelular, composta por duas subunidades do tipo alfa e duas do tipo beta. Essas subunidades são globinas com enovelamento muito similar ao da Mb, porém estão associadas de tal forma que seu comportamento frente a disponibilidade de oxigênio não obedece o modelo proposto por Michaelis–Menten mas apresentam um efeito de cooperatividade entre suas subunidades23, de forma que, quando uma das quatro cadeias de
globina liga-se à uma molécula de oxigênio, as mudanças conformacionais resultantes dessa interação influenciam na afinidade pelo ligante das cadeias restantes. A reciproca é verdadeira, de forma que a desocupação de um dos sítios facilita a desocupação dos demais. Isso permite que a hemoglobina apresente alta afinidade por oxigênio nos pulmões, onde há um excesso do ligante (pressão parcial de pO2 = 100 torrs), e baixa afinidade nos tecidos,
onde há uma baixa concentração de oxigênio livre (pressão parcial de pO2 = 20 torrs). Uma
forma ligada, ou oxi-Hb apresenta uma conformação designada como “relaxada” (R), ao mesmo tempo que a forma desligada, ou deoxi-Hb apresenta uma conformação denominada de “tensionada” (T).
Quando purificada, a Hb humana apresenta uma afinidade por oxigênio muito maior do que no interior das hemácias, essa diferença dramática se deve a presença do 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG). Esse composto, muito aniônico, está presente nas hemácias em concentração equivalente a de hemoglobinas (~2 mM). Sem o 2,3-DPG a Hb torna-se um transportador menos eficiente, liberando somente 8 % de sua carga nos tecidos. Isso acontece porque o 2,3-DPG se liga em um bolsão formado apenas na conformação T24. Assim, quando
ligado a Hb, o 2,3-DPG estabiliza a forma T, reduzindo de forma eficaz a afinidade pelo oxigênio. As Hbs são sensíveis a variação do pH, sendo esse efeito conhecido por: efeito Bohr. Em 1904, Christian Bohr demonstrou que a diminuição do pH de 7,4 para 7,2, diminui a afinidade da Hb humana pelo oxigênio. Dessa forma nos pulmões, onde o pH é 7,4, a Hb fica saturada e a medida que migra para os tecidos musculares em atividade, encontra um ambiente químico com pH em torno de 7,2. Essa pequena variação é capaz de alterar sensivelmente a capacidade de liberação do oxigênio de 66% para 77%. A entrada e saída do oxigênio causa alterações estruturais importantes nas globinas. Em condições normais, o íon de ferro ligado ao grupo heme está no estado ferroso (Fe2+). Este íon de ferro pode formar
duas ligações adicionais, uma em cada lado do plano do heme. Esses sítios são chamados de
Figura 1.3.1 - (a) Comparação entre o comportamento da hemoglobina e mioglobina humana. (b) Alterações no espectro de Uv-vis da Hb humana e virtude da entrada e saída do oxigênio. A transição da forma
quinto e sexto sítios de coordenação. O quinto sítio é ocupado pela cadeia lateral da histidina presente na hélice F (histidina proximal). Na forma deoxi, o sexto sítio permanece desocupado, deslocando o íon ferroso aproximadamente 4o para fora do plano da porfirina.
Isso acontece, pois o ferro nesta forma é um pouco maior do que a cavidade do centro do anel. A ligação de uma molécula de oxigênio ao sexto sítio de coordenação leva a um rearranjo dos elétrons do ferro, de modo que o íon torna-se efetivamente menor, permitindo mover-se para o plano do anel. As alterações na estrutura eletrônica são visíveis através de espectroscopia de absorção UV-vis, como mostra a figura 1.3.1 - b. O espectro de absorção das Hbs é caracterizado pela presença de uma banda intensa entre 400nm e 450nm, conhecida como banda de Soret, e outras duas bandas menos intensas, cujos máximos estão em 540nm e 580nm, denominadas bandas Q. A entrada e saída de ligantes no sexto sítio de coordenação resultam em bandas Q características de cada ligante coordenado. Na Hb humana (e de outros vertebrados), com a saída do oxigênio e deslocamento do átomo de ferro para fora do plano do anel, a histidina proximal e a hélice F, deslocam-se, alterando a orientação desta hélice. Esse efeito é peculiar das hemoglobinas, uma vez que o mesmo, não é observado na Mb humana25. Detalhes do deslocamento da hélice na Hb humana, podem ser observados na
figura 1.3.2. As mudanças estruturais devido à entrada e saída do oxigênio não estão restritas apenas a alterações locais. A transição da forma T para a forma R na Hb humana é acompanhada também de uma rotação de aproximadamente 15o entre os dímeros alfa-beta no
Figura 1.3.2 - Conformação dos grupos hemes na forma oxi(a) a deoxi(b). Note que existe um deslocamento do íon ferroso para fora do plano do anel com a saída do oxigênio (transição d forma oxi para
1.4 Hemoglobinas extracelulares de invertebrados.
Hemoglobinas de invertebrados por sua vez, variam de estruturas monoméricas até complexos gigantes com múltiplas subunidades, ocorrendo em uma diversificada variedade de meios biológicos, como por exemplo: citoplasma de tecidos específicos (músculo, nervos, gametas e etc.), células vermelhas ou livremente dissolvidas nos fluidos biológicos. Quando comparadas com as estruturas tetraméricas assumidas pelas hemoglobinas dos vertebrados, as Hbs dos invertebrados mostram uma grande variação de estruturas quartenárias e possuem uma alta variabilidade, refletindo a especialização e adaptação para uma maior gama de ambientes26. Porém, pouco se sabe da relação entre a função biológica e suas estruturas
moleculares ao nível atômico. As Hbs de invertebrados podem ser divididas em cinco grupos, de acordo com suas estruturas quartenárias:
1. Monoméricas, com um único domínio de massa ~17 kDa. Podem ser intracelulares ou extracelulares e são as que formam o maior grupo de Hbs de invertebrados.
2. O segundo grupo, contem Hbs diméricas de bactérias27, dímeros e tetrâmeros
de Hbs intracelulares, como as de ostras (Scapharca28), e complexos de uma
única cadeia, como a Hb polimérica intracelular de Glycera29.
3. O terceiro grupo abrange complexos de múltiplas subunidades com massas que vão de 200 até 800 kDa, compostas de subunidades de globinas com dois domínios (~35 kDa), encontrada em artrópodes30 e nematóides31.
4. O quarto grupo, contem Hbs com múltiplas subunidades, múltiplos domínios, constituídos de uma ou mais cadeias de 4 – 20 domínios de globinas ligados de forma covalente. Inclusos no quarto grupo, estão a Hb de camarão, com 250-kDa32, a Hb de lesma33 com 1.700 a 2.300 – kDa, a Hb polimérica encontrada
em ostras, com mais de 8.000 kDa34, e a Hb de 124 e 153-kDa encontrada nos
poliquetas Branchipolynoe de hidrotermais35.
todo somam entre 180 e 192 subunidades.
As Hbs extracelulares são invariavelmente sintetizadas no meio intracelular e então secretadas. Elas ocorrem em solução na hemolinfa de quatro filos de invertebrados (Annelida incluindo vestimentíferos e pogonóforos, Nematoda, Artropoda e Mollusca)36,37. Devido à
ausência de um micro ambiente intracelular, onde os níveis efetores podem ser regulados, como nas hemácias dos vertebrados, as Hbs extracelulares por sua vez, operam em condições que são mais dependentes de variações do ambiente do que as Hbs enclausuradas. A ocorrência de Hbs extracelulares é caracterizada por sistemas moleculares grandes que evitam serem excretados através de membranas. Uma exceção a essa regra é a Hb das larvas de mosquitos da família Chironomidae (libélulas) que está presente nas formas monomérica/dimérica. Essas estruturas pequenas são permitidas devido à presença de tubos de Malpighi, que desempenham a função de órgãos excretores ao invés de filtradores/coletores, como no caso de nefrídios/rins, encontrados em outros invertebrados e que poderiam resultar na perda de globinas livremente dissolvidas. Os anelídeos apresentam órgãos filtradores como nefrídios ou celomadutos (protonefrídios) o que está em acordo com a presença de complexos extracelulares gigantes, carregadores de oxigênio, como no caso das eritrocruorinas e clorocruorinas38,39.
1.5 Hemoglobinas gigantes em anelídeos.
As eritrocruorinas e clorocruorinas presentes em anelídeos formam um único grupo de acordo com suas propriedades físico-químicas40. Essas estruturas são formadas por dois tipos
diferentes de cadeias de polipeptídeos, globinas e linkers41, que se associam formando uma
estrutura quaternária característica em forma de bicamada hexagonal. Nos trabalhos primordiais, sobre evolução molecular de hexagonal bilayer haemoglobins (HBL Hbs) extracelulares em anelídeos, Gotoh et al42, dividiu-se as cadeias de globinas em dois grupos
com uma origem em comum. Sucessivamente, Suzuki e Riggs43 demostraram que as cadeias
Hbs extracelulares gigantes. De acordo com esse autor, o ancestral comum de todos esses complexos, era uma proteína formada apenas por cadeias de globinas, e então, durante o processo evolutivo em anelídeos, as cadeias de linkers foram adicionadas formando a estrutural final das Hbs extracelulares gigantes (Fig. 1.5.1 - a, parte superior). É importante mencionar, que os membros do grupo Siboglinidae que abrangem vestimentíferos e pogonóforos (vermes marinhos evolutivamente próximos aos poliquetas) apresentam variações em suas Hbs extracelulares. Vestimentíferos apresentam duas formas de Hbs extracelulares. A primeira, denominada pesada (HbP) com massa entre 3,0 e 4,0 MDa, é em
realidade uma eritrocruorina, compostas por globinas e linkers. A segunda forma é chamada de leve (HbL), possui massa de aproximadamente 400kDa e é composta apenas por
subunidades de globina. A forma HbL pode ser subdivida em duas de acordo com o meio
extracelular onde se encontra. Uma coexiste com a forma pesada no meio vascular (HbLV), a
outra é exclusiva de cavidades celômicas (HbLC). Pogonóforos por sua vez possuem apenas a
forma HbL. Com base no sequenciamento das Hbs de vestimentíferos e pogonóforos, e com a
classificação dessas espécies com um subgrupo dos poliquetas, Negrisolo e colaboradores45,
sugeriram uma origem evolutiva alternativa para as hemoglobinas extracelulares e clorocruorinas. Segundo esse autor, o ancestral comum de anelídeos, vestimentíferos e pogonóforos, conteria em seu genoma todo o conjunto de genes que codificam cadeias de globinas e linkers, constituindo uma HBL Hb primitiva. Dessa forma as HbsL, eritrocruorinas
e clorocruorinas não haveriam coevoluído independentemente. Posteriormente o ancestral comum a vestimentíferos e pogonóforos, evoluiu para as HbsL, e por fim, pogonóforos
perderam a HbP ao longo do processo evolutivo. Um esquema simplificado das duas teorias
sobre a origem das hemoglobinas extracelulares em anelídeos pode ser observado na figura 1.5.1 – a. Recentemente, foram reportadas estruturas cristalográficas de HbsL de pogonóforos
e vestimentíferos, Oligobrachia mashikoi46,47 (código PDB 2D2M, 2ZS0) e R.pachyptila48
Os primeiros estudos, utilizando microscopia eletrônica, para as Hbs extracelulares de anelídeos, revelaram que tais Hbs são constituídas de duas camadas hexagonais superimpostas, com altura de ~20 nm e diâmetro de ~30nm em torno de uma cavidade central49,50. Vários estudos também foram realizados utilizando-se espalhamento de raios-X a
baixo ângulo para investigar o formato assumido por esses complexos51-,55. Quando a
estrutura da eritrocruorina de Lumbricus terrestris (HbLt) foi caracterizada inicialmente, esta revelou um eixo local de simetria de ordem 3 para cada uma das doze unidades (protômeros) repetitivas que formavam o complexo hexagonal. Os doze protômeros da estrutura estão arranjados em duas camadas hexagonais sobrepostas, com uma rotação de 16o entra elas 56.
Essa conformação chamada de não eclipsada, constitui o grupo das eritrocruorinas do tipo I. Uma estrutura quaternária muito semelhante foi encontrada para as Hbs gigantes de outros anelídeos; Macrobdella decora (um tipo de sangue suga), Riftia pachyptila (vestimentífero),
Alvinella pompejana (poliqueta), e a clorocruorina de Eudistylia vancouverii (poliqueta)57-60.
Porém, a hemoglobina de Alvinella pompejana, não apresenta a rotação entre as duas camadas hexagonais. Essa constatação se estendeu para varias outras estruturas de hemoglobinas de poliquetas, incluindo a da espécie Arenicola marina (HbAm)61, sugerindo que poliquetas, Figura 1.5.1 - (a) As duas teorias sobre a origem das hemoglobinas extracelulares em anelídeos. (b) Estrutura da
incluindo os que habitam o oceano profundo, mas excluindo as quatro famílias que contém clorocruorinas, apresentam estruturas sem a rotação entre as camadas. Essa conformação do tipo eclipsada constitui o grupo das eritrocruorinas do tipo II. Sendo assim todos os outros anelídeos (incluindo vestimentíferos) apresentam rotação relativa entre as camadas hexagonais. A figura 1.5.2 mostra uma comparação dos modelos gerados por microscopia eletrônica das eritrocruorinas do tipo I e II.
Eritrocruorinas apresentam o fenômeno de cooperatividade com coeficientes de Hill da ordem de 7,0. Porém, a espectroscopia Raman de ressonância foi utilizada pra caracterizar a HbLt, mostrando que, em contraste com as com as Hbs de vertebrados, a ligação do O2 não
resulta em alterações espectrais envolvendo o modo de estiramento do ferro-His proximal63.
Este comportamento, análogo para a Mb, sugere que o mecanismo de cooperatividade nas eritrocruorinas é aparentemente diferente dos mecanismos do cooperatividade dos vertebrados64,65. Dessa forma, estudos de espalhamento de raios X de baixo ângulo para as Figura 1.5.2 - Uma comparação dos modelos gerados por microscopia eletrônica das eritrocruorinas do tipo I e
II. (a) Arenicola marina (tipo II, eclipsada) e (b) Lumbricus terrestris (tipo I, não eclipsada)62
formas oxi-Hb e deoxi-Hb das eritrocruorinas e também para a porção dodecamérica isolada (fração contendo apenas as subunidades de globinas, muito semelhante às Hbs leves de vestimentíferos e pogonóforos), mostram que não há alterações observáveis nos formatos dessas espécies com a entrada e saída do oxigênio66,67. Esse resultado sugere que não existem
alterações na estrutura quartenária maiores do que ~1%. Em contraste, a Hb de mamíferos onde o coeficiente de Hill é tipicamente constante frente aos níveis de saturação de oxigênio entre 10% e 90% em uma ampla variação de valores de pH, as eritrocruorinas variam grandemente de espécie pra espécie39,68-70, e intrinsecamente, com a saturação de O
2, pH,
concentração de cátions inorgânicos, e temperatura71-75. Cooperatividade é comumente
máxima em pH fisiológico, assim como para HbAm, onde o pico de cooperatividade é observado entrepH 7,2 e 7,6 (em 20°C) e para a Alvinella caudata e Apompei, onde o pico é em torno de pH 6,9, em concordância com o pH mais baixo apresentados pela hemolinfa desses organismos75,76. No entanto a maior divergência entre pH fisiológico e o pH de máxima
cooperatividade é encontrado para a HbLt, onde o coeficiente de Hill aumenta de 3 em pH baixo para um máximo de 9,5, perto de pH 7,866. Da mesma forma, a cooperatividade de Hbs
dos oligoquetas Pheretima hilgendorfi73 e Eisenia foetida71, e dos sangues sugas Hirudo medicinalis77 e Macrobdella decora78,79, possuem um máximo em pH acima de 8,0. A
temperatura também pode ser um fator muito importante na cooperatividade. Na HBL Hb de
A.pompejana, o coeficiente de Hill em pH 7,25 cai de 3 em 20°C, para 1,2–1,5 em 10 e 40°C74. Isso indica pronunciadas diferenças no calor total de oxigenação das formas
desoxigenada e oxigenada das eritrocruorinas. A cooperatividade das eritrocruorinas em sangue fresco aparece ser maior do que purificada pelo menos nos casos de Octolasium complanatum80 e L.terrestris66. A razão pela qual isso ocorre é a perda de cátions durante o
processo de purificação. Diferente das hemoglobinas dos vertebrados, que são sensíveis a presença de compostos orgânicos aniônicos (2,3-DPG e ATP), as eritrocruorinas são sensíveis a presença de cátions, que aumentam a afinidade desses complexos por oxigênio. De uma forma geral, cátions divalente são mais efetivos (Ba2+ > Ca2+ > Sr2+ > Mg2+ > Li+ > Na+ > K+),
de forma que não depende apenas da carga do íon, mas também do raio iônico de cada espécie81. Isso está em acordo com os efeitos mais pronunciados do Ca2+ sobre oMg2+ nas
hemoglobinas de Amphitrite ornata82, Eisenia foetida71,73, Pheretima hilgendorfi83, e Hirudo
medicinalis77. Assim como o maior efeito do Ba2+ sobre os outros cátions divalentes na Hb de
Macrobdella decora78. No entanto algumas Hbs mostram-se insensíveis à presença de Ca2+ e
Mg2+, como no caso das Hbs de Tubifex e Marphysa sanquinea. As Hbs dos oligoquetas
Cu2+ como parte da sua estrutura84,85. Na Hb de Pheretima hilgendorf, onde o sangue contém
0,9 mM Zn2+, (o que significa entre 1 ou 2 átomos de Zn para cada 165 átomos de ferro) e não
podem ser removidos por diálise. A adição de Zn2+, aumenta a afinidade pelo O
2, devido a
alterações na constante de associação com o estado T (KT)86. Porém, esse fato aparentemente
não altera a constante de associação de O2 com o estado R (KR), sugerindo um mecanismo de
ação diferente dos outros cátions divalentes mencionados anteriormente.
1.6 A hemoglobina gigante de Lumbricus terrestris.
Com a resolução da estrutura cristalográfica da hemoglobina hexagonal gigante de
Lterrestris (HbLt)87,88, Royer e colaboradores, deram grande contribuição no esclarecimento
sobre a estequiometria referente às subunidades constituintes, e também, sobre os níveis hierárquicos de empacotamento desse complexo. Na estrutura existem quatro tipos diferentes de globinas, denominadas a, b, c e d, que formam um heterotetrâmero abcd. O heterotetrâmero é repetido então três vezes, formando uma estrutura com simetria C3, denominada dodecâmero ou cap, com a seguinte estequiometria ([abc]3[d]3), onde a1b1c2
(onde c2 é a subunidade tipo c do heterotetrâmero adjacente), são unidos por ligações de
dissulfeto (embora a presença das ligações de dissulfeto não se estende a todos os anelídeos). Especificamente a1 forma duas pontes dissulfetos com b1 e c2 respectivamente mantendo esta
unidades trimérica covalentemente ligada. Essa estrutura em forma de cúpula, com aproximadamente 200 kDa de massa, é muito semelhante as estruturas na forma de cúpula que formam a então denominada Hb “leve” de vestimentíferos e pogonóforos46-48. Em 2004
Strand e colaborares resolveram a estrutura do dodecâmero da HbLt isoladamente89,
mostrando que este apresenta grande concordância estrutural com as estruturas de hemoglobinas leves de poliquetas resolvidas por difração de raios X. Porém na HbLt, assim como nas outras eritrocruorinas, o dodecâmero aparece associado a um héterotrímero de
linkers denominados (L1, L2 e L3). Essa estrutura com estequiometria ([abc]3[d]3)(L1L2L3)
estrutura da HbLt. Apesar da resolução moderada de 3,5Å, a estrutura da HbLt também revelou detalhes sobre o enovelamento das unidades constituintes. As cadeias de globinas apresentam um enovelamento similar ao das subunidades das globinas alfa/beta nas Hbs dos vertebrados, porém nenhuma das globinas da HbLt possui a hélice D. Detalhes como ligações de dissulfeto intra e inter subunidades foram observados, confirmando a presença e os locais de ligações entre as cadeias to tipo a,b e c. Grupos prostéticos como, cátions metálicos e a presença dos grupos heme também foram determinados.
As globinas que formam o heterotetrâmero ([abc][d]), estão primeiramente associadas como heterodímeros, a/d e b/c e estes dímeros interagem entre si, através das hélices E e F. Nessa interface, resíduos presentes na hélice F, interagem diretamente com o grupo heme da subunidade complementar, formando uma ponte salina através dos grupos propionato que o
Figura 1.6.1 - Classificação dos diferentes níveis de hierarquia das HBL Hbs/Eritrocruorinas. Unidade da HbLt (a) e (b), com simetria D6 (ou 622), contendo 12 protômeros. Ao todo são 144 cadeias de globinas e 36 cadeias tipo linkers. O protômero (c) por sua vez é composto por 4 diferentes tipos de globinas que primeiramente formam um heterotetrâmero abcd, e em seguida são associadas em uma estrutura dodecamérica (d) - cap ([abc]3[d]3). O cap por sua vez, está associado a um
mesmo possui. Um arranjo quaternário semelhante é observados para a hemoglobina do molusco Scapharca inaequivalvis90.A estrutura da HbLt possui três distintas subunidades de
linkers (L1 L2 e L3), que são necessárias para a formação da bicamada hexagonal91-93 onde
cada uma, ocupa 1/15 da unidade protomérica. A densidade eletrônica obtida para a estrutura da HbLt, não é ambígua para duas das cadeias de linkers, L1 e L2, porém a terceira posição, aparentemente, pode ser ocupada pela cadeia L3 ou L4 (onde L4 é uma isoforma da cadeia L394. No modelo cristalográfico apenas a cadeia L3 foi modelada, uma vez que foi constatado
experimentalmente que esta é a isoforma mais abundante na HbLt95. Os três linkers são
estruturalmente semelhantes entre si, e segundo Royer e colaboradores, podem ser divididos em quatro domínios diferentes (figura 1.6.2). O primeiro domínio, na porção N-terminal, é uma hélice-α contendo entre 21-30 resíduos. Esta estrutura em hélice interage com as outras homólogas dos dois linkers vizinhos formando uma estrutura do tipo coiled coil trimérico.
Figura 1.6.2 - Visão geral da estrutura dos linkers. A cadeia é constituída de 4 domínios, (1) Hélice 1, (2) hélice 2, (3) LDL-A e (4) β-barril. O domínio LDL-A possui um sítio de ligação de Ca2+, assim como
A estrutura segue com um arranjo de 1-7 resíduos não helicoidais, que conectam com o segundo domínio. Esse por sua vez é uma pequena hélice contendo 12–17 resíduos que participam de um curto coiled coil também trimérico, dentro da “cabeça” do heterotrímero de
linkers. O terceiro domínio é rico em cisteínas, homólogo ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL-A: Low-density lipoprotein receptor domain class A). Este apresenta um sítio de ligação de Ca2+ de alta afinidade, estimado em ~70 nM, o que explica parte da demanda
por cátions divalente dessa natureza para a estabilização da estrutura. Por fim, o quarto e ultimo domínio, é uma estrutura do tipo β-barril, formado por 8 fitas antiparalelas, que desempenha papel importante na interação com a porção dodecamérica de globinas. Os
linkers desempenham um papel estrutural importante no arranjo quaternário das eritrocrurinas, não apenas na formação do protômero, mas também realizando os principais contatos entre protômeros na unidade biológica. A HbLt apresenta atividade superóxido dismutase96, o que está em concordância com a presença dos metais Zn e Cu na composição
química determinada experimentalmente. Uma vez que a atividade de superóxido dismutase (SOD) não foi constatada para as cadeias de globinas na HbLt, essa atividade fica então, restrita para a porção dos linkers. No entanto, essa Hb apresenta apenas ~10% da atividade superóxido dismutase de CuZnSODs97. Dado que existem quatro linkers diferentes e nenhum
contribui com mais do que 10% da massa total da partícula, a atividade de cada linker
isoladamente seria comparável à enzima de mamíferos. Para o modelo cristalográfico da HbLt, apenas um único átomo de Zn foi modelado na estrutura, e encontra-se em um ambiente químico que não sugere nenhuma semelhança com os sítios de Zn nas CuZnSODs97.
