Thiago Zaqueu de Lima
Estudos sobre a patogênese e tratamento da
Doença de Alzheimer
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo para obtenção de título de Doutor em Ciências
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Universidade Federal de São Paulo
Departamento de Fisiologia
Pragrama de Neurologia / Neurociências
Chefe do Departamento: Prof.a. Dra. Débora Amado Scerni
Coordenadora do programa de pós-graduação: Profa. Dra. Maria da Graça
Naffah Mazzacoratti
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Banca Examinadora:
Prof.Dr. Alexandre Salgado Basso
Prof. Dr. Luis Barbeito
Prof. Dr. Roberto Frussa Filho
Prof. Dr.Sérgio Teixeira Ferreira
Suplentes:
Profa. Dra. Beatriz Monteiro Longo
Prof. Dr. Mauro Fantini Nogueira Martins
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Agradecimentos
Esta tese é fruto de uma história que começou muito antes da minha primeira imuno-histoquíma. Antes de aprender a pipetar, minha família ensinou-me o valor do caráter, honestidade e do trabalho. Em um país, onde tão poucos tem acesso ao ensino superior, muitas vezes, o mérito encontra-se na oportunidade gerada pela família. Certamente, eu não estaria pleiteando um título sem os sacrifícios, investimentos, insentivos e cobranças, dos meus pais, José Alberto e Vera Lucia, de quem eu serei eternamente grato. Agradeço aos meus avós pelo exemplo que deram e àqueles, que muito contribuiram na minha trajetória, mas partiram antes de poder folhar esta tese. Agradeço ao Prof. Luiz Eugênio por ter me ensinado o pensamento científico e por ter me mostrado como me direcionar, objetivamente, para responder as perguntas mais relevantes e alcançar meus objetivos. Obrigado por sua confiaça, paciência, pela oportunidade que me ofereceu e pelo tempo empenhado no meu amadurecimento científico. Apesar de até proporcionar um visual charmoso, espero não ter contribuído com muitos dos seus cabelos brancos.
Agradeço a Universidade e a sorte por ter permitido conhecer amigos tão valiosos. Estes amigos tornaram os nove anos de moradia em São Paulo, uma das cidades mais caóticas do mundo, o período mais divertido da minha vida. Apesar de terem tirado minhas fichas nos jogos de poquêr, terem me colocado de churrasqueiro e muito mais, seria muito díficil a vida sem eles. Aos amigos, obrigado pelo apoio, pelas festas e pela ajuda científica.
Agradeço aos companheiros de laboratório pelo agradável ambiente de trabalho e por terem me ensinado muito. Obrigado também a Roseli, por sua eficiência e muita boa vontade. À parte da casa dos meus pais, onde passei a minha infância e juventude, o laboratório foi o local, em que mais convivi. Certamente, carregarei a saudade dessa minha segunda casa, onde quer que vá.
Agradeço ao Nikkyoji por ter me acolhido como parte de uma família, ensinado a ter força, empenho e a fazer o meu melhor. Sou muito grato à postura do Nikkyoji, que incorporei de mim.
7 “Ouça um bom conselho
Que eu lhe dou de graça
Inútil dormir,que a dor não passa Espere sentado, ou você se cansa
Está provado, quem espera nunca alcança.
Venha meu amigo Deixe esse regaço Brinque com meu fogo Venha se queimar Faça como eu digo Faça como eu faço
Aja duas vezes antes de pensar
Corro atras do tempo Vim de não sei onde
Devagar é que não se vai longe Eu semeio o vento, na minha cidade Vou pra rua e bebo a tempestate.”
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Índice
Banca examinadora... 3
Agradecimentos... 5
Epígrafe... 7
Lista de abreviaturas... 11
Prefácio... 14
Resumo... 16
Capitulo 1: A influência da degeneração colinérgica sobre a progressão de um modelo da doença de Alzheimer e os efeitos do tratamento com lítio sobre a lesão colinergica Introdução... 18
Objetivo... 21
Materiais e métodos... 21
Animais... 22
Administração de IgG-192 saporina... 22
Tratamento com lítio... 23
Labirínto aquático de Morris... 24
Histologia... 26
Acetilcolinesterase... 26
Thioflavina-S... 28
Elisa... 28
Extração de peptídeos Aβ... 28
Elisa para Aβ... 29
Análise estatística... 29
Resultado... 30
Acetilcolinesterse... 31
Labirinto aquático de Morris... 33
Elisa de Aβ... 38
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Discussão... 42
Os efeitos da degeneração colinérgica sobre marcador patológico e sintomas da Doença de Alzheimer... 42
O tratamento com LiCl... 45
Conclusões... 48
Capítulo 2: Modulação da inflamação induzida por Beta-Amiloide por receptores IREM1 Introdução... 50
Objetivo... 56
Materiais e métodos... 56
Cultura de astrócitos... 56
Purificação de astrócitos... 57
Transfecção... 58
Co-culturas de astrócitos e neurônios... 59
Peptídeo β-amilóide... 60
Western-Blot... 60
Imuno-histoquímica... 61
Contagem de neurônios... 62
Imunofluorescência... 63
Endocitose de Aβ... 64
Citometria de fluxo... 65
Análise da transcrição de IREM1... 66
Extração de RNA... 68
RT-PCR... 68
PCR em tempo real... 69
Sequenciamento... 70
Análise estátistica... 71
Resultados... 72
Efeito do IREM1 sobre a toxicidade do Aβ42 in-vitro... 72
Distribuição dos ligantes de IREM1... 75
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Análise da expressão de RNAm de IREM1... 80
Discussão... 82
Conclusão... 87
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Lista de Abreviações
ºC = graus celsius
G = gramas
Mg = miligramas
µg = microgramas
M = molar
mM = milimolar
µM = micromolar
Cm = centimetro
µm = micrometro
Aβ = peptídeo beta-amiloide
AchE = histologia de achetilcolinesterase ANOVA = análise de variância
APP = proteína precursora de peptídeo beta-amiloide
APPswe-PS1∆E9 = camundongo portador das mutações swedish da APP e deleção do exon 9 da presenilina
APS = persulfato de amônia BSA = albumina sérica bovina CA1 = região CA1 do hipocampo CA3 = região CA3 do hipocampo Cing Cortex = córtex cingulado
cDNA = dupla fita de DNA complementar ao RNA mensageiro ChAT = colina acetil-transferase
COX = ciclo oxigenase DA = Doença de Alzheimer
DG = Giro Denteado do hipocampo
DMEM = Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
EDTA = ácido etilenodiamino tetra-acético EGTA =ácido etilenoglicol tetra-acético
ELISA = Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
12 GAPDH = gliceraldeido fosfato desidrogenase
GFAP = proteína glial fibrilar ácida GFP = proteína fluorescente verde
GL = Grau de liberdade
GSK-3 = Glycogen synthase kinase
IDE = Insulin Degrading Enzyme
IgGsap = IgG-192 saporina
IL = interleucina
INF-γ = interferon gama
iNOS = óxido nítrico sintase (induzível)
IREM1 = immune receptor expressed in myeloid cell
IREM1∆cit = IREM1 desprovido da cadeia citoplasmática ITAM = immunereceptor tyrosine-based activation motif
ITIM = immunereceptor tyrosine-based inhibitory motif
LAM = labirinto aquático de Morris
KPBS = soluação salina potássica fosfatada tamponada LTP = potenciação duradoura
LiCl = Cloreto de Lítio LPS = lipopolisacarídeo
MBP = proteína básica de mielina
MHC = complexo de histocompatibilidade principal MIP = proteína inflamatória de macrófago
MCP = proteína quimiotática de monócito
NEP = neprelisina
NeuN = proteína de núcleo neuronal NMDA = N-metil D-aspartato
PBS = salina fosfato tamponada
PCR = Polymerase Chain Reaction
PFA = paraformaldeído PF Cortex = córtex pré-frontal
PKC = proteína cinase dependente de calcio
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RNAm = RNA mensageiro
ROS = espécies reativas de oxigênio
RT-PCR = Retro-transcriptase Polymerase Chain Reaction
S100B = proteína S100 ligadora de calcio SDS = sódio dodecil sulfato
SFB = soro fetal bovino
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Prefácio:
A ciência tem a responsabilidade de buscar explicações, desmistisficar o universo e desfazer coincidências. Assim, para desenvolverem uma visão mais completa, os pesquisadores evitam ao máximo entregar o pensamento à casualidade simplista frente a um evento complexo. Contudo, certas histórias ocorrem de maneira tão peculiar, que parecem questionar a probabilidade e a casualidade se torna uma explicação tentadora. Assim como uma coincidência desprentenciosa, este trabalho foi fruto da confluência de uma série de eventos que permitiram a realização de um projeto até que improvável.
Esta tese nasceu a partir de descobertas científicas que ampliavam as competências do labortário de neurofisiologia da UNIFESP a serem aplicadas em um novo campo da neurociência. Décadas de evidências finalmente pareciam sustentar que a degeneração dos neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal reproduziria a patologia e os sintomas da Doença de Alzheimer (DA). Em meio aos relatos mais otimistas, dados de nosso laboratório confirmavam déficits cognitivos semelhantes a demência da DA causados pela degeneração colinérgica. Desta forma, um laboratório com experiência no estudo do sistema colinérgico viu-se amparado para contribuir com o desenvolvimento científico em outra área. Em paralelo, a Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais (APAE de São paulo) havia se associado a UNIFESP, reforçando o interesse em pesquisas relacionadas a deficiência mental. O acordo entre as instituições abriu as portas da disciplina de neurofisiologia para um aluno com interesse particular em demência. Enfim, munidos de confiança, motivação e persistência, lançamo-nos a desbravar uma nova linha de pesquisa. Assim, a tese nasceu em lugar inusitado: um laboratório historicamente devotado ao estudo das epilepsias.
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comprovação final: a quantificação dos níveis de Aβ. As dificuldades na avaliação deste fator foram decisivas para que o trabalho fosse concluído prematuramente. Na “Quadrilha” de Carlos Drummond de Andrade, João amava Teresa, mas apesar de seus supostos esforços, não conseguiu alcançar seu objetivo. João termina nos EUA, onde inesperadamente deve ter sido feliz e feito grandes realizações. De maneira menos poética, nossos planos não permitiram alcançar os objetivos iniciais, mas mesmo assim trouxeram contribuições importantes. O efeito da degeneração colinérgica sobre a cognição foi detalhado e os níveis de Aβ produzidos no modelo foram mensurados pela primeira vez. Além disso, foi possível testar os efeitos do tratamento com lítio sobre a deficiência produzida pela lesão colinérgica.
Diante das constatações, de que a degeneração do sistema colinérgico reproduzia apenas parcialmente os aspectos da DA, o estudo dos efeitos anti-amiloidogênico do lítio tornou-se inviável. Assim o trabalho foi retomado em outra direção, o que acabou dividindo a tese em dois capítulos.
O segundo capítulo desta tese destina-se ao estudo de alternativas para manipular a inflamação presente na DA e, assim amenizar a neurodegeneração decorrente da doença. Para tanto, avaliamos o potencial neuroprotetor da proteína IREM1, um novo receptor imunológico inibitório. Além disso, pudemos especular sobre a repercussão que a ativação de IREM1 traria sobre o clearence de Aβ e como estes receptores poderiam influenciar a
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Resumo
Capítulo 1: A influência da degeneração colinérgica sobre a progressão de um modelo da doença de Alzheimer e os efeitos do tratamento com lítio sobre a lesão colinergica
A denervação colinérgica do hipocampo e córtex cerebral é universalmente aceita como um dos principais fenômenos da doença de Alzheimer (DA), entretanto não é um fenômeno constante na DA e sua contribuição para a progressão da doença ainda não foi completamente esclarecida. Deste modo, o presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da degeneração colinérgica sobre o comprometimento cognitivo, o metabolismo de peptídeo β-amiloide (Aβ) e como o tratamento com lítio poderia alterar os sintomas gerados pela lesão colinérgica. Para tanto, ratos foram submetidos à cirurgia neonatal para injeção intracerebroventricular de IgG-192 saporina (IgGsap). Depois de três meses, os animais foram avaliados em labirinto aquático de Morris (LAM) e, em seguida, iniciaram o terapia com LiCl por três meses. Ao término do tratamento, os ratos foram novamente avaliados em LAM, depois seus encéfalos foram destinados a histologia e quantificação de Aβ por ELISA. Os testes mnemônicos mostraram que os déficits relacionados à memória operacional surgem antes e são mais severos, do que a deficiência relacionada à memória de referência. Observou-se que a degeneração colinérgica causada pela injeção neonatal de IgGsap não alterou os níveis nem a solubilidade dos peptídeos Aβ. Assim, espera-se que a degeneração colinérgica seja mais importante em produzir os sintomas da DA, do que em alterar a progressão da doença. Além disso, observou-se que o consumo de lítio promoveu a redução dos níveis de Aβ40, mas
surpreendentemente, favoreceu o aumento de peptídeo Aβ42 insoluvel, efeito
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Capítulo 2: Modulação da inflamação induzida por Beta-Amiloide por receptores IREM1
A DA é a causa mais freqüente de demência entre os idosos. A enfermidade é caracterizada pelo declínio cognitivo, degeneração neuronal e a presença de emaranhados neurofibrilares e placas senis, as quais são compostas sobretudo pelo acúmulo de peptídeo Aβ. Além do efeito tóxico direto, o Aβ induz toxicidade indireta por ativar uma resposta inflamatória. No cérebro de pacientes afetados pela doença de Alzheimer, o peptídeo Aβ
desenvolve uma conformação anormal, que favorece sua agregação em aglomerados aberrantes, os quais não são mais reconhecidos por células da glia como peptídeos endógenos. Por sua vez, as células gliais recrutam outras células, por meio da sinalização inflamatória, para promover a eliminação dos peptídeos aberrantes. No entanto, a inflamação resulta na produção de citocinas pró-inflamatórias e radicais livres que acabam contribuindo para a toxicidade da doença e agravando a neurogeneração.
No presente trabalho, almejamos avaliar o potencial de um novo receptor imunológico inibitório de membrana (IREM1) em modular a inflamação e atenuar a toxicidade exercida pelo peptídeo Aβ.
O presente trabalho constatou o efeito neuroprotetor dos receptores IREM1 sobre a toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ42 oligomérico. Esta
propriedade protetora se deve à interação célula-célula e requer, ao menos, a presença de astrócitos, ou oligodendrécitos, como fornecedores dos ligantes de IREM1. A super-expressão de IREM1 não comprometeu a internalização de Aβ
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A influência da degeneração colinérgica sobre a
progressão de um modelo da doença de Alzheimer e os efeitos
do tratamento com lítio sobre a lesão colinergica
Introdução:
A doença de Alzheimer (DA) é um disturbio neurodegenerativo caracterizado pela ocorrência de demência, presença de emaranhados neurofibrilares e placas senis, cujo principal componente proteico são os peptídeos beta-amiloides (Aβ) [1]. Estudos genômicos identificaram o envolvimento de mais de 200 genes na DA [2-3], o que acaba proporcionando uma grande variabilidade na patologia e sintomas da doença. No entanto, apenas mutações em quatro genes estão bem estabelecidas com a etiologia da doença (ver tabela 1).
Entre as diversas formas de demência, a DA é a manifestação mais frequente, correspondendo a 50-70% do total da prevalência das demências. O risco de desenvolver a doença aumenta exponencialmente com o envelhecimento, partindo de aproximadamente 1% entre indivíduos com idade entre 60-65 anos e atingindo 30-35% na população de faixa etária superior aos 80 anos. Desta forma, estima-se que, por todo o planeta, 25 milhões de pessoas estejam acometidas pela DA nos dias de hoje e que, provavelmente, mais de 75 milhões estarão suscetíveis a doença nos próximos 20 a 25 anos [4].
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da doença e do pais onde se encontra [2]. Um estudo britânico revelou, que a intervenção farmacológica convencional contra a demência apenas prolonga o tempo até o paciente encontrar-se dependente de cuidados integrais em 1,5 mês, com um custo entre £37.000 a £80.000 por ano de vida corrigido para qualidade de vida (Quality-Adjusted Life year) no mesmo país [5]. A impotente situação perante a DA alerta para a necessidade de melhor compreensão da doença e busca por novas estratégias terapêuticas.
Desde que foi descrita por Alois Alzheimer em 1906, a DA foi encarada como uma forma excêntrica de demência, até que dois grupos britânicos independentes constataram que a doença era associada à maciça redução de marcadores colinérgicos no córtex cerebral [6-7]. Essa descoberta ocorreu no eufórico período de pesquisa centralizada nos neurotransmissores e trouxe a doença para um campo menos obscuro da medicina. Nessa época, a neuroanatomia do sistema colinérgico central vinha sendo detalhada [8] e logo demonstrou-se que bloqueadores colinérgicos produziam comprometimento de memória [9]. Assim, o sistema colinérgico tornou-se o alicerce das pesquisas que investigavam a DA. A degeneração colinérgica mostrou-se correlacionada com a- magnitude da demência [10-11] e também foi responsabilizada pela formação das placas senis [12]. Não tardou para que animais com degeneração colinérgica e consequente déficit de aprendizagem fossem defendidos como modelo para a doença [13]. Na época, o consenso era que, assim como a doença de Parkinson era uma enfermidade do sistema dopaminérgico, a DA era uma doença colinérgica.
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Os neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal distinguem-se por expressar seletivamente a proteína p75 [17-19], um receptor de baixa afinidade para o NGF. Foi observado, que o número de neurônios p75 positivos do núcleo Basalis diminui em casos moderados de DA [20], sugerindo que a degeneração desta sub-população neuronal seja um fenômeno importante na doença. No entanto, os efeitos que a degeneração colinérgica do prosencéfalo basal exerce sobre a patologia e a progressão da DA permanecem desconhecidos. A fim de gerar um modelo animal que representasse tal degeneração, foi produzida uma toxina específica aos neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal. Construída a partir da junção de uma imunoglobulina do tipo G específica para os receptores p75 com a toxina saporina, a IgG-192 saporina (IgGsap) é internalizada pelos neurônios portadores de p75, causando a inativação dos ribossomos. Então, as células alvo entram em apoptose, resultando na morte específica de neurônios do prosencéfalo basal e denervação colinérgica do córtex e hipocampo [21-23]. Como consequencia da degeneração colinérgica produzida pela infusão neonatal da IgGsap, os ratos desenvolvem comprometimento de memória semelhante a DA, o qual mantem-se ao longo da vida do animal [24-25]. Além disso, a degeneração do prosencéfalo basal induzida por dose tóxica de NMDA aumenta a expressão da proteína precursora de peptídeo beta-amiloide (APP) [26], o que foi posteriormente confirmado pela lesão seletiva com IgGsap [25, 27-28]. Diante das evidências de que a injeção de IgGsap reproduziria tanto os sintomas como o aumento dos níveis de Aβ, a denervação colinérgica parecia fornecer um modelo ideal para impulsionar as pesquisas no campo da DA.
De acordo com a hipótese da cascata amiloide [29] [30], o peptídeo Aβ
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estratégias para reduzir a produção de Aβ baseadas na inibição de presenilina tornam-se pouco viáveis. Mas, essa dificuldade foi superada por Phiel e colaboradores, os quais mostraram que o tratamento com lítio reduz seletivamente os níveis de Aβ sem afetar o processamento da Notch [33]. Entre os diversos alvos, o lítio inibe a GSK-3α, que por sua vez deixa de promover a atividade catalítica da presenilina. E ainda, o lítio inibe a hiperfosforilação da proteína Tau e também protege culturas neuronais contra a toxicidade do Aβ
[34]. Desta forma, o uso de sais de lítio surge como uma alternativa profilática e terapêutica para a DA.
Objetivo
O presente trabalho teve por objetivo avaliar os sintomas atribuíveis à degeneração colinérgica e os efeitos desta lesão sobre os níveis de Aβ e assim, avaliar como a morte destes neurônios afetaria o curso da doença. Face ao potencial terapêutico dos sais de lítio, também almejou-se analisar os possíveis benefícios do seu tratamento sobre os prejuízos decorrentes da degeneração colinérgica.
Materiais e métodos:
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peptídeo amilóide-beta (Aβ). A outra metade foi processada para extração de proteínas, a fim de se quantificar os níveis de Aβ por Elisa.
Animais:
Foram utilizados ratos Wistar de sete dias de vida pós-natal, de ambos os gêneros. Os animais foram alojados em condições de temperatura (22 ±2°C) e luminosidade controladas (ciclo claro-escuro de 12 horas, com início da iluminação as 6:00). Por fim, todos os experimentos executados neste trabalho foram aprovados pelo comitê de ética em pesquisa da Universidade Federal de São Paulo, sob registro número 0188/04 e 1078/09.
Administração de IgG-192 saporina:
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Figura 1: descrição dos grupos de acordo com os procedimentos experimentais, aos quais os animais foram submetidos. Aos sete dias de vida pós natal, alguns filhotes receberam injeção intracerebroventricular de IgGsap, enquanto outros receberam apenas o veículo (PBS) e ainda uma parcela dos animais não sofreu o procedimento cirúrgico. Três meses após a cirurgia, os ratos foram designados ao tratamento correspondente, o qual estendeu-se por três meses. Concluído o tratamento, os encéfalos dos animais foram processados para marcação pela histologia de AChE e os grupos foram redefinidos conforme o grau de degeneração colinérgica (IgGMax= lesão máxima; IgGParcial= lesão parcial).
Tratamento com Lítio:
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resultar em concentração plasmática do lítio dentro da sua faixa terapêutica e resultar em alterações cognitivas muito sutis [35]. E ainda, a concentração sérica alcançada mostrou-se capaz de inibir a GSK-3 in-vivo [36].
A ração suplementada com Lítio oferecida aos animais foi produzida a partir da ração convencional. De início, deve-se misturar farelo de ração a uma solução aquosa contendo LiCl até que tenha distribuição homogênea. Em seguida, um toque de requinte: remodelar os cilindros de ração. Estes devem ser levados a estufa (a temperatura de 70º C) para secagem. Depois de esfriar a ração está pronta pra servir.
Decorridos três meses de tratamento, o consumo das rações suplementadas foi suspenso e os animais foram avaliados em labirinto aquático de Morris.
Labirinto aquático de Morris:
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A memória dos animais foi avaliada tanto antes como após o término do tratamento. Em ambas situações, a memória espacial foi avaliada primeiro, seguida da memória operacional. Para analisar a memória espacial (de longo prazo), cada animal era avaliado em quatro tentativas diárias, espaçadas por intervalos de seis a oito minutos, durante seis dias de testes. Durante toda a avaliação, a posição da plataforma manteve-se constante e os animais eram poscionados nas mesmas regiões de largada, porém a seguência dessas posições foi alternada em cada dia de teste. Assim, para acompanhar a progressão da curva de aprendizagem referente a memória de longo prazo, foi computada a média a partir das latências nas quatro tentativas de cada dia de teste. Por fim, no sétimo dia de avaliação, foi realizada uma corrida de prova, na qual a plataforma foi removida e o tempo em que o animal permanecia próximo a posição inicial da plataforma foi comparado entre os grupos experimentais. Contudo, a análise estatística mostrou que a corrida de prova foi menos informativa, do que a análise da curva de aprendizagem, portanto seus resultados foram omitidos nesta tese. Durante o teste, a disposição da sala não foi alterada, para que os animais se lembrassem das pistas ambientais, e se norteassem para a plataforma.
Em seguida, os mesmos animais foram avaliados na versão de memória operacional (de curto prazo). Visando minimizar interferências decorrentes da memorização da versão anterior, as pistas ambientais foram totalmente alteradas. Esta versão comparou parâmetros de trajetória e tempo até atingir a plataforma, cuja localização variou entre os cinco dias de teste. Como a posição da plataforma era alterada a cada dia de teste, as posições de largada também foram mudadas para quatro posições squidistantes em relação ao posicionamento da plataforma. Cada animal foi avaliado em quatro tentativas ininterruptas, sendo que a curva de aprendizagem foi computada a partir da media entre as latências dos varios dias de teste para a mesma tentativa. Assim, o tempo médio para encontrar a plataforma durante as primeiras tentativas de todos os dias de teste foi comparada com a latência da segundas, terceiras e quartas tentativas.
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quantificação Ethovision em computador. Deste modo, a latência, distância percorrida, e velocidade para alcançar a plataforma foram obtidas automaticamente.
Fatores de exclusão do labirinto aquático de Morris.
Os animais que apresentaram comprometimento motor, dificuldades de locomoção na piscina ou mesmo, que não buscavam encontrar a plataforma submersa, foram excluídos da estatística de cada versão do LAM.
Histologia:
Depois de concluído o tratamento com lítio e realizados os testes de LAM, os animais foram profundamente anestesiados com tiopental e perfundidos através da artéria aorta com 40 mL de solução salina. Então, alguns animais continuaram sendo perfundidos com paraformaldeído (PFA)4% em PBS, enquanto o restante foi rapidamente decapitado após a perfusão com salina para a remoção do córtex cerebral. As amostras de córtex foram prontamente congeladas e depois utilizadas para extração de proteínas conforme descrito adiante. Os encéfalos perfundidos com PFA permaneceram imersos nesta mesma solução por 48 horas e, em seguida, foram transferidos para solução de sacarose 30% em PBS por mais 48 horas. Então, os encéfalos foram cortados em secções coronais de 35 µm em criostato, as quais foram utilizadas em histologia de Acetilcolinesterase (AchE) e Thioflavina-s.
Acetilcolinesterase:
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De todos os encéfalos, foram selecionados cortes a cada 200µm, os quais foram estendidos em lâminas gelatinadas. Em seguida, as lâminas foram lavadas em três banhos de Na2SO4 saturado, e pré-incubadas em solução
contendo 250mL de Na2SO4 mais 2,5mL de ISO OMPA
(tetraisopropilpirofosforamida) por 30 minutos à temperatura ambiente. A seguir, incubaram-se os cortes em solução estoque (1,5g de CuSO4.5H2O,
1,875g de glicina, 5,0g de MgCl2.H2O, 8,75g de ácido maléico, 150mL de
hidróxido de sódio e 850 mLNa2SO4 saturado à temperatura de 40ºC, pH 6,0)
mais 250mL de iodeto de acetilcolina e 2,5mL de ISO OMPA durante uma hora à temperatura de 37ºC. O material foi lavado em três trocas de Na2SO4
saturado. A etapa seguinte foi revelar em sulfeto de amônio diluído (250mL de Na2SO4 saturado, mais 10 a 15 gotas de Cu SO4 1M e 10 a 15 gotas de
(NH4)2S 1M). O material foi lavado em água destilada e, em seguida, a
marcação foi intensificada em nitrato de prata 10% durante um minuto. A seguir, os cortes foram mantidos em solução de tiosulfato de sódio 5% (Na2S2O3.5H2O) por um minuto e também em água destilada. O material foi
contracorado com hematoxilina de Mayer e finalmente desidratado, diafanizado e montado.
Para melhor descrever o modelo, foram realizadas análises densitométricas em estruturas hipocampais e corticais ao longo do eixo rostro-caudal. A densidade óptica da marcação de AchE foi captada de regiões previamente definidas e constante entre os diferentes animais. As medidas foram ajustadas como uma razão da intensidade de marcação do corpo caloso do mesmo corte. Em todas as mensurações, foram mantidas as mesmas condições de luminosidade. As imagens adquiridas foram convertidas em escala de cinza 0-255, das quais a densidade óptica de áreas predefinidas foi calculada pelo programa NIH-Image, acoplado a um microscópio Olympus PX50.
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Marcação por Thioflavina-S
A marcação por Thioflavina-S procedeu conforme descrita anteriormente [39]. Inicialmente, os cortes encefálicos foram montados sobre lâminas superfrost (Fisher Scientific, # 12-550-15). Em seguida, foram lavados em cinco banhos de PBS e, então, incubados em solução de thioflavina-s 0,1% contendo 0,1% de triton x-100 por cinco minutos. Depois, os cortes foram lavados em dois banhos de PBS e incubadas em solução de etanol 70% por cinco minutos. Por fim, as lâminas foram lavadas três vezes em PBS e cobertas com fluoromount.
ELISA:
Extração de peptídeo Aβ:
A extração de Aβ procedeu conforme protocolo padronizado anteriormente [40], no qual as amostras são convertidas a um homogenato comum para extração de peptídeos solúveis e insolúveis. A partir deste homogenato, os peptídeos Aβ solúveis foram extraídos por dietilamina 0,4% e os insolúvel por ácido fórmico 95%. Para tanto, as amostras foram pesadas e depois homogeneizadas em 10% (gramas de tecido / mL) da solução composta por 0,5M de EDTA, mais 0,25M de EGTA e Tris (base) 20mM, pH 7,4, a qual foram adicionados 17,4mg de fluoreto de fenilmetilsulfonila e 0,1mL de etanol 100%, mais inibidores de protease: 5µg de leupeptina, 5µg de antipaina HCl, 5µg de pespstatina A e 1µL de N-N-dimetilformamida. Depois, 1mL do homogenato foi misturado à solução aquosa de 1mL de dietilamina 0,4% e NaCl 100mM, por cinco minutos, em vórtex. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 100.000g, a 4° C, por uma hora. Ent ão o sobrenadante, contendo Aβ solúvel, foi coletado e neutralizado com solução de Tris-base 0,5Molar, pH 6,8.
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Depois, as amostras foram sonicadas por um minuto sobre gelo e, então, centrifugadas a 100 000g, a 4°C, por uma hora. Por fim, a fase intermediária da centrifugação foi coletada e neutralizada com 4mL de solução 0,5mg fosfato de sódio bibásico, 0,05% de azida de sódio e Tris-base 1M.
Elisa para Ab
Os níveis de Aβ40 e Aβ42 foram quantificados a partir dos extratos solúveis (por
dietilamina) e insolúveis (por ácido fórmico) por meio de Kits de ELISA específicos (Wako, #294-62501 e #290-62601, respectivamente para Aβ40 and
Aβ42 endógenos). A mensuração foi realizada de acordo com o protocolo do
fabricante, o qual recomendava que 100µL de amostra fossem incubados na placa de ELISA selada, por uma noite, a 4°C. Após c inco lavagens, 100µL de anticorpo conjugado a peroxidase foram adicionados à placa, a qual foi novamente selada e permaneceu por uma hora sob refrigeração. Em sequência, a placa foi lavada e incubada com 100µL (por orifício) de solução TMB, por 30 minutos, em temperatura ambiente.e no escuro. Por fim, a reação foi interrompida pela adição de solução STOP e a quantidade de peptídeo foi determinada em função da absorbância em 450nm.
Análise estatística:
Os dados que se apresentavam uma distribuição normal foram analisados por testes paramétricos, como ANOVA fatorial e ANOVA de medidas repetidas. Sempre que pertinente, os efeitos apontados por estes testes de hipótese foram detalhados por teste post-hoc de Tukey-Kramer.
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pelos critérios descritos acima. Desta forma, o N experimental foi expresso como graus de liberdade (GL).
Resultados
A massa corpórea dos animais experimentais foi acompanhada desde a cirurgia neonatal, sete dias após o nascimento. A partir da quinta semana de vida, surgiram diferenças no crescimento decorrentes do desenvolvimento diferenciado entre os gêneros. Estas diferenças mantiveram-se constantes ao logo do experimento, indiferente ao tratamento com lítio (Figura 2).
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Acetilcolinesterase (AChE)
Seis meses após a lesão induzida por IgGsap, a marcação por AChE revelou acentuada degeneração colinérgica, como mostrado na figura 3. Os animais mais afetados pela lesão,foram agrupados como IgGMax (figura 3C). Da mesma forma, os ratos, cuja degeneração foi parcial ou unilateral, foram alocados ao grupo IgGParcial (Figura 3B). E deste modo, os resultados coletados anteriormente à análise histológica foram reorganizados, conforme o grau de lesão/preservação das aferências colinérgicas.
Figura 3: Diferentes intensidades de marcação para AChE decorrentes da injeção intra-cerebroventricular de IgGsap, ou veículo. O quadro A exemplifica o integro sistema colinérgico seis meses após a injeção de PBS. Por outro lado, a figura C destaca a intensa degeneração das aferências colinérgicas destinadas ao córtex em animais submetidos a injeção de IgGsap. No entanto, em alguns casos, como na figura B, a administração de IgGsap apenas produziu uma lesão parcial ou unilateral. A barra de calibração, presente no canto inferior direito de cada figura, representa 0,5mm.
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(ANOVA fatorial, os valores de p para todas as estruturas foram inferiores a
0,001). A média de intensidade de marcação no hipocampo foi reduzida em 56 e 40% nos animais do grupo IgGMax e IgGParcial respectivamente (ANOVA fatorial, os valores de p para todas as estruturas foram inferiores a 0,0001)
Enquanto a IgGsap afetou a intensidade de marcação da AChE em todas as estruturas analizadas, o tratemento com LiCl não produziu qualquer efeito sobre a intensidade de marcação da AChE em animais com o sistema colinérgico intacto, nem com máxima degeneração. Por outro lado, o consumo de lítio esboçou um efeito em diminuir a marcação no hipocampo (exceto no Hilus) de animais parcialmente lesados (ANOVA fatorial, todos os valores de p
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Figura 4: a lesão colinérgica produzida pela administração de IgGsap. Decorridos seis meses após a cirurgia para injeção intracerebroventricular de IgGsap (e ao término do tratamento com LiCl por três meses), os animais foram perfundidos e suas secções coronais encefálicas foram processadas para marcação dos terminais pré-sinápticos colinérgicos por AChE. O gráfico ilustra a intensidade de marcação da AChE como a razão da medida de cada grupo experimental com o grupo Branco+Controle. As barras verticais representam o erro padrão. A IgGsap induziu uma redução na intensidade de marcação da AChE em todas as estruturas observadas (ANOVA fatorial, com valores de p
inferiores a 0,001 em regiões corticais e inferiores a 0,00001 em areas hipocampais). Em geral, o tratamento com lítio exerceu uma tendência em reduzir a marcação da AChE em estruturas hipocampais (exceto o hilo) do grupo IgGParcial (ANOVA fatorial, com valores de p inferiores a 0,1). Em
algumas regiões, como o giro denteado a 2,4 e 5mm e CA1 a 3,7 e 5mm distantes do bregma, este efeito mostrou-se estatisticamente significante (ANOVA fatorial, p < 0,05). PF = córtex pré-frontal; Cing = córtex cingulado; GD
= giro denteado; CA1, CA3 e hilo do hipocampo.
Labirinto Aquático de Morris (LAM)
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tratamento, os mesmos animais foram novamente analisados em LAM (LAM2). Deste modo, foi possível acompanhar a evolução de prejuízos cognitivos resultantes da degeneração colinérgica, assim como investigar os possíveis efeitos do tratamento com LiCl sobre as deficiências desenvolvidas nestes animais.
LAM1
Na versão de memória operacional, constatou-se que a lesão pela IgGsap comprometeu a latência média dos animais (efeito da lesão significante, ANOVA de medidas repetidas, F = 7,10; G.L. [efeito lesão/erro] = 3/29; p = 0,001), de modo que os ratos lesados necessitaram de um tempo
maior para atingir a plataforma em relação aos grupos controles. Entretanto, não foi possível identificar especificamente quais grupos demonstravam latências diferentes por teste Post-hoc (Tukey-Kramer, p >0,05). Mas, ao
analisar os intervalos de confiança, o grupo com máxima lesão (IgGMax) destaca-se por gastar um tempo superior para encontrar a plataforma, comparativamente aos grupos PBS e BRANCO. Apesar da IgGsap afetar a latência média dos animais, estes apresentaram curvas de aprendizagem semelhantes (ANOVA de medidas repetidas, F = 1,79 ; G.L. [interação modelo x latências repetidas] = 9/87; p = 0,08 e Poder = 0,88), ou seja, a progressão
da latência ao longo das tentativas foi igual a curva dos animais controles. Mesmo apresentando curvas de aprendizagem, que progrediram de maneira semelhante aos animais controles, os ratos com maior lesão pela IgG sap estabilizaram o tempo necessário para encontrar a plataforma em uma latência superior aos demais grupos (Figura 5), demonstrando assim, uma capacidade de aprendizagem mais limitada (ANOVA, p para média da latência das três
últimas tentativas = 0,0002 e Tukey-Kramer com p <0,05).
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representada pela progressão das distâncias percorridas ao longo das tentativas. O poder para interação lesão x curva de distância da ANOVA de medidas repetidas foi apenas 0,19. Assim, a probabilidade de identificar diferenças entre as curvas, se elas fossem de fato diferentes, seria de apenas 19%. Uma vez que, a distância é mais um indicador da memória e aprendizagem dos animais, da mesma forma que a latência, a sua análise torna-se redundante e a impossibilidade de confirmar os achados apresentados acima não compromete a interpretação dos resultados.
Na versão de momória espacial, a lesão pela IgGsap não afetou nem a latência média (ANOVA de medidas repetidas, F = 1,53; G.L. [interação lesão x latências repetidas/ erro] = 3/29; p = 0,23), nem a progressão da curva de
aprendizagem (ANOVA de medidas repetidas, F = 0,78; G.L. [interação lesão x latências repetidas/ erro] = 15/145; p = 0,69). Entretanto, o poder da análise
não foi suficiente para descartar com probidade os efeitos da IgGsap sobre os a memória de referência. Os resultados apresentados podem ser utilizados para estimar a variabilidade do fenômeno e o tamanho do efeito (diferença entre os grupos), permitindo estimar o tamanho do N experimental adequado. De fato, a diferença entre as latências dos grupos, nesta versão do LAM, foi tão pequena que demandaria um N de aproximadamente 45 ratos por grupo para fornecer poder adequado à análise (> 0,80).
LAM2
Ao retornarem ao LAM, os animais lesados pela IgGsap mantiveram uma latência média superior aos animais controle, na versão de memória operacional (ANOVA de medidas repetidas, F = 6,50; G.L. [fator lesão/erro] = 3/59; p = 0,0007). Contudo, assim como na versão de memória operacional
anterior ao tratamento, a degeneração colinérgica não influenciou o desenvolvimento da curva de aprendizagem dos animais e os ratos lesados continuaram demonstrando o mesmo padrão de aprendizagem que os grupos controles (ANOVA de medidas repetidas, F = 1,80; G.L. [interação lesão x latências repetidas/erro] = 9/177; p = 0,07). Como o poder da análise foi
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operacional. Da mesma forma, a degeneração seguiu afetando outro parâmetro: o plateau da aprendizagem. O máximo de aprendizagem alcançado por um animal com máxima lesão foi inferior (maior latência) comparativamente aos grupos Controle, Branco e aos ratos parcialmente lesados (ANOVA, F =
10,01, G.L. [fator lesão/erro] = 3/25; p = 0,00016; e p para Tukey-Kramer <
0,05).
Na mesma versão do LAM, o tratamento alterou a progressão da curva de aprendizagem (ANOVA de medidas repetidas, F = 3,32; G.L. [interação tratamento x latências repetidas/erro] = 3/177; p = 0,02). Efeito este que
mostrou-se indiferente ao status do sistema colinérgico (ANOVA de medidas repetidas, F = 1,68; G.L. [interação modelo x latências repetidas x tratamento/erro] = 9/177; p = 0,09; Poder = 0,84). No entanto, não há
evidências de que a influência do tratamento tenha sido positiva (nem negativa), uma vez que afetou a curva de aprendizagem sem alterar a latência média, independentemente do grau de preservação do sistema colinérgico (interação lesão x tratamento não foi significante, ANOVA de medidas repetidas, F = 1,26; G.L. [interação lesão x tratamento/erro] = 3/59; p = 0,29;
Poder = 0,90). Como o tratamento não afetou a latência media, supõe-se que não houve qualquer efeito específico do mesmo sobre a memória de nenhum grupo. Por fim, o plateau da memória operacional do grupo portador de máxima degeneração, o qual havia sido comprovado deficiente, não foi alterado pelo tratamento (ANOVA, F = 0,38; G.L. [interação lesão x tratamento/erro] = 3/25; p
= 0,76).
A análise das distâncias percorridas durante essa versão confirmou os efeitos demonstrados pela latência dos animais. E nenhuma diferença foi encontrada, quanto à velocidade de nado.
Na versão de memória de longo prazo , três meses após a primeira avaliação, os animais lesados pela IgGsap passaram a apresentar uma latência média superior aos grupos controles (ANOVA de medidas repetidas, F = 7,71; G.L. [fator lesão/erro] = 3/25; p = 0,0008), sugerindo comprometimento
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aprendizagem dos animais lesados (ANOVA de medidas repetidas, F = 1,85; G.L. [interação lesão x latências repetidas/erro] = 15/125; p = 0,03). Ao avaliar
os intervalos de confiança, sugere-se que os animais com máxima lesão apresentaram uma aprendizagem mais reduzida em comparação aos controles e até perante o grupo parcialmente lesado.
Apesar da análise não fornecer poder suficiente para afirmar, com segurança, que o tratamento não exerceu efeito algum sobre o desempenho dos animais neste teste de memória de referência, os resultados sugerem que isso seria esperado. A latência média dos animais não foi afetada pelo tratamento (ANOVA de medidas repetidas, F = 0,16; G.L. [fator tratamento/erro]; p = 0,69), não resultou em diferença na latência média entre
as condições experimentais (ANOVA de medidas repetidas, F = 0,21; G.L. [interação tratamento x lesão/erro] = 3/25; p = 0,88), nem influenciou a curva de
aprendizagem de cada grupo (ANOVA de medidas repetidas, F = 0,86; G.L. = 15/125; p = 0,61). Para que fosse possível descartar, com segurança, o efeito
do LiCl sobre a aprendizagem de acordo com a magnitude da lesão colinérgica seria necessário obter aproximadamente 20 ratos em cada grupo (para poder > 0,80).
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Figura 5: o desempenho de cada grupo experimental avaliado no LAM três meses após a cirurgia para indução da lesão colinérgica e ao término do tratamento com LiCl (seis meses após a cirurgia). As barras verticais ilustram o erro padrão para cada média.
Elisa de Aβ
Após seis meses de lesão, a degeneração colinérgica, na proporção obtida, não alterou os níveis dos peptídeos Aβ40, nem Aβ42. Da mesma forma,
não afetou a solubilidade dos peptídeos, de modo que a relação entre o Aβ
extraído por dietilamina e ácido fórmico manteve-se inalterada em animais lesados pela IgGsap em comparação com os controles (figura 6, ANOVA fatorial, p > 0.05).
Por sua vez, o tratamento com LiCl mostrou-se mais efetivo em modular os níveis de Aβ. O consumo de lítio reduziu a quantidade total de Aβ40 (ANOVA
fatorial, p = 0,016). Efeito este decorrente da redução de Aβ40 a partir das
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ácido fórmico (ANOVA fatorial, p = 0,018). A influência do tratamento com LiCl
sobre os níveis de Aβ mostrou-se indiferente ao status do sistema colinergico. Deste modo, o consumo de lítio promoveu a diminuição de 53 e 29% do Aβ40
solúvel nos córtices dos animais de sistema colinérgico intacto (Controle) e lesados pela IgGsap (IgGMax), respectivamente. Enquanto isso, os níveis de Aβ40 insolúvel (extraído por ácido fórmico) reduziram em 57% nos córtices de
animais de máxima degeneração colinérgica. Em córtices de animais controles, o tratamento diminuiu a quantidade de Aβ40 insolúvel para concentrações
inferiores a 0,25 pM (o limite mínimo de sensibilidade do Kit de Elisa).
Por outro lado, o tratamento com LiCl não alterou os níveis totais Aβ42 (ANOVA
Fatorial, p = 0,522), mas afetou sua solubilidade. Enquanto que os níveis de
Aβ42 extraído por dietilamina permaneceram inalterados com o consumo de
Lítio (ANOVA fatorial, p = 0,921), os efeitos do tratamento sobre os peptídeos
insolúveis mostraram-se dependentes do status colnérgico. Por um lado, o consumo de lítio aumentou em 377% a concentração de Aβ42 extraído por
ácido fórmico a partir de córtices de animais controles, mas por outro reduziu em 44% os níveis de Aβ42 em animais com máxima lesão colinérgica (ANOVA
fatorial para interação lesão-tratamento quanto ao Aβ42 extraído por ácido
fórmico, p = 0,008).
Além dos animais experimentais, um camundongo APPswe-PS1∆E9 e ratos infundidos com DAPT 4mM foram incluídos na quantificação de Aβ por Elisa como controles positivo e negativo, respectivamente. O animal APPswe-PS1∆E9 é portador de duas mutações causadoras de formas familiares de Alzheimer: a APP swedish e a deleção do nono exon da presenilina 1. Como resultado, o duplo transgênico mostrou maciço acúmulo de peptídeo Aβ: 143,70 pM de Aβ40 solúvel, 888,15 pM de Aβ40 insolúvel, 425,04 pM de Aβ42
solúvel e 3442,8 pM de Aβ42. Por sua vez, o DAPT é um inibidor de γ
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Figura 6: os níveis de Aβ exibidos de acordo com a isoforma do peptídeo e sua solubilidade. Ao término do tratamento com LiCl por 3 meses (seis meses após a lesão colinérgica), amostras de córtex foram recolhidas dos animais e destinadas a quantificação de Aβ por Elisa. A degeneração do sistema colinérgico não afetou os níveis de Aβ em qualquer das condições mensuradas ANOVA fatorial, p > 0,05). Por outro lado, o tratamento com LiCl reduziu a concentração de Aβ40 em ambos os protocolos de extração(factorial ANOVA,
p< 0.05).Por fim, o consumo de lítio afetou os níveis de Aβ42 insolúvel de
maneira dependente do status colinérgico, uma vez que aumentou a concentração do peptídeo em córtices intactos, mas diminui a quantidade do Aβ42 em córtices lesados (ANOVA fatorial, p < 0,05). As barras verticais
representam o erro padrão.
Marcação por Thioflavina-S
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Discussão:
O dano induzido pela DA sobre o sistema colinérgico vem sendo elucidado nas últimas décadas, no entanto pouco se conhece sobre como o sistema colinérgico comprometido afeta a doença. Desta forma, o presente trabalho preocupou-se em investigar como a degeneração colinérgica poderia interferir na progressão da DA. A princípio, reportamos a contribuição da lesão colinérgica nas deficiêncas de memória e aprendizagem, que surgem ao longo da DA. Para tanto, acompanhamos o desempenho mnemônico dos animais por seis meses, desde a lesão colinérgica neonatal pela IgGsap. De acordo com os resultados apresentados, os déficits relacionados à memória operacional surgem antes e são mais severos, do que a deficiência relacionada à memória espacial. E ainda, mostramos que a degeneração colinérgica causada pela injeção neonatal de IgGsap não alterou os níveis nem a solubilidade dos peptídeos Aβ.
A lesão colinérgica parecia satisfazer as condições para ser o modelo apropriado para estudar a DA, segundo relatos, de que reproduziria tanto os sintomas como a patologia da doença [25, 27-28, 41-42]. Assim, tivemos a oportunidade de avaliar os efeitos do consumo de LiCl nestes animais. No entanto, os efeitos do tratamento sobre a cognição dos animais foi tão sutil, que nem permitiu inferir, se o resultado do tratamento foi benéfico, ou prejudicial. Além disso, observou-se que o consumo de lítio promoveu a redução dos níveis de Aβ40, mas surpreendentemente, favoreceu o aumento de peptídeo
Aβ42 insoluvel, efeito este dependente da preservação do sistema colinérgico.
Os efeitos da degeneração colinérgica sobre marcador patológico e sintomas da Doença de Alzheimer
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animal [45]. Desta forma, o presente trabalho fornece evidências da idade aproximada, em que o déficit surge. Por sua vez, a memória operacional de ratos, cujo sistema colinergico foi gravemente afetado na infância, foi menos apreciada em estudos de animais adultos. De fato, nas condições empregadas neste trabalho, a deficiência da memória operacional mostrou-se mais ascentuada, do que o comprometimento da memória espacial e surgiu antes de qualquer indicativo de problemas na memoria de longo prazo.
Contudo, o sistema colinérgico não tem a honra de um comprometimento exclusivo durante a DA e outros sistemas neurotransmissores também podem contribuir para a deficiência cognitiva. Estudos anteiros mostraram que formas oligoméricas do Aβ, sobretudo ≥
50kDa, concentram-se sobre certos espinhos sinápitocos [46], onde modulariam a função de receptores como o receptor de NMDA. Por fim, a exposição ao Aβ oligomérico resulta em depressão da corrente por NMDA [47], inibição de LTP [48], dano oxidativo depente de influxo de Ca2+ por canais NMDA [49] e redução da quantidade destes receptores expostos na membrana sináptica (por mecanismos dependentes da ativação de receptores α7 nicotínicos) [47].
Segundo a hipótese da cascata amiloide, o aumento de agregados de Aβ desencadeia uma sucessão de eventos prejudiciais ao sistema nervoso, que acabam agravando a toxicicidade do peptídeo e conduzindo a doença rumo ao comprometimento do sistema nervoso central. Desta forma, avaliamos como a lesão colinérgica poderia interferir na evolução da doença pelo modo, com que a degeneração afetaria a concentração e solubilidade dos peptídeos Aβ.
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confronta evidências indiretas, de que a degeneração colinérgica poderia alterar o metabolismo do Aβ e assim promoveria a deposição de placas senis. Pelo que temos conhecimento, o presente trabalho é o primeiro estudo a quantificar diretamente os níveis dos peptídeos Aβ em diferentes condições de solubilidade neste modelo.
Além do controverso efeito da degeneração colinérgica sobre a expressão APP, uma série de evidências sugere, que a neurotransmissão colinérgica poderia modular o processamento de APP. Os receptores muscarínicos acoplados a proteína G M1, M3 e M5, uma vez ativados, induzem a fosfolipase-C a converter fosfatidilinositol em diacilglicerol e inositol-3-fosfato (IP3), Por sua vez, o IP3 ativa a PKC, que além de possíveis efeitos indiretos, pode fosforilar diretamente a APP e modular seu processamento. A consequência da influência colinérgica sobre os níveis de Aβ ainda é incerta, mas aparentemente a ativação de receptores muscarínicos M1 e M3 promove a atividade da α-secretase e também reduz o processamento da APP pela β -secretase, favorecendo a via não amiloidogênica, [52-53]. Desta forma, a carência de aferências colinérgicas poderia interromper os efeitos não amiloidogênicos da ativação muscarínica, logo aumentaria os níveis de Aβ. Contudo, a degeneração colinérgica gerada no presente trabalho (pela injeção de IgGsap) não alterou a concentração de nenhuma isoforma do Aβ, nem afetou a solubilidade do peptídeo. A manutenção da solubilidade sugere que a agregação do Aβ não foi influenciada pela lesão, assim acredita-se que a proporção entre formas solúveis (monômeros e oligômeros) e insolúveis (fibrilas e fibras) permaneceu inalterada. Desta forma, é esperado que a lesão colinérgica seja insuficiente para potencializar a toxicidade do Aβ.
A degeneração colinérgica gerada neste trabalho foi semelhante à lesão observada em encéfalos de pacientes acometidos pela DA [54]. Talvez, uma degeneração ainda maior pudesse até influenciar os níveis do peptídeo Aβ, mas o modelo deixaria de representar uma condição patológica real.
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ao desenvolvimento da DA, não seja atribuído a degeneração colinérgica do envelhecimento. Logo, a lesão colinérgica resulta em sintomas cognitivos (seja em indivíduos idosos, acometidos pela DA, ou ambos) e sua interferência sobre o desenvolvimento/evolução da doença é bastante modesta.
O tratamento com LiCl
O compromentimento colinérgico pode até não ser o único responsável pela deficiência cognitiva na DA, mas parece bastante importante. Enquanto a redução na atividade da ChAT correlacionou-se com o declínio cognitivo, mensurações corticais de neuropeptídeos, neuroaminas e seus metabólitos não mostraram relação com os déficits de memória [56]. Então, considerando a determinante participação da degeneração colinérgica sobre os prejuízo cognitivos da DA, seria imprescindível reproduzir a lesão, para gerar os mesmos sintomas da doença e, assim avaliar os efeitos do tratamento em um modelo representativo da enfermidade humana. Deste modo, a injeção intracerebroventricular de IgGsap pareceu mais tentadora, do que um modelo transgênico, o qual não reproduz o comprometimento colinérgico. No entanto, como discutido anteriormente, as 1001 utilidades da IgGsap parecem ter sido exageradas. Uma vez que a lesão não promoveu o acúmulo de Aβ, a deficiência resultante não poderia ser comparada à demência do tipo DA. Certamente, a injeção de IgGsap fornece um valioso modelo de demência, porém não tão característico da DA.
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animais com lesão máxima, justamentente, para deixar o grupo IgGMax mais homogêneo. No entanto, esta estratégia resultou na formação de um grupo reduzido (N=5) e com grande variabilidade, o que pode ter proporcionado a ideia equivocada de que o grupo IgGParcial + Controle apresentasse uma degeneração modesta em algumas estruturas.
O presente trabalho demonstrou um aumento de quase quatro vezes na concentração de Aβ42 insolúvel no córtex de animais não lesados após três
meses de terapia com LiCl, ainda que esse aumento esteja muito longe de se equiparar ao acúmulo do peptídeo em um modelo transgênico para a DA. No córtex de um camundongo APPswe-PS1∆E9 a concentração de Aβ42 insolúvel
atinge níveis 3000 vezes superior à concentração induzida no presente trabalho pelo consumo de lítio. Além disso, o aumento nos níveis de Aβ42
insolúvel induzído pelo tratamento não resultou na formação de nenhum depósito de amiloide positivo para thioflavina-s, sugerindo que a relevância biológica deste efeito seria questionável. Provavelmente, este efeito não seja suficiente para induzir a patologia da DA, mas seria um fator de risco para desenvolver a doença em casos com o sistema colinérgico preservado, principalmente durante períodos prolongados de tratamento.
Já foi publicado que o tratamento com lítio reduz a produção de Aβ em camundongos transgênicos para a DA (APP-Swedish/PS1P264L/wt) por meio da inibição da GSK3 [33]. Contudo, este efeito não permaneceu inabalável por muito tempo. Logo, outros pesquisadores mostraram que o lítio é pode aumentar a produção de Aβ em céllulas CHO, expressando a APP695 humana, de maneira independente da GSK3 [57]. É evidente, que um estudo in-vitro
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sem incluir o alterado metabolismo do peptídeo, que seria responsável pela doença.
Mesmo atuando sobre um quadro incompleto da DA, foi possível observar um intrigante efeito do tratamento com LiCl. O consumo de lítio reduziu os níveis de Aβ40, mas aumentou a concentração de Aβ42 insolúvel nos
córtices de animais controles. Surpreendentemente, este efeito foi dependente da preservação do sistema colínergico. A abrangente ação do lítio dificulta dissecar exatamente o mecanismo responsável por este efeito, mas provavelmente ele tenha resultado da modulação no processamento da APP pela γ-secretase. O lítio pode interagir com diversas moléculas envolvidas na síntese do Aβ. Ele é capaz de inibir a GSK-3, que além de modular o processamento da APP pela γ-secretase, também pode fosforilar esta proteína, o que resultaria em uma mudança conformacional da APP suficiente para alterar seu processamento [58]. Além disso, o lítio pode inibir a PKC, que também fosforila a APP. A fofoforilação da APP parecer prover um mecanismo pós-traducional de regulação do processamento desta proteína, um fenômeno de certa forma semelhante aos efeitos de mutações causadoras de DA familiar [59]. A APP apresenta vários sítios de fosforilação, sendo que o resultado depende do conjunto de sítios fosforilados, da isoforma e a presença de mutações [60-63]. Provavelmente, o efeito do consumo de lítio sobre os níveis de Aβ observados neste trabalho (redução de Aβ40 e aumento de Aβ42
insolúvel) seja devido a inibição da GSK-3, mas também requer um tônus de PKC, que é mantido pelas aferências colinérgicas.
Como mencionado anteriormente, a isoforma da APP é determinante sobre o resultado final da fosforilação desta proteína. Assim, diferentes isoformas de APP poderiam gerar dados conflitantes quanto aos efeitos do lítio sobre os níveis de Aβ. Desta forma, esperamos que estudar um modelo com a isoforma endógena da APP, por mais que seja a forma murina, contribua para a compreensão das consequências do tratamento com lítio em casos esporádicos da DA (98-99% do total de casos), cuja APP não carrega nenhuma mutação.
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próprio grupo, resultar em concentração plasmática de lítio dentro da faixa terapêutica do ion [35] e capaz de inibir a GSK-3 in vivo [36].
O aumento da concentração de Aβ42 insolúvel induzido pelo LiCl, em
córtices de animais não lesados, torna-se ainda mais importante, considerando que a degeneração colinérgica é comum, mas não é um fenômeno constante na DA. Na verdade, a degeneração colinérgica não é observada em estágios iniciais da doença. Davis e colaboradores mostraram, que os déficits colinérgicos não estão presentes em casos moderados da DA e sugem apenas tardiamente ao longo do curso da doença [64]. Além disso, a deficiência intelectual não é invariavelmente acompanhada pela morte neuronal no núcleo Basalis de Meynert [65]. Ainda que o sistema colinérgico seja a neurotransmissão afetada mais frequentemente, algumas raras degenerações seletivas de monoaminas podem ocorrer [14]. Por fim, a degeneração colinérgica parece ser dependente da idade de início da DA. Enquanto a perda neuronal no núcleo Basalis de Meynert é maciça em casos de início precoce, essa população neuronal pode permanecer quase inabalada em casos de início tardio da doença [66] [65]. Deste modo, o conjunto de resultados apresentados neste trabalho alerta que o uso de sais de lítio para fins profiláticos, ou durante estágios iniciais da DA poderia, na verdade, promover o acúmulo de Aβ e até agravar a progressão da doença. Assim, o tratamento com lítio seria um fator de risco para casos sem degeneração colinérgica.
Conclusões
49
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Efeito dos receptores IREM-1 sobre a inflamação induzida pelo
peptídeo A
ββββ
Introdução:
A doença de Alzheimer (DA) distingue-se das demais demancias pela formação de placas senis, emaranhados neurofibrilares (compostos pela proteína Tau hiper-fosforilada) e degeneração sináptica e neuronal. Apenas 1 a 2% dos casos de DA apresentam origem genética definida, sendo que todas as mutações causadoras da doença promovem o aumento dos níveis de Aβ
(tabela 1), o que rendeu ao peptídeo uma função central na origem da doença.
Tabela 1: distribuição das principais mutações relacionadas a DA. A tabela foi obtida a partir de [67]. Para atualização, consultar:
http://www.molgen.ua.ac.be/ADMutations/default.cfm?MT=1&ML=1&Page=Mut ByGene
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Aβ, entretanto ela é proporcionada pela inflamação às custas da produção de fatores potencialmente tóxicos. De fato, a secreção destes elementos pertence ao arsenal de estratégias do sistema imunológico para combater um antigêno e promover a regeneração tecidual. Contudo, como a inflamação é sustentada pela presença constante dos agregados de Aβ na DA, seus efeitos nocivos acabam superando suas propriedades benéficas, agravando ainda mais a toxicidade da doença.
Os astrócitos e micróglias são capazes de contribuir com a eliminação do Aβ, por meio da secreção das proteases IDE (insulin degrading enzyme), e
Neprelisina (NEP) e também por fagocitose. Entretanto, as células gliais somente potencializam o clerarance do peptídeo, quando são ativadas pelo
processo inflamatório, o qual coordena as células envolvidas a atuarem de maneira mais organizada, visando favorecer a eliminação dos antígenos e reparo do tecido. Contudo, conforme detalhado abaixo, alguns dos fatores utilizados para conduzir e amplificar a inflamação são tóxicos, ou podem originar metabólitos nocivos ao tecido nervoso [72] [73]. Assim, os agragados Aβ desencadeiam a secreção de um conjunto de fatores anti e pró-inflamatórios específicos para recrutar as células gliais a combaterem o peptídeo. Por fim, o desfecho desta batalha depende do preço pago para a remoção de Aβ, às custas da produção de elementos potencialmente tóxicos e possível dano do tecido.
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de Prion [74] e até inflamações sistemicas parecem contribuir com a neurotoxicidade central em modelo neurodegenerativo [80]. Na falta de um flagrante, várias evidências têm sido coletadas para se estabelecer formas, pelas quais a inflamação seria induzida na DA e como ela afetaria a doença. Alguns destes mecanismos estão descritos a seguir.
Ao serem expostas ao Aβ, as células do SNC recrutam e ativam novas células, amplificando a resposta, de modo que independente de qual célula tenha iniciado a sinalização, todo o tecido adjacente é recrutado a operar conjuntamente. Os astrócitos podem ser ativados diretamente pelo Aβ, produzindo quimiocinas MIP-α, MIP-β, MCP-1 e Rantes [81-85], que por sua vez recrutam micróglias, monócitos/macrófagos da corrente sanguínea, eosinófilos, basófilos e ainda induz a ativação de astrócitos vizinhos. As micróglias, além de serem recrutadas por quimiocinas de outras células (incluindo outras micróglias) podem ser atraídas pelo próprio Aβ [85] e ativadas, diretamente, pela ligação do Aβ aos receptores RAGE (receptor for advanced glycation end products), receptores para LPS, CD14 e para M-CSF
(fator estimulante de colonização de macrófago). E ainda, as micróglias podem
ser induzidas à ativação por citocinas inflamatórias como a IL-1β. Ao atingir determinado grau de maturação, fibrilas de Aβ passam a ativar o sistema complemento, resultando na opsonização das fibrilas pela via clássica (mas independente de anticorpo) e ativação de micróglias por receptores de complemento CR3 e CR4 [72]; [73].
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favorecem a ativação ainda maior do sistema imune e podem até lesar células pela formação de canais de ataque a membranas, quando o Aβ encontra-se associado à superfície celular [72] [73]. Entretanto, face a um evento neurodegenerativo, a ativação de micróglias é necessária ao reparo do tecido, uma vez que, ao atingirem a fonte quimiotática, as micróglias envolvem o tecido em degeneração, eliminando os restos de células mortas.
A DA, diferentemente de outras neurodegenerações, não compromete a integridade da barreira hematoencefálica. No entanto a inflamação presente na doença promove maior permeabilidade da barreira, permitindo a passagem de célullas do sistema imune periférico para o SNC. A IL-8 apresenta efeito quimiotático sobre neutrófilos e células endoteliais, enquanto as quimiocinas MIP1-α e MCP-1 atraem micróglias, monócitos/macrófagos, linfócitos T, basófilos e eosinófilos [73].
A secreção de IL-1β promove astrogliose, induzindo a produção de IL-6 e expressão de iNOS, e ainda ativa micróglias, estimulando-as a produzir mais IL-1β, resultando em um ciclo de ativação e expansão da inflamação. Além do esperado prejuízo do processo inflamatórios sobre a viabilidade neuronal, a produção de IL-1β é, particularmente, prejudicial ao sistema nervoso acometido pela DA, pois aumenta a atividade da acetilcolinesterase e induz a expressão de S100β, o qual induz a síntese de proteína precursora de Aβ [72]; [73]. Assim como a IL1-β, outras citocinas, como TNF-α e IFN-γ podem agravar a progressão da doença por promover maior expressão e processamento da APP [86-88]. Fatores pró-inflamatórios, como a IL1-β, não comprometem as funções cognitivas apenas por meio da neurotoxicidade induzida pela inflamação, como também agem diretamente sobre o funcionamento neuronal. Já foi demosntrado, que a IL-1β pode inibir LTP em neurônios hipocampais [89].
