LEANDRO SILVA WILLISH MARTOS
AVALIAÇÃO DA APOPTOSE NAS POPULAÇÕES LEUCOCITÁRIAS DO SANGUE PERIFÉRICO DE PACIENTES SÉPTICOS
São Paulo 2010
ii LEANDRO SILVA WILLISH MARTOS
AVALIAÇÃO DA APOPTOSE NAS POPULAÇÕES LEUCOCITÁRIAS DO SANGUE PERIFÉRICO DE PACIENTES SÉPTICOS
Orientador:
Prof. Dr. Reinaldo Salomão
São Paulo 2010
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
iv LEANDRO SILVA WILLISH MARTOS
AVALIAÇÃO DA APOPTOSE NAS POPULAÇÕES LEUCOCITÁRIAS DO SANGUE PERIFÉRICO DE PACIENTES SÉPTICOS
Orientador: Prof. Dr. Reinaldo Salomão
BANCA EXAMINADORA
TITULARES
Dr. Paulo Sérgio Martins
Prof. Dr. Fernando Dall-Pizzol
Dra. Aparecida Dalboni
SUPLENTE
Prof. Dr. Francisco Soriano
v
Martos, Leandro Silva Willish
Avaliação da apoptose nas populações leucocitárias do sangue
periférico de pacientes sépticos
xiv, 60f.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.
Título em inglês: Evaluation of apoptosis in leukocytes populations of the peripheral blood of septic patients.
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Dedicatória
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x Resumo
A sepse apresenta crescente incidência com elevada morbidade e mortalidade, sendo a principal causa de óbito nas unidades de terapia intensiva. O controle da infecção depende do adequado reconhecimento dos microrganismos pelas células do hospedeiro e de resposta efetora competente. Os linfócitos, monócitos e neutrófilos são as principais populações celulares do sangue periférico envolvidas nesse processo. A apoptose representa um importante mecanismo de controle da resposta imune, mas em condições críticas, a apoptose desregulada dessas células pode levar o hospedeiro a imunossupressão, dificultando o controle da sepse.
Este trabalho avaliou-se a porcentagem de apoptose em linfócitos monócitos e neutrófilos do sangue periférico de pacientes sépticos pela exposição de fosfatidilserina na superfície celular e pela detecção intracelular de caspase-3, também foi avaliado o número absoluto e percentual de linfócitos e suas subpopulações por citometria de fluxo. Foram incluídos 40 pacientes, sendo 4 em sepse, 9 em sepse grave e 27 em choque séptico, classificados de acordo com as definições do consenso de 1992. Quinze voluntários sadios foram incluídos para comparação. Nos ensaios de detecção de apoptose foi feita a separação dos leucócitos totais seguida de lise hipotônica das hemácias e marcação com anticorpos de superfície para identificação das populações leucocitarias. Para verificação da apoptose as amostras foram marcadas com anexina-V e coradas com Iodeto de Propídeo (PI) em tampão apropriado ou incubadas com anticorpo anti-caspase-3 após fixação e permeabilização. A contagem de linfócitos foi realizada em tubos TruCOUNT após a marcação com anticorpos anti-CD45, CD3, CD4, CD8, CD16/56 e CD19.
Não houve diferença no percentual de linfócitos totais em apoptose, porém observou-se menor apoptose tardia em linfócitos T nos pacientes sépticos quando comparados aos sadios ( P<0,05). Foi observada menor contagem absoluta de linfócitos totais, linfócitos T, TCD4+, TCD8+ e NK de pacientes sépticos (p<0,01), embora o percentual destas populações celulares tenha se mantido inalterado. Os resultados mostram que o menor número de linfócitos circulantes observados durante o quadro de sepse não pôde ser explicado pela presença de apoptose. A diminuição da contagem destas células na periferia pode significar uma migração para os tecidos ou órgãos linfóides desencadeada pela infecção.
xi lesão, talvez prolongando a meia vida e atividade dos neutrófilos, entretanto, essa apoptose diminuída pode contribuir para a lesão inflamatória sistêmica e predispor o desenvolvimento da síndrome de disfunção de múltiplos órgãos.
Os monócitos foram avaliados unicamente pela detecção intracelular de caspase-3, todavia, não foi encontrado diferença entre pacientes sépticos e indivíduos sadios. O mesmo ocorreu em amostras obtidas na admissão, 7º e 14º dia de seguimento. O percentual de monócitos com positividade para caspase-3 nos dias 0, 7 e 14 de sepse foi relacionado com a evolução dos pacientes em sobreviventes e óbitos, após 28 dias do diagnóstico. A análise realizada com amostras do D0 não indicou diferença na porcentagem de células apoptóticas entre os pacientes sobreviventes e que evoluíram a óbito. Entretanto, o percentual de apoptose observado no D7 mostrou que pacientes que evoluíram a óbito apresentaram menor porcentagem de células positivas para caspase-3 após 28 dias, e essa associação persistiu no seguimento de 60 e 180 dias. O papel da apoptose em monócitos parece ser muito importante na sepse, todavia são necessários novos estudos para elucidar a correlação entre apoptose de monócitos e sobrevida.
xii Abstract
Sepsis incidence continues to rise with significant morbidity and mortality and is the leading cause of death in intensive care units. Infection control depends on proper recognition of the microorganisms by immune cells and an adequade effector immune response. Lymphocytes, monocytes and neutrophils are the major peripheral blood cell populations involved in this process. Apoptosis is an important mechanism for controlling the immune response, however, in critical conditions, deregulated apoptosis can lead to immune suppression, difficulting the control of sepsis.
This study evaluated the percentage of apoptosis in peripheral blood derived lymphocytes, monocytes and neutrophils by means of exposure of phosphatidylserine on the cell surface and detection of intracellular caspase-3 and evaluated the absolute number and percentage of lymphocytes and their subpopulations by flow cytometry. Forty septic patients were included, of whom, 4 were septic, 9 presented severe sepsis and 27 were in septic shock, classified according to the definitions of the 1992´s consensus. Fifteen healthy volunteers’ were included for comparison. For apoptosis assays, total leucocytes were isolated from the whole blood by hypotonic lysis of the red blood cells and stained with surface antibodies in order to identify the leukocyte subpopulations. For apoptosis evaluation samples were stained with annexin-V and propidium iodide (PI) in an appropriate buffer or labeled with anti-caspase-3 after fixation and permeabilization. Lymphocyte counts were performed in TruCOUNT tubes after labeling the cells with anti-CD45, CD3, CD4, CD8, CD16/56 and CD19.
xiii a result of the cell migration to the lymphoid tissues or organs triggered by infection.
There were no differences in the percentage of early apoptosis in neutrophils of patients and healthy individuals. There was a decrease in the percentage of late apoptosis and a consequent increase in the percentage of viable cells in the patients when compared to the healthy subjects (P<0.05). There was no significant differences in the measurement of intracellular caspase-3 in neutrophils of patients compared to the healthy individuals. Analysis of apoptosis during the development os sepsis did not differ among the D0, D7 an D14 groups. There was no difference in the proportion of cells undergoing apoptosis between patients with sepsis who survived and those who died by the twenty-eight (D28) after the diagnosis of sepsis. Late apoptosis in neutrophils appears to be diminished. The possible biological effect of the reduction of apoptosis would be an adapted response to the injury, perhaps extending the half life and activity of neutrophils, however, this decreased apoptosis may contibute to inflammatory injury and predispose to the development of the multiple organ dysfunction syndrome.
Only intracellular caspase-3 was evaluated in monocyte population, and no differences were found between this marker on septic patients and healthy individuals. The same results were observed in samples from adminssion, 7 and 14 days of follow-up. The percentage of monocytes with caspase-3 activity on days 0, 7 and 14 of sepsis was related to patient outcome as regards of survival and non-survival, after 28 days of diagnosis. The analysis performed on samples from D0 did not indicate differences in the percentage of apoptotic cells among the survivors and non-survivors. To counterpoint, when this analysis was performed on D7, the percentage of cells positive for caspase-3 were lower in those who died when compared with the survivors after 28 days; besides, this association persisted on 60 and 180 days follow-up. The role of apoptosis in monocytes seems to be important in sepsis, however, further research is needed to elucidate the correlation between monocyte apoptosis and survival.
xiv Sumário
DEDICATÓRIA... vii
AGRADECIMENTOS.. ... viii
RESUMO... x
LISTAS... xvi
1. INTRODUÇÃO... 1
1.1 Definição da Sepse... 2
1.2 Epidemiologia da Sepse ... 3
1.3 Fisiopatologia... 4
1.4 Desencadeamento da resposta inflamatória... 6
1.5 Necrose e Apoptose. ... 8
1.6 Apoptose na sepse... 16
2. OBJETIVOS... 19
3. MATERIAIS E MÉTODOS... 21
3.1. Reagentes e soluções... 22
3.2 Anticorpos... 23
3.3. Grupo de indivíduos sadios e pacientes sépticos... 24
3.4. Coleta de sangue... 25
3.5. Casuística... 25
3.5.1 Critérios de Inclusão... 25
3.5.2 Critérios de exclusão... 26
3.5.3 Estadios da Sepse... 26
3.5.4 Informações clínicas e epidemiológicas dos pacientes sépticos e indivíduos sadios... 27
3.6. Extração de leucócitos totais... 30
3.7. Detecção de apoptose através da marcação por Anexina-V e Iodeto de Propídeo (PI)... 31
3.8. Detecção de apoptose através da marcação intracelular de Caspase 3... 32
xv
3.10 Citometria de fluxo... 35
3.10.1 Estratégia de aquisição para contagem absoluta de linfócitos 39 3.10.2 Análise das populações de linfócitos totais e subpopulações. 40 3.11. Análise estatística... 45
4. RESULTADOS... 46
4.1 Linfócitos... 47
4.2 Linfócitos T... 54
4.3 Monócitos... 60
4.4 Neutrófilos... 65
4.5 Contagem absoluta e percentual das populações e subpopulações de linfócitos... 72
5. DISCUSSÃO... 87
6. CONCLUSÃO... 96
7. BIBLIOGRAFIA ... 99
xvi Lista de figuras
Figura 1: Representação esquemática do LPS de Salmonella... 7
Figura 2: Principais diferenças entre apoptose e necrose... 9
Figura 3: Características morfológicas da apoptose... 11
Figura 4: Exteriorização da fosfatidilserina……… 12
Figura 5: Representação esquemática das vias de ativação da apoptose.. 13
Figura 6: Representação esquemática dos eventos apoptóticos... 16
Figura 7: Estratégia de aquisição……… 36
Figura 8: Estratégia de análise de linfócitos... 37
Figura 9: Estratégia de análise de monócitos e neutrófilos... 37
Figura 10: Estratégia de análise da detecção de apoptose através da marcação por Anexina-V e Iodeto de Propídeo (PI)... 38
Figura 11: Estratégia de análise da detecção de apoptose através da marcação de caspase-3... 38
Figura 12: Aquisição de eventos para contagem linfócitos... 39
Figura 13: Estratégia de análise de linfócitos T... 40
Figura 14: Estratégia de análise das subpopulações de linfócitos T... 41
Figura 15: Contagem das partículas de referências... 42
Figura 16: Estratégia de análise das populações de linfócitos B e NK... 43
Figura 17: Contagem das partículas de referências... 43
Figura 18: Linfócitos em apoptose e células viáveis no sangue periférico de indivíduos sadios e pacientes sépticos... 48
Figura 19: Apoptose em linfócitos de pacientes sépticos nos dias 0, 7 e 14 de seguimento... 50
Figura 20: Linfócitos dos pacientes sépticos durante os 14 dias de evolução da sepse relacionado com sobrevida... 53
Figura 21: Células em apoptose e células viáveis em linfócitos T do sangue periférico de indivíduos sadios e pacientes sépticos avaliada pelo método de anexina V e iodeto de propídeo... 55
xvii Figura 23: Linfócitos T de pacientes sépticos durante os 14 dias de evolução da sepse relacionado com sobrevida... 59 Figura 24: Percentuais de monócitos do sangue periférico em apoptose de indivíduos sadios e pacientes sépticos avaliada pela detecção intracelular de caspase-3... 60 Figura 25: Percentuais de monócitos em apoptose de pacientes sépticos
nos 14 dias de seguimento. 61
xviii seguimento... 83 Figura 39: Percentual e numero absoluto de linfócitos T CD8+ por microlitro de sangue periférico de pacientes sépticos nos dias 0, 7 e 14 de seguimento... 84 Figura 40: Percentual de linfócitos e numero absoluto de linfócitos B por microlitro de sangue periférico de pacientes sépticos nos dias 0, 7 e 14 de seguimento... 85 Figura 41: Percentual e contagem absoluta de células NK do sangue periférico de pacientes sépticos nos dias 0, 7 e 14 de seguimento... 86
xix Lista de tabelas
xxi Lista de Abreviaturas e Símbolos
AP-1: proteína ativadora-1 APC: aloficocianina
BD: Becton Dickinson
BSA: albumina bovina
Bpm: batimentos por minuto
CD: “cluster of differentiation” CO2:dióxido de carbono °C: graus Celsius
EDTA: ácido etilenodiaminotetraacético
Eros: espécies reativas de oxigênio
FADD: proteína associada ao domínio de morte de FAS
FC: freqüência cardíaca
FCS: soro fetal bovino
FITC: fluoresceína isotiocianato
FR: freqüência respiratória
G: gravidade (velocidade de centrifugação)
g: grama
I B: inibidor de NF- B
ICS: infecções da corrente sanguínea
IFN: interferon IL: interleucina
IL-1 : interleucina-1 beta
IL-1R: receptores de IL-1
IL-6: interleucina-6
IL-10: interleucina-10
IRAK: quinase associada ao IL-1R IRF: fator regulador de interferon
LBP: proteína ligante de lipopolisacarídeo LPS: lipopolissacarídeo
g: micrograma
l: microlitro
M: molaridade
Mal/TIRAP: proteína adaptadora tipo MyD88 MALP-2: lipopeptídeo estimulador de macrófagos MAPKs: proteínas quinases ativadoras de mitose MD-2: proteína de diferenciação mielóde-2
Min: minuto
ml: mililitro
MyD88: proteína de diferenciação mielóide 88 mRNA: ácido ribonucléico mensageiro
NF- : fator nuclear-kappa B NO: óxido nítrico
NOD: “nucleotide-binding oligomerization domain” PAMP: padrão molecular associado à patógenos
xxii PE: ficoeritrina
PerCP: clorofila peridinina
PRR: receptor de reconhecimento padrão
ROS: espécies reativas de oxigênio
SIRS: síndrome da resposta inflamatória sistêmica
sCD14: CD14 sóluvel
TGF- : fator transformador de crescimento-beta
TICAM-1/TRIF: molécula adaptadora contendo o domínio TIR-1 TIR: domínio homólogo ao receptor Toll/IL-1
TIRAP/MAL: proteína adaptadora tipo MyD88 TLR: “Toll-like Receptor”
tlr4: “toll-like receptor-4 gene”
TNF- :fator de necrose tumoral-alfa TNFR: receptor de TNF
TRAM: molécula adaptadora relacionada à TRIF TRIF: molécula indutora de interferon-beta
2
1. INTRODUÇÃO
1.1 - Definição da Sepse
A sepse pode ser definida como a repercussão sistêmica da infecção. Manifestando-se como diferentes estadios clínicos de um mesmo processo
fisiopatológico, é, para o médico, um de seus maiores desafios, uma emergência médica associada à elevada morbidade e mortalidade. No início da década de 90, em reunião de consenso das Sociedades de Terapia Intensiva e
de Pneumonologistas (American College of Chest Physicians/ Society of
Critical Care - Bone et al.; 1992a) se procurou estabelecer uma padronização
para o diagnóstico de sepse e suas complicações, levando-se em consideração os avanços da compreensão de sua fisiopatologia. Reconheceu-se que uma grande diversidade de causas poderia levar um quadro clínico comum,
caracterizado pelo desencadeamento da resposta inflamatória do hospedeiro. Este quadro foi definido como Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica (SIRS, do inglês Systemic Inflammatory Response Syndrome) e seria
desencadeado por pancreatite, queimaduras, trauma e outros, ficando o termo sepse restrito a SIRS causada por infecção, ou seja, resposta inflamatória
causada por infecção. SIRS, sepse, sepse grave e choque séptico representam um continuum clínico de gravidade fisiopatológica. O processo começa com
3 de temperatura (hipotermia ou hipertermia), elevação de freqüência respiratória (FR>20 irpm), de freqüência cardíaca (FC> 90 bpm), e presença de
leucocitose, leucopenia ou de células imaturas no sangue periférico. A presença de sepse e pelo menos uma disfunção orgânica caracteriza a sepse
grave. A existência de hipotensão refratária à adequada administração de fluído com hipoperfusão evidencia o choque séptico onde representa sua expressão mais grave. (Bone et al., 1992b).
1.2 - Epidemiologia da Sepse
A importância da sepse pode ser inferida pela sua elevada morbidade e mortalidade. Avaliando incidência e mortalidade associadas às infecções de
corrente sanguínea (ICS) no Hospital São Paulo, hospital de ensino da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), entre 1985 e 1986, foram
encontrados 21,7 episódios por 1000 admissões, com mortalidade de 33,4% (Salomão et al., 1992; 1993). Estudo conduzido na Universidade de Iowa,
Estados Unidos da América (EUA), entre 1980 e 1992, mostrou aumento de
praticamente três vezes na incidência de ICS adquiridas no hospital (Pittet & Wenzel, 1995). Mais recentemente estudos utilizando diagnósticos clínicos e laboratoriais de sepse e com base populacional foram conduzidos. O mais
completo, avaliando internações entre o ano de 1979 a 2000, com amostragem representativa do conjunto dos hospitais americanos, mostrou que a incidência
4 Outro estudo estimou a ocorrência de 750.000 casos de sepse anualmente nos EUA, com cerca de 210.000 óbitos (Angus et al., 2001). Um estudo brasileiro
multicêntrico observacional (BASES - Brazilian Sepsis Epidemiological Study)
conduzido em cinco unidades de terapia intensiva, de maio de 2001 a janeiro
de 2002, mostrou incidência de sepse 61,4; sepse grave 35,6 e choque séptico 30,0 para cada 1000 pacientes-dia. As taxas de mortalidade para os pacientes em sepse, sepse grave e choque séptico foram de 34,7%; 47,3% e 52,2%;
respectivamente (Silva et al., 2004).
1.3 - Fisiopatologia
A compreensão da sepse é complexa porque envolve múltiplos fatores
simultaneamente como virulência, tamanho do inóculo, doenças de base, estado nutricional, idade e presença de polimorfismos que interferem na
resposta imune. Os mecanismos adaptativos da resposta imune e inflamatória do hospedeiro na sepse são imperativos no controle da infecção, e ao mesmo tempo, é mediadora de alterações funcionais, que são a base fisiopatológica
das manifestações clínicas. Importantes progressos foram obtidos no entendimento da patogenia da sepse nos últimos anos destacando-se o mecanismo de reconhecimento de antígenos bacterianos e a melhor
compreensão dos mecanismos de sinalização celular, que são descritos a seguir.
5 sepse, as alterações induzidas na célula endotelial constituem um importante substrato fisiopatológico. Há alterações do seu citoesqueleto, alterações
funcionais, como síntese de mediadores com efeitos quimiotáticos, além do aumento da expressão de moléculas de adesão. Ainda, a liberação de
vasodilatadores potentes como o óxido nítrico (NO) pelas células inflamatórias e endoteliais leva a uma importante vasodilatação. As citocinas inflamatórias desencadeiam também a cascata de coagulação, principalmente pela
exposição do fator tissular, criando um ambiente de exacerbação da inflamação e coagulação.
A regulação negativa de proteínas com função anticoagulante contribui ainda mais para a indução da coagulação. Como resultado tem-se a adesão de neutrófilos e monócitos às células endoteliais, migração para o extravascular,
extravasamento de fluídos para o interstício, coagulação intravascular, que em conjunto com alteração do tônus resultam em alterações da microcirculação e
levam à hipóxia tecidual e consequente disfunção de órgãos e sistemas. Importante ainda, a disfunção celular desencadeada pela sepse pode persistir mesmo após estabelecimento do fluxo sanguíneo aos tecidos, por mecanismos
de sofrimento celular, referido como choque citopático (Salomão et al., 1999;
Rigato et al., 2001; Cohen, 2002; Hotchkiss & Karl, 2003).
A melhor percepção da fisiopatologia da sepse é importante para
6 1.4 - Desencadeamento da resposta inflamatória
A similaridade entre os efeitos fisiopatológicos agudos induzidos pelo LPS e as manifestações da sepse por Gram-negativos levou a hipótese de que o LPS, liberado da bactéria in vivo, é responsável pela indução dos sintomas
da septicemia. As bactérias Gram-negativas possuem em sua membrana externa o LPS, que desempenha importante função na viabilidade bacteriana e
na interação com o hospedeiro (Rietschel et al., 1982).
Após a morte e lise, e também quando a bactéria se multiplica, o LPS é
liberado da superfície bacteriana. A molécula do LPS pode ser dividida, estrutural e funcionalmente, em três sub-regiões: polissacarídeo O, região central ("core") e o lipídeo A (figura 1). O lipídeo A representa a estrutura mais
conservada do LPS e retém a toxicidade da molécula (Galanos et al., 1979a).
Por intermédio do lipídeo A, o LPS interage com vários tipos celulares, como
células mononucleares, células endoteliais, polimorfonucleares e de particular importância os monócitos e macrófagos. A ativação dos macrófagos pelo LPS resulta na liberação de mediadores como o fator de necrose tumoral-alfa
(TNF-), interleucina-1 (IL-1(TNF-), IL-6, IL-8 e IL-10. Estes mediadores têm atividade bioativa potente e podem atuar em sinergismo ou ter efeito antagônico a endotoxina (Rietschel et al., 1994). In vivo, estas moléculas podem ter ação
7
Figura 1: Representação esquemática do LPS de Salmonella (adaptado de Galanos et al., 1979a).
A ação biológica do LPS é modulada por proteínas presentes no soro, como a proteína ligante de lipopolissacarídeo (LBP) (Schumann et al., 1990). A
LBP facilita a ligação do LPS ao CD14, potencializando a ativação do macrófago induzida pelo LPS, e subsequente produção de citocinas pro-inflamatórias, como o TNF- (Schumann et al., 1990; Wright et al., 1990).
O CD14, caracterizado inicialmente como o mais importante receptor de LPS, apresenta-se em duas formas: o CD14 solúvel (sCD14) e o CD14 ligado à
membrana celular (mCD14) (Wright et al., 1990). O CD14 é encontrado na
membrana de monócitos, macrófagos e em menor proporção em granulócitos
(Ziegler-Heitbrock & Ulevitch, 1993).
O CD14 não possui porção intracelular e para transmitir o sinal de ativação utiliza o receptor tipo Toll (“Toll-like receptor 4” - TLR4). O receptor
Toll foi originalmente descoberto na Drosophila melanogaster. O primeiro
homólogo humano do Toll de Drosophila foi descrito por Medzhitov et al em
1997, devido sua capacidade de ativar a imunidade adaptativa.
Os TLRs são compostos por proteínas transmembranas ricas em leucina com porção citoplasmática muito similar ao receptor de interleucina-1,
8 investigação em camundongos sensíveis (C3H/HeN) e resistentes (C3H/HeJ e C57Bl10/ScCR) ao LPS por Poltorak et al. (1998). O TLR4 necessita da
proteína de diferenciação mielóide-2 (MD-2) que se encontra acoplada a parte extracelular do TLR4, conferindo uma maior sensibilidade ao LPS, provavelmente através da estabilização dos dímeros do TLR4 (Shimazu et al.,
1999).
A cascata de sinalização tem caminhos que se sobrepõem e resultam na
ativação de fatores de transcrição. A cascata de ativação é desencadeada após a ligação do LPS ao complexo TLR4/MD-2, existem quatro proteínas
adaptadoras envolvidas na sinalização da ativação pelo TLR4: fator de diferenciação mielóide 88 (MyD88), adaptadora tipo MyD88 (Mal) também chamada de proteína adaptadora contendo o domínio TIR (TIRAP), molécula
adaptadora contendo o domínio TIR-1 (TICAM-1) também chamada de adaptadora indutora de interferon- (TRIF) e molécula adaptadora relacionada
à TRIF (TRAM) (Takeda & Akira, 2005).
1.5 - Necrose e Apoptose
Definição e vias de ativação
A necrose é uma forma patológica de morte celular que pode ser induzida por injúria grave, como hipertemia, hipóxia ou altas concentrações de
9 subprodutos, os quais estimulam uma inflamação exudativa. Essa característica é importantíssima na diferenciação de apoptose e necrose, pois
na apoptose não ocorre esse processo inflamatório intenso devido a não liberação das enzimas lisossomais tóxicas e proteases no espaço intersticial.
Nas células necróticas o núcleo sofre desorganização da cromatina e intumescimentos, podendo exibir estruturas vacuolizadas (figura 2) (Hotchkiss
et al., 2003).
Figura 2: Principais diferenças entre apoptose e necrose (Adaptado de http://ihome.cuhk.edu.hk/~b105122/n6.htm).
O termo morte celular programada ou apoptose é uma forma fisiológica de morte celular, proporcionando um mecanismo seguro para eliminação de
10 A palavra apoptose é de origem grega e descreve o processo da queda de folhas das árvores no outono, uma parte necessária no ciclo de vida das
plantas. O termo apoptose foi utilizado pela primeira vez por Kerr, Wyllie e Currie em 1972 onde descreveram morfologicamente a forma distinta das
células mortas. No entanto, certos componentes do conceito de apoptose já haviam sido descritos vários anos antes. Este é um fenômeno muito frequente, tanto em estados fisiológicos como patológicos, onde a célula é estimulada a
acionar mecanismos que culminam em sua morte (Kerr et al., 1972; Kerr,
2002).
Em condições normais é um mecanismo importante na remodelação de órgãos durante a embriogênese e na vida pós-natal, além do controle da diferenciação e proliferação celular. Em estados patológicos, os danos podem
ser associados à resistência da apoptose, como no caso de alguns tipos de câncer, doenças autoimunes e malformações; ou podem ser associados ao
excesso de apoptose, como processos infecciosos, doenças neurodegenerativas e neuromusculares (Brasileiro & Bogliolo, 2001).
A morte celular por apoptose é geneticamente mediada por um percurso
bioquímico e foi primeiramente caracterizada como tal por mudanças nos aspectos morfológicos celulares identificados ao microscópio. Muitos estudos utilizam um fenômeno clássico para investigar o decurso da apoptose como a
exposição da fosfatidilserina, que em células viáveis encontra-se interiorizadae em células apoptóticas apresenta-se exteriorizada, devido as mudanças na
estrutura da membrana (Engeland et al., 1998).
11 a margem nuclear contra o envelope nuclear e concentração do citoplasma. A condensação da cromatina é acompanhada por invaginação das membranas
celular e nuclear, seguida pela ruptura do núcleo em fragmentos, que se tornam circundados por partes do envoltório nuclear (figura 3). Surgem então
os corpos apoptóticos (ou vesículas apoptóticas), contendo parte do citoplasma e do núcleo, expressando marcadores de superfície que permitem serem rapidamente reconhecidos e fagocitados por macrófagos ou outras células do
sistema imune ou ainda, por células adjacentes (“fagócitos”) (Elmore S, 2007).
Figura 3: Características morfológicas da apoptose (Adaptado de KERR, 1972).
O encolhimento e a condensação do citoplasma se devem à perda de água e ao acúmulo de proteínas desnaturadas, embora haja evidências de
12 culminado com sua fragmentação. A condensação da cromatina parece decorrer da ação de endonucleases que clivam os filamentos de cromatinas
nos espaços entre os nucleossomos gerando fragmentos de DNA (Schroeder
et al., 2001).
Durante a formação dos corpos apoptóticos ocorre a inversão da localização dos fosfolípides da membrana plasmática devido às mudanças em sua estrutura. A fosfatidilserina é um fosfolipídio presente nas camadas mais
internas da membrana plasmática. Quando a célula entra em apoptose e se formam os corpos apoptóticos este fosfolípide é exteriorizado, ou seja, está
presente na porção externa da célula como mostra a figura 4 (Azevedo, 2007).
Figura 4: Exteriorização da fosfatidilserina (Adaptado de Van Engeland, 1998).
De maneira geral, a morte celular por apoptose resulta de uma das duas
13
Figura 5: Representação esquemática das vias de ativação da apoptose.
(http://homepage.usask.ca/~vim458/advirol/SPCV/mitochondria/mitochondria.html).
A via intrínseca pode ser desencadeada em diversas situações, como na
presença de citocinas, espécies reativas de oxigênio (EROs), esteróides, danos no DNA e carência de fator de crescimento. A sinalização por esta via é mediada através de um complexo de estímulos que envolvem a mitocôndria e,
algumas vezes a via do retículo endoplasmático, proporcionando a liberação do citocromo C, que em condições normais de sobrevivência celular encontra-se junto ao espaço intermembrana da mitocôndria (Lindoholm et al., 2004). As
proteínas da família Bcl-2 são determinantes principais da sobrevivência da célula, controlando a formação de poros na membrana da mitocôndria
induzidos pelos diferentes sinais de morte que convergem na organela. Esses poros são importantíssimos na liberação do citocromo C para o citosol (Danial
& Korsmeyer, 2004), onde forma-se um complexo conhecido como
Via Intrínseca Via Extrínseca
estresse, viroses, etc
Citoplasma
Fragmentação do DNA do hospedeiro
14 apoptossomo, constituído por citocromo C, adaptador (Apaf-1) e caspase-9 (Hengartner, 2000), levando a ativação por autoclivagem da caspase-9 e assim
ativando a cascata de caspases, que são enzimas, ou seja, proteases de cisteínas, que clivam cadeias de proteínas após resíduos de ácido aspártico, resultando em morte celular (Aceham et al., 2002). A complexidade deste
caminho permite a regulação minuciosa da morte da célula e fornece a possibilidade de intervenção na cascata antes ou após o envolvimento da
mitocôndria. Em geral, os principais estímulos pró-apoptóticos responsáveis pela ativação da via intrínsica são decorrentes da ativação de proteínas da família Bcl-2, como por exemplo, Bax (Bcl-2 associated X protein) e Bak (Bcl-2
antagonist/killer). Portanto, células desprovidas dessas proteínas são
resistentes a apoptose mediada por essa via (Lindoholm & Arumae, 2004).
A via do retículo endoplasmático é importante devido o seu mecanismo aparentemente envolver o aumento de cálcio no conteúdo intracelular. Há
indícios que moléculas como Bax, Bak e Bcl-2, também induzem as alterações de cálcio no conteúdo do retículo endoplasmático proporcionando liberação de cálcio no citossol e propagação do estímulo apoptótico. A ativação da apoptose
via liberação de cálcio pode liberar o citocromo C da mitocôndria, sendo a interação mais conhecida entre as vias mitocondriais e do retículo endoplasmático na apoptose. Entretanto o aumento de cálcio é capaz de
induzir apoptose por clivagem da Bid ou por ativação de caspase 12, que aparentemente migra para o citosol e ativa a caspase-9 independente da
formação do apoptossomo (Silva & Velascos 2007).
15 FasL. Tanto o Fas quanto o seu ligante, são normalmente induzidos durante uma resposta imune adaptativa (Marsik et al., 2003). A apoptose é iniciada pela
estimulação do receptor Fas através da ligação do FasL, induzindo trimerização do receptor. As porções citoplasmáticas dos receptores ligam-se
às moléculas adaptadoras (FADD) que, por sua vez, ligam-se à uma caspase contracorrente, chamada caspase-8. Isso leva à ativação de caspase-8 por autoclivagem, que então ativa a cascata de caspases (Engeland et al., 1998).
As vias intrínseca e extrínseca interagem em suas cascatas de ativação intracelular. A caspase-8 não cliva somente outras caspases, mas também um
membro da família Bcl-2, chamado Bid. A Bid, ao contrário de outros membros da família Bcl-2, induz a apoptose. Normalmente, ela está retida em forma inativa no citosol. Entretanto, a clivagem por caspase-8 permite à Bid translocar
para a mitocôndria, onde ela rompe a membrana e libera o citocromo C para o citosol. Isto leva à ativação de caspase-9, promovendo a amplificação da
cascata de caspases iniciada pela ativação direta de caspase-8 em receptores de morte celular (Hotchkiss et al., 2005).
Embora existam diferentes vias de sinalização, todas culminam em uma
única caspase denominada caspase-3 efetora (figura 6). Em seguida ocorre a ativação de uma DNAse (CAD), esta por sua vez entra no núcleo e cliva o DNA, produzindo fragmentos característicos de uma célula apoptótica. Uma
das descobertas mais emocionantes foi a elucidação do mecanismo de ativação da nuclease. Essa nuclease fragmenta o DNA genômico entre os
16
Figura 6: Representação esquemática dos eventos apoptóticos (VENKATACHALAM,
2000).
1.6 - Apoptose na sepse
Os modernos conhecimentos da biologia celular têm revelado a cada dia
que a morte celular programada e seus indutores e inibidores podem ser a chave para a compreensão de muitas patologias e doenças. Apoptose e suas
disfunções têm um papel crucial na sepse, onde tem sido observado mudanças na dinâmica e regulação da apoptose. Essas mudanças são observadas nos neutrófilos, entre outras células do sistema imune inato, e nos linfócitos T, que
fazem parte do sistema imune adaptativo (Mahidhara & Billiar, 2000).
Os linfócitos B e T têm papel importante no desenvolvimento da resposta
17 processo relacionado à deleção de linfócitos auto-reativos ou à contenção da ativação de células imunes. Em condições críticas, a apoptose desregulada no
timo, no baço e no tecido linfóide associado a mucosas pode levar o hospedeiro a imunossupressão, dificultando o controle da sepse (Silva &
Velascos, 2007).
Modelos animais demonstram que o bloqueio da apoptose de linfócitos melhora a sobrevida na sepse. A utilização de estratégias para inibir a
apoptose pode melhorar a sobrevida e proporcionar uma terapia eficaz (Hotchkiss et al., 2005).
Em modelo experimental Hotchkiss et al. observaram a melhora na
sobrevida de camundongos sépticos depletados de caspase-3 quando comparado com camundongos selvagens. O uso de inibidor seletivo de
caspase-3 nos animais selvagens também resultou em melhora, indicando que a redução da apoptose pode aumentar a sobrevida na sepse (Hotchkiss et al.,
2000).
Tulzo et al. e Schroeder et al. mensuraram a apoptose através da
detecção da fosfatidilserina na membrana celular de linfócitos em sangue total
de pacientes sépticos e observaram um aumento significativo da apoptose nos linfócitos T (Tulzo et al., 2002; Schroeder et al., 2001). Além disso, Salomão et
al. observaram uma expressão aumentada de CD95 em linfócitos T de
pacientes com sepse quando comparado com voluntários sadios (Salomão et
al., 2002).
Adrie et al. estudaram monócitos de sangue periférico e observaram um
18 sépticos comparado ao grupo controle. Neste mesmo estudo, ao dividir-se o grupo de pacientes com sepse grave em sobreviventes e não sobreviventes
obtiveram um aumento significativo na porcentagem de células com despolarização na mitocôndria no grupo de não sobreviventes. Ao verificar a
expressão de Bcl-2 detectaram um aumento também significativo desta proteína nos indivíduos sobreviventes quando comparado com os não sobreviventes (Adrie et al., 2001).
Utilizando-se a citometria de fluxo, Taneja et al. observaram diminuição
da apoptose em neutrófilos de pacientes sépticos em relação ao grupo controle, demonstrado pela redução da expressão de caspase-9 e 3 (Taneja et
al., 2004). Em oposição, Martins et al. observaram um aumento na apoptose de
neutrófilos de pacientes sépticos, ( Martins et al., 2003).
Desta forma, a apoptose é um evento regulado de forma complexa na sepse. Por um lado, estudos experimentais demonstram que o bloqueio da
apoptose em linfócitos pode ser protetor na sepse. Entretanto, estudos clínicos apontam para exacerbação da apoptose em linfócitos circulantes de pacientes sépticos (Silva & Velascos, 2007).
A melhor caracterização do papel da apoptose na sepse e na disfunção de múltiplos órgãos pode ser de grande importância na decisão de qual ou quais métodos terapêuticos devem ser adotados no controle dessas patologias
(Martins et al., 2003).
20
2. OBJETIVOS
Avaliar a ocorrência de apoptose precoce, apoptose tardia e células viáveis em linfócitos, linfócitos T e neutrófilos através do método de anexina V e iodeto de propídeo assim como pela marcação intracelular de caspase-3
ativa em linfócitos, linfócitos T, monócitos e neutrófilos do sangue periférico de pacientes sépticos.
Investigar se o índice de apoptose em pacientes sépticos está relacionado com a sobrevida dos pacientes sépticos.
Avaliar a contagem absoluta dos linfócitos, linfócitos T, linfócitos T CD4,
22
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Reagentes e soluções
- PBS 0,15M pH 7,2 (8g NaCl (Labsynth, Diadema, SP, Brasil); 0,2g KH2PO4
(Labsynth); 1,15g Na2HPO4 (Labsynth); 0,2g KCl (Labsynth) diluído em 1 litro
de água destilada).
- Tampão de Marcação pH 7,4-7,6 (PBS 1% Soro Fetal Bovino (Invitrogen,
cidade, estado, país); 0,1% Azida Sódica (Sigma, Saint Louis, MO, EUA).
- Solução de NaCl 0,2% (1g de NaCl diluído em 500mL de água destilada).
- Solução de NaCl 1,6% (8g de NaCl diluído em 500mL de água destilada).
- Kit para Detecção de Apoptose por Anexina V (BDBioscience, San Diego,
CA, EUA) composto por Anexina V-FITC, Iodeto de Propídeio e tampão de marcação 10x concentrado.
- Trypan Blue ( Sigma) 0,1% em PBS.
- Tampão de Fixação [PBS 4% paraformaldeído (Polysciences, Warrington,
PA ,EUA), pH 7,4-7,6].
- Tampão de Permeabilização [solução de lise BDBiocience diluída para 2
vezes concentrada em água destilada; 0,05% Tween 20 (Casa Americana
de Artigos para Laboratório, São Paulo, SP, Brasil)].
- Tampão de marcação pH 7,4-7,6 (soro bovino fetal 1%, Azida sódica 0,1%
23 3.2 Anticorpos
Os anticorpos utilizados para caracterização das diferentes populações
leucocitárias encontram-se listados na tabela1, com descrição dos clones e
isotipos dos mesmos.
Tabela 1: Lista de anticorpos utilizados no estudo.
Anticorpo Quantidade Clone Isotipo Fabricante
CD3 APC1 2µL HIT3a mouse IgG2a BD Biosciences
CD19 APC 2µL SJ25C1 mouse IgG1 BD Biosciences
CD14 PerCP2 4µL M P9 mouse IgG2b BD Biosciences
CD45 FITC3 5µL 2DI mouse IgG1 BD Biosciences
HLA-DR PE4 2µL 27-35 mouse IgG2b BD Biosciences
CD3 APC 2µL HIT3a mouse IgG2a BD Biosciences
CD19 PerCP3 6µL 4G7 mouse IgG1 BD Biosciences
CD14 FITC 5µL M P9 mouse IgG2b BD Biosciences
CD15 APC 5µL HI98 mouse IgM BD Biosciences
CD3 FITC
CD8 PE
CD45 PerCP3
CD4 APC
with BD
10µL
SK7
SK1
2D1
SK3
24 trucount tubes
CD3 FITC
CD16/56 PE
CD45 PerCP3
CD19 APC
with BD
trucount tubes
10µl
SK7
B73.1
NCAM 16.2
2D1
SJ25C1
BD Biosciences
Caspase-3
ativa PE
10µL C92-605 rabbit IgG BD Biosciences
CD45: Marcador leucocitário. CD3: Marcador de linfócitos T.
CD4: Marcador de linfócitos T auxiliador. CD8: Marcador de linfócitos T citotóxicos. CD19: Marcador de linfócitos B.
CD14: Marcador de monócitos. CD 15: Marcador de neutrófilos. CD 16/56: Marcador de células NK.
3.3. Grupo de indivíduos sadios e pacientes sépticos
Voluntários sadios e pacientes sépticos, de diferentes faixas etárias, que
preencheram os critérios de inclusão do estudo e participaram espontaneamente
do estudo.
Foi solicitada aos voluntários ou responsáveis legais a assinatura de um
25
pesquisa da Universidade Federal de São Paulo/Hospital São Paulo, Hospital
Israelita Albert Einstein e Hospital Sírio Libanês (anexo).
3.4. Coleta de sangue
Foram coletados 10mL de sangue de voluntários sadios e pacientes
sépticos em tubos à vácuo contendo heparina sódica (BD, Plymouth, Inglaterra) e
5mL de sangue em tubo de EDTA (BD). As amostras de sangue colhidas foram
imediatamente processadas no Laboratório de Virologia e Imunologia I da
Disciplina de Infectologia, UNIFESP.
3.5 Casuística
3.5.1 Critérios de Inclusão
Voluntários: Voluntários sadios, de diferentes faixas etárias, que não esteja
em uso de medicação e que participe espontaneamente do estudo.
Pacientes: Foram incluídos pacientes com quadro clínico e laboratorial de
sepse, sepse grave ou choque séptico, classificados de acordo com as definições
adaptadas do consenso de 1992, admitidos no Hospital São Paulo, Hospital Sírio
Libanês, Hospital Albert Einstein e Hospital Santa Marcelina, na cidade de São
Paulo. Os pacientes foram incluídos nas primeiras 72 horas do diagnóstico de
26
séptico. Novas amostras foram coletadas nos dias 7, 14, 28 após a coleta da
primeira amostra.
3.5.2 Critérios de exclusão
1. Pacientes menores de 18 anos ou com doença em estádio terminal, como
neoplasias ou Aids.
2. Pacientes que estejam recebendo alguma terapia experimental.
3. O evento definidor de sepse grave ou choque ocorreu há mais de 48 horas.
4. Pacientes moribundos ou com morte iminente.
3.5.3 Estadios da Sepse
Sepse: entidade clínica presente em um paciente com sítio de infecção identificado, associando-se uma resposta inflamatória sistêmica decorrente dessa infecção, onde estejam presentes sinais como: a) temperatura >38°C ou <36°C; contagem de leucócitos >12.000 ou <4.000 células/mm3 ou formas imaturas >10%; c) freqüência cardíaca >90 bpm; d) freqüência respiratória >20 ipm ou necessidade de ventilação mecânica; e) alteração do estado mental; f) edema significativo ou balanço positivo (>20 mL/Kg/24h); g) hiperglicemia (glicose plasmática >120 mg/dL) na ausência de diabete.
Sepse grave: sepse complicada por alguma disfunção orgânica refletida por hipoxemia (PaO2/FiO2 <300), disfunção renal (oligúria <0,5 mL/Kg/h ou aumento de creatinina >0,5mg/dL), distúrbios de coagulação (RNI >1,5 ou TTPA >60 segundos), trombocitopenia <100.000, hiperbilirrubinemia > 4 mg/dL, hiperlactatemia, alteração da perfusão da pele e íleo paralítico.
27
<90 mmHg ou redução de mais de 40 mmHg na pressão sistólica basal, ou ainda se houver necessidade de infusão de inotrópicos para manter níveis pressóricos adequados.
3.5.4 Informações clínicas e epidemiológicas dos pacientes sépticos e
indivíduos sadios
Foram incluídos em nosso protocolo 15 voluntários sadios e 40 pacientes
sépticos após assinatura do consentimento livre e esclarecido por eles mesmos ou
responsáveis.
Voluntários sadios: foram incluídos 15 indivíduos sadios, de diferentes
faixas etárias. A média das idades foi de 63±16 anos, sendo 66,7% do gênero
masculino.
Pacientes: foram incluídos 40 pacientes, admitidos no Hospital São Paulo,
Hospital Universitário da Escola Paulista de Medicina, UNIFESP,na cidade de São
Paulo, Hospital Sírio Libanês e Hospital Israelita Albert Einstein. O grupo de
pacientes foi constituído de 67,5% do gênero masculino com idade média de
63±19 anos. De acordo com as definições do consenso de sepse de 1992
(American College of Chest Physicians/ Society of Critical Care - Bone et al.;
1992a), 4 pacientes apresentavam quadro clínico e laboratorial de sepse, 9 sepse
28
Os principais focos primários de infecção foram: pneumonia, associada ou
não a outra doença, em 18 pacientes; infecção abdominal em 12 pacientes;
infecção do trato urinário em 5 pacientes.
O desfecho clínico foi avaliado em relação a evolução na UTI e após 28
dias do diagnóstico de sepse. Vinte e oito pacientes (70%) receberam alta da UTI
e 12 evoluíram para óbito na própria unidade. A mortalidade após 28 dias foi de
35%. A mediana do escore APACHE destes pacientes foi de 19, com mínimo de
10 e máximo de 35, e a mediana do SOFA de admissão foi de 7, com mínimo de 1
e máximo de 14.
Tabela 2: Informações clínicas e epidemiológicas dos pacientes sépticos
Escores de Gravidade Evolução Paciente (anos) Gênero Estadio Idade infeccioso Foco
Primário Escore
APACHE SOFA ADM SOFA D1 SOFA D3 Desfecho na UTI 28 dias
1 59 H sepse grave Pneumonia 13 3 2 1 Alta Óbito
2 84 H choque séptico Pneumonia 28 11 8 7 Alta internado
3 44 H choque séptico ICS 20 10 10 9 Óbito Óbito
4 82 H choque séptico Pneumonia 23 6 6 5 Alta domicílio
5 53 H choque séptico Pneumonia / Inf.
Abdominal 22 7 8 9 Óbito Óbito
6 51 M choque séptico Pneumonia 35 5 5 11 Óbito Óbito
7 19 M choque séptico Pneumonia 14 5 7 7 Alta domicílio
8 92 H choque séptico Abdominal Inf. 21 2 9 6 Alta internado
9 73 H choque séptico ITU 19 5 5 Óbito Óbito
10 49 H choque séptico Abdominal Inf. 19 7 9 10 Alta domicílio
11 69 H sepse grave partes moles Pele ou 19 5 5 alta Alta internado
12 50 H choque séptico Pneumonia 12 10 6 6 Alta internado
13 71 H choque séptico Inf. Urinária 23 6 10 15 Alta internado
29
15 87 M choque séptico Abdominal Inf. 25 6 3 3 Alta domicílio
16 74 H choque séptico Inf. Urinária 11 3 4 6 Alta internado
17 80 M choque séptico Abdominal Inf. 21 7 12 7 Óbito Óbito
18 81 H choque séptico Abdominal / Inf.
Endocardite 24 10 10 6 Alta Óbito
19 47 H choque séptico Abdominal Inf. 10 10 6 0 Alta domicílio
20 93 M sepse grave Pneumonia 29 7 2 7 Alta internado
21 49 H sepse grave Pneumonia 16 10 9 7 Alta domicílio
22 75 M sepse Inf. Urinária 33 5 7 4 Alta internado
23 71 H choque séptico Pneumonia 17 7 9 9 Óbito Óbito
24 77 H choque séptico Pneumonia / Inf.urinária 21 2 6 7 Óbito Óbito
25 78 H sepse Inf.abdominal 25 11 8 11 Alta internado
26 68 H choque séptico Operatória Ferida 26 13 Óbito Óbito
27 57 H sepse grave Corrente Inf. Da
Sanguínea 12 5 2 2 Alta internado
28 75 M choque séptico Abdominal Inf. 19 9 8 8 Óbito Óbito
29 48 M sepse Abdominal Inf. 15 1 1 3 Alta domicílio
30 75 M choque séptico Abdominal Inf. 18 10 7 2 Alta domicílio
31 45 H choque séptico Pneumonia 15 10 3 alta Alta domicílio
32 58 H choque séptico Abdominal Inf. 19 14 13 14 Óbito Óbito
33 53 M choque séptico Corrente Inf. Da
Sanguínea 20 10 11 11 Alta internado
34 47 H sepse grave Pneumonia 16 11 7 7 Alta
35 80 M choque séptico Pneumonia 15 7 4 3 Alta internado
36 87 M choque séptico Pneumonia 28 11 11 12 Alta internado
37 71 H sepse grave Pneumonia 10 3 3 3 Alta internado
38 78 H sepse Abdominal Inf. 22 3 3 Alta domicílio
39 53 H sepse grave Pneumonia 13 9 9 9 Óbito Óbito
40 57 H choque séptico Pneumonia 14 10 10 11 Óbito Óbito
M = Masculino, F = Feminino, APACHE = do inglês, Acute Physiology and Chronic Health Evaluation, SOFA = do inglês, Sequential Organ Failure Assessment, Adm = Admissão no
30 3.6. Extração de leucócitos totais
O sangue heparinizado foi centrifugado a 1300g durante 15 minutos a
temperatura ambiente. A camada de leucócitos acima das hemácias foi transferida
para tubo cônico de 50mL. Foi realizada a lise hipotônica com adição de 20mL de
NaCl 0,2% (gelado). O tubo foi homogeneizado durante 20 segundos por inversão.
Em seguida, a amostra recebeu 20mL de NaCl 1,6% (gelado),foi homogeneizada
e ajustado o volume com PBS (gelado) para 50 mL . As amostras foram
centrifugadas a 650 g durante 5 minutos a 4 C, e a lise repetida de duas a três
vezes, se necessário.
Após a lise das hemácias o botão de leucócitos foi suspendido em 5mL de
PBS, para a contagem em câmara de Neubauer, para isso uma alíquota da
suspensão de células foi diluída 1:10 em trypan blue e as células foram contadas
no microscópio. Após a contagem a concentração celular foi ajustada para 2x106
31 3.7. Detecção de apoptose através da marcação por Anexina-V e
Iodeto de Propídeo (PI)
Após obtenção dos leucócitos totais como previamente descrito,
distribuímos uma alíquota de 1x106 células nos tubos nos seguintes tubos para a
descritos na tabela 3:
Tabela 3: Painel de anticorpos utilizados em cada tubo para o ensaio de anexina-V e iodeto de propideo.
Tubo FL1 FL2/FL3 FL4
1 - - CD3
2 CD19
3 - - CD15
Os tubos foram centrifugados a 650g durante 5 minutos a 4 C e os
sobrenadantes desprezados. Foi realizada a marcação de superfície celular com
os anticorpos da tabela acima. Os tubos foram homogeneizados em vórtex e
incubados durante 15 minutos no escuro a temperatura ambiente. Em seguida,
receberam 2mL de PBS e foram novamente centrifugados a 650g durante 5
minutos a 4 C. As células foram suspendidas em 100µL de tampão de marcação
do kit diluído em água destilada até a concentração de uso (1x), e acrescentado
32 Tabela 4: Painel de marcação com anexina v e iodeto de propideo.
Tubo Células Anexina V Iodeto de Propideo Tampão de anexina
1 1x106 5µL 10µL 300µL
2 1x106 5µL 10µL 300µL
3 1x106 5µL 10µL 300µL
4 1x106 5µL 10µL 300µL
As amostras foram novamente incubadas durante 20 minutos a temperatura
ambiente no escuro. Após este tempo, foram acrescentados 200µL de tampão de
marcação 1x para a leitura em citômetro de fluxo.
3.8. Detecção de apoptose através da marcação intracelular de
caspase-3
Após a extração dos leucócitos totais como previamente descrito no item
3.6., distribuímos uma alíquota de 1x106 células nos seguintes tubos descritos na
tabela 5:
Tabela 5: Painel de anticorpos utilizados em cada tubo para o ensaio de caspase-3
Tubo FL1 FL2 FL3 FL4
1 - - CD14 CD15
33
Os tubos foram centrifugados a 650g durante 5 minutos a 4 C e os
sobrenadantes desprezados. Foi realizada a marcação de superfície celular com
os anticorpos descritos na tabela 5. Os tubos foram homogeneizados em vórtex e
incubados durante 15 minutos no escuro a temperatura ambiente. Em seguida,
receberam 2mL de PBS, novamente centrifugados a 650g durante 5 minutos e os
sobrenadantes desprezados. As células foram fixadas com 2mL de
paraformaldeído 4% e deixadas em repouso durante a noite ao abrigo da luz em
geladeira (2-8 C). No dia seguinte os tubos foram centrifugados a 650g durante 5
minutos a temperatura ambiente e os sobrenadantes desprezados. As células
foram lavadas em 2mL de PBS e novamente centrifugadas. Foram acrescentados
750µL de tampão de permeabilização em cada tubo e incubados durante 30 min a
temperatura ambiente no escuro. As células foram lavadas com 2mL de PBS e em
seguida foi realizada a marcação intracelular com o anticorpo anti-caspase-3 como
descrito abaixo (tabela 6):
Tabela 6: Painel de marcação com caspase-3.
Tubo células Anti Caspase-3 PE Tampão
1 1x106 10µL 300µL
2 1x106 10µL 300µL
As células foram incubadas durante 30 minutos a temperatura ambiente ao
abrigo da luz. Após a incubação foram adicionados 2mL de PBS e os tubos
34
300µL de tampão de marcação, e as amostras estavam prontas para serem
adquiridas em citômetro de fluxo.
3.9. Contagem absoluta de linfócitos com TruCount
Este teste determina o número absoluto de linfócitos através da técnica de
imunofenotipagem, ou seja, através da ligação específica de anticorpos marcados
com fluorocromo aos antígenos de superfície dos linfócitos. A técnica é realizada
em tubos TruCOUNT (BD Biosciences) que contêm um número conhecido de
partículas de referência liofilizadas, que possuem fluorescência. Estas partículas
são lidas na citometria de fluxo, simultaneamente com as células de interesse já
marcadas. A contagem destas partículas auxilia no cálculo da contagem absoluta
da população de linfócitos.
Os tubos TruCOUNT foram identificados e receberam 10 L da mistura de
anticorpos CD3-FITC, CD8-PE, CD45-PerCP e CD4-APC ou CD3-FITC,
CD16/56-PE, CD45-PerCP e CD19-APC. O sangue coletado em tubo contendo EDTA foi
homogeneizado e foram transferidos 50 L de sangue total por pipetagem reversa
para os tubos TruCOUNT. Após serem homogeneizados em vórtex, os tubos
foram incubados durante 15 minutos no escuro a temperatura ambiente. Em
seguida, as hemácias foram lisadas acrescentando-se 450 L da solução de lise
(BD Biosciences). Os tubos foram homogeneizados em vórtex e incubados
durante 15 minutos em temperatura ambiente no escuro. Após a incubação foi
35 3.10 Citometria de fluxo
A leitura das amostras foi realizada em citômetro de fluxo FACSCalibur (BD
Bioscience) equipado com dois laseres, um de argônio e outro de diodo, com
emissão de comprimentos de onda de 488nm e 633nm, respectivamente. O laser
de argônio possibilita a excitação de três fluorocromos, FITC, PE e PerCP, e o de
diodo excita o fluorocromo APC. As dispersões frontal (FSC) e lateral (SSC) de luz
detectam, sem auxílio de fluorescência, tamanho e complexidade celular,
respectivamente, e foram observadas em escala linear. Desta forma foi possível
detectar até seis parâmetros para cada evento adquirido, sendo que cada evento
foi considerado como uma célula. Foi realizada compensação entre os canais de
fluorescências com a finalidade de excluir a sobreposição do comprimento de
onda dos respectivos fluorocromos. O citômetro é acoplado a unidade constituída
por microcomputador Macintosh Power PC, modelo G4 (Apple Computer Inc.,
Cupertino, CA, EUA), que permite controle sobre o citômetro e armazenamento
dos dados em arquivos.
Para a aquisição dos eventos utilizou-se um gráfico de dispersão frontal de
luz (FSC) versus dispersão lateral de luz (SSC) para identificação das populações
de leucócitos. Desta forma foi possível estabelecer a região de Linfócitos (R1).
Através da janela R1 Foram adquiridos 10.000 eventos, ou seja, células que
tivessem morfologia de linfócitos (figura 7).
Tanto a aquisição dos eventos quanto a análise dos resultados foram
36
R1
0 200 400 600 800 1000 R1 0 2 00 4 00 6 00 80 0 1 00 0
Dispersão frontal de luz
D is pe rs ão la te ra l d e lu z R1
0 200 400 600 800 1000 R1 0 2 00 4 00 6 00 80 0 1 00 0
Dispersão frontal de luz
D is pe rs ão la te ra l d e lu z
Figura 7: Estratégia de aquisição. O gráfico acima mostra a dispersão frontal de luz (abscissa) e dispersão lateral de luz (ordenada), correspondendo ao tamanho e complexidade celular, respectivamente. A região 1 (R1) separa a população característica de linfócitos onde foram adquiridos 10.000 eventos. Todos os eventos, mesmo os fora da região R1, foram armazenados.
Para a análise dos dados de linfócitos, foi utilizado gráfico de dispersão
frontal versus lateral de luz definindo-se uma região na morfologia de linfócitos R1,
onde analisamos os linfócitos totais, como mostra a figura 8A. Em outro gráfico de
dispersão lateral de luz versus expressão de CD3, desenhou-se outra região (R2)
nas células CD3+ (figura 8B). Combinando os eventos contidos nas janelas R1 e
R2 foi possível identificar os linfócitos T (CD3+) de menor tamanho e excluir a
37 Figura 8: Estratégia de análise de linfócitos. O gráfico A acima mostra a dispersão frontal de luz (abscissa) e dispersão lateral de luz (ordenada), correspondendo ao tamanho e complexidade celular, respectivamente. A região 1 (R1) separa a população característica de linfócitos. O gráfico B mostra expressão de CD3 (abscissa) e dispersão lateral de luz (ordenada). A região 2 (R2) separa os eventos CD3+.
Na análise dos dados de monócitos e neutrófilos, utilizou-se estratégia
similar, gráfico de dispersão frontal versus lateral de luz definindo-se uma região
na morfologia de monócitos (R1) e neutrófilos (R2) figura 9A. Os monócitos foram
analisados após a combinação das regiões R1 e R4 (CD14+) e os neutrófilos após
a combinação das regiões R2 e R3 (CD15+), conforme descrito na figura 9.
R3 R1 R2 0 2 00 4 00 6 00 80 0 1 00 0 D is pe rs ão la te ra l d e lu z 0 2 00 4 00 6 00 80 0 1 00 0 0 2 00 4 00 6 00 80 0 1 00 0
0 200 400 600 800 1000 Dispersão frontal de luz
100 101 102 103 104 CD15
100 101 102 103 104 CD14 R1 R2 R3 R4 R3 R1 R2 0 2 00 4 00 6 00 80 0 1 00 0 D is pe rs ão la te ra l d e lu z 0 2 00 4 00 6 00 80 0 1 00 0 0 2 00 4 00 6 00 80 0 1 00 0
0 200 400 600 800 1000 Dispersão frontal de luz
100 101 102 103 104 CD15
100 101 102 103 104 CD14 R3 R1 R2 0 2 00 4 00 6 00 80 0 1 00 0 D is pe rs ão la te ra l d e lu z 0 2 00 4 00 6 00 80 0 1 00 0 0 2 00 4 00 6 00 80 0 1 00 0
0 200 400 600 800 1000 Dispersão frontal de luz
100 101 102 103 104 CD15
100 101 102 103 104 CD14
R1 R2
R3
R4
Figura 9: Estratégia de analise de monócitos e neutrófilos. O gráfico A acima mostra a dispersão frontal de luz (abscissa) e dispersão lateral de luz (ordenada), correspondendo ao tamanho e complexidade celular, respectivamente. A região 1 (R1) separa a morfologia característica de monócitos e a região 2 (R2) os neutrófilos. O gráfico B mostra a região 3 (R3) onde separa-se os eventos CD15+. Os neutrófilos foram identificados através da combinação das regiões R2 e R3. O gráfico C mostra a região 4 (R4) onde separa-se os eventos CD14+. Os monócitos foram identificados através da combinação das regiões R1 e R4.
R2
R1
0 200 400 600 800 1000 R1 0 2 00 4 00 6 00 80 0 1 00 0
Dispersão frontal de luz
D is pe rs ão la te ra l d e lu z R2 0 2 00 4 00 6 00 80 0 1 00 0 D is pe rs ão la te ra l d e lu z
100 101 102 103 104
CD45
R2
R1
0 200 400 600 800 1000 R1 0 2 00 4 00 6 00 80 0 1 00 0
Dispersão frontal de luz
D is pe rs ão la te ra l d e lu z R2 0 2 00 4 00 6 00 80 0 1 00 0 D is pe rs ão la te ra l d e lu z
100 101 102 103 104
CD45CD3
A B
B
38
Após a identificação das subpopulações celulares como descrito nas figuras
8 e 9, foi possível analisar a apoptose pelas técnicas de anexina-V e iodeto de
propídeo (figura 10) e caspase-3 (figura 11).
Figura 10: Estratégia de análise da detecção de apoptose através da marcação por Anexina-V e Iodeto de Propídeo (PI). O quadrante 1 mostra as células viáveis, quadrante 2 células em apoptose precoce (anexina-V +), quadrante 3 células em apoptose tardia/necrose (anexina-V+ e iodeto de propídeo +), e o quadrante 4 células em necrose (iodeto de propídeo +).
0 2 00 4 00 6 00 80 0 1 00 0 D is pe rs ão la te ra l d e lu z Caspase-3
100 101 102 103 104
Caspase-3 100 101 102 103 104
0 2 00 4 00 6 00 80 0 1 00 0 D is pe rs ão la te ra l d e lu z Caspase-3
100 101 102 103 104
Caspase-3 100 101 102 103 104
Figura 11: Estratégia de análise da detecção de apoptose através da marcação de caspase-3. Utilizando um tubo não marcado com caspase-3 (gráfico a esquerda) determinou-se um quadrante para verificar a expressão basal de caspase-3. Em outro tubo marcado com caspase-3 (gráfico a direita) utilizou-se o mesmo quadrante da condição anterior para determinar a expressão real de caspase-3.
10
010
110
210
310
4Anexina V
