1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PERIODONTIA E PRÓTESE DENTÁRIA
Avaliação
in vitro
da adesão e proliferação de células
mesenquimais do ligamento periodontal humano em diferentes
superfícies de titânio
Rodrigo Alves Ribeiro
Natal/RN 2011
2 Rodrigo Alves Ribeiro
Avaliação
in vitro
da adesão e proliferação de células
mesenquimais do ligamento periodontal humano em diferentes
superfícies de titânio
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Odontologia do CCS/UFRN, como requisito parcial para obtenção do grau de mestre em Odontologia, com área de concentração em Periodontia e Prótese Dentária.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Galvão Barboza
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Agradecimento Especial
À
DEUS
, por me permitir enxergar muito além daquilo que se
postava em minha frente, por me dar forças quando eu julgava não mais as
ter, pela saúde, pelos amigos e por, através dos obstáculos, mostrar-me a
força, o potencial e a fé existentes em mim.
Ao meu orientador, Prof. Dr.
Carlos Augusto Galvão Barboza
, meu
profundo agradecimento pelos valiosos ensinamentos acadêmicos e de
vida, por toda confiança depositada, apoio, paciência, estímulo e pelo
exemplo de competência e simplicidade que representa em minha formação
acadêmica. Que Deus o abençoe e ilumine.
5
Agradecimentos
Ao
Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte
, na pessoa de seu chefe, Prof. Dr. Ricardo Calazans, da
qual tenho orgulho de fazer parte da minha formação.
Ao
Laboratório de Processamento a Plasma
(LabPlasma), em nome
do seu coordenador, Prof. Dr. Clodomiro Alves Júnior, por ter oferecido
todas as condições para as etapas laboratoriais desse estudo.
Ao
Prof. Dr. Hugo Rocha
, pela cessão do laboratório de cultivo
celular do Departamento de Bioquímica do Centro de Biociências da
UFRN e aos seus alunos
Raniere e Ruth
pela ajuda dispensada
Ao meu Pai,
Henry Rodrigues Ribeiro
, por não ser somente um Pai,
mas um amigo fiel, com quem eu sempre pude contar. E que ensinou, com
seu exemplo, os princípios de honestidade, humildade e apoiou-me nas
conquistas e dificuldades incondicionalmente, com muito amor e carinho.
À minha mãe,
Maria do Socorro Alves Soares,
essencial alicerce,
porto seguro onde encontro paz e muito amor, que transforma minhas
angústias, agitações e tristezas, em segurança e força. Braço direito que
esteve ao meu lado em todos os momentos em que o chão me faltou aos
pés.
À minha namorada
Bárbara Vanessa de Brito Monteiro
, por seu
incentivo, apoio, compreensão e companheirismo, que tanto contribuiu
para esta conquista, e por me dar forças quando essa tendia faltar.
Obrigado pelo seu amor e carinho.
6
Ao Professor e amigo,
Dr.
Josué Alves,
agradeço pela força e
incentivo dado para o começo de uma carreira acadêmica. É um grande
exemplo para minha vida profissional.
Ao amigo
Rodrigo Gadelha Vasconcelos
, exemplo de humildade,
bondade e esforço. Sua valiosa ajuda e dedicação foi fundamental no
desenvolvimento dos experimentos laboratoriais deste trabalho. Meu
sincero agradecimento!
À aluna de iniciação científica,
Fernanda Ginani
, por compartilhar
o conhecimento sobre cultura celular na fase experimental deste estudo.
Ao amigo
Alexandre da Cunha Diniz,
pela solidariedade em todos
os momentos, incentivo, amizade constante e alegria sempre presente
durante nossa convivência diária. Obrigado por tudo e conte comigo,
sempre.
À amiga que com o tempo e as circunstâncias de convivência
tornou-se muito querida,
Anna Paula Serêjo da Costa.
Que todo o suporte e
ombro-amigo que você me deu te retornem em bênçãos. Obrigado por toda
paciência, compreensão, sincera amizade e carinho. Uma alegria
compartilhada se transforma em dupla alegria; uma dor compartilhada,
em meia dor. Obrigado por tudo.
À todos os colegas do curso de mestrado por compartilharem suas
experiências, em especial aos amigos
Eudes Euller, Maria Regina, Jânio
Rêgo, Gisele Chaves, Ângela Medeiros, Jaiane Ribeiro, Camila e Alberto
Gurgel
. Aprendi muito com vocês.
Aos Professores da disciplina de Periodontia, Dr.
Bruno Gurgel e
Dra.
Delane Rego
pelos valiosos ensinamentos transmitidos,
engrandecendo nossa formação.
7
Patrícia dos Santos Calderon e
Dr.
Ricardo Calazans
pelo importante
conhecimento científico que nos foi proporcionado.
Ao Prof. Dr.
Kênio Costa Lima
, pela grande ajuda na realização da
análise estatística deste trabalho.
Aos Professores Dra.
Ruthnéia Diógenes Alves Uchoa
e Dr.
José
Sandro Pereira da Silva
, pela participação na banca da qualificação,
contribuindo para o aprimoramento deste trabalho de dissertação.
À TODOS os professores do Programa de Pós-gaduação em
Odontologia da UFRN, pela competência em ministrar as disciplinas do
curso.
Aos funcionários,
Sandra e Lucas
, meus agradecimentos pela
eficiência, disponibilidade, paciência e colaboração.
Ao Departamento de Energia Nuclear, na pessoa da Profa. Dra.
Helen Jamal Khoury
, pela colaboração na irradiação das amostras.
À Profa. Dra.
Christina Alves Peixoto
, do CETENE (UFPE), pela
realização da Microscopia Eletrônica de Varredura.
À
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pelo suporte financeiro na forma de bolsa de mestrado.
À toda minha família e amigos, pelo estímulo no sucesso deste
trabalho e pela compreensão em todos os momentos de ausência.
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9 RESUMO
Nos últimos anos, várias pesquisas científicas em Implantodontia têm buscado alternativas que proporcionem maior rapidez e qualidade no processo de osseointegração. Diferentes métodos de tratamento podem ser utilizados para modificar as propriedades topográficas e químicas da sua superfície do titânio, a fim de otimizar as reações tecido-implante através de uma resposta tecidual favorável. O presente trabalho teve como objetivo analisar a adesão e proliferação de células mesenquimais de ligamento periodontal humano a diferentes superfícies de titânio, através de técnicas de cultivo celular. Discos de titânio grau II receberam diferentes tratamentos de superfície, constituindo dois grupos distintos: polido e nitretado a plasma na configuração de gaiola catódica. Células mesenquimais obtidas do ligamento periodontal de dentes humanos hígidos foram cultivadas sobre os discos de titânio em placas de cultivo de 24 poços, na densidade de 2 x 104 células/poço, incluindo poços sem
discos como controle positivo. Os dados obtidos das contagens das células aderidas às superfícies de titânio (grupo polido e grupo gaiola catódica) e à superfície plástica (grupo controle), nos intervalos de 24, 48 e 72 horas após o plaqueamento, foram utilizados para analisar a adesão e proliferação celular e obter a curva de crescimento celular nos diferentes grupos. Os dados foram submetidos a análises não paramétricas e as diferenças entre os grupos foram comparadas pelos testes estatísticos Kruskal-Wallis e Friedman. Não foram encontradas diferenças estatísticas significativas nas contagens celulares entre os grupos estudados (p>0,05). Conclui-se que ambos os tratamentos produziram superfícies compatíveis com adesão e proliferação de células mesenquimais do ligamento periodontal humano.
10 ABSTRACT
In the last years, many scientific researches in implantology have been focused on alternatives that would provide higher speed and quality in the process of osseointegration. Different treatment methods can be used to modify the topographic and chemical properties of titanium surface in order to optimize the tissue-implant reactions by a positive tissue response. This study aimed to evaluate the adhesion and proliferation of mesenchymal cells from human periodontal ligament on two different titanium surfaces, using cell culture techniques. Grade II titanium discs received different surface treatments, forming two distinct groups: polished and cathodic cage plasma nitriding. Human periodontal ligament mesenchymal cells were cultured on titanium discs in 24-well cell culture plates, at a density of 2 x 104 cells per well, including wells
with no discs as positive control. Data obtained by counting the cells that adhered to the titanium surfaces (polished group and cathodic cage group) and to the plastic surface (control group), in the 24, 48 and 72-hour periods after plating, were used to analyze cell adhesion and proliferation and to obtain the cell growing curve in the different groups. The data were submitted to non-parametric analysis and the differences between groups were compared by Kruskal-Wallis and Friedman statistical tests. No statistically significant differences were found in the cells counts between the groups (p>0.05). It was concluded that both treatments produced surfaces compatible with the adhesion and proliferation of human periodontal ligament mesenchymal cells.
11 LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ASTM Sociedade Americana para análise e padronização de Materiais ºC Graus Celsius
CCC Cúbica de corpo centrado CD Marcador de superfície celular Cm Centímetro
cm2 Centímetro quadrado CO2 Gás carbônico
Dina/cm² Dinas por centímetro quadrado Dp Desvio-padrão da média
DRX Difração de raio-X FBS Soro Fetal Bovino
GN/m² Giganewton por metro quadrado g/cm³ Grama por centímetro cúbico
HC Hexagonal compacta K Constante dielétrica kGy Quilogray
kGy/h Quilogray por hora M Molar
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura mA Miliampére
Mbar Milibar
mg/L Miligramas por litro mg/mL Miligramas por mililitro
ml Mililitro MPa Mega Pascal
mm Milímetro
mm2 Milímetro quadrado mM Milimolar
µl Microlitro µm Micrômetros
12 pH Potencial hidrogeniônico
Ra Rugosidade média RPM Rotações por minuto
Sccm Centímetro cúbico padrão por minuto SBF Fluido corpóreo simulado
Ti Titânio
Ti-cp Titânio comercialmente puro TiO Óxido de titânio
TiO2 Dióxido de titânio Ti2O3 Trióxido de titânio
Ti6Al4V Titânio-Alumínio-Vanádio TiN Nitreto de titânio
Torr Unidade de pressão em mmHg U.I. Unidades internacionais
UV Ultra-violeta V Volt
Vo Potencial elétrico
∂ Alfa
α-MEM Meio essencial mínimo tipo alfa
13 LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Principais propriedades do titânio.
Tabela 2 – Concentrações máximas permitidas para as impurezas nas principais formas de Ti cp e ligas (% em peso).
Tabela 3 – Variáveis estudadas.
Tabela 4 – Parâmetros de tratamento com plasma de nitrogênio.
Tabela 5 – Análise da adesão celular em 24 horas referente aos diferentes grupos de estudo.
Tabela 6 – Análise da proliferação celular em 48 horas referente aos diferentes grupos de estudo.
14 LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema básico de um equipamento para nitretação iônica.
Figura 2. Processo de nitretação em gaiola catódica mostrando que o “sputtering” atua diretamente na tela, arrancando átomos de titânio que, por sua vez, se combinam com o nitrogênio havendo deposição de nitreto de titânio na superfície da amostra.
Figura 3. Discos de titânio embutidos em resina de poliéster.
Figura 4. Discos de titânio após o polimento.
Figura 5. Representação esquemática do processo de nitretação em gaiola catódica.
Figura 6. Amostras de titânio sendo nitretadas em gaiola catódica.
Figura 7. Remoção das células do ligamento periodontal dos terceiros molares. Figura 8. Digestão enzimática do extrato celular com dispase e colagenase.
Figura 9. Desenho esquemático da placa de 24 poços e a distribuição dos discos para o cultivo das células nos diferentes grupos.
15 SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 17
2 REVISÃO DA LITERATURA... 19
2.1 Titânio... 19
2.2 Tratamento de superfície... 23
2.3 Nitretação Iônica... 30
2.4. Células mesenquimais indiferenciadas do ligamento periodontal... 34
2.4.1 Respostas celulares ao tratamento de superfície... 37
3 PROPOSIÇÃO... 41
4 METODOLOGIA... 42
4.1 Implicações éticas... 42
4.2 Caracterização do estudo... 42
4.2.1 Tipo do estudo... 42
4.2.2 Desenho do estudo... 42
4.3 Desenho do estudo... 42
4.4 Amostras... 43
4.4.1 Preparo das amostras... 43
4.5 Protocolo de nitretação... 44
4.6 Esterilização das amostras... 45
4.7 Cultura de células... 46
4.7.1 Obtenção dos elementos dentários... 46
4.7.2 Obtenção das células mesenquimais do ligamento periodontal.. 46
4.7.3 Cultivo das células mesenquimais do ligamento periodontal... 47
4.8 Cultivo celular sobre discos de Titânio... 48
4.8.1 Análise da adesão e proliferação celular... 49
4.9 Análise estatística... 49
5 RESULTADOS... 50
5.1 Adesão e Proliferação celular... 50
16 6 DISCUSSÂO... 53 7 CONCLUSÕES... 61 REFERÊNCIAS... ANEXOS...
17 1 INTRODUÇÃO
A partir do estabelecimento de critérios clínicos e experimentais para o alcance da osseointegração, tornou-se necessária a busca de alternativas que proporcionem maior qualidade e rapidez nesse processo. As pesquisas na área de Implantodontia têm se direcionado para a viabilização mais rápida dos implantes dentários para estabelecimento de função, na tentativa até mesmo de eliminar o período de cicatrização óssea livre de carga funcional, como recomendado nos protocolos iniciais de Bränemark (TEIXEIRA, 2001). A osseointegração requer a utilização de implantes confeccionados com material e superfície atrativas à deposição óssea. O titânio comercialmente puro é o material de escolha para a confecção dos implantes endósseos, pois exibe características peculiares: é um biomaterial que possibilita uma resposta tecidual favorável; apresenta estabilidade química dos seus componentes; estimula a atividade celular na formação da matriz óssea; tem elevada resistência à corrosão; e não provoca reações de hipersensibilidade ou imunológicas (JOLY, LIMA, 2003). A camada de óxido de titânio é responsável pela adaptação íntima – denominada osseointegração ou anquilose funcional - entre o osso mineralizado e a superfície do implante (BRANEMARK et al., 1969; SCHROEDER et al., 1981).
De acordo com Sul, Johansson, Albrektsson (2002), a cicatrização ao redor dos implantes usinados ocorre através de um gradual processo de mineralização do osso para o implante. As células em contato com a superfície permitem a mineralização óssea; além disso, o processo de cicatrização ocorre em vários dias e o processo de remodelação leva semanas ou anos. O tempo de cicatrização para implantes dentais sem tratamento de superfície é maior do que os que utilizam uma superfície tratada. O tratamento da superfície de titânio reduz o tempo de mineralização e acelera os mecanismos de adesão entre implante e osso.
Com o tratamento de superfície, é possível modificar as características dos implantes dentais, tais como a composição química, a morfologia, a topografia e a rugosidade (RUPP et al., 2006).
18 osseointegração, tem sido amplamente empregada na pesquisa em Implantodontia. Diversos eventos biológicos associados à cicatrização óssea sobre superfícies de implantes podem ser investigados com a utilização de culturas celulares apropriadas. Adesão, proliferação e diferenciação celular, assim como produção e mineralização de matriz extracelular, são alguns dos eventos que podem ser analisados isoladamente. Interpretações legítimas de experimentos in vitro devem ser discutidas em termos de limitações práticas, técnicas e biológicas referentes à utilização de culturas celulares. A utilização dessas culturas permite o acesso a informações celulares e moleculares que favorecem uma abordagem de engenharia nanoestrutural no desenho do implante e hipóteses significativas para serem testadas. Neste contexto, culturas celulares oferecem uma oportunidade única dentro do processo e fenômeno de osseointegração (COOPER et al., 1998).
O titânio tem sido o material mais utilizado atualmente em implantodontia. As células do ligamento periodontal quando cultivadas sobre esse biomaterial mostraram ser capazes de formar tecidos semelhantes a um verdadeiro ligamento periodontal ao redor do titânio, através do processo de osseointegração (CHOI, 2000), fato este o que justifica o aprofundamento dos estudos relativos à integração entre estes componentes (titânio e células do ligamento periodontal).
A busca por uma superfície de titânio que favoreça os eventos celulares que podem resultar em uma osseointegração mais rápida e eficiente foi o que motivou o presente estudo. Nesse sentido, busca-se avaliar a adesão e a proliferação de células mesenquimais obtidas do ligamento periodontal de terceiros molares hígidos de humanos em superfícies de titânio polidas e nitretadas por plasma.
19 2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Titânio
Segundo Williams (1999) um biomaterial é qualquer material, sintético ou natural, que pode ser usado como um sistema ou parte de um sistema que repare ou substitua algum tecido, órgão ou função do corpo. Já a biocompatibilidade de um dispositivo médico implantável por longo período compreende a capacidade de o dispositivo cumprir com sua função destinada, com o desejado grau de incorporação no hospedeiro, sem provocar efeitos locais ou sistêmicos indesejáveis.
O metal titânio e suas ligas têm sido usados com sucesso como biomateriais, devido às suas propriedades mecânicas e químicas, excelente resistência à corrosão e biocompatibilidade (HAMADA et al., 2002). A alta resistência à corrosão sob condições normais resulta da formação de uma película natural da superfície. Embora a película de óxido tenha uma estrutura não densa, é estável e protege o metal contra a maioria dos ambientes. A nova camada passiva é formada em milisegundos pela reação com o ambiente local, mas íons metálicos são liberados no processo (AZADEH, ASHRAFIZADEH, 2009).
Diversos biomateriais têm sido utilizados em cirurgias ortopédicas e odontológicas. Suas aplicações incluem dispositivos de fixação de vértebras, discos vertebrais, além de stents cardiovasculares. O titânio e as ligas à base de titânio possuem biocompatibilidade, resistência à corrosão, baixo módulo de elasticidade e baixa densidade. Devido a estas qualidades, o titânio é o material de escolha para as cirurgias de implantes odontológicos e ortopédicos. A forma do implante é outro fator importante a ser considerado para a substituição do tecido duro, pois havendo concentração de tensão, o fenômeno de reabsorção do osso natural pode acontecer, promovendo o enfraquecimento da interface osso-implante. Esta é a causa principal do insucesso da osseointegração (RACK, QAZI, 2006).
20 estrutura transforma-se em cúbica de corpo centrado (CCC), denominada de fase beta (ß), na temperatura de 882,5ºC (LIU; CHU; DING, 2004). A tabela 1 apresenta algumas das principais propriedades do titânio.
Tabela 1 – Principais propriedades do titânio (DONACHIE, 1988).
Propriedades químicas, físicas,
físico-químicas e mecânicas Valores para o Titânio Puro
Número atômico 22
Peso atômico 47,9
Estrutura cristalina 1 α - hexagonal compacta para temperaturas menores que 882,5 Cº Estrutura cristalina 2 ß – cúbica de corpo centrado para temperaturas acima de 882,5 Cº
Cor Cinza escuro
Ponto de fusão 1668 ± 10ºC
Dureza HBR 70 a 74
Resistência à tração 520 Mpa
Módulo de elasticidade 107 GN/m2
Densidade 4,51 g/cm3
21 Tabela 2 - Concentrações máximas permitidas para as impurezas nas principais formas de Ti cp e ligas (% em peso) (ADAPTADO DE DONACHIE, 1988).
Liga Elemento (% Impureza)
N C H Fe O Al V Ti
Ti grau I 0,03 0,10 0,015 0,02 0,18 - - Balanço
Ti grau II 0,03 0,10 0,015 0,03 0,25 - - Balanço
Ti grau III 0,05 0,10 0,015 0,03 0,35 - - Balanço
Ti grau IV 0,05 0,10 0,015 0,05 0,40 - - Balanço
Ti grau V 0,05 0,10 0,015 0,03 0,25 - - Balanço
Ti grau VII 0,03 0,08 0,015 0,03 0,25 - - Balanço
Ti6Al4V 0,05 0,08 0,012 0,25 0,13 5,5 – 6,5 3,5 – 4,5 Balanço
Esse metal é bastante reativo e em contato com pequenas concentrações de oxigênio ou água (na faixa de parte por milhão) forma óxidos que podem ser TiO, Ti2O3 ou TiO2, sendo este último o mais comumente
encontrado. Esta variedade ocorre em consequência de existirem diversas formas estáveis desse óxido e devido ao fato do oxigênio ser bastante reativo com o titânio. O óxido mais estável é o TiO2 uma vez que é
termodinamicamente estável devido a sua energia livre de Gibbs altamente negativa em comparação com os outros óxidos de titânio (LIU; CHU; DING, 2004).
22 usada para melhorar a resposta óssea e a eficácia do implante (BRAMA et al, 2007).
O aumento do uso do titânio e suas ligas como biomateriais deve-se ao seu baixo módulo de elasticidade, superior biocompatibilidade e alta resistência à corrosão quando comparado ao aço inoxidável e ligas a base de cobalto que também possuem aplicações médicas e odontológicas (LIU; CHU; DING, 2004).
Uma contribuição para a sua biocompatibilidade é a grande resistência à corrosão que é conferida por seu óxido, que forma uma película contínua e aderente (SILVA, 2006). A camada de Ti02, formada espontaneamente
durante o processo de torneamento dos implantes, é semicondutora ou não condutora e previne a troca de elétrons e qualquer reação redox na superfície. Dessa forma, os produtos de corrosão nos tecidos não estão em forma de íon, mas como óxidos estáveis. Em meios fisiológicos a camada de óxido é altamente protetora prevenindo o contato entre o meio e o metal base, o que significa que não existe o contato direto entre o metal e seus tecidos hospedeiros, mas certamente entre o tecido e a superfície do óxido formado (KASEMO, 1998).
Outra vantagem desse material é a sua constante dielétrica (k) alta (de 20 a 50) quando comparada com a de outros óxidos, propriedade essa que pode retardar o movimento celular sobre superfícies e causar menor desnaturação das proteínas (Branemark et al., 1985). Segundo Silva (2006), o TiO2 promove forças de Van der Waals maiores do que a dos outros óxidos,
apresentando propriedades catalíticas em diversas reações químicas. A natureza, bem como a composição e espessura da camada do óxido depende das condições do meio circunvizinho. Geralmente, em meio aquoso, o óxido presente é o TiO2. No entanto, pode haver uma mistura de outros óxidos como
Ti2O3 e TiO.
23 representa um problema sério para alguns materiais de implante, parece ser um processo muito lento com o titânio, provavelmente devido à alta estabilidade de seus óxidos (SILVA, 2009).
A estabilidade de implantes dentais depende da integração do material artificial com o tecido ósseo. As propriedades físicas e químicas dos implantes podem influenciar a osseointegração; todavia, apesar de se reconhecer a importância desta interface, pouco se sabe sobre os fatores que promovem sua atuação no processo de osseointegração (CIRANO, 2007).
Antes das aplicações os biomateriais são frequentemente analisados e testados in vitro e in vivo quanto às suas propriedades osteocondutivas e indutivas. Para a osteoindução é necessário haver células capazes de se diferenciarem em células formadoras de osso. O parâmetro mais confiável para a diferenciação final e formação óssea consiste na produção de células intermediárias controladas pela matriz extracelular calcificada. Os implantes removidos do organismo humano apresentam clara correlação entre a corrosão do metal e a resposta tecidual. Além disso, os íons liberados pela degradação da prótese podem afetar a resposta celular em locais sadios do corpo humano. O efeito da dissolução dos íons depende da taxa de difusão, através da camada de óxidos do metal e da dissolução dos óxidos (MARQUES, 2007).
Apesar do sucesso obtido com o titânio, desde seu lançamento comercial, outras alternativas de tratamento de superfícies nunca deixaram de ser investigadas, sobretudo aquelas superfícies rugosas com grande potencial de ancoragem óssea. Ainda que o método de implantes osseointegrados já tenha se consolidado como uma possibilidade para a restauração das perdas dentais, uma confirmação de que determinadas superfícies possibilitam maior e mais rápido contato ósseo na fase de cicatrização e contato ósseo duradouro quando em função poderá seguramente colaborar para a otimização do procedimento.
2.2 Tratamento de superfície
24 implante, condições da superfície, o estado do osso, técnica cirúrgica e condições de carga.
A superfície do implante parece exercer influência nos processos biológicos da interface implante/osso que determinarão o sucesso ou falha da implantação. Na tentativa de aumentar o índice de sucesso dos implantes, tem-se adotado o controle das características da superfície dos implantes, principalmente em termos de topografia, composição química e energia superficial. Para alterar a morfologia dessa superfície são empregados diferentes tratamentos, tais como: jateamento com partículas abrasivas, ataque ácido, tratamento a plasma, tratamento com laser, etc.
Os parâmetros adequados para uma superfície apropriada de implantes ainda não estão bem definidos na literatura. Assim, novas técnicas de modificação de superfícies vêm sendo estudadas. Estas técnicas produzem modificações físico-químicas e morfológicas. Os tratamentos podem ser classificados de duas maneiras: subtração e adição (SYCARAS et al., 2000).
Os processos de subtração são aqueles que retiram uma camada da superfície, incluem o processo de jateamento de partículas, ataque químico e mais recentemente a modificação a laser (SILVA et al., 2006); já o processo de adição, por sua vez, é caracterizado pela deposição de uma camada sobre a superfície, podem produzir superfícies porosas e rugosas, características estas que influenciarão na camada de óxido a ser produzida. Nestes casos, um dos processos mais usados tem sido a aspersão térmica, através do processo de plasma spray, que serve para revestir implantes com titânio ou hidroxiapatita (LANCHETTA, GUEZENNEC, 2001).
25 O objetivo das modificações mecânicas é obter uma superfície com topografia e rugosidade específicas, remover contaminações superficiais e/ou aumentar a aderência dos tratamentos que serão feitos posteriormente (LAUSMAA, 2001).
Tratamentos químicos são utilizados para garantir aos implantes metálicos características tais como: limpeza e assepsia para o seu uso em cirurgias, eliminação de impurezas oriundas do processo de fabricação; rugosidade adequada da superfície visando o aumento de biocompatibilidade; obtenção de uma camada homogênea regular de óxido de espessura variável sobre a sua superfície (SENA, 2001). São baseados nas reações que ocorrem na interface do titânio e da solução, podendo ser ácidos ou alcalinos. Os alcalinos são tratamentos químicos superficiais aos quais são submetidos o titânio e suas ligas a fim de que se tornem bioativos. Os tratamentos ácidos são frequentemente usados para remover óxidos ou contaminações, objetivando obter-se uma superfície limpa e uniforme (SCHWARTZ et al., 1996; NANCI et al., 1998).
Os processos físicos têm como característica a não ocorrência de reações químicas durante o processo de modificação da superfície. A formação de uma camada modificada, de filmes ou de revestimentos é atribuída à energia térmica, cinética e elétrica que são utilizadas nesses procedimentos, nos quais se incluem a deposição física de vapor e a aspersão térmica (VAZ, 2007).
26 Alguns estudos mostram que a superfície rugosa pode direcionar o processo de osseointegração, influenciando mecanismos celulares importantes. Na verdade, o desenho microrrugoso do implante parece favorecer a adesão e diferenciação dos osteoblastos, além da produção da matriz extracelular mineralizada, in vitro (MARTIN et al., 1995) e in vivo (COCHRAN et al., 1998) .
Os osteoblastos aderem à superfície de titânio e, frequentemente, cobrem a superfície restante com a proliferação celular. O fenótipo dos osteoblastos é mantido nas células cultivadas sobre o titânio. Estas células, porém, não respondem da mesma maneira em cultura sobre discos de titânio com diferentes rugosidades (CIRANO, 2007).
O processo original de fabricação de implantes de titânio para implantação nos maxilares produz a superfície usinada com valores de rugosidade média (Ra) entre 0,5 e 1,0µm. Implantes com este tipo de superfície têm sido utilizados com sucesso no decorrer das ultimas décadas, embora estudos tenham demonstrado que a modificação da topografia tende a aumentar a área de contato osso-implante e a resistência da união na interface (WENNERBERG, 1999).
A rugosidade superficial dos implantes pode ser analisada em três níveis de grandeza: macroscópica, microscópica e nanorugosidade. Cada tamanho de rugosidade propicia contatos diferentes com as células e biomoléculas e são responsáveis pela intensidade e tipos de ligações biológicas individuais. A macrorugosidade com ordem de grandeza de milímetro não influencia na osseointegração, mas afeta a distribuição das forças para o osso e na estabilidade do implante. As rugosidades entre 0,5 m e 1,0 m são encontradas nos implantes usinados e foram usadas na maioria dos implantes anteriores a 1995. No implantes usinados a ligação osso-implante ocorre devido à presença das ranhuras (ELIAS, LIMA, SANTOS, 2008). Há uma tendência atual de se obter superfícies híbridas, com morfologias com micro e nanorugosidade.
27 ferramenta de corte originam sulcos periódicos de orientação paralela. Esta característica da topografia parece ter a capacidade de influenciar a orientação e a locomoção de tipos específicos de células e de diretamente afetar a forma e função celular (SYKARAS, 2000).
O processo de crescimento de células sobre a superfície do implante se faz tão dependente da variação de rugosidade, que implantes com superfície no estado como usinada apresentam proliferação de células, preferencialmente, ao longo das marcas de usinagem. Trata-se de uma rugosidade com forte direcionalidade. Em contrapartida, nas superfícies submetidas ao tratamento para mudança da morfologia e rugosidade observou-se uma menor direcionalidade quanto à rugosidade e, conobservou-sequentemente uma melhor interação das células na superfície dos implantes. Outro aspecto a ser considerado em relação ao efeito da microestrutura superficial na adesão celular é o tipo de célula presente no micro-ambiente. Existem células com características de rugofilia, cujas superfícies rugosas são preferidas, como osteoblastos, macrófagos, células epiteliais e leucócitos, e células que são mais atraídas por superfícies lisas, como fibroblastos (ELIAS et al., 2004). Com base na identificação da rugosidade, as células iniciam diferentes reações e com diferentes velocidades. Nas superfícies de titânio lisas (rugosidades inferiores a 0,5 m) há ligação de fibroblastos, enquanto nas superfícies com rugosidade entre 0,5 m e a 1,5 m há a adesão de osteoblastos. Ou seja, não basta que a célula identifique a presença do Ti cp para ocorrer a osseointegração, as reações que são desencadeadas na superfície dependem também da rugosidade superficial. Cada superfície provoca uma reação específica com várias fases que ocorrem simultaneamente (DAVIES, 1998; JOOS et al., 2006).
28 adesão de osteoblastos, enquanto na região de contato com tecidos moles a superfície deve ser lisa para permitir a aderência de fibroblastos (ELIAS, LIMA, SANTOS, 2008).
Outro fator de grande importância e que é alterado pelos tratamentos de superfície é a molhabilidade. Segundo Elias et al. (2004), a molhabilidade pode ser entendida como a energia livre superficial dos sólidos ou a capacidade do líquido molhar o sólido, e pode ser quantificada pela medida do ângulo de contato de um líquido com a superfície. Quando esse ângulo de contato é maior que 90 graus a superfície é hidrofóbica e quando é menor que 90 graus, a superfície é hidrofílica. Materiais com alta energia livre superficial adsorvem mais facilmente macromoléculas e possuem maior número de sítios favoráveis para permitir ligações das células. A regra geral é que materiais com tensão superficial entre 20 e 30 dinas/cm2 exibem baixa bioadesão e os materiais com valores de tensão superficial superiores a essa faixa apresentam melhores resultados para a osseointegração (BAIER, MEYER, 1988).
A composição química da superfície determina a estabilidade e reatividade do implante, a qual deve ser constituída unicamente por óxido de titânio. Apesar de não existirem trabalhos conclusivos da influência das impurezas na superfície dos implantes, a superfície deve conter os menores níveis possíveis de contaminação. A energia de superfície e a existência de tensões residuais após o jateamento modificam a reatividade da superfície. A incorporação de revestimento, independendo do tipo e espessura da camada, modifica o comportamento das células e a cascata de reações (CARVALHO et al., 2009).
Marques (2007) analisou quatro tipos de superfícies usadas comercialmente: usinada, superfície tratada com ácido, superfície anodizada e superfície tratada com flúor; e comparou a influência dos tratamentos superficiais do Ti cp na deposição de íons após a imersão em solução de fluído corpóreo simulado (SBF) durante 10, 20 e 30 dias. Os resultados mostraram que entre os três tratamentos superficiais, as superfícies com melhor resultado de deposição de íons da solução SBF foram às superfícies anodizada e a tratada com ácido.
29 através da análise quantitativa do número de células aderidas em diferentes períodos de cultura celular. Foram testadas as superfícies ácido-condicionadas, superfície com cobertura de hidroxiapatita e superfície com bisfosfonato imobilizado na cobertura de hidroxiapatita. Células osteoblásticas derivadas de osteossarcoma humano (SaOS-2) foram cultivadas sobre os discos e a contagem celular foi realizada em 3, 7 e 14 dias. O estudo concluiu que o tipo de tratamento de superfície do titânio e período de cultura celular, bem como a interação de ambos, afetam significativamente o crescimento celular e que a superfície de titânio, seja ela usinada ou ácido-condicionada, obteve melhores resultados de adesão e proliferação de células osteoblásticas quando comparada in vivo com superfícies de hidroxiapatita.
Bucci-Sabattini et al. (2010), compararam uma superfície jateada com alumina e condicionada com ácido (grupo controle) com uma superfície de baixa impregnação de cálcio e fósforo (grupo experimental). A morfologia da superfície foi caracterizada através de microscopia eletrônica de varredura e de difração de raios-X (DRX). Adesão e proliferação celular e atividade da fosfatase alcalina foram avaliadas com osteoblastos humanos SaOS-2 e células mesenquimais do osso em condições de cultura não osteogênica. Os resultados mostraram que ambas as superfícies se apresentaram como um substrato adequado para adesão e crescimento de osteoblastos humanos SaOS-2 e nenhum sinal de citotoxidade foi detectado. Em relação à proliferação de células SaOS-2, as duas superícies não mostrarm diferenças estatísticas significantes. No grupo experimental, a atividade da fosfatase alcalina foi maior que no grupo controle. Para as células mesenquimais, a proliferação foi significante menor no grupo experimental em relação ao controle, embora a atividade da fosfatase alcalina tenha sido maior do grupo testado.
30 após 48 horas ocorreu uma aumento nas amostras do grupo eTi, seguidas pelo grupo beTi. O grupo titânio polido apresentou a superfície mais regular, seguido pelo grupo condicionamento ácido, que mostrou microporos de 1,5 a 2,5 µm de diâmetro. Na superfície jateada foram encontradas cavidades de 10 a 50 µm, sendo esta superfície a mais irregular. O grupo que teve a combinação do jateamento e do ataque ácido apresentou-se com características semelhantes ao grupo eTi. Em relação à molhabilidade, pTi obteve os menores valores, seguido por eTi, bTi e beTi. Os autores concluíram que para uma superfície com uma mesma composição química, o crescimento celular é dirigido pelas características topográficas da superfície; a adesão celular aumenta de acordo com a rugosidade da superfície, ou seja, quanto mais rugosa maior será a adesão celular; e que o grupo eTi teve melhores resultados porque gerou uma superfície com rugosidade de comprimento horizontal que se aproximava do tamanho da célula, facilitando sua acomodação.
Macedo (2008) avaliou a influência da microestrutura produzida por diferentes tratamentos térmicos na resposta à proliferação de células osteoblásticas. Foram utilizados 21 discos de titânio de 15mm X 1,5mm (diâmetro X espessura) divididos em 7 grupos: têmpera (1100°C), têmpera e revenimento a 200°C, 300°C e 500°C, tratamento térm ico a 300°C e 500°C e controle (sem tratamento). Os discos foram colocados em placa de cultura celular de 24 poços e foram utilizadas células MC3T3-E1 (40.000 células por poço), mantidas em condições e cultura celular (5% de CO2 e 37°C) durante 24
horas. Pode-se concluir que a proliferação celular foi maior nos discos temperados e revenidos do que nos discos apenas com tratamento térmico e não tratados, ou seja, a proliferação foi maior nos discos que apresentavam maior tensão residual e não foi observada qualquer organização celular preferencial influenciada pela microestrutura.
2.3 Nitretação iônica
31 resistência ao desgaste das superfícies tratadas (NICOLETO, TUCCI, ESPOSITO, 1996).
O processo consiste em ionizar um gás ou mistura gasosa, contendo nitrogênio, através de uma descarga luminescente, gerada por uma diferença de potencial entre a amostra (cátodo) e o anodo, em uma atmosfera a baixa pressão. Os íons produzidos no plasma são acelerados em direção a amostra (cátodo), chocando-se com ela e fornecendo energia suficiente para aquecê-la até a temperatura de nitretação (O’BRIEN J.M.; GOODMAN D, 1991).
A nitretação a plasma é um processo bem aceito industrialmente, porque apresenta várias vantagens em relação aos outros processos de nitretação (a gás e em banho de sais), tais como maior economia de gases e menor duração do processo, uma vez que a velocidade de difusão do nitrogênio é maior. É utilizada na melhoria das propriedades superficiais como dureza, resistências ao desgaste e à corrosão, com o objetivo de aumentar a vida útil das peças nitretadas (ALVES Jr., 2001).
O termo “plasma” se aplica a um gás contendo espécies neutras e eletricamente carregadas como elétrons, íons positivos, íons negativos, átomos e moléculas. Na média, um plasma é eletricamente neutro porque qualquer desbalanceamento de carga resultará em campos elétricos que tendem a mover as cargas de modo a restabelecer o equilíbrio. Como resultado disso, a densidade de elétrons mais a densidade de íons negativos deve ser igual à densidade de íons positivos. As cargas livres no plasma podem mover-se em resposta a qualquer campo elétrico e neutralizá-lo. Se uma carga qualquer é inserida num plasma ou num campo é imposto, produzindo um potencial elétrico (Vo), as cargas livres, compostas de elétrons na grande maioria, se moverão formando uma blindagem elétrica, denominada blindagem de Debye (Alves Jr, 1995).
Um equipamento típico de nitretação iônica é constituído basicamente de um sistema de vácuo, uma fonte de potência e um reator. O esquema de vácuo deve ser capaz de atingir em torno de 10–2 torr de pressão e possuir
32 para que ela seja aquecida a uma temperatura entre 300 e 700º C (Alves Jr, 1995).
Figura 1. Esquema básico de um equipamento para nitretação iônica (ALVES Jr, 1995).
O processo consiste em expor superfícies metálicas a um plasma nitretante, o qual é gerado devido a uma diferença de potencial entre dois eletrodos. Esses eletrodos estão contidos num reator hermeticamente fechado, onde é introduzida a atmosfera nitretante (tipicamente uma mistura de N2-H2, a
uma pressão entre 1 e 10mbar. Os íons criados devido a essa diferença de potencial, em torno de 600V bombardeiam a superfície da peça presa ao catodo, aquecendo-a até a temperatura de trabalho. Nestas condições, o plasma já está revestindo completamente o catodo e a peça a ser nitretada. Os íons deste plasma estão sendo acelerados para a superfície do catodo onde diversos efeitos ocorrem, dentre eles o aquecimento da peça devido ao bombardeamento pelos íons. A partir daí, é contado o tempo de duração do processo. Após este tempo, a fonte é desligada e a peça é deixada para resfriar naturalmente (SILVA, 2009).
33 “sputtering” atua na tela de titânio (gaiola), arrancando seus átomos que, por sua vez, se combinam com o nitrogênio da atmosfera e se condensam na superfície da amostra (LI, BELL, 2004). Na nitretação por gaiola catódica, as amostras isoladas eletricamente são envolvidas por uma tela, na qual um alto potencial catódico é aplicado. Dessa forma, o plasma atua na tela e não na superfície das amostras. Os componentes a serem tratados estão em um potencial flutuante ou sujeitos a uma baixa tensão de polarização, por exemplo -100 a - 200 V. Por esse motivo, configuração gaiola catódica reduz alguns danos causados pelo método de nitretação planar, como abertura de arco e efeito do cátodo oco (LI; BELL; DONG, 2002).
Figura 2. Processo de nitretação em gaiola catódica mostrando que o “sputtering” atua diretamente na tela, arrancando átomos de titânio que, por sua vez, se combinam com o nitrogênio havendo deposição de nitreto de titânio na superfície da amostra. (ALVES Jr., 2005)
A técnica de nitretação a plasma de metais é um método bem estabelecido com inúmeras aplicações industriais devido a resultados peculiares nas características físicas e químicas dos materiais, como o aumento na dureza, resistência ao desgaste e oxidação, além de comprovada biocompatibilidade (FIGUEROA, ALVAREZ, 2006).
34 sem tratamento. Foi utilizada a linhagem celular Osteo-1 com 1 X 104 células por poço que foram analisadas com 24, 48 e 72 horas. Tanto a adesão como a proliferação celular nas placas nitretadas foram superiores as placas sem tratamento. Além disso, a superfície nitretada apresentou melhores resultados no que se refere a molhabilidade e rugosidade que os implantes sem tratamento.
Sá et al. (2009) modificou a superfície do titânio através do plasma por diferentes configurações e observou as alterações das propriedades relacionando-as com adesão e proliferação celular. Foram utilizadas as configurações de nitretação em gaiola catódica (G1); cátodo planar (G2); cátodo oco (G3); e oxidação em cátodo oco (G4). Das técnicas utilizadas, a nitretação por cátodo oco foi a que produziu melhores modificações nas propriedades da superfície para aplicações biomédicas (molhabilidade, microdureza, rugosidade e textura). Em relação a proliferação celular, foi mais acentuada nas amostras nitretadas em cátodo oco e na gaiola catódica, indicando que esses métodos de tratamento superficiais são viáveis e eficientes na avaliação in vitro da proliferação de células-tronco.
2.4 Células mesenquimais indiferenciadas do ligamento periodontal
O ligamento periodontal é um tecido conjuntivo especializado, altamente vascularizado e rico em células, que desempenha um papel importante dando suporte ao dente, atuando na manutenção da homeostase e reparando danos teciduais causados pela doença periodontal ou por trauma mecânico (SHIMONO et al., 2003). Esse tecido contém uma população celular heterogênea, incluindo fibroblastos, cementoblastos, osteoblastos, células endoteliais e epitelias (LEKIC et al., 2001).
35 periodontal tem sido bastante pesquisada, conforme mostra a revisão realizada por Alves, Lins, Barboza (2010).
As células-tronco são comumente definidas como células multipotentes, com capacidade de se diferenciarem em um ou mais tipos de células especializadas (COSTA, MIGUEL, ROSA, 2005). Há duas categorias de células-tronco: as células-tronco embriononárias pluripotentes, que são procedentes do embrioblasto durante a fase de blástula do embrião e que são capazes de dar origem a todas as linhagens celulares do corpo e a categoria de células unipotentes ou multipotentes, denominadas células-tronco adultas, que têm a capacidade de originar tipos celulares específicos (SOUZA et al., 2003).
Existem várias fontes de células-tronco adultas, tais como: a medula óssea, o sangue, a córnea e a retina, o cordão umbilical, o fígado, a pele, o trato gastrointestinal e o pâncreas (SLACK, 2000). Há alguns anos, inúmeros estudos têm isolado células mesenquimais indiferenciadas derivadas dos tecidos orais, incluindo a polpa dentária (MIURA et al., 2003; SHI, GRONTHOS, 2003; SLOAN, SMITH, 2007) e o ligamento periodontal (AKIZUKI, 2005; CHEN et al., 2006; NAGATOMO, 2006).
A maior vantagem do uso de células-tronco embrionárias é a sua capacidade de proliferação e de diferenciação em diversos tipos celulares. Contudo, existem desvantagens, como a sua instabilidade genética, a obrigatoriedade de sua transplantação para hospedeiros imunocomprometidos e o risco de formação de teratocarcinomas, além da questão ética (SOARES et al., 2007).
As células-tronco adultas apresentam a vantagem de serem autogênicas, não incorrendo em limitações morais e responsivas aos fatores de crescimento inerentes ao hospedeiro. No entanto apresentam algumas desvantagens como o fato de não serem pluripotentes, a dificuldade de obtê-las, purificá-las e cultivá-las in vitro, além de sua presença em menor quantidade nos tecidos (RISBUD, SHAPIRO, 2005).
36 expressaram marcadores de células-tronco CD105, CD166, e STRO-1. Esses resultados sugerem que as células do ligamento periodontal incluem células-tronco mesenquimais juntamente com outras células progenitoras.
Gay, Chen e Macdougall (2007) realizaram um estudo em que células do ligamento periodontal de humanos foram isoladas, marcadas para STRO-1 e separadas em meio de cultura com o objetivo de analisar sua capacidade de diferenciação em osso, cartilagem e tecido adiposo. Células da medula óssea foram usadas como controle nas mesmas condições de cultivo e indução. Os autores concluíram que as células do ligamento periodontal contêm células mesenquimais que têm o potencial de se diferenciarem em osteoblastos, condrócitos e adipócitos, semelhantes às células-tronco da medula óssea.
Choi (2000), em um estudo piloto, cultivaram células do ligamento periodontal de cães e investigaram se essas células eram capazes de formar uma nova inserção do ligamento periodontal quando utilizadas sobre a superfície de implantes de titânio. Os implantes com as células cultivadas do ligamento periodontal foram colocados nas mandíbulas dos cães. Após 3 meses de cicatrização, o exame histológico revelou que em algumas superfícies do implante, uma camada com tecido semelhante ao cemento com inserção de fibras colágenas tinha sido alcançada. Estes resultados demonstraram que células cultivadas do ligamento periodontal podem formar tecidos semelhantes a um verdadeiro ligamento periodontal ao redor do titânio, o qual têm sido o biomaterial mais utilizado atualmente em implantodontia através do processo de osseointegração.
A capacidade de expandir as células-tronco em cultura é um passo indispensável para medicina regenerativa, e um esforço considerável tem sido feito para avaliar as consequências do cultivo no comportamento das células-tronco e tem como objetivo recriar gradualmente in vitro todos os mecanismos e processos que a natureza utiliza durante a iniciação e morfogênese de um determinado órgão. Neste contexto, a pesquisa em células-tronco oferece um potencial singular para a homeostase corporal, reparação e regeneração (BLUTEAU, 2008).
37 estimulando a proliferação e diferenciação celular (SOARES et al., 2007). As células-tronco mesenquimais proporcionam, ao menos teoricamente, essa inesgotável fonte celular que, a depender do tipo e do fator de crescimento envolvido, pode originar determinado tecido ou vários tecidos do corpo, tais como ósseo, cartilaginoso, adiposo, fibroso, muscular e medular. Os fatores de crescimento, por sua vez, desempenham papel fundamental no controle da proliferação e diferenciação desses tipos específicos de células (CANCEDDA et al., 2003).
2.4.1 Respostas celulares ao tratamento de superfície
A osseointegração está associada às respostas celulares que contribuem para a formação de osso em superfícies aloplásticas. As reações iniciais entre os tecidos e a superfície dos implantes têm o papel de determinar os eventos seguintes que caracterizam a atividade biológica da superfície e a resposta celular. Essa resposta celular depende das propriedades da superfície, que vão influenciar na natureza da composição subsequente do filme de proteínas adsorvido na superfície do implante (ELLINGSEN, 2000; SCHEIDELER et al., 2003). Assim, imediatamente após a instalação, os implantes de titânio interagem com os fluidos biológicos e com tecidos, dando início à osseointegração. É nesta fase que as propriedades físicas (rugosidade, molhabilidade) e a composição química da superfície do implante têm importância primordial (ELIAS, LIMA, SANTOS, 2008).
38 experimentos in vitro estudem o comportamento de células sobre superfícies de titânio, as propriedades de superfície ideais para adesão, proliferação e diferenciação celular ainda não foram claramente definidas (MUSTAFA, 2001). Os estudos de biocompatibilidade de novas superfícies de titânio focam na avaliação da resposta celular à superfície do material. Essa resposta é traduzida pelo processo de adesão, proliferação e diferenciação das células, embora a multiplicidade de modelos experimentais torne difícil a interpretação dos resultados (SILVA, 2009).
A adesão celular está envolvida em vários fenômenos naturais, tais como embriogênese, manutenção da estrutura dos tecidos, cicatrização de lesões, resposta imune, metástase, bem como a integração do biomaterial. A biocompatibilidade do material está intimamente relacionada com o comportamento celular no contato com esse material, e em particular, a adesão celular a sua superfície. Características de superfícies dos materiais como topografia, composição química ou energia de superfície desempenha um papel essencial na adesão dos osteoblastos, assim, a adesão e o espraiamento celular fazem parte da primeira fase da interação célula/material e a qualidade dessa primeira fase irá influenciar a capacidade da célula proliferar e se diferenciar quando em contato com o implante (ANSELME, 2000).
O termo “adesão” ao biomaterial engloba diferentes fenômenos: a fase de adsorção, a qual ocorre rapidamente e envolve pequenas ligações físico-químicas entre as células e o material – tais como ligações iônicas e força de Van der Walls – e a fase de adesão, que ocorre lentamente envolvendo moléculas biológicas – tais como proteínas da matriz extracelular, proteínas de membrana celular e proteínas do citoesqueleto – as quais interagem juntas para induzir sinal de transdução, promovendo a ação dos fatores de transcrição e consequentemente regulando a expressão gênica. Esta fase é a mais importante da integração tecidual, pois a qualidade desta adesão influenciará na morfologia e na capacidade para proliferação e diferenciação das células (ANSELME, 2000).
39 condicionado pelos componentes do fluido biológico. O pH, composição iônica, energia de ligação, temperatura, grupo funcional de proteínas são fatores determinantes para adsorção protéica. A energia da superfície pode influenciar a adsorção protéica e o arranjo estrutural das proteínas no material, atraindo células precursoras ósseas. Quando ocorrem mudanças conformacionais destas células devido a superfícies hidrofóbicas e/ou baixa energia superficial, sua afinidade com o receptor da superfície para células ósseas é diminuída, atraindo fibroblastos e formando tecido fibroso em torno do material (ANSELME, 2000).
Lee et al. (2009), tiveram como objetivo determinar a dimensão da microrrugosidade em superfícies de titânio que mostra a maior influência positiva sobre o comportamento e características celulares específicas. As amostras de titânio foram confeccionadas com rugosidades de profundidade padronizada (3,5 µm), variando a largura em 15 µm (TiD15), 30 µm (TiD30) e 60 µm (TiD60), fabricadas usando fotolitografia, além do grupo controle liso. Foram cultivados fibroblastos gengivais humanos sobre os discos e analisados quanto à adesão, proliferação e viabilidade celular. Os autores encontraram que TiD15 aumentou significantemente a viabilidade e proliferação em relação ao grupo controle após 72 horas da cultura celular e concluíram que a rugosidade superficial com profundidade de 3,5 µm e largura tanto de 15 µm quanto de 30 µm influenciou positivamente no comportamento dos fibroblastos.
41 3 PROPOSIÇÃO
42 4 METODOLOGIA
4.1 Implicações éticas
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN (parecer nº 080/2010, protocolo 018/10, CAEE/SISNEP 0021.0.051.000-10 - ANEXO I, Emenda ao projeto – Anexo II). Todos os voluntários da pesquisa receberam um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE - ANEXO III), explicando a realização do estudo, os objetivos, os riscos e os benefícios aos quais estariam expostos, de acordo com as Diretrizes e Normas Regulamentadoras do Conselho Nacional de Saúde (Resolução n° 196/96).
4.2 Caracterização do estudo
4.2.1 Tipo do Estudo
Tratou-se de um estudo experimental in vitro.
4.2.2 Desenho do Estudo
Foi realizado um estudo do tipo longitudinal, prospectivo e controlado.
4.3 Desenho do estudo
43 4.4 Amostras
Foram utilizados no experimento dois dentes humanos hígidos (terceiros molares inclusos), que seriam desprezados após a cirurgia, para a obtenção das células mesenquimais do ligamento periodontal. Os dentes foram extraídos de pacientes que apresentavam indicação cirúrgica prévia de remoção desses dentes por motivos ortodônticos e que não apresentavam doenças bucais e/ou doenças sistêmicas.
Foram utilizados também 18 (dezoito) discos de titânio fornecidos pelo Departamento de Física/UFRN, para que as células obtidas fossem cultivadas sobre os mesmos.
4.4.1 Preparo das Amostras
As amostras de titânio foram preparadas segundo o protocolo estabelecido no LabPlasma do Departamento de Física da UFRN (ALVES Jr., 1995). Dezoito discos de titânio grau II ASTM F86 nas dimensões de 15mm de diâmetro por 1,5mm de espessura, foram embutidos em resina poliéster (figura 3) e lixados gradualmente com lixas de SiC, de abrasividade 220, 360, 400, 600, 1200 e 2000 em água corrente e depois polidas (politriz AROTEC, modelo APL-2 e série 212560, BRASIL) com pano de polimento OP-CHEM, sílica coloidal com partículas de 0,1µm (ATM-GMBH, Alemanha) e água oxigenada (H2O2)20 volumes até um acabamento final de 0,04µm.
44
Figura 3. Discos de titânio
embutidos em resina de poliéster. Figura 4. Discos de titânio após o polimento.
4.5 Protocolo de nitretação
Após o polimento e limpeza, seis amostras por vez foram colocadas em uma câmara de aço inoxidável (reator), com 400 mm de diâmetro e 400 mm de comprimento, hermeticamente fechada para receber o tratamento de superfície. Utilizou-se configuração no reator de plasma para nitretação em gaiola catódica (figura 5).
Figura 5. Representação esquemática do processo de nitretação em gaiola catódica (ALVES Jr., 2005).
45 pressão de 10-1 mbar e então introduziu-se hidrogênio com um fluxo de 12sccm, como gás de arraste de impurezas, até uma pressão de 1,6 mbar por 20 minutos. Após esta etapa, o N2 a 3sccm foi introduzido até conseguir uma
atmosfera de trabalho estável em torno de 680V, 0,5 miliampére (mA), temperatura de 450ºC e pressão de nitretação de 2,5mbar. Nestas condições as amostras foram nitretadas por 60 minutos (figura 6).
Figura 6. Amostras de titânio sendo nitretadas em gaiola catódica
As atmosferas do plasma foram configuradas obedecendo a um fluxo de gases de 15sccm (tabela 4).
Tabela 4. Parâmetros de tratamento com plasma de nitrogênio.
Grupo
experimental Atmosfera do plasma tratamento Tempo de
Pressão do plasma
Temperatura
do plasma Fluxo do gás total
Polidas - - - - -
Gaiola
catódica N20%H80% 1h 2,5mbar 450°C/17.5mA 15sccm
4.6 Esterilização das amostras
46 UFPE – Universidade Federal de Pernambuco). A dose total de radiação por amostra foi de 25 kGy, liberada a uma dose média de 8,993 kGy/h (2h 46minutos a uma distância de 50mm), em irradiador GAMMACELL 220 Excel (MDS Nordion, Ca).
4.7 Cultura de células
4.7.1 Obtenção dos Dentes
Os dois dentes utilizados (terceiros molares retidos) foram extraídos de pacientes com indicação cirúrgica prévia, em sala de cirurgia apropriada, localizada no setor de Cirurgia e Traumatologia Bucomaxilofacial do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), através de protocolo cirúrgico, utilizando técnicas cirúrgicas convencionais, obedecendo às rigorosas técnicas assépticas. Em seguida, os elementos dentários foram imediatamente armazenados em tubos tipo Falcon de 50 ml contendo 10 ml de meio de cultura alfa-MEM (Cultilab, Brasil).
Os dentes foram submetidos a três lavagens de 15 minutos cada, com 10 ml de solução contendo meio alfa-MEM (Cultilab, Brasil) enriquecido com 10.000 U.I./ml de Penicilina (Gibco, USA), 10.000 µg/ml de Estreptomicina (Gibco, USA), 100 mg/ml de Gentamicina (Gibco, USA) e 250 µg/ml de Anfotericina B (Gibco, USA), objetivando eliminar possível contaminação. Este procedimento foi realizado em uma câmara de fluxo laminar. Depois de processados, os elementos dentários obtidos encontravam-se aptos para a obtenção e cultivo das células do ligamento periodontal.
4.7.2 Obtenção das Células Mesenquimais do Ligamento Periodontal
47 (Gibco, USA), por 1 hora a 37°C. Em seguida a soluç ão foi aspirada e processada em filtro de 70 µm (BD Falcon, USA); a suspensão foi centrifugada a 1200 rpm durante 5 minutos e o sobrenadante retirado. As células precipitadas foram então ressuspensas e cultivadas.
Figura 7. Remoção das células do ligamento periodontal dos terceiros molares.
Figura 8. Digestão enzimática do extrato celular com dispase e colagenase.
4.7.3 Cultivo das Células Mesenquimais Indiferenciadas do Ligamento Periodontal
As células mesenquimais do ligamento periodontal foram cultivadas em placas com área de crescimento de 25cm2 (TTP®, USA), com meio básico α-MEM (Cultilab, Brasil) suplementado com 15% de soro fetal bovino – FBS (Cultilab, Brasil). As culturas foram mantidas a 37º C em 5% de CO2, com troca
No subcultivo, re garrafas 2 ml de tripsina/ Gibco/USA). A suspens mesmo volume de mei objetivo de inativar a trips 5 minutos, retirou-se o so de meio α-MEM. Uma alí na Câmara de Neubauer pelo Azul de Trypan.
4.8 Cultivo celula
Na terceira passa foram cultivadas em trê poços (TTP®, Swizterlan se 24 discos de titânio, s mesma densidade celula positivo. A disposição do
Figura 9. Desenho esq discos para o cultivo das
removeu-se o meio básico e então ad na/EDTA (0,25% de Tripsina contendo 1 m nsão celular foi colocada em um tubo
eio α-MEM suplementado com 15% de ripsina. A suspensão foi centrifugada a 120 sobrenadante e as células foram ressuspe alíquota dessa suspensão foi separada pa uer, utilizando o método da exclusão de cé
lar sobre os discos de titânio
sagem (subcultivo), as células do ligamen três placas (uma para cada intervalo de
and), na densidade de 2 x 104 células por , sendo 12 de cada grupo (polido e gaiola lular foi cultivada em poços sem disco, dos discos nos poços está esquematizada
squemático da placa de 24 poços e a di as células nos diferentes grupos.
48 adicionou-se às mM de EDTA – o cônico com o de FBS com o 200 rpm durante spensas em 1 ml para a contagem células coradas
ento periodontal e tempo) de 24 or poço. Utilizou-iola catódica). A
, como controle a na figura 9.
49 4.8.1 Análise da Adesão e Proliferação Celular
Para análise da adesão e proliferação celular e obtenção da curva de crescimento nos diferentes grupos foram utilizados os dados obtidos das contagens de células aderidas às superfícies de titânio (grupo polido e grupo gaiola catódica) e à superfície de plástico (grupo controle), nos intervalos de 24, 48 e 72 horas após o plaqueamento. O número de células colhidas de cada poço foi obtido pela contagem de células viáveis através do uso de hemocitômetro e o método da exclusão de células coradas pelo azul de trypan (FRESHNEY, 2000), obedecendo-se a seguinte equação matemática:
Nº de céls. = ú é çã 10
ú ℎ ô "
4.9 Análise estatística
