UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO
Tamires Amabile Valim Brigante
Ribeirão Preto 2015
Desenvolvimento de polímeros de impressão molecular para
a microextração em ponteiras de bisfenol A em amostras de
RESUMO
BRIGANTE, T.A. V. Desenvolvimento de polímeros de impressão molecular para microextração em ponteiras de bisfenol A em amostras de urina e análise por GC-MS. 2015. 82f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015.
O Bisfenol A (BPA, acrônimo da língua inglesa – bisphenol A) é uma substância utilizada na fabricação de embalagens alimentícias e resinas odontológicas. Sua toxicidade deve-se ao fato de que, como disruptor endócrino, afeta o sistema reprodutor, cardiovascular, neuro-endócrino e pode apresentar potencial carcinogênico. Em métodos bioanalíticos, o preparo da amostra tem sido requerido para aumentar a seletividade e sensibilidade analítica, através da remoção dos interferentes da amostra biológica e concentração dos analitos, quase sempre presentes em níveis de traços. A microextração em ponteiras (DPX, acrônimo das iniciais em língua inglesa -
Disposable Pipette Extraction), baseada no equilíbrio de sorção do soluto com a fase extratora,
consiste em uma ponteira padrão de micropipeta modificada, na qual o sorvente está contido livremente entre dois filtros, permitindo rápida extração do analito em diferentes matrizes complexas. Os polímeros de impressão molecular (MIP acrônimo das iniciais em língua inglesa –
Molecularly Imprinted Polymer) consistem em uma rede polimérica tridimensional que possui
cavidades seletivas para o reconhecimento molecular do analito ou de substâncias de estrutura análoga. Essa rede polimérica é sintetizada ao redor da substância molde (analito), e a cavidade seletiva é formada após a remoção do molde. As vantagens do processo sol-gel para a síntese do MIP são o controle do tamanho e forma das partículas, ajuste da hidrofobicidade e alta estabilidade térmica. No presente trabalho, o MIP foi sintetizado e utilizado como sorvente para a técnica DPX para a determinação de bisfenol A em amostras de urina por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS, acrônimo das iniciais em língua inglesa -
Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry). O MIP foi sintetizado pela via sol-gel
utilizando aminopropiltrietoxisilano (APTES) como mônomero funcional e tetraetil-orto-silicato (TEOS) como reagente de ligação cruzada. Como molde foram avaliados o BPA para o MIP, e o tetrabromobisfenol A (TBBPA) para o polímero molecularmente impresso com molécula análoga ao analito (DMIP, acrônimo das iniciais em língua inglesa – Dummy Molecularly Imprinted Polymer). Para avaliar a seletividade do MIP, o polímero não impresso (NIP, acrônimo das iniciais em língua inglesa - Non-imprinted Polymer) foi sintetizado seguindo o mesmo
procedimento de síntese do MIP com exceção da adição da molécula molde. Apesar de a capacidade de sorção do MIP ser ligeiramente maior, o DMIP foi selecionado como sorvente para minimizar o efeito de memória. O DMIP foi caracterizado por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e por espectroscopia vibracional na região do infravermelho por transformada de Fourier (FTIR, acrônico das inicias em língua inglesa - Fourier Transform Infrared). Os parâmetros da técnica DPX, tais como, o tempo de equilíbrio de sorção entre a amostra e o sorvente e condições de dessorção foram otimizadas por técnicas quimiométricas. A robustez do DMIP sintetizado via sol-gel foi comprovada pela reutilização deste sorvente por mais de 100 vezes, sem perda da eficiência da extração. O método desenvolvido DPX/GC-MS apresentou linearidade na faixa de 50 a 500 ng mL-1, precisão com CV (coeficientes de variação) entre 4 e 14% e de exatidão com valores de erro padrão relativo (EPR) de -13,6 a 12,3%. O método de referência utilizando a extração líquido-líquido e GC-MS (LLE/GC-MS), faixa de linearidade de 5 a 50 ng mL-1,foi desenvolvido e validado. Embora o método DPX/GC-MS inovador, quando comparado ao LLE/GC-MS, tenha apresentado maior limite de quantificação, apresentou as seguintes vantagens: simplicidade, rapidez e utilização de menores volumes de amostra e de solventes orgânicos na etapa do preparo da amostra.
1 INTRODUÇÃO
1.1 Bisfenol A
Bisfenol A (BPA) é o nome popularmente usado para se referir ao composto (2,2-bis(4-hidroxifenil) propano (CAS n. 000080-05-7) (ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2013). Este composto é produzido pela condensação de 2 mols de fenol com 1 mol de acetona em pH baixo e temperatura alta na presença de catalisador, passando por destilação, filtração e secagem para a purificação. Em condições ambientes, o BPA é encontrado como sólido branco e comercializado na forma de pó ou cristais. As propriedades físico-químicas do BPA estão apresentadas na tabela 1 (MICHAŁOWICZ, 2014)(STAPLES et al., 1998)(KOSKY; SILVA; GUGGENHEIM, 1991). A Figura 1 ilustra a estrutura molecular do BPA.
Tabela 1 – Propriedades físico químicas do BPA
Proriedade Valor
Fórmula molecular C15H16O2 Massa molar 228,3 g mol-1 Temperatura de fusão 156ºC Temperatura de ebulição 220ºC
pKa 9,6* e 10,2**
Kow 3,32
pKa: constante de dissociação; Kow: coeficiente de partição octanol-água. *Referente ao primeiro próton. **Referente ao segundo próton.
Figura 1 – Estrutura molecular do Bisfenol A.
A produção mundial de BPA por ano é maior do que 3,5 milhões de toneladas, pois devido a características de resistência e elasticidade, ele é utilizado na produção de diversos produtos, como policarbonato, polímeros e resinas epóxi (FERREIRA; COUTO; OLIVEIRA, 2015), (VIBERG; LEE, 2012). O policarbonato é muito utilizado na fabricação de mamadeiras, garrafões retornáveis de água mineral, e outras embalagens alimentícias, devido sua transparência e alta resistência mecânica e térmica (ANVISA, 2013). Já as resinas epóxi estão presentes no revestimento de embalagens de alimentos enlatados (YANG et al., 2009). O BPA é precursor do bisfenol glicidil metacrilato (Bis-GMA) e do bisfenol dimetacrilato (Bis-DMA) presentes na produção de resinas utilizadas como selantes odontológicos (RATHEE; MALIK; SINGH, 2012). A degradação e erosão das resinas liberam substâncias na saliva, incluindo o BPA que além de precursor, é produto de degradação do Bis-GMA. As esterases salivares também podem contribuir para a degradação das resinas e liberação de seus constituintes na saliva. Essas substâncias quando liberadas, podem causar efeitos locais nos tecidos orais, ou induzir efeitos sistêmicos (WANG et al., 2013).
O Bisfenol-A é considerado um disruptor endócrino (DE), e a exposição a esse agente exógeno culmina em efeitos negativos diversos. Os disruptores endócrinos são xenobióticos que alteram o sistema endócrino. Essa alteração pode ser devido à capacidade do composto químico em mimetizar hormônios endógenos, bloquear sua ligação aos receptores ou alterar a síntese e metabolismo destes hormônios. (SCHUG et al., 2011). O BPA atua como agonista parcial dos receptores estrogênicos e antagonista dos receptores andrógenos (FERREIRA; COUTO; OLIVEIRA, 2015). Além disso, possui capacidade de se ligar a muitos outros receptores envolvidos na atividade hormonal, exercendo diversos efeitos deletérios ao organismo e interferindo na função de hormônios sexuais, insulina, leptina e tiroxina. Estudos em animais sugerem que o BPA possui potencial oxidativo e mutagênico, além de promover a hipometilação do DNA no processo de reparação; imunotoxicidade e hepatotoxicidade. Estudos epidemiológicos sobre a associação da exposição humana ao bisfenol A e doenças coronárias, diabetes e obesidade demonstram que o risco de desenvolvimento destas doenças apresenta-se aumentado em pessoas expostas (MICHAŁOWICZ, 2014).
estes trabalhos apontam uma associação da exposição ao BPA nos níveis encontrados na população geral, com a presença de diabetes, obesidade, aumento da gordura visceral e hipertensão. Porém mais estudos devem ser realizados para elucidar o mecanismo de sua toxicidade (RANCIÈRE et al., 2015).
A presença do bisfenol A já foi identificada em estudos realizados na atmosfera, em água e efluentes, e em poeira doméstica. Este composto é geralmente encontrado em maiores concentrações no ambiente em regiões com alto desenvolvimento urbano, pois as principais fontes de liberação do BPA são atividade e esgoto industrial e decomposição de produtos a base de polímeros que têm BPA em sua composição. Algumas espécies de bactérias e de fungos são capazes de metabolizar o BPA transformando-o em compostos com menor toxicidade ou mineralizando-o e convertendo em fonte de carbono no solo. Espécies de algas e plantas também possuem enzimas capazes de converter o BPA em compostos com menor toxicidade. Esses microrganismos, algas e plantas têm potencial para serem utilizadas na recuperação do ambiente contaminado por este agente tóxico (MICHAŁOWICZ, 2014).
O bisfenol A é liberado para o meio através da hidrólise e por difusão que ocorrem nos produtos que têm este composto como matéria prima. A difusão aumenta com alteração do pH das substâncias que estão em contato com os recipientes, e a hidrólise dos policarbonatos e das resinas epóxi é facilitada pelo aumento da temperatura. Alimentos enlatados que passam pelo processo de pasteurização apresentam maiores níveis de BPA liberado do que os alimentos enlatados que não necessitam deste processo. O tempo prolongado de uso das embalagens de policarbonato, como garrafões de água e mamadeiras, também favorece a hidrólise do polímero e liberação do BPA (MICHAŁOWICZ, 2014).
Como o BPA é encontrado facilmente no ambiente, a exposição pode ocorrer por inalação, contato dérmico ou ingestão oral, sendo esta, a forma mais comum de exposição humana (ROCHESTER, 2013). Utilizando sistemas in vivo e in vitro, o metabolismo do BPA
tem sido aos poucos elucidado. Após a ingestão, o bisfenol A sofre metabolismo de primeira passagem pelas enzimas presentes no intestino e no fígado, diminuindo assim a biodisponibilidade do xenobiótico (GAO et al., 2015). Apesar do metabolismo de primeira passagem, o BPA pode ser encontrado em concentrações significativas no sangue, sugerindo que ocorra absorção sublingual, na qual o metabolismo de primeira passagem é evitado. Gayrard et al. confirmaram essa hipótese em estudos realizados em cães, devido a semelhança
liga-se covalentemente ao DNA na presença de enzimas peroxidases, danificando o material genético. Este mesmo metabólito é capaz de gerar, por reações de oxi-redução, radicais livres
(MICHAŁOWICZ, 2014). O BPA e seus metabólitos sofrem, posteriormente, ação das enzimas uridina-difosfato-glicuronosil-transferases (UGT) e sulfotransferases em seus conjugados, respectivamente a BPA-glicuronídeo e BPA-sulfato, que são inativos e eliminados principalmente na urina. Uma pequena porcentagem (menor do que 2%) é eliminada na forma livre do BPA (GERONA et al., 2013).
Devido a sua lipossolubilidade, o bisfenol A atravessa facilmente a barreira placentária, permitindo a exposição fetal após a exposição materna. Os neonatos e os bebês podem ser expostos ao BPA pelo leite materno. Embalagens de alimentos e mamadeira também contribuem para o aumento dos níveis de exposição (NACHMAN et al., 2014). A exposição fetal e neonatal pode comprometer o desenvolvimento levando a alterações neurais, comportamentais, desordens imunológicas e sexuais (GAO et al., 2015). Há grande preocupação com a exposição no período pré-natal, pois a metabolização e inativação do BPA no período fetal é ineficiente devido ao fato de que o sistema UGT, responsável por 80% da metabolização do BPA em adultos, está ausente ou há baixa expressão durante este período (GERONA et al., 2013).
Seguindo medidas adotadas por outros países, como Canadá e Estados da União Europeia, a ANVISA, por meio da resolução n. 41 de 2011, proibiu a fabricação e a importação de mamadeiras que contenham BPA em sua composição. Essa medida passou a vigorar a partir de 2012 (ANVISA, 2013). Essa medida foi adotada apenas para mamadeiras, excluindo outros utensílios utilizados para crianças como pratos, colheres, copos e mordedores, que também podem conter BPA (ANVISA, 2012a).
A European Food Safety Authorithy (EFSA) definiu o valor de ingestão diária
tolerável (IDT) de BPA como 0,05mg/Kg/dia. Este valor foi baseado em estudos em animais que encontraram o nível máximo sem efeitos adversos observados (NOAEL, acrônimo das iniciais em língua inglesa - Non observed adverse effects levels) do BPA no valor de
5mg/Kg/dia (EFSA, 2010). Embora esses valores sejam maiores do que a média de ingestão diária humana de BPA na Europa (0,01mg/Kg/dia), muitos estudos em animais demonstram efeito significativos com consumo de níveis menores do que os valores atualmente estabelecidos, além disso, estes valores não levam em consideração a vulnerabilidade pré-natal e neopré-natal (REZG et al., 2014).
estudos recentes evidenciam que este DE pode apresentar toxicidade em concentrações baixas, e não apresentar em doses mais altas, que são muitas vezes utilizadas nos estudos de toxicidade (ROCHESTER, 2013). Dessa forma, para avaliar a exposição humana ao BPA é imprescindível o desenvolvimento de métodos cromatográficos de alta detectabilidade para a determinação de BPA em níveis de traços em amostras biológicas.
As análises toxicológicas são realizadas a fim de verificar exposição do indivíduo a determinada concentração de agente tóxico e/ou avaliar as consequências desta exposição. Os fluidos biológicos, tais como sangue, plasma, soro, urina, saliva, etc., são as amostras para acessar essas informações, pois avaliando a composição das mesmas pode-se presumir as alterações decorridas no organismo. Apresentando em sua composição proteínas, sais, lipídeos e muitas outras substâncias, o material biológico não pode ser introduzido diretamente nos sistemas analíticos, pois esta introdução direta afetaria a seletividade e sensibilidade do método analítico. Por essa razão, é fundamental a etapa de preparo da amostra no desenvolvimento de métodos analíticos, onde os analitos de interesse, presente em níveis de traços, são isolados e pré-concentrados e grande parte dos interferentes da amostra biológica é eliminada (FIGUEIREDO, 2009).
As extrações clássicas trazem consigo alguns inconvenientes como o uso de grandes quantidades de solventes orgânicos tóxicos e dispendiosos. Várias sub-etapas são realizadas, aumentando a probabilidade de erros e o tempo da análise. A utilização de tais solventes orgânicos, por si só, gera problemas ambientais e, frequentemente, resultam em baixa seletividade analítica, fato que dificulta bastante a análise de amostras complexas.
Tabela 2 - Recentes métodos analíticos para a determinação de BPA em amostras biológicas, de alimentos ou ambientais.
Analito Amostra Extração Sistema de
detecção LOQ Referência
BPA Urina LLE UHPLC-MS/MS 0.75 ng mL-1 (PORUCZNIK et al., 2015) Suor BPA Atum enlatado Atum:barra de agitação
de PTFE LC-FD 3.7 ng g-1 (FATTORE et al., 2015) BPB
BADGE Oléo e
água da lata: SPE BFDGE Compostos fenólicos Água de Efluentes
SPE – com carvão ativado
GCxGC -
TOFMS 0.19 ng mL
-1 (OLORUNDARE et al., 2014)
BPA Água
MIP-AuNPs
Espalhamento Raman intensificado por superfície
0,5 ng mL-1 (XUE et al., 2013)
Compostos
estrogênicos Água MEPS MIP -
GC-MS - derivatização
"no injetor" por BSTFA
0,025 ng
mL-1 (PRIETO et al., 2011)
BPA
água de torneira
MISPME HPLC/DAD
5 ng mL-1
(TAN et al., 2009)
Urina 14 ng mL-1
Leite 80 ng mL-1
BPA Água MIP-SPE HPLC - UV 200 ng mL-1 (JIANG et al., 2007)
A química analítica moderna tem sido direcionada para a simplificação através da miniaturização dos sistemas analíticos. Este procedimento facilita a hifenação de técnicas, a minimização do consumo de solvente orgânico, do volume da amostra, do tempo da análise, e a utilização de tecnologias ambientalmente corretas, em direção ao cuidado preventivo do meio ambiente. Neste contexto, podemos destacar a Microextração em ponteiras com adsorvente dispersante.
1.2 Microextração em ponteira (DPX, acrônimo das iniciais em língua inglesa -
Disposable Pipette Extraction)
A DPX utiliza pequena quantidade de fase inserida em uma ponteira descartável. Esta técnica foi desenvolvida por William E. Brewer, da Universidade da Califórnia, e baseia-se no rápido equilíbrio de sorção do analito, devido à dispersão da fase sólida na solução da amostra, podendo então, ser empregada no pré-tratamento de amostras com matrizes complexas, como sangue, urina, saliva, humor vítreo entre outras (LAMBERT; SCIENCES; BOX, 2009).
Figura 2 - Pipeta descartável contendo sorvente dispersante.
A DPX comparada à extração em fase sólida (SPE, acrônimo das inicias em língua inglesa - solid phase extraction) apresenta procedimento analítico mais rápido, utiliza apenas
alguns microlitros de amostra biológica e de solvente orgânico e não necessita do sistema à vácuo. A fase sólida encontra-se livremente acondicionada no interior da ponteira entre filtros que evitam a perda da fase extratora e contaminação da seringa usada para aspirar a amostra. Assim, as soluções podem ser facilmente aspiradas e dispensadas, manualmente, com o auxílio de uma seringa descartável ou em um sistema automatizado (PENA-ABAURREA; GARCÍA DE LA TORRE; RAMOS, 2013).
A amostra aspirada para o interior da pipeta é dinamicamente misturada com o sorvente, com aspiração de ar (bolhas de ar turbulento) por alguns segundos, promovendo rápida e eficiente extração. Para maior repetitividade do método, o tempo de contato entre a amostra e sorvente deve ser rigorosamente controlado (FERNANDES et al., 2014).
O procedimento de microextração em ponteira com sorvente dispersante, geralmente, tem sido realizado nas seguintes etapas:
Condicionamento do sorvente com solvente orgânico (ativação dos sítios ativos) e água (remoção do excesso de solvente e deixar a fase extratora com solvente similar à amostra);
Aspiração de alguns microlitros da amostra e em seguida aspiração de ar por aproximadamente 30 a 40 s. Após este período a amostra é descartada;
Limpeza do sorvente com solvente adequado para remoção dos componentes endógenos da amostra biológica;
Eluição dos analitos com solvente adequado.
Para o desenvolvimento de método de extração, cada uma dessas etapas precisa ser otimizada, assim como o tempo de contato entre o líquido e o adsorvente dispersante. A figura 3 ilustra o procedimento de extração por DPX (BORDIN et al., 2014).
O solvente da eluição pode ser simplesmente dispensado e diretamente injetado no sistema cromatográfico, ou evaporado e reconstituído com a fase móvel para análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou evaporado e reconstituído com solvente adequado para injeção no cromatógrafo a gás (CG). Diferentes sorventes estão disponíveis no mercado, com diferentes mecanismos de extração, entre estes pode-se citar a sílica gel, octadecilsilano (C18), troca catiônica, troca aniônica entre outras (FERNANDES et al., 2014).
Figura 3 – Etapas da microextração em ponteira com sorvente dispersante.
Tabela 3 - Aplicações da técnica DPX no preparo de amostras
Solutos (amostra) i i i Fase de sorção DPX (Procedimento) LOQ/LOD i
Fluoxetina
Norfluoxetina LC-FD SD/PANI
Sorção: 200µL de amostra com solução borato em pH 9,0 por 30s.
Eluição: 200µL de ACN por 10s.
LOQ = 10ng/mL
(CHAVES et al., 2015)
Cocaína,
GC-MS CX
Condicionamento: 1mL ACN (30% v/v)
LOD ≥ 2.5
ng/g; LOQ
≥ 10 ng/g
(BORDIN et al., 2014)
Nicotina Sorçãominuto: Sucção da amostra por 1
e metabolitos Lavagem: 1mL de água deionizada
(Mecônio)
Eluição: 1mL de diclorometano: 2-propanol: hidróxido de amônio (78:20:2 v/v/v) - 3 vezes
Praguicidas
GC-MS/MS MgSO4, PSA, C18
Sorção dos interferentes: 1.5mL de extrato da amostra preparado por QuEChERS - 2 vezes
LOD ≥ 0.1
ng/g;
LOQ≥ 0.3
ng/g
(FERNANDES et al., 2014)
(Morangos) Dispensação: extrato limpo em vial
Continuação Tabela 3 - Aplicações da técnica DPX no preparo de amostras.
Solutos (amostra) i i i Fase de sorção DPX (Procedimento) LOQ/LOD i Antibioticos
aminoglicosídeos
UHPLC-MS/MS WCX
Condicionamento: 3mL MeOH (1x) e 3mL gua (2x)
LOD = 5 ng/g (LEHOTAY et al., 2013) amostra por 30s
(Tecidos bovino) Lavagem: 3 mL gua
i 0, mL de c. F rmico 0,1 (5x)
Codeina, morfina e 6-
monoacetilmorfina GC-NPD CX
Condicionamento: 2 mL
gua e 2 mL MeOH (1x-20s) LOD ≥ 160 ng/mL;
LOQ ≥ 4 0 ng/mL (KOVATSI et al., 2011) : amostra por 30s
(Humor vítreo) Lavagem: 2,5 mL de gua
(30s) e 2,5 mL de ACN (30s); i : 2,5 mL de CH2Cl2/isopropanol/hidr xido
de am nio (78:20:2 v/v/v)
1.3 Polímeros Molecularmente Impressos
O Polímero molecularmente impresso, ou MIP (acrônimo das iniciais em língua inglesa
Molecularly Imprinted Polymer) é uma rede polimérica tridimensional contendo sítios com
capacidade de reconhecimento molecular. Esses sítios possuem grupos funcionais capazes de interagir seletivamente com determinada molécula. A rede polimérica é sintetizada ao redor da molécula a qual deseja-se obter o reconhecimento molecular (molécula molde ou
template), e ao final da síntese essa molécula é retirada, deixando a cavidade livre para a
interação com o analito (GRASSI, 2008).
Em 1940, Pauling sugeriu a ideia de utilizar uma substância alvo como template para
se ligar seletivamente a um sítio de reconhecimento para explicar como funcionava o sistema imunológico. Em 1972 surgiu o primeiro trabalho empregando MIPs em química analítica no qual Wulff e Sarhan descreveram a síntese de um polímero com sítios seletivos para a separação enantiomérica de racematos de açúcares (TEIXEIRA TARLEY; TABOADA SOTOMAYOR; KUBOTA, 2005). Arshady e Mosbach, em 1981, desenvolveram uma metodologia que utilizava as interações não-covalentes para o reconhecimento molecular, ao contrário do MIP desenvolvido por Wulff que utilizava as interações covalentes. Whitcombe
et al., em 1995 apresentaram a interação semi-covalente como uma nova abordagem para a
utilização do MIP (SOUSA; BARBOSA, 2009).
O mecanismo de sorção (reconhecimento molecular) dos MIPs assemelha-se ao observado nos imunossorventes (interação antígeno-anticorpo). Os MIPS comparados aos imunossorventes apresentam as seguintes vantagens: maior estabilidade química, alta capacidade de adsorção, fácil procedimento de síntese, adequada repetitividade do procedimento de síntese, baixo custo de obtenção, alta resistência a variações de pH, temperatura e pressão, e ao contrário dos imunossorventes, podem ser facilmente armazenados em temperatura ambiente por períodos prolongados (BOMPART; HAUPT, 2009).
1.3.1 SÍNTESE DO MIP
monômero que será utilizado. O analito (template) precisa apresentar grupos funcionais
capazes de interagir com esse monômero, permitindo a formação de um complexo estável entre o MIP e o analito. O solvente, também é um importante fator a ser considerado no planejamento da síntese do MIP, pois pode interferir na interação entre monômero funcional e o analito, e participa do controle da porosidade, sendo por essa razão, muitas vezes chamado de agente porogênico (SOUSA; BARBOSA, 2009).
As interações entre o monômero-funcional e a molécula-molde, assim como entre o MIP e o analito, podem ocorrer por ligações covalentes ou não covalentes. Nos processos de síntese que ocorrem interações covalentes, o template é removido por clivagem. Esse
procedimento tem estequiometria conhecida, assim, por não haver grandes excessos de monômero funcional, há pequena quantidade de sítios de interações inespecíficas, e gera sítios homogêneos e altamente específicos. Porém, há maior dificuldade em remoção do template e
posteriormente, o analito apresenta baixa cinética de recaptação e eluição, aumentando o tempo de extração (SOUSA; BARBOSA, 2009).
Nos procedimentos não-covalentes, as interações podem ser de vários tipos, ligação de hidrogênio, interação dipolo- dipolo, interação iônica e interações hidrofóbicas, sendo que as mais utilizadas são as ligações de hidrogênio e as interações hidrofóbicas. A facilidade de remoção do template é maior, e consequentemente, diminui o tempo da extração e aumenta a
aplicabilidade ao polímero. Em contrapartida, há maior formação de sítios inespecíficos, já que há necessidade de adicionar monômero funcional em excesso em relação à molécula-molde (SOUSA; BARBOSA, 2009).
Visando minimizar as desvantagens dos dois tipos de interação, surge a abordagem semi-covalente, na qual utiliza-se as interações covalentes no procedimento de síntese, e as interações não- covalentes na recaptação do analito na aplicação do MIP. Para isso utiliza-se um grupo espaçador, que é um grupo funcional presente na molécula usada como template no
procedimento de síntese, mas que não está presente na molécula do analito (SOUSA; BARBOSA, 2009).
O processo mais comumente utilizado para a síntese do MIP é a metodologia chamada de polimerização em bulk, na qual a reação acontece em um sistema homogêneo. Neste
(FIGUEIREDO, 2009). Esta reação é conduzida em frascos selados e ocorre na ausência de oxigênio sob fluxo de nitrogênio ou argônio e induzida com aquecimento e/ou radiação UV. O oxigênio deve ser eliminado do meio reacional porque retarda a reação de polimerização radicalar (FIGUEIREDO; DIAS; ARRUDA, 2008). Na etapa seguinte, removem-se as moléculas molde do polímero, e então microcavidades com tamanho, forma e estrutura complementares a do template são encontradas no polímero, como ilustra a Figura 4. O
processo de polimerização radicalar é descrito pela maioria dos trabalhos envolvendo síntese de polímeros orgânicos devido a simplicidade de síntese dos monômeros e facilidade de encontrá-los comercialmente (SILVA; AUGUSTO, 2006).
Figura 4. Processo de impressão molecular.
Fonte: (GOMES, 2009)
No processo sol-gel, ocorre, a transição do estado sol para o estado gel, sendo que, sol é um sistema coloidal, com partículas de dimensão entre 1 e 100nm, no qual a fase dispersa é sólida e encontra-se estável na fase de dispersão (JUNIOR; VARANDA, 1999). As partículas se ligam e formam uma rede tridimensional sólida, que retém as partículas líquidas em seu interior (fase gel), e que se comporta como um sólido elástico. (LOFGREEN; OZIN, 2014).
A síntese via processo sol-gel, tem muitas vantagens, dentre estas estão a possibilidade de controlar a porosidade, tamanho e forma das partículas, ajuste do caráter hidrofílico do polímero e alta estabilidade térmica. Pois o processo sol-gel permite utilizar precursores de diferentes naturezas (orgânicos e inorgânicos), assim, é possível sintetizar um material que possua características de ambos, podendo-se escolher os precursores de acordo com as características de interesse que se espera encontrar no material formado (LOFGREEN; OZIN, 2014).
1.3.2 REMOÇÃO DA MOLÉCULA MOLDE
Além da escolha da via de síntese, a etapa de remoção da molécula molde é de extrema importância para manter a eficiência do MIP e não alterar as propriedades do polímero. Técnicas como imersão em solvente orgânico e extração em Soxhlet são amplamente empregados, porém, apresentam desvantagens. Entre elas pode-se citar o longo tempo exigido para remoção, grandes volumes de solvente e a dificuldade dos solventes atingirem todos os sítios de ligação o que pode levar a liberação de molécula molde durante a aplicação do polímero (sangramento). (LORENZO et al., 2011).
1.3.3 POLÍMERO MOLECULARMENTE IMPRESSO COM MOLÉCULA MOLDE ANÁLOGA AO ANALITO
Geralmente o template usado para a síntese do MIP é a mesma molécula do analito
para o qual o MIP será usado, porém há alguns casos em que ainda observa-se a saída dessa molécula molde mesmo depois de exaustiva lavagem do polímero. Isso pode interferir na exatidão da análise e coloca em risco a confiabilidade da mesma. Visando solucionar este inconveniente é possível sintetizar o MIP usando como template uma molécula análoga a do
analito.
O polímero sintetizado dessa forma é conhecido como Dummy molecularly imprinted
polymer (DMIP). Apesar de menor capacidade de reconhecimento molecular que a do MIP
sintetizado com o próprio analito como molécula molde, o uso dessa estratégia pode prevenir
que o “sangramento” da molécula molde prejudique a an lise, pois mesmo que ocorra, não ir
6 CONCLUSÃO
O MIP sintetizado com o molde BPA apresentou maior capacidade de sorção, quando comparado ao NIP, e capacidade de sorção ligeiramente maior, quando comparado ao DMIP (molécula molde: TBBPA), comprovando assim, a seletividade dos polímeros molecularmente impressos. Porém, com o intuito de minimizar o efeito de memória do BPA no MIP, o DMIP foi utilizado para o desenvolvimento do método DPX/GC-MS.
A técnica de preparo de amostra DPX proporcionou simplicidade e agilidade ao método GC-MS. Além disso, por ser uma técnica de microextração, utilizou menores volumes de amostra de urina e de solvente orgânico (técnica ambientalmente correta).
A utilização do polímero molecularmente impresso como sorvente (DPX) favoreceu a seletividade da extração (reconhecimento molecular) e remoção dos compostos endógenos da matriz biológica. A robustez do DMIP sintetizado via sol-gel foi comprovada pela reutilização deste sorvente por cerca de 100 vezes, sem perda na eficiência da extração.
REFERÊNCIAS
AL-OWEINI, R.; EL-RASSY, H. Synthesis and characterization by FTIR spectroscopy of silica aerogels prepared using several Si(OR)4 and R′′Si(OR′)3 precursors. Journal of
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