Linfócitos Th17 e linfócitos T CD4+ multifuncionais em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico.

(1)

w w w . r e u m a t o l o g i a . c o m . b r

REVISTA

BRASILEIRA

DE

REUMATOLOGIA

Artigo

original

Linfócitos

Th17

e

linfócitos

T

CD4

+

multifuncionais

em

pacientes

com

lúpus

eritematoso

sistêmico

Júlio

Antônio

Pereira

Araújo

a

_,

_Danilo

_Mesquita

_Jr.

a

_,

_Wilson

_de

_Melo

_Cruvinel

a,b

_,

Karina

Inácio

Salmazi

c

_,

_Esper

_Georges

_Kallás

c

_e

_Luis

_Eduardo

_Coelho

_Andrade

a,∗

a_Departamento_de_{Reumatologia,}_Universidade_Federal_de_São_Paulo_(Unifesp),_São_Paulo,_SP,_Brasil

b_Departamento_de_Biomedicina,_Pontifícia_Universidade_Católica_de_Goiás_(PUC-GO),_Goiânia,_GO,_Brasil

c_Departamento_de_Imunologia_Clínica_e_Alergia,_Universidade_de_São_Paulo_(USP),_São_Paulo,_SP,_Brasil

informações

sobre

o

artigo

Históricodoartigo:

Recebidoem4deabrilde2014 Aceitoem22deagostode2015

On-lineem9deoutubrode2015

Palavras-chave:

Lúpuseritematososistêmico LinfócitosT

Th17

LinfócitosTmultifuncionais

r

e

s

u

m

o

Introduc¸ão/Objetivo:Evidênciasrecentessugeremqueanormalidadesqueenvolvemos

lin-fócitosTh17estãoassociadasàfisiopatologiadolúpuseritematososistêmico(LES).Além disso,oslinfócitosTmultifuncionais(LTM),ouseja,aquelesqueproduzemmúltiplas cito-cinassimultaneamente,estãopresentesnomeioinflamatórioepodemestarimplicadosno processoautoimuneobservadonoLES.Nopresenteestudo,objetiva-secaracterizaroestado funcionaldoslinfócitosTCD4+_no_LES_e_determinar_{simultaneamente}_a_{concentrac¸ão}_de

IL-2,IFN-␥eIL-17emculturasdelinfócitossobestímulosexógenoseautoantigênicos.

Pacientesemétodos:Dezoitopacientescomdoenc¸aativa,18comdoenc¸ainativae14controles

saudáveisforamsubmetidosàanálisedoestadofuncionaldoslinfócitosTCD4+_.

Resultados:Encontrou-sequeospacientescomLESapresentaramumadiminuic¸ãona

quan-tidadetotaldecélulasCD4+_,_um_aumento_na_quantidade_de_linfócitos_T _ativados_e_um

aumentonafrequênciadelinfócitosTh17emcomparac¸ãocomcontrolessaudáveis(HC). AscélulasLTMtinhafrequênciaaumentadaempacientescomLESehouveumaumentona frequênciadeLTMtrifuncionaisempacientescomLESativoemcomparac¸ãocomaqueles comLESinativo.Curiosamente,ascélulasMTFproduziramquantidadesmaioresdeIFN-␥

doqueoslinfócitosTmonofuncionaisempacientesecontroles.

Conclusão:Analisadosemconjunto,essesdadosindicamaparticipac¸ãodoslinfócitosTh17

recentementeativadosecélulasMTFnafisiopatologiadoLES.

Th17

cells

and

CD4

+

_{multifunctional}

_T

_cells

_in

_patients

_with

_systemic

lupus

erythematosus

Keywords:

Systemiclupuserythematosus Tlymphocytes

a

b

s

t

r

a

c

t

Introduction/Objective:Recent evidence suggests that abnormalities involving Th17

lymphocytes are associated with the pathophysiology of systemic lupus erythema-tosus (SLE). In addition, multifunctional T cells (MFT), i. e., those producingmultiple

∗

Autorparacorrespondência.

E-mail:luis.andrade@unifesp.br(L.E.C.Andrade).

http://dx.doi.org/10.1016/j.rbr.2015.08.008

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Th17

MultifunctionalTcells

cytokinessimultaneously,arepresentintheinflammatorymilieuandmaybeimplicatedin theautoimmuneprocessobservedinSLE.Inthepresentstudy,weaimedtocharacterizethe functionalstatusofCD4+_T_cells_in_SLE_by_{simultaneously}_determining_the_{concentration}

ofIL-2,IFN-␥andIL-17inlymphocyteculturesunderexogenousandself-antigenicstimuli.

Patientsandmethods: Eighteenpatientswithactivedisease,18withinactivedisease,and14

healthycontrolshadfunctionalstatusofCD4+_T_cells_analyzed.

Results: WefoundthatSLEpatientspresentedadecreasednumberoftotalCD4+_cells,_an

increasednumberofactivatedTcells,andanincreasedfrequencyofTh17cellscompared tohealthycontrols(HC).MFTcellshadincreasedfrequencyinSLEpatientsandtherewasan increasedfrequencyoftri-functionalMFTinpatientswithactiveSLEcomparedwiththose withinactiveSLE.Interestingly,MTFcellsproducedlargeramountsofIFN␥than

mono--functionalTcellsinpatientsandcontrols.

Conclusion: TakentogetherthesedataindicatetheparticipationofrecentlyactivatedTh17

cellsandMTFcellsintheSLEpathophysiology.

Introduc¸ão

Os linfócitos T CD4+ _efetores _foram _inicialmente

classifi-cadosemdois subgrupos,de acordo com ascitocinas que produzem.1-3_Os_linfócitos_Th17_fazem_parte_desse_novo

pano-ramadelinfócitosTemostramumfenótipodelinfócitosT CD4+_ativados_{caracterizado}_pela_produc¸ão_de_elevadas

quan-tidadesdeIL-17.4–6_Os_linfócitos_Th17_parecem_desempenhar

umpapelcrucialnodesenvolvimentodeumaamplagama de transtornos inflamatórios crônicos e autoimunes.7–9 _Na

verdade, sugeriu-se que a regulac¸ão inapropriada dos lin-fócitos Th17 pode ser um evento-chave na patogênese da artritereumatoideedolúpuseritematososistêmico(LES).10–14

Diversosestudosrelataramníveisséricossignificativamente maisaltosdeIL-17eumafrequênciamaiselevadade célu-lasmononucleadasdosangueperiférico(CMSP)produtorasde IL-17empacientescomLES,emcomparac¸ãocomindivíduos normais.13,15–18_Mostrou-se_também_que_a_resposta_do_Th17

estácorrelacionadacomaatividadedadoenc¸aempacientes comLES.17

Umaestratégiainovadora paraaavalic¸ãoda funcionali-dadedo linfócitoT sebaseia nadeterminac¸ão simultânea de várias citocinas expressas por subtipos de células. De acordocomessa abordagem,oslinfócitosTqueproduzem múltiplascitocinas simultaneamentesãochamados de lin-fócitos T multifuncionais. Foram documentadas respostas dos linfócitos T multifuncionais no HIV-119 _e _na _resposta

imune à vacina contra o vírus da hepatite B20 _e _HIV.19,20

Essa nova abordagem tem sido possível em grande parte emrazão dosavanc¸os tecnológicosna citometriade fluxo, quenaatualidadepossibilitaadetecc¸ãosimultâneade diver-sos marcadores funcionais, fenotípicos ede linhagemnos linfócitosT.21

Nopresenteestudo,buscou-secaracterizaroestado funci-onaldoslinfócitosTCD4+_em_pacientes_com_LES_com_doenc¸a

ativaeinativaedeterminarsimultaneamenteaconcentração deváriascitocinasemculturasdelinfócitoscomdiferentes estímulosantigênicos.Tambémsequantificouaproporçãode Th17elinfócitosTmultifuncionaiseseacorrelacionoucoma pontuaçãonoSledai(SystemicLupusErythematosusDisease

ActivityIndex)ecomafrequênciadelinfócitosTativadose linfócitosTREG.

Materiais

e

métodos

Trintaeseis pacientesadultos(33mulheresetrêshomens, de40± 7,2anos)com diagnósticodeLESdeacordocomos critériosdoColégioAmericanodeReumatologia22_foram

con-secutivamente incluídosno estudo,depois de fornecer seu consentimento informado.Todos os pacientes foram enca-minhados do ambulatório da Divisão de Reumatologia da UniversidadeFederaldeSãoPaulo.Ospacientesforam dividi-dosemdoisgrupos,deacordocomasuapontuac¸ãonoSLE Disease Activity Index(Sledai).23,24 _O _grupo_LES_ativo

(LES--A)eracompostopor18pacientes(pontuaçãonoSledai≥6; 17mulhereseumhomem,idade36,7±10,2anos)eogrupo LESinativo(LES-I)eracompostopor18pacientes(pontuação no Sledai=0;16 mulheresedois homens,idade 39,2± 13,9 anos).Atabela1mostraascaracterísticasdemográficase clíni-casdetodosospacientesincluídosnoestudo.Comocontrole, foramincluídos14funcionáriosdolaboratório(13mulherese umhomem,de33,9±10,4anos),saudáveis,depoisdedarem seu consentimento informado.Os pacientes eos controles saudáveisforamsubmetidosaumquestionárioestruturado ecederam60mLdesanguevenoso.Oprotocolo doestudo foirevisadoeaprovadopelocomitêdeéticaempesquisada instituição.

Foramisoladascélulasmononuclearesdosangue perifé-rico (CMSP) por sedimentação em gradiente de densidade sobre Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) e lavadas duasvezes emsoluçãosalina balanceadade Hank (Gibco, Grand Island, NY). Para a criopreservação, as célu-lasforamlentamentecongeladasemsorofetalbovinoa90% (FBS; HyClone Laboratories, Logan,UT) earmazenadas em nitrogênio líquido. Nomomentodoensaio, asCMSP foram rapidamentedescongeladasemumbanhocomáguaa37◦_C_e

lavadasemRPMI1640pré-aquecidosuplementadocomsoro fetal deviteloa10%,100U/mLde penicilina,100␮g/mLde

(3)

Tabela1–Característicasdemográficasdoscontrolesepacientescomlúpuseritematososistêmico

Controles(n=14) LES-A(n=18) LES-I(n=18) p

Idade 33,9±10,4 36,7±10,2 39,2±13,9 0,624

Feminino(%) 92,8% 94,4% 88,9% 0,987

DP,desviopadrão;LES-A,lúpuseritematososistêmicoativo;LES-I,lúpuseritematososistêmicoinativo;Sledai,systemiclupuserythematosus

diseaseactivityindex;NS,nãosignificativo.

contadas,foiverificadasuaviabilidadeeforamsuspensasem R10aumaconcentrac¸ãode1×106_células_viáveis/mL.

As CMSP descongeladasforam incubadas emplacas de 96alvéolos(200␮L/alvéolo)(BectonDickinson,SanJosé,CA)

napresençade100ng/mLde forbol12-miristato13-acetato (PMA;Sigma)e500ng/mLdeionomicinaoucom100ng/mLde extratodecélulasHEp-2durante16horas.Apósaestimulação, ascélulasforamcentrifugadasa1.500gdurantecinco minu-tos,suspensasemtampõesMacsetransferidasparaplacas de96alvéoloscombaseemV(Nunc,Roskilde,Dinamarca) em100␮L de tampão de coloração [soluçãosalina

tampo-nadacomfosfato(PBS)suplementadacomazidadesódioa 0,1%(Sigma)eFBSa1%,pH7,4]comopaineldeanticorpos monoclonaisdesuperfície(CD4-PerCP,CD3-APC-CY7e CD69-PE-Cy7).Ascélulasforamincubadasa4◦_C_no_escuro_durante

30min,lavadasduasvezescomPBSe,emseguida,suspensas em100␮Ldetampãodefixac¸ão[paraformaldeídoa1%

(Polys-ciences,Warrington, PA) emPBS,pH 7,4].Para acolorac¸ão intracelular,ascélulaspreviamentemarcadaspara marcado-resdesuperfícieforamincubadascom100␮Ldetampãode

fixac¸ãoa4%elavadascomtampãodepermeabilizac¸ão(PBS suplementadocomazidadesódioa0,1%,FBSa1%e sapo-ninaa0,1%;Sigma). Cada amostra foi suspensaem100␮L

de tampãode permeabilizac¸ão, incubada durante 15min à temperaturaambientenoescuro,lavadacom100␮Lde

tam-pãodecolorac¸ãoeincubadadurante30mina4◦_C_no_escuro

semqualqueranticorpo(tubonãocorado)nemacúmulode anticorposmonoclonaisanti-IL-2-PE,anti-IFN-␥-APCe

anti--IL-17-FITC em50␮L de tampãode colorac¸ão.25 As células

foramlavadascom200␮Ldetampãodecolorac¸ãoe

suspen-sasem100␮Ldeparaformaldeído(PFA)a1%recentemente

preparadodepH7,4.

Os linfócitos TREG e os linfócitos T CD25+ efetores

foram identificados conforme um protocolo anteriormente estabelecido.26_{Resumidamente,}_as_CMSP_foram_lavadas_em

PBSe0,5×106_células_viáveis_foram_incubadas_com

anticor-posanti-CD127marcadoscomisotiocianatodefluoresceína (ITCF),anti-CD3marcadocomaloficocianina-Cy3(APC-Cy3), anti-CD4marcadocomPerCPeanti-CD25marcadocom ficoe-ritrina(PE)-Cy7(BectonDickinson,SanJosé,CA,EUA),segundo asinstruc¸õesdofabricante.Após30mindeincubac¸ãoa4◦_C_no

escuro,ascélulasforamlavadascomtampãodeMacs,fixadas epermeabilizadascom tampão de fixação/permeabilização FoxP3(eBioscience,SanDiego,CA,EUA)eentãoprocessadas paracoloraçãocomFoxP3comousodokitdecoloraçãoFoxP3 eanti-Foxp3marcadocomAPC(eBioscience),deacordocom asinstruçõesdofabricante.

AsamostrasforamprocessadasemumFACSCantoFlow Cytometer,comousodosoftwareFACSDIVA(BDBiosciences). Osdadosobtidos foramanalisadoscomosoftware FLOWJO

(TreeStar,SanCarlo,CA).Asvoltagensdefluorescênciaforam determinadas comousodecélulasnãocoradas correspon-dentes.A compensac¸ãofoi feita como usode CompBeads (BDBiosciences)únicocoradocomCD3-PerCP,CD4-FITC, CD8-APC-CY7,CD4-PE-CY7,CD3-PEouCD3-APC,respectivamente. As amostras eram adquiridas atéque fossem obtidos pelo menos500mileventosemumajaneladecélulasvivas.

Osdadosforamdescritoscomamedianaeintervalo inter-quartil (IQR).As comparações entreosgrupos foram feitas com otestenãoparamétricodeKruskal-Wallis,seguido de comparações entre os grupos com o teste de Dunnett. As correlaçõesforamfeitascomo métodonãoparamétricode Spearman.Estabeleceu-seumníveldeinferênciaestatística de5%(p<0,05).

Resultados

FrequênciareduzidadelinfócitosTCD4+_e_frequência

aumentadadelinfócitosrecentementeativadosnolúpus eritematososistêmico

AfrequênciarelativadelinfócitosCD4+_em_relac¸ão_aos

lin-fócitosCD3+_totais_em_culturas_de_CMSP_estimuladas_com_o

extratoparacélulasHEp-2foisignificativamenteinferiorem amostrasdepacientescomLES-A(18,4±8,9)eLES-I(17,3±7,6) em comparac¸ão com os controles (24,0±8,2) (fig. 1A). Do mesmomodo,asculturasdeCMSPestimuladascomPMA/Io apresentaramumafrequênciarelativamenordecélulasCD4+

emrelac¸ãoaoslinfócitosCD3+_totais_em_amostras_de

pacien-tescomLES-A(16,6±8,4)eLES-I(19,6±7,6),emcomparac¸ão comoscontroles(25,3±6,4)(fig.1B).Omesmofoiobservado emculturasdeCMSPnãoestimuladas(dadosnãomostrados). Emcontraste,quandoforamavaliadascélulasrecém-ativadas, caracterizadaspelaexpressãoda moléculaCD69,foi obser-vadaumafrequênciarelativamaiordelinfócitosCD4+_CD69+

emrelac¸ãoaototaldelinfócitosCD4+_em_pacientes_com_LES-A

(5,1±6,6)eLES-I(4,9±5,2)quandocomparadoscomos con-troles(2,8±1,9)emculturasestimuladascomoextratopara célulasHEp-2(fig.1C),bemcomocomPMA/Io:LES-A(6,6± 8,3), LES-I(5,9±5,5)econtroles(3,5±2,0)(fig.1D).Maisumavez, foiobservadoumcomportamentosemelhanteemculturasde CMSPnãoestimuladas(dadosnãomostrados).

PerfilmultifuncionaldoslinfócitosTCD4+_no_lúpus

eritematososistêmico

Em seguida, analisou-se o perfilfuncional doslinfócitos T CD4+ _após _estímulos _{autoantígeno-específico}_(extrato

(4)

Controles

50

*

45

A

B

C

D

40 35 30 25

P

orcentagem de linf

ócitos

T CD4

+ CD69

+

P

orcentagem de linf

ócitos

T CD4

+ CD69

+

20 15 10 5 0

25 40

30

20

10

0 20

15

10

5

0

LES-I _LES-A

Controles

LES-I _LES-A

Controles

LES-I _LES-A

Controles

LES-I _LES-A

50

**

***

45 40 35 30 25

P

orcentagem de linf

ócitos

T CD4

+

P

orcentagem de linf

ócitos

T CD4

+

20 15 10 5 0

Figura1–FrequênciarelativadelinfócitosTCD4+ _em_pacientes_com_LES_ativo,_LES_inativo_e_controles_(A)_e_frequência relativadelinfócitosTCD4+_CD69+_em_pacientes_com_LES_ativo,_LES_inativo_e_controles_na_{estimulac¸ão}_com_HEp-2_(A,_C)_e

comPMA/Io(B,D).Asbarrasrepresentamamedianaparacadagrupo.*p<0,05;**p<0,01;***p<0,001.

simultaneamenteaIL-2,IL-17eINF-␥intracelularpela

cito-metriade fluxo após aestimulac¸ão in vitro com o extrato paracélulasHEp-2ePMA/Io,respectivamente.Afigura2 mos-traaestratégiadejanelaeacaracterizac¸ãomultiparamétrica dospadrõesderespostamonofuncionais,bifuncionaise tri-funcionaisemumpacientecomLESativorepresentativo.A frequênciadessessubconjuntosfuncionaisdelinfócitosTfoi, então,exploradaemcontrolessaudáveiseempacientescom LESativoeinativo.

Foi encontrado um aumento na frequência relativa de célulasqueproduzirampelomenosumadastrês citocinas analisadasempacientescomLES-AeLES-Iemcomparação comoscontrolesquandoestimuladaspeloHEp-2(fig.2B)ou PMA/Io(fig.2C),masnãoemculturasnãoestimuladas(dados nãomostrados).Nãohouvediferençanafrequênciarelativa decélulastrifuncionaisentrepacientescomLESecontroles emculturasestimuladascom o extratopara célulasHEp-2 ouPMA/Io(fig.2D,tabela2).Alémdisso,nãohouvediferença relativanafrequênciadecélulasmonofuncionaisou bifunci-onaisemculturasdostrêsgruposestimuladoscomoextrato paracélulasHEp-2ouPMA/Io(fig.2D,tabela2).Amaiorparte doslinfócitosTbifuncionaisemonofuncionaisteve frequên-ciasimilaremamostras depacientescom LESecontroles. Noentanto,amostrasdepacientescomLES-AeLES-I apre-sentaram maior frequênciade células produtoras de IL-17 emculturasestimuladascomPMA/Io,masnãonas estimu-ladascom oextratoparacélulas HEp-2(fig.2D etabela2). Alémdisso,ascélulasbifuncionaisprodutorasdeIL-17eINF-␥

mostraramumafortetendênciaaumamaiorfrequênciaem

culturasestimuladasporPMAdepacientescomLES-AeLES-I

emcomparac¸ãocomoscontrolesnormais(fig.2Detabela2). Comopodeservistonafigura2D,houveumagrandevariac¸ão nafrequênciadecélulasmonofuncionaisemculturas estimu-ladasdepacientescomLES.Váriospacientesapresentaram umafrequênciamuitoaltadecélulasqueexpressamIL-17e INF-␥.

OslinfócitosTCD4+_IL-2+_/INF-+_bifuncionais_produzem

maisINF-doqueoslinfócitosTCD4+IL-2+/INF-+

monofuncionais

Aseguir,perguntou-se seaquantidadede citocinas produ-zidas pelos linfócitos T multifuncionais e monofuncionais era equivalente. Para avaliar esse parâmetro, avaliou-se a intensidade médiade fluorescência(IMF)de cada umadas trêscitocinasavaliadas.Comopodeservistoem experimen-tos com amostras estimuladas porPMA/Io de controles, a IMFdoIFN-␥emlinfócitosIL-2+/INF-␥+foisignificativamente

maiordoqueemoutrassubpopulac¸õesdelinfócitosT,mesmo naquelasqueproduzemapenasINF-␥(fig.3AeB).Essa

(5)

IL-17

IL-2 IL-17 IFN-γ

Janela boeana Porcentagem do total de linfócitos

T CD4+ que produzem citocinas

P

o

rcentagem do total de linf

ócitos

T CD4

+ que produz

em citocinas

Porcentagem do total de linfócitos T CD4+ que produzem citocinas LES-A

Aa

B

Ab

LES-I

Controles

LES-A

LES-A LES-I

LES-I

4%

2% 2% p < 0,5 3% 86%

86% 86% 88%

82% 85%

4% 4%

Controles

Controles HEp-2

PMA/lo

LES-A LES-I Controles

0 5 10

40

30

20

10

0

15 20 ₀ ₁₀ ₂₀ ₃₀ ₄₀

*** *

***

* *

**

A

B

D

C

3 funções

3 funções 2 funções

2 funções 1 funções

1 funções SSC CD4

CD3

CD4 FSC

R1

R3 R4 R5 R2

IL-2

IL-17 + + +

+ + –

– + +

+ – +

+ + +

+ + –

+ – +

– + +

+ – –

– + +

– – + – + + – + – + –

– + – + +

– – + +

– –

– – +

– + – IL-2

IFN-γ

IL-2 Hep-2 PMA/lo

IL-17 IFN-γ

Figura2–(A)EstratégiadeanálisemultiparâmetrosparaidentificaroslinfócitosTh17elinfócitospolifuncionaisnasCMSP deHCestimuladascomPMA/Io.Inicialmente,foiestabelecidaumajanelaparaapopulaçãodelinfócitos(R1),entãoapenas apopulaçãoCD3+_CD4+_foi_selecionada_(R2)._A_partir_dessa_{população,}_foram_obtidas_células_que_expressam_IL-2_(R3)_IL-17 (R4)eINF-␥(R5).FrequênciarelativadelinfócitosTCD4+queproduzemcitocinas(IL-2,IL-17ouINF-␥)pelaestimulaçãocom HEp-2(B)ePMA/Io(C).Asbarrasrepresentamoerropadrãoparacadagrupo.(D)Diagramailustrandoocomportamentode subconjuntosfuncionaisdelinfócitosTCD4+_de_pacientes_com_LES-A,_LES-_I_e_controles._O_gráfico_box_plot_representa_a frequênciarelativadecadasubconjuntofuncionaldelinfócitosTCD4+_nos_três_grupos,_sob_duas_condições_de_estímulo (extratoparacélulasHEp-2ePMA/Io,respectivamente).Ospadrõesderespostasãoagrupadosecodificadosporcorespelo númerodefunçõespositivaseresumidosemgráficosemformadepizza,emquecadafatiadepizzarepresentaa

percentagemmédiadarespostadoslinfócitosTCD4+_contribuída_pelos_padrões_de_resposta_com_as_três_funções_medidas (verde),qualquercombinaçãodeduasfunções(vermelho)ouuma(azul)dasfunçõesmedidas.*p<0,05;**p<0,01; ***p<0,001.

TCD4+ _em_qualquer_dos_três _grupos_estudados_(dados_não

mostrados).

Correlac¸ãoentreafrequênciadelinfócitosTh17ecélulas recém-ativadasempacientescomlúpuseritematoso sistêmicoinativoecomlinfócitosTCD4+_efetores_no_lúpus

eritematososistêmicoativo

Foi encontrada uma correlac¸ão positiva entre a frequên-cia de linfócitos Th17 e linfócitos recentemente ativados em amostras de CMSP de pacientes com LES-I em cultu-ras não estimuladas (fig. 4A) ou sob estímulo do extrato para células HEp-2 (fig. 4B), mas não quando as células foramestimuladascomPMA/Io(fig.4C).Houvetambémuma correlac¸ão positiva entre a frequência de linfócitos Th17 e linfócitos CD4+_CD25+_Foxp3∅ _em _amostras _de _pacientes

com LES ativo sem estímulos ou sob diferentes estímulos (fig. 4D-F). Nas amostras de controle, houve também uma correlac¸ão positiva entre afrequência de linfócitosTh17 e linfócitos CD4+_CD25+_Foxp3∅ _quando _a _cultura _foi

estimu-lada com extrato para células HEp-2 e em culturas não estimuladas, mas não naquelas estimuladas com PMA/Io (dados nãomostrados). Essacorrelac¸ãonão foiencontrada em culturas de amostras de pacientes com LES inativo (dadosnãoapresentados).Nãofoiencontradacorrelac¸ãoentre a frequência relativa de linfócitos Th17 e linfócitos TREG

(CD4high_CD27∅_Foxp3+₎_em_amostras_de_controles_e_pacientes

(6)

IFN-γ+ 386 323 564 1150

Funcionalidade do CD4

A

B

C

D

E

IMF

IFN-γ

IMF

IFN-γ

IMF

IFN-γ

IMF

IFN-γ

Funcionalidade do CD4 Funcionalidade do CD4 Funcionalidade do CD4

IFN-γ+IL-2+IL-17+

IFN-γ+IL-2+IL-17+ IFN-γ+IL-17+ IFN-γ+IL-2+

IFN-γ

IFN-γ+IL-2+IL-17+C

IFN-γ+IL-2+IL-17+I

IFN-γ+IL-2+IL-17+A

IFN-γ+IL-2+I

IFN-γ+IL-2+A

IFN-γ+IL-17+I

IFN-γ+IL-17+A

IFN+IIFN+A

IFN-γ+IL-2+IL-17+I

IFN-γ+IL-2+C

IFN-γ+IL-2+I

IFN-γ+IL-17+C

IFN-γ+IL-17+I

IFN-γ+C

IFN-γ+I

IFN-γ+IL-2+IL-17+A

IFN-γ+IL-2+C

IFN-γ+IL-2+A

IFN-γ+IL-17+C

IFN-γ+IL-17+A

IFN+CIFN+A

IFN-γ+IL-2+

IFN-γ+IL-17+ IFN+ 100

80

60

40

% de células

20

8.000 _***

**

*** 6.000

4.000

2.000

8.000

6.000

4.000

2.000

0

8.000 5.500

5.000 4.500 4.000 3.500 3.000 2.500 2.000 1.500 1.000 500 0 6.000

4.000

2.000

0 0

0

0 102 103 104 105

Figura3–(A)Histogramaquerepresentaaintensidademédiadafluorescência(IMF)doINF-␥apósaestimulaçãocom PMA/IonasdiferentessubpopulaçõesdelinfócitosTCD4+_funcionais_de_uma_amostra_{representativa}_do_controle_normal._A linhaazulrepresentaaIMFdascélulascomumafunção,alinhaverderepresentaascélulascomtrêsfunçõeseaslinhas laranjaevermelharepresentamascélulascomduasfunçõesparaoINF-␥+IL-17eINF-␥+IL-2,respectivamente.(B)Gráfico representandoadiferençaentreaIMFdoIFN-␥entrediferentessubpopulaçõesfuncionaisdelinfócitosTCD4+nos

controlespelaestimulaçãocomPMA/Io.ComparaçãodaIMFdoIFN-␥pordiferentestiposdelinfócitosCD4+após estimulaçãocomPMA/IoentreocontroleeLES-A(C),controleeLES-I(D)eLES-IeLES-A(E).**p<0,01;***p<0,001.

Porcentagem de linfócitos CD4+ CD69+

15

40

30

20

10

0

40

30

20

10

0

40

30

20

10

0 10

p = 0,0002

A

B

C

D

E

F

5

0

0 5 10 15

0 5 10 15 20 25

0 5 10 15 20 25 0 10 20 25

Porcentagem de linfócitos CD4+ CD69+ Porcentagem de linfócitos CD4+ CD69+

P

orcentagem de linf

ócitos

Th17

P

orcentagem de linf

ócitos

T CD25

+ F

o

xp3

–

P

orcentagem de linf

ócitos

T CD25

+ F

o

xp3

–

P

orcentagem de linf

ócitos

T CD25

+ F

o

xp3

–

P

orcentagem de linf

ócitos

Th17

Porcentagem de linfócitos Th17

P

orcentagem de linf

ócitos

Th17

r = 0,7665

p = 0,006

r = 0,619 p = 0,100

r = 0,399

p = 0,010 r = 0,732 p = 0,006

r = 0,763 p = 0,023

r = 0,674

Figura4–CorrelaçãoentreafrequênciarelativadelinfócitosTh17elinfócitosTCD4+_CD69+_em_culturas_de_CMSP_de pacientescomLES-Isemestimulação(A),culturaestimuladacomextratoparacélulasHEp-2(B)eculturaestimuladacom PMA/Io(C)n=18.CorrelaçãoentreafrequênciarelativadelinfócitosTh17eCD4+_CD25+_Foxp3−_em_culturas_de_CMSP_de

(7)

T abela 2 – F requência rela ti v a de células pr odutor as de citocinas em relac ¸ã o ao total de linfócitos T CD4 + em cultur as estim uladas por extr a to par a células HEp-2 ou PMA/Io Subpopulac ¸ões Estím ulo Extr ato par a células HEp-2 PMA/Io Contr oles LES-A LES-I p Contr oles LES-A LES-I p IL-2 + 0,70% (0,32-1,03) 0,99% (0,75-1,54) 1,07% (0,79-1,61) 0,245 1,09% (0,89-1,69) 1,65% (1,41-2,20) 1,90% (1,62-2,44) 0,388 IL-17 + 2,47% (0,73-5,88) 4,37% (0,63-20,90) 3,71% (0,73-25,80) 0,132 3,60% (1,09-9,66) 6,25% (1,83-25,62) 7,20% (2,51-33,20) 0,010 INF-␥ + 1,67% (0,35-6,69) 3,61% (2,46-5,55) 3,16% (2,27-9,61) 0,653 4,96% (3,56-6,37) 6,25% (5,10-8,19) 11,47% (10,58-17,92) 0,156 IL-2 +lL17 + INF-␥ + 0,17% (0,05-0,54) 0,42% (0,27-1,08) 0,48% (0,30-0,80) 0,074 0,26% (0,11-0,52) 0,47% (0,32-1,13) 0,54% (0,36-0,86) 0,526 IL-2 +lL17 + 0,27% (0,09-0,75) 0,47% (0,023-1,28) 0,49% (0,27-0,91) 0,179 0,33% (0,15-0,80) 0,71% (0,47-1,52) 0,85% (0,63-1,27) 0,422 IL-2 +INF -␥ + 0,12% (0,07-0,20) 0,16% (0,11-0,21) 0,14% (0,08-0,37) 0,279 0,54% (0,48-0,61) 0,60% (0,54-0,64) 0,94% (0,88-1,17) 0,944 IL-17 + INF-␥ 0,17% (0,09-0,77) 0,41% (0,20-2,02) 0,94% (0,76-1,50) 0,166 0,23% (0,16-0,83) 0,66% (0,45-2,27) 1,19% (1,01-1,75) 0,087

Discussão

O objetivo dopresente estudofoi avaliar osistema imune de pacientes com LESem relac¸ão àsvias efetoras dos lin-fócitos T CD4+ _produtores _de _IL-17 _(Th17) _e _linfócitos _T

CD4+ _{multifuncionais.}_Portanto,_{estimularam-se}_as_culturas

de CMSPcomextratopara célulasHEp-2,queexpressama maiorpartedosautoantígenosdeimportânciaclínicanoLES, incluindoospolipeptídeosSm/RNP,SS-A/RoeSS-B/La,bem comoosantígenosdecromatina.Esseestímulopossibilitou avaliar,entreosagrupamentosdelinfócitosTCD4+_,_aqueles

com capacidade autorreativaemcomparaçãocomas célu-las não estimuladas e as células estimuladascom PMA/Io (estimulaçãopoliclonal).Essesexperimentosmostraramque asCMSPde pacientescomLESresponderamàestimulação com autoantígenos. Além disso, observou-se que, mesmo emindivíduossaudáveis,havialinfócitosTCD4+_sensíveis_à

estimulaçãocomautoantígenosderivadosdecélulasHEp-2, masemproporçõesmenoresemcomparaçãocomos pacien-tescomLES.

Nessecontexto,observou-sequeasculturasdepacientes comLESativoapresentarammenorfrequênciarelativade lin-fócitosTCD4+_,_conforme_previamente_relatado_por_Wouters

etal.27_Por_outro_lado,_amostras_de_pacientes_com_LES_ativo

einativotinhamumafrequênciaaumentadadelinfócitosT recentementeativados(CD4+_CD69+_)._A_reduc¸ão_na

frequên-ciarelativadelinfócitosCD4+_pode_estar_relacionada_com_os

efeitosdaterapiaimunossupressora,umavezqueváriosdos pacientesestudadosestavamsobessetratamento.Em con-traste,oaumentonafrequênciadelinfócitosTCD4+_CD69+

possivelmentecorrespondeàfraçãodelinfócitosT recente-menteativados quepodecontribuirpara amanutençãoda respostaautoimuneexacerbadaeatividadedadoençaapesar dotratamento.

HouveumaumentonafrequênciarelativadelinfócitosT CD4+_produtores_de_IL-2,_IL-17_ou

INF-␥emamostrasde

paci-entescomLES-AeLES-IdepoisdeestímulocomPMA/Ioou extratoparacélulasHEp-2.Oaumentonaproporçãodecélulas circulantescapazdeassumirumfenótipodesecreçãode cito-cinasapósestimulaçãoindicaqueosistemaimunológiconos pacientescomLESapresentaumacúmuloexpressivode célu-lasparcialmentediferenciadasprontasparaassumirfunções efetoras.Épossível queisso seestenda alocais inflamató-riosdeórgãosalvoecontribua,assim,paraaperpetuaçãoda inflamaçãonesseslocais.

Opróximopassofoiavaliarafrequênciarelativade célu-lascapazesdeproduzircada citocinaindividualmenteede célulascapazesdeadquirirumfenótipomultifuncionalpela produc¸ãodemaisdeumacitocina.Naverdade,encontrou-se umaumentorelativonafrequênciadelinfócitosTCD4+

pro-dutoresdeIL-17(Th17linfócitos)emculturasestimuladaspelo PMA/IodepacientescomLES-AeLES-I.Esseachadocorrobora relatos anterioresdaliteraturaque mostramuma frequên-cia aumentadade linfócitosTh17 eníveisséricoselevados deIL-17nospacientescomLES.10,15,16,18,28-31_No_entanto,_não

sepodeexcluir aparticipac¸ãodoslinfócitosTh1eda cito-cinaINF-␥relacionadanoprocesso inflamatóriodoLES.Na

(8)

LES inativo

Linfócitos Th17

Linfócitos Th17 Linfócitos

T CD69+

Linfócitos T CD69+

Linfócitos T CD25+

Foxp3φ

Linfócitos T CD25+

Foxp3φ

LES ativo

Figura5–PropostadeconcepçãodecorrelaçãoentreafrequênciarelativadelinfócitosTh17elinfócitosTCD4+_CD69+_em pacientescomLES-IecorrelaçãoentreafrequênciarelativadelinfócitosTh17elinfócitosTCD4+_CD25+_Foxp3−_em_pacientes

comLES-A.Evidencia-sequeamaiorpartedoslinfócitosresponsáveispelaproduc¸ãodeIL-17sãoosrecém-ativados empacientescomLES-I,enquantoempacientescomLES-AamaiorpartedosIL-17produtoresdecélulassãoaqueles cronicamenteativados.

elevadaemamostrasdepacientescomLESdoquenas amos-trasdecontrole,sobestímulodaPMA/IoouHEp-2.

Quesetemconhecimento,esteéoprimeiroestudoque avalia a frequênciarelativa de linfócitosT multifuncionais no LES. Esse tipo de análise possibilita umadefinição fle-xíveldossubtipos funcionaisde linfócitosT quecontrasta coma classificaçãotradicional polarizadade subtipos defi-nidos por marcadores de superfície. De acordo com esse conceito,analisou-seaatividademultifuncionaldoslinfócitos TCD4+_._Não_foi_encontrada_diferença_na_frequência_relativa_de

linfócitosTCD4+_bifuncionais_(INF-_␥+_/IL-2+_;_IL-2+_/IL-17+_;

IFN--␥+/IL-17+)etrifuncionais(INF-␥+ IL-2+ IL-17+)empacientes

comLES-A,LES-Iecontroles.Noentanto,quandoseanalisou afrequênciadecélulastrifuncionaisemrelaçãoàquantidade totalde célulasqueproduzemqualquerumadas citocinas analisadas,conseguiu-seencontrarumadiferença significa-tivanasculturasestimuladascomPMA/Io,emqueasamostras depacientescomLES-Atinhamumafrequênciarelativa sig-nificativamentemaiordelinfócitosTmultifuncionaisdoque asamostrasdaquelescomLES-I.Esseachadosugereque paci-entescomLES-Amostramumasubpopulaçãoaumentadade linfócitosTauxiliarescapazdeproduzirumamploespectro decitocinaspró-inflamatóriasdepoisdeumestímuloforte, como pelo PMA/Io. Essa subpopulação aumentada pode contribuir para os transtornos imunológicos no processo autoimunedoLES.Outroachadointeressanterelativoaos lin-fócitos T multifuncionais se deu na observaçãode que os linfócitosTCD4+_que_expressam_IL-2_e_INF-_␥_produziram_mais

IFN-␥doqueascélulasqueexpressamapenasIFN-␥.Issofoi

igualmenteobservadoemamostrasdepacientesecontroles. Bettsetal., 2006,demonstraramumfenômenosemelhante eobservaramumaumentonaproduc¸ãodeINF-␥porcélulas

tri-funcionaisempacientesinfectadospeloHIV.19

Foi encontrada uma correlac¸ão significativa entre a frequênciade linfócitosTh17elinfócitosrecentemente ati-vados (CD4+_CD69+₎ _em _pacientes _com _LES-_I_, _bem _como

uma correlac¸ão entre a frequência de linfócitos Th17 e CD4+_CD25+_Foxp3∅_em_pacientes_com_LES-A._Esses_resultados

sugeremqueaproduçãodeIL-17épredominantemente asso-ciada aos linfócitos T recentemente ativados no LES em estágioinativoeaoslinfócitosTefetoresregularesativadosno LESemestágioativo.Esseconceitoéilustradonafigura5.Não foi encontradacorrelaçãoentre aatividadedoLES,medida pelaSledai,eafrequênciadelinfócitosTprodutoresde IL-17 em pacientes com LES-A,como também observado por Wong et al., 2000. No entanto, outros estudos mostraram umacorrelaçãosignificativaentreoSledaieafrequênciado Th17.16,29

Aanálisecombinadadosdadosaquiapresentados, junta-mentecomasinformaçõesexistentesnaliteratura,fornece pistas para uma melhorcompreensão da fisiopatologiado LESeabreperspectivasparaodesenvolvimentodeterapias opcionaisparaessadoença.Acredita-sequeopadrão imuno-lógicoobservadonopresenteestudoocorreempacientescom LESemgeral,masháumaheterogeneidadeconsiderávelno grupo.Opresenteestudonãotevecomoobjetivoinvestigara associaçãodessefenômenocomasdiversasmanifestaçõesdo LES.Esseéumpontorelevanteaserinvestigadoemumestudo futuro,projetadoespecialmenteparaesseobjetivo.É concebí-velqueumaterapiadebloqueiopersonalizadodecitocinas, especificamente projetadadeacordocom operfil predomi-nantedelinfócitosTefetoresmultifuncionais,sejaeficazem ajudararestauraroequilíbrioimunológicoemcadapaciente. OslinfócitosTprodutoresdeIL-17parecemdesempenharum papelproeminentenafisiopatologiadoLESepodem repre-sentar umalvo empotencial paraaterapia.Na verdade,é possívelqueaterapiapersonalizadaesegmentadapor cito-cinapossacontribuirparamelhoraroequilíbriodaresposta imuneefetora,evitarouminimizarosdanoscausadospela respostaautoimune.

Conflitos

de

interesse

(9)

r

e

f

e

r

ê

n

c

i

a

s

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