MARTA NATIVIDADE CRIZOL MARTINS
RELAÇÃO ESTRUTURA – ATIVIDADE DE FRAGMENTOS DA LEPTINA
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
São Paulo para obtenção do Título de Mestre em
Ciências.
São Paulo
Martins, Marta Natividade Crizol
Relação Estrutura-Atividade de Fragmentos da Leptina.
São Paulo, 2008 95 paginas
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo
De tudo ficaram três coisas...
A certeza de que estamos começando...
A certeza de que é preciso continuar...
A certeza de que podemos ser interrompidos antes de
terminar...
Façamos da interrupção, um caminho novo...
Da queda, um passo de dança...
Do medo uma escada...
Do sonho, uma ponte...
Da procura um encontro!
MARTA NATIVIDADE CRIZOL MARTINS
Dissertação preparada no Departamento de Biofísica, durante o curso de Pós-graduação em Biologia Molecular e apresentada à Universidade Federal de São Paulo como requisito parcial para a obtenção de título de Mestre em Ciências.
Dedicatórias
Aos meus queridos pais, João e Rosa, por terem me dado não só a
vida, mas principalmente muito amor e coragem para enfrentar todos os
obstáculos que surgiram ao longo desta minha árdua jornada. A minha
grande família pelo incentivo, por acreditar e estar sempre ao meu lado
torcendo e vibrando pelos meus objetivos e conquistas
.Agradecimentos
A Deus pela vida, e por estar sempre iluminando meu caminho.
Ao Professores Doutores Guita N. Jubilut e R. Nakaie pelos ensinamentos, idéias e incentivos.
Aos colegas de laboratório, Marcela dos Santos Carmona, Lílian Faccioli, Luciana Malavolta Guaglio, Marta Gomes da Silva, Elias H. da Silva, Erick F. Poletti, Marcelo Rodrigo S. Pinto, Vani Xavier de Oliveira Jr., Marcos A. Fázio, Marcus Marra, Douglas Duarte Lopes, Luis Gustavo de Deus, Sinval E. Gregório de Souza, Alexandre Barros, Hugo Torres, Daniela Nardi, Kátia Barca pela troca de experiências, pelo apoio fornecido na elaboração desse trabalho e pela amizade e companheirismo demonstrados durante toda a jornada.
Ao Prof. Dr. João Bosco Pesquero e Edson Lucas dos Santos pelo apoio, ensinamentos e idéias.
À Profa Dra Eliane Beraldi Ribeiro, Iracema Senna de Andrade e Juliane Costa Silva Zemdegs pelos ensaios biológicos de comportamento alimentar, a Mônica Marques Telles por nos fornecer seus dados da leptina e pelo incentivo, e ao Bioterista Mauro Cardoso Pereira pela ajuda com os animais.
À toda Equipe do CEDEME, pelo fornecimento dos animais.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) pelo auxilio financeiro.
Desculpas
ÍNDICE
ABREVIATURAS...II ÍNDICE DE ESQUEMAS ... IV ÍNDICE DE TABELAS ... IV ÌNDICE DE FIGURAS... IV RESUMO... VI SUMMARY ...VII
1) INTRODUÇÃO...1
1.1)LEPTINA (LEP) ...1
1.1.1) Histórico...1
1.1.2) Estrutura...2
1.1.3) Receptor da leptina...2
1.1.4) Modelos de experimentação animal para o estudo da leptina...7
1.1.5) Ação da leptina...10
1.1.6) Fragmentos peptídicos da leptina...14
2) OBJETIVOS ...23
3) MATERIAIS E MÉTODOS ...26
3.1)MATERIAIS...26
3.2)MÉTODOS...27
3.2.1) Síntese dos peptídeos...27
3.2.1.1) Estratégia t-Boc...27
3.2.1.2) Clivagem dos peptídeos...28
3.2.1.3) Extração dos peptídeos...28
3.2.1.4) Liofilização ...28
3.2.2) Purificação dos peptídeos...33
3.2.3) Caracterização dos peptídeos...33
3.2.3.1) Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)...33
3.2.3.2) Espectrometria de massas – LC/MS...34
3.2.3.3) Análise de aminoácidos – AAA ...34
3.2.4) Análise estrutural de peptídeos – Dicroísmo circular (CD)...35
3.2.5) Ensaios biológicos...39
3.2.5.1) Comportamento alimentar de ratos Wistar sob administração (icv) ...39
3.2.5.1.1) Animais...39
3.2.5.1.2) Cirurgia para implante de cânula no ventrículo lateral (icv)...39
3.2.5.1.3) Cuidados pós-operatório...44
3.2.5.1.4) Controle fisiológico e administração dos peptídeos...44
3.2.5.1.5) Análise Estatística...44
4) RESULTADOS ...45
4.1)SÍNTESE DE PEPTÍDEOS...45
4.1.1) Síntese dos fragmentos I a X pela estratégia t-Boc....45
4.1.2) Síntese dos fragmentos XI a XVII pela estratégia t-Boc....45
4.2)PURIFICAÇÃO DOS PEPTÍDEOS...45
4.3)CARACTERIZAÇÃO DOS PEPTÍDEOS...50
4.4) ANÁLISE ESTRUTURAL DE PEPTÍDEOS –DICROÍSMO CIRCULAR (CD) ...50
4.5)ESTUDOS DE DIMERIZAÇÃO DOS FRAGMETOS DA LEPTINA...50
4.6)ATIVIDADE BIOLÓGICA DOS FRAGMENTOS...50
4.6.1) Comportamento alimentar de ratos Wistar sob administração (icv)...50
5) DISCUSSÃO ...82
5.1)OBTENÇÃO DOS PEPTÍDEOS...82
5.2)ANÁLISE ESTRUTURAL DOS PEPTÍDEOS -DICROÍSMO CIRCULAR (CD) ...83
5.2.1) Estudos da variação das concentrações de SDS e TFE...83
5.3)ENSAIOS BIOLÓGICOS...84
6) CONCLUSÕES...87
ABREVIATURAS
2-Cl-Z 2-cloro-benziloxicarbonila AAA Análise de aminoácidos ACN Acetonitrila
AcOH Ácido acético
AGRP “Agouti-related protein”
Arc Núcleo arqueado do hipotálamo BAR Benzidrilamino-resina
Boc-aa Nα-terc-butiloxicarbonil-L-aminoácidos
BOP Benzotriazolil-oxy-tris-(dimetilamino)-fosfônio hexafluorofosfato BSA Albumina de soro bovino
Bzl Benzila
CART “Cocaine- and amphetamine-regulated transcript” CD Dicroísmo circular
Chex Ciclohexila
CRH Hormônio liberador de corticotropina CSF Fluído Cerebrospinal artificial
DAB Diaminobenzidina DCM Diclorometano
DIC N,N-Diisopropilcarbodiimida DIEA N,N-Diisopropiletilamina DMF N,N-Dimetilformamida
DMH Núcleo hipotalâmico dorso-medial EDT 1,2-Etanoditiol
Fmoc-aa Nα-fluorenilmetiloxicarbonil-L-aminoácidos
For Formila
FSH Hormônio folículo estimulante GAL Galanina
GH Hormônio de crescimento GLP1 “Glucagon like peptide 1”
GnRH Hormônio liberador de gonadotrofina
HATU O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio-hexafluorofosfato) HBTU (O-Benzotriazolyl-N,N,N’,N’-tetrametilurônio hexafluorofosfato) HF Fluoreto de hidrogênio
hLEP Leptina – Seqüência humana HOAt 1-hidroxi-7-azabenzotriazol HOBt 1-hidroxibenzotriazol
HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência ICV Intracérebro ventricular
LC/ESI-MS Cromatografia líquida de fase reversa acoplada a um Espectrômetro de Massas - Ionização por electrospray
LEP Leptina
LH Hormônio luteinizante LIF Fator inibidor de leucemia MBAR Metilbenzidrilamino-resina
MCH Hormônio concentrador de melanina MeOBzl Metoxibenzila
MSH Hormônio estimulante de melanócitos NMP N-Metil-2-pirrolidona
NPY Neuropeptídeo Y
NT Neurotensina
Ob-R Receptor da leptina OcHx Éster Ciclohexila OtBu Éster terc-butila
PAMR Fenilacetamidometil-resina PIP Piperidina
POMC Pro-opiomelanocortina
PyBOP Hexafluorofosfato de benzotriazolil-N-oxitris(pirrolidino)fosfônio Pyr Piridina
RMN Ressonância magnética nuclear SDS Dodecil sulfato de sódio
SPFS Síntese de peptídeos em fase sólida
STAT Transdutor de Sinal e Ativador de Transcrição
t-Boc Grupo Terc-butiloxicarbonila
TBTU 2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio tetrafluoroborato tBu Terc-butila
TEA Trietilamina
TEAP Trietilamônio fosfato TFA Ácido trifluoroacético TFE Trifluoroetanol
Tos Tosila
Trt Tritila
UCP “Uncoupling protein” UV-Vis Ultravioleta visível
ÍNDICE DE ESQUEMAS
ESQUEMA 1.ETAPAS DA SÍNTESE MANUAL DE PEPTÍDEOS EM FASE SÓLIDA PELA ESTRATÉGIA T-BOC. ...29
ÍNDICE DE TABELAS TABELA I.MUTAÇÕES QUE CAUSAM OBESIDADE EM ROEDORES...8
TABELA II.SEQÜÊNCIAS SINTETIZADAS E ESTUDADAS POR GRASSO...15
TABELA III.SEQÜÊNCIAS SINTETIZADAS E ESTUDADAS POR SAMSON...17
TABELA IV.SEQÜÊNCIAS DOS FRAGMENTOS PEPTÍDICOS SINTETIZADOS E ESTUDADOS POR OLIVEIRA...18
TABELA V.FRAGMENTOS PEPTÍDICOS SINTETIZADOS E ESTUDADOS, SEQÜÊNCIA HUMANA E DE RATO...24
TABELA VI.RESULTADOS DAS SÍNTESES DOS FRAGMENTOS, SEQÜÊNCIA HUMANA...43
TABELA VII.RESULTADOS DAS SÍNTESES DOS FRAGMENTOS, SEQÜÊNCIA DE RATO. ...44
TABELA VIII.CONDIÇÕES DE PURIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DA LEPTINA HUMANA. ...53
TABELA IX.CONDIÇÕES DE PURIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DA LEPTINA, SEQÜÊNCIA DE RATO. ...54
TABELA X.CARACTERIZAÇÃO DOS FRAGMENTOS DA LEPTINA. ...55
TABELA XI.ANÁLISE DE AMINOÁCIDOS DOS PEPTÍDEOS ESTUDADOS...56
ÌNDICE DE FIGURAS FIGURA 1.SEQÜÊNCIAS DA LEPTINA HUMANA, DE RATO,BOVINA E DE CAMUNDONGO,RESPECTIVAMENTE...3
FIGURA 2.ESTRUTURAS COMPARATIVAS DA LEPTINA...4
FIGURA 3.ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DA LEPTINA. ...5
FIGURA 4.ESTRUTURA DO RECEPTOR DA LEPTINA...6
FIGURA 5.LINHAGENS DE CAMUNDONGOS QUE EXPRESSAM A PROTEÍNA AGOUTI...8
FIGURA 6.CAMUNDONGOS OB/OB E NORMAL. ...9
FIGURA 7.OCORRÊNCIAS DOS EXPERIMENTOS DE PARABIOSE ENVOLVENDO ANIMAIS NORMAIS,OB/OB E DB/DB. ...10
FIGURA 8.ILUSTRAÇÃO DO MECANISMO DE AÇÃO CENTRAL E PERIFÉRICA DA LEPTINA...11
FIGURA 9.MODELO DO FEEDBACK DA REGULAÇÃO DO CONSUMO ALIMENTAR EM RESPOSTA A VARIAÇÃO DO CONTEÚDO DE GORDURA CORPORAL. ...12
FIGURA 10.INTERAÇÃO DOS FRAGMENTOS PEPTÍDEOS DERIVADOS DA LEPTINA COM O SEU RECEPTOR EXPRESSO EM CÉLULAS HP-75. ...19
FIGURA 11.COMPARAÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS DA LEPTINA...21
FIGURA 12.COMPARAÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS DA LEPTINA...22
FIGURA 13.REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DAS SEQÜÊNCIAS DOS FRAGMENTOS QUE FORAM USADAS COMO PONTO DE PARTIDA NA DEFINIÇÃO DOS PEPTÍDEOS UTILIZADOS NESTE TRABALHO...25
FIGURA 14.ETAPAS DE OBTENÇÃO DOS PEPTÍDEOS EM FASE SÓLIDA, UTILIZANDO A ESTRATÉGIA T-BOC. ...30
FIGURA 15.MECANISMO DO TESTE DE KAISER...31
FIGURA 16.REPRESENTAÇÃO DO SISTEMA DE HF UTILIZADO NA CLIVAGEM E DESPROTEÇÃO DOS PEPTÍDEOS. ...32
FIGURA 17.LUZ CIRCULARMENTE POLARIZADA, CARACTERÍSTICA DA TÉCNICA DE CD. ...36
FIGURA 18.TRANSIÇÕES QUE PODEM OCORRER NAS MACROMOLÉCULAS...37
FIGURA 19.ESPECTROS TÍPICOS DE CD MOSTRANDO O PERFIL CARACTERÍSTICO DAS ESTRUTURAS SECUNDÁRIAS...38
FIGURA 20.SEQÜÊNCIA DE FOTOS DA CIRURGIA PARA A IMPLANTAÇÃO DOS CAPACETES NOS ANIMAIS. ...40
FIGURA 21.VISTA DORSAL E LATERAL DO CRÂNIO DE RATO...41
FIGURA 22.REPRESENTAÇÃO DO VENTRÍCULO LATERAL VISUALIZADO EM UM CORTE DO ENCÉFALO DE RATO A -1,30 MM DO BREGMA, ADAPTADO DE PAXINOS E WATSON.EM AZUL ESTÁ DESTACADO A CÂNULA GUIA E EM VERMELHO O VENTRÍCULO LATERAL. ...42
FIGURA 23.REPRESENTAÇÃO DO VENTRÍCULO LATERAL DIREITO VISUALIZADO EM UM CORTE DO ENCÉFALO DE RATO A 1,40 MM DO BREGMA, ADAPTADO DE PAXINOS E WATSON.EM AZUL ESTÁ DESTACADO A CÂNULA GUIA E EM VERMELHO O VENTRÍCULO LATERAL...43
FIGURA 24.(A)CROMATOGRAMA E (B) SOMATÓRIAS DOS ESPECTROS DE MASSAS DO AC-HLEP101-110-NH2(III) BRUTO. ...48
FIGURA 25.ESPECTRO DE MASSAS DO AC-HLEP101-110-NH2(III) BRUTO. ...49
FIGURA 26.(A)CROMATOGRAMA E (B) SOMATÓRIAS DOS ESPECTROS DE MASSAS DO AC-HLEP101-110-NH2(III) PURIFICADO...51
FIGURA 27.ESPECTRO DE MASSAS DO FRAGMENTOAC-HLEP101-110-NH2(III) PURIFICADO. ...52
FIGURA 28.ESPECTROS DE CD DO AC-HLEP98-122-NH2(I) OBTIDOS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SDS E DE TFE. ...57
FIGURA 29.ESPECTROS DE CD DO AC-HLEP98-107-NH2(II) OBTIDOS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SDS E DE TFE. ...58
FIGURA 31.ESPECTROS DE CD DO AC-HLEP104-113-NH2(IV) OBTIDOS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SDS E DE
TFE. ...60 FIGURA 32.ESPECTROS DE CD DO AC-HLEP107-116-NH2(V) OBTIDOS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SDS E DE
TFE. ...61 FIGURA 33.ESPECTROS DE CD DO AC-HLEP110-119-NH2(VI) OBTIDOS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SDS E DE
TFE. ...62 FIGURA 34.ESPECTROS DE CD DO AC-HLEP113-122-NH2(VII) OBTIDOS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SDS E DE
TFE. ...63 FIGURA 35.ESPECTROS DE CD DO AC-[SER117]-HLEP98-122-NH2(VIII) OBTIDOS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE
SDS E DE TFE. ...64
FIGURA 36.ESPECTROS DE CD DO AC-[SER117]-HLEP110-119-NH2(IX) OBTIDOS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE
SDS E DE TFE. ...65
FIGURA 37.ESPECTROS DE CD DO AC-[SER117]-HLEP113-122-NH2(X) OBTIDOS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SDS E DE TFE. ...66
FIGURA 38.ESPECTROS DE CD DO AC-RLEP98-122-NH2(XI) OBTIDOS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SDS E DE
TFE. ...67 FIGURA 39.ESPECTROS DE CD DO AC-RLEP98-107-NH2(XII) OBTIDOS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SDS E DE
TFE. ...68 FIGURA 40.ESPECTROS DE CD DO AC-RLEP101-110-NH2(XIII) OBTIDOS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SDS E DE
TFE. ...69 FIGURA 41.ESPECTROS DE CD DO AC-RLEP104-113-NH2(XIV) OBTIDOS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SDS E DE
TFE. ...70 FIGURA 42.ESPECTROS DE CD DO AC-RLEP107-116-NH2(XV) OBTIDOS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SDS E DE
TFE. ...71 FIGURA 43.ESPECTROS DE CD DO AC-RLEP110-119-NH2(XVI) OBTIDOS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SDS E DE
TFE. ...72 FIGURA 44.ESPECTROS DE CD DO AC-RLEP113-122-NH2(XVII) OBTIDOS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SDS E DE
TFE. ...73 FIGURA 45.ESPECTROS DE CD COMPARATIVOS DO AC-HLEP110-119-NH2(VI) E DO [D-LEU4]-HOB3OBTIDOS EM
DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SDS E DE TFE. ...74
FIGURA 46.(A)CROMATOGRAMA E (B) SOMATÓRIAS DOS ESPECTROS DE MASSAS DO AC-HLEP110-119-NH2(VI) EM MEIO
CSF...75 FIGURA 47.ESPECTRO DE MASSAS DO AC-HLEP110-119-NH2(VI). ...76
FIGURA 48.(A)CROMATOGRAMA E (B) SOMATÓRIAS DOS ESPECTROS DE MASSAS DO [D-LEU4]-HOB3 EM MEIO CSF...77
FIGURA 49.ESPECTRO DE MASSAS DO [D-LEU4]-HOB3. ...78
FIGURA 50.VARIAÇÕES NO PESO DE RATOS WISTAR MACHOS CAUSADOS PELA LEPTINA E SEUS FRAGMENTOS...79
FIGURA 51.VARIAÇÕES NO CONSUMO ALIMENTAR DOS RATOS WISTAR MACHOS CAUSADOS PELA LEPTINA E SEUS FRAGMENTOS. ...80
RESUMO
A hormônio protéico produzido pelo gene-ob e denominado leptina, é um produto originário do tecido adiposo, circula pelo plasma e afeta o balanço energético interagindo em receptores presentes no hipotálamo. A leptina desempenha um papel importante na regulação de uma variedade de funções fisiológicas, incluindo controle de ingestão alimentar, temperatura corporal e manutenção do peso corporal. A ausência ou resistência a leptina pelo organismo causa obesidade mórbida, diabetes e hipogonadismo. A estrutura terciária da molécula da leptina revela a presença de quatro hélices, cujo padrão é típico das citocinas. Com o objetivo de identificar a região da molécula responsável pela expressão de sua atividade biológica foram sintetizados seis fragmentos peptídicos cujas estruturas foram escolhidas de acordo com a estrutura tridimensional da leptina. Em estudos anteriores do nosso grupo, dois peptídeos, Ac-hLEP92-115-NH2 (IV) e Ac-[Ser117]-hLEP116-140-NH2 (V), foram reconhecidos pelo receptor
da leptina presentes em células HP-75, confirmando outros trabalhos da literatura que também apontavam que é nesta região da molécula que deve estar presente o epitopo funcional da leptina. Neste trabalho, uma nova série de fragmentos, cujas estruturas primárias estão contidas na região dos fragmentos IV e V, foram sintetizados e os efeitos dos mesmos na variação do peso corporal e no consumo de alimento quando administrados no ventrículo cerebral de ratos normais foram avaliados. Os peptídeos foram sintetizados pelo método da fase sólida manual pela estratégia t-Boc. Os mesmos foram purificados por cromatografia liquida de alta eficiência e foram caracterizados por análise de aminoácidos e cromatografia liquida acoplada a um espectrômetro de massas. Estudos conformacionais dos peptídeos também foram realizados por Dicroísmo Circular com o objetivo de correlacionar a estrutura com a atividade biológica dos fragmentos. Dentre os compostos estudados, o melhor resultado foi obtido com o fragmento
Ac-hLEP110-119-NH2 (VI) que se mostrou ser mais ativo que a própia leptina e foi equipotente
SUMMARY
The protein hormone produced by the ob-gene and denominated leptin, a product originating from adipose tissue, circulates in the plasma and affects the energy balance by interacting with the hypothalamus. Leptin plays an important role in the regulation of a variety of physiological functions, including food intake, body temperature and body weight maintenance. Total absence or resistance to leptin causes morbid obesity, diabetes and hypogonadism. The tertiary structure of the leptin molecule reveals the existence of a four-helix bundle that is characteristic of the short-four-helix cytokines. To identify regions of the leptin molecule responsible for its bioactivity, we have synthesized six peptides based on the protein three-dimensional structure. Our results indicated that the fragments
Ac-hLEP92-115-NH2 (IV) and Ac-[Ser117]-hLEP116-140-NH2 (V) were recognized by leptin
receptor present in hp-75 cells, in agreement with the obtained by other authors, validating that this region of the molecule contain the functional epitope of the leptin molecule. In the present study, a new series of peptides encompassing the region of fragments IV and V of leptin were synthesized, and their effects on body weight and food intake were assessed when administered into the lateral cerebroventricle of normal rats. Peptides were synthesized by the solid phase methodology, purified by RP-HPLC and characterized by LC/ESI-MS. We also performed a conformational study of the peptides by circular dichroism in order to correlate the biological activity and secondary structure of the leptin fragments. Out off the new series of compounds, the best results were obtained with the fragment Ac-hLEP110-119-NH2 (VI) which showed to be more active than leptin and
1) INTRODUÇÃO
A obesidade é um sério problema de saúde pública, e na sociedade de consumo atual o aumento no peso corporal é o distúrbio nutricional mais comum, e suas conseqüências vão desde o diabetes mellitus até doenças cardio-respiratórias, abrangendo a hipertensão arterial, hiperlipidemia (excesso de lipoproteínas de baixa densidade que carregam colesterol e triglicérides no sangue), apnéia do sono, problemas psico-sociais, doenças ortopédicas e diversos tipos de câncer.
Atualmente, no mundo todo, bilhões de dólares são gastos na busca da perda de peso. Infelizmente, quase todas as pessoas que conseguem perder algum peso recuperam-no num intervalo de tempo que varia entre 1 e 5 anos. A obesidade é uma doença crônica que envolve fatores sociais, comportamentais, ambientais, culturais, psicológicos, metabólicos e genéticos. Caracteriza-se pelo acúmulo de gordura corporal resultante do desequilíbrio energético prolongado, que pode ser causado pelo excesso de consumo de calorias e/ou sedentarismo1. Em humanos o mecanismo que regula a ingestão de alimentos e o gasto energético e que determina quem será obeso e quem será magro, ainda é pouco compreendido.
1.1) Leptina (LEP)
1.1.1) Histórico
Na década de 1950, Kennedy propôs a existência de um hormônio ou metabólito que sinalizaria ao cérebro e a outros tecidos a reserva de energia do corpo, causando assim, mudanças no consumo de alimentos e dos gastos de energia do indivíduo, e portanto possibilitando a manutenção do balanço energético de todo o organismo evitando assim a obesidade2. Evidências da participação desta substância foram demonstradas através de experimentos clássicos de parabiose3,4. Nestes experimentos, observou-se que a obesidade poderia ser corrigida por uma substância reguladora de peso presente no sangue de um indivíduo normal, ao observar que quando se ligava os sistemas circulatórios de dois animais, um rato obeso portador do gen mutante (rato
ob/ob) e um rato normal, o animal obeso perdia peso.
protéico codificado pelo gene-ob, o qual foi denominado proteina-ob ou leptina (do grego “leptos” que significa “magro ou delgado”). O gene-ob de camundongo está localizado no cromossomo 6, enquanto que o de humano está no cromossomo 7q31.3, cujo DNA apresenta mais de 15.000 pares de base e consiste de três êxons e dois íntrons.
1.1.2) Estrutura
A leptina é constituída por 146 resíduos de aminoácidos, cujas seqüências primárias em diferentes mamíferos estão apresentadas na Figura 1, onde se observa que a leptina humana e de rato apresentam 83% de similaridade, enquanto que a de rato e de camundongo é de 96%9. O gene-ob selvagem codifica uma proteína de cerca de 16 kDa que é precedida de um peptídeo sinal hidrofóbico, cujo precursor da leptina de camundongo é constituído por 167 resíduos de aminoácidos. Os primeiros 21 resíduos N-terminais deste precursor são excluídos e a leptina liberada na circulação sanguínea. Na Figura 2 estão esquematizadas e comparadas algumas das diferentes estruturas descritas para a leptina10.
Em 1997, Zhang e colaboradores11 utilizando cristalografia de raio X e Kline e Colaboradores12 com RMN, elucidaram a estrutura secundária da leptina ilustrada na Figura 3. Ambos os trabalhos são concordantes quanto a existência de quatro α-hélices antiparalelas, compreendendo os seguintes resíduos: (I) Pro23-His47; (III) Leu72-Ser88; (IV) Arg92-Lys115 e (VI) Ser141-Ser164. Os últimos cinco resíduos da hélice VI são do tipo 310; A
estrutura também apresenta dois “loops” entre os resíduos (I-III) Thr48-Thr71 e (IV-VI) Ser116-Tyr140). Trata-se de uma molécula alongada, com dimensões aproximadas de 20 X 25 X 45 Å.
1.1.3) Receptor da leptina
25 30 35 40 45 50 55
VPIQK VQDDT KTLIK TIVTR INDIS HTQSV SSKQK
VPIHK VQDDT KTLIK TIVTR INDIS HTQSV SARQR
VPIRK VQDDT KTLIK TIVTR INDIS HTQSV SSKQR
VPIQK VQDDT KTLIK TIVTR INDIS HTQSV SAKQR
60 65 70 75 80 85 90
VTGLD FIPGL HPILT LSKMD QTLAV YQQIL TSMPS
VTGLD FIPGL HPILS LSKMD QTLAV YQQIL TSLPS
VTGLD FIPGL HPLLS LSKMD QTLAI YQQIL TSLPS
VTGLD FIPGL HPILT LSKMD QTLAV YQQVL TSLPS
95 100 105 110 115 120 125
RNVIQ ISNDL ENLRD LLHVL AFSKS CHLPW ASGLE
QNVLQ IAHDL ENLRD LLHLL AFSKS CSLPQ TRGLQ
RNVVQ ISNDL ENLRD LLHLL AASKS CPLPQ VRALE
QNVLQ IANDL ENLRD LLHLL AFSKS CSLPQ TSGLQ
130 135 140 145 150 155 160
TLDSL GGVLE ASGYS TEVVA LSRLQ GSLQD MLWQL
KPESL DGVLE ASLYS TEVVA LSRLQ GSLQD ILQQL
SLESL GVVLE ASLYS TEVVA LSRLQ GSLQD MLRQL
KPESL DGVLE ASLYS TEVVA LSRLQ GSLQD ILQQL
165
DLSPG C
DLSPE C
DLSPG C
DVSPE C
Figura 3. Estrutura tridimensional da leptina.
Obtida por Zhang e colaboradores (Cristalografia de Raio X)11 e por Kline e colaboradores (RMN)12 as diferentes cores correspondem as diferentes estruturas [quatro α-hélices: (I) Pro23-His47; (II) Leu72-Ser88; (III) Arg92-Lys115 e (IV) Ser141-Ser164 e os dois “loops” entre os
resíduos (I-III) Thr48-Thr71 e (IV-VI) Ser116-Tyr140]. Ser158
Ile24 Ile45
Leu60
Ser116
Glu126
Gln84
Cys167
que são: forma longa (Ob-Rb), forma curta (Ob-Ra, c, d, f) e forma secretora (Ob-Re). Três isoformas apresentam um domínio extracelular comum e somente diferem no domínio intracelular20. A forma longa (Ob-Rb) apresenta o domínio intracelular mais longo (cerca de 300 aminoácidos) e é composta de 1162 aminoácidos. O domino intracelular da Ob-Rb é o que apresenta a maior homologia com a gp130. As formas curtas (Ob-Ra, c, d, f) apresentam domínio intracelulares homólogos (cerca de 40 aminoácidos) e com grande homológica com o Box 1 da Ob-Rb. Ob-Re carece do domino intracelular transmembranar e é considerado como o receptor secretor.
Na espécie humana, a existência de mutação no gene do receptor presente no hipotálamo é rara, tendo sido observada apenas em casos de obesidade severa21. Entretanto, altos níveis de leptina circulante, indica que a resistência à proteína desempenha papel importante na obesidade “comum”7,22 e o entendimento do mecanismo responsável pela resistência tem sido objeto de vários estudos. Baixa capacidade de transporte através da barreira hematoencefálica é uma das possibilidade23. Outra é a existência de atividade excessiva de SOCS-3 (suppressor of cytokine signaling), uma proteína inibidora da via de sinalização da leptina24.
1.1.4) Modelos de experimentação animal para o estudo da leptina
As investigações com animais de laboratório destinadas à identificação de genes implicados na obesidade e seus homólogos no ser humano, incluem o estudo de modelos animais de obesidade com mutações monogênicas e poligênicas, a caracterização de loci relacionados com a obesidade através do cruzamento de animais com genótipo conhecido e fenótipo obeso e também a produção de animais transgênicos ou knockout de genes candidatos relacionados com a incidência de obesidade.
A descrição de animais fenotipicamente obesos com mutações monogênicas permitiu localizar alguns genes e caracterizar a sua participação na obesidade e as conseqüências da sua ausência ou alteração (Vide Tabela I). Assim, os animais diabético (db/db), obeso (ob/ob), Tubby (tub), amarelo (Ay), gordo (fat) e Zucker (fa/fa), permitiram reconhecer genes homólogos no genoma humano, que se podem expressar de forma dominante (Ay) ou recessiva (db, ob, tub, fat).
Tabela I. Mutações que causam obesidade em roedores.
Nome Alelo Produto do Gene Herança Grau/ fase de prevalência
Cromossomo afetado Camundongo
Agouti Ay Proteína AGOUTI Dominante Moderado/adulto 2 Obese ob Proteína-ob (leptina) Recessivo Extremo/jovem 6
Diabetes db receptor OB-R Recessivo Extremo/jovem 4
Fat fat Carboxipeptidase E Recessivo Moderado/adulto 8
Tubby tub Proteína TUB Recessivo Moderado/adulto 7
Rato
Zucker fa/fa receptor OB-R 5
Corpulent La/nf/f receptor OB-R 5
instala de forma tardia acompanhada de hiperfagia. Os ratos obesos (ob/ob), cuja mutação se localiza no cromossomo 6 murino, desenvolvem-se com uma síndrome acompanhada de hiperfagia, diabetes e obesidade, cuja origem se deve à ausência de leptina ou à presença de leptina não funcional (Figura 6). Por outro lado, o modelo de obesidade observado no rato db/db e na rata fa/fa (Zucker) deve-se a uma resistência a leptina, como conseqüência de alterações no receptor da leptina, causadas por uma mutação no cromossomo 4 do rato ou no cromossomo 5 da rata. Estes animais, além de obesidade, apresentam hiperinsulinemia, intolerância à glicose e alterações neuro-endócrinas e termogênicas, além de hiperfagia e infertilidade. A rata Zucker apresenta algumas variantes, assim como a rata corpulenta, SHR. A mutação presente no gene tub (rato Tubby), localizada no cromossomo 7, produz obesidade de aparecimento lento, uma ligeira resistência à insulina com hipoglicemia moderada e transtornos sensoriais. A ação da mutação parece estar ligada a uma incapacidade para hidrolisar diversos precursores. O rato gordo com a mutação fat/fat no cromossomo 8, constitui um exemplo de obesidade tardia acompanhada de infertilidade e hiperinsulinemia; nele, foi afetada a enzima carboxipeptidase E, responsável pelo processamento de diferentes precursores de hormônios como a pró-insulina e o POMC.
Figura 6. Camundongos ob/ob e normal.
Figura 7. Ocorrências dos experimentos de parabiose envolvendo animais normais, ob/ob e db/db.
Fonte: http://www.scq.ubc.ca/wp-content/uploads/2006/08/parabiosis.jpg
a um normal, este último apresenta uma acentuada perda de peso e morte, evidenciando que há um aumento na produção de leptina, mas que não é notada pelo animal db/db, já que este não possui o receptor da leptina. E finalmente, na Figura 7C, quando se conecta um camundongo db/db a um ob/ob, este último apresenta um acentuada redução de peso, o que acarreta em morte, devido à sinalização causada pela leptina produzida pelo individuo db/db.
1.1.5) Ação da leptina
A leptina é secretada pela célula adiposa7,25 em resposta ao aumento da massa gordurosa e age sobre os núcleos hipotálamicos ventro-medial14 dorso-medial e arqueado15,19, onde diminui a biossíntese e a secreção do NPY (neuropeptídeo Y), reconhecido como o mais potente estimulador do apetite26, do pro-opiomelanocortina27, do hormônio concentrador de melanina e da galanina, e estimula a expressão de neurotensina28. É responsável também pela sinalização para o sistema nervoso central do estado nutricional do indivíduo e, em parte pela regulação do metabolismo energético, procedimento alimentar29,30, função reprodutiva31,32, respiratória33 e manutenção do
peso34,35. Também está envolvida em vários processos fisiológicos36, como a regulação
de lipídeos e o metabolismo de glicose37. A Figura 8 traz o mecanismo de ação central e periférico da leptina. Já na Figura 9 está ilustrado o modelo de feedback proposto para a
Figura 8. Ilustração do mecanismo de ação central e periférica da leptina.
Figura 9. Modelo do feedback da regulação do consumo alimentar em resposta a variação do conteúdo de gordura corporal.
leptina, onde se observa que um aumento na quantidade de tecido adiposo leva a um aumento da concentração de leptina, que uma vez atuando no cérebro sinaliza para que haja uma diminuição do consumo alimentar, um aumento do gasto energético e um aumento do metabolismo de glicose. Por outro lado uma diminuição na quantidade de tecido adiposo leva a uma diminuição da concentração de leptina, que uma vez diminuindo a sinalização no cérebro, provoca um aumento do consumo alimentar, uma diminuição do gasto energético e uma diminuição do metabolismo de glicose38. A predominância de um destes caminhos pode acarretar obesidade ou anorexia.
Em 1997, Montague e colaboradores, ao estudarem duas crianças portadoras de obesidade mórbida que apresentavam baixos níveis séricos de leptina, encontraram uma mutação envolvendo uma deleção no códon 133 do locus Ob. A obesidade severa presente nestes dois indivíduos congenitamente deficientes em leptina forneceu a primeira evidência genética de que esta proteína seria um importante regulador do balanço energético na espécie humana. Entretanto, a procura de mutações do gene ob em humanos obesos, portadores de obesidade “comum” (não mórbida) não tem levado a resultados positivos8,39 .
A leptina e o sistema imunológico foram relacionados, a partir da observação de que o decréscimo do nível de leptina, durante um período de inanição ou subnutrição em humanos, leva à imunossupressão, e que uma deficiência crônica de leptina promove uma diminuição de células T-helper (Th1) e um aumento na função celular de Th2.
Recentemente, Materese e colaboradores40, verificaram que a leptina é requerida para a indução e propagação da resposta auto-imunológica em camundongos.
Caprio e colaboradores41, estudando a atuação da leptina na reprodução, discutiram os efeitos central e periférico da proteína, nos tecidos reprodutivos, diferenciando-os através de níveis anatômicos.
Magni e colaboradores42, utilizando ensaios in vitro, demonstraram que, após 24h de tratamento com leptina, em diferentes concentrações, não houve efeito na expressão do gene de NPY, porém promoveu a liberação do neuropeptídeo.
A relação entre neurotensina e leptina foi observada através de injeções centrais de leptina, as quais induziram à expressão gênica de neurotensina no hipotálamo, associado a uma redução de ingestão alimentar e do peso corporal em ratos28.
1.1.6) Fragmentos peptídicos da leptina
Estudos em camundongos tem revelado várias características genéticas com importantes papéis na obesidade19,29,35. Na tentativa de se conhecer mais a respeito dos grupos e regiões importantes para a atividade biológica da leptina e de sua interação com receptor cerebral, alguns trabalhos estudaram o efeito de peptídeos sintéticos nesse mecanismo.
Grasso e colaboradores44, sintetizaram 6 peptídeos amida (cujas seqüências estão entre os resíduos 106 e 167) e estudaram o efeito dos mesmos no peso e no consumo alimentar, em camundongos C57BL/6J ob/ob (Vide Tabela II). Esta escolha foi baseada no fato de que em camundongos C57BL/6J ob/ob, uma simples mutação de uma base no códon 84 do gene ob produz uma forma truncada e inativa de leptina. Um fenótipo que inclui obesidade, aumento do depósito de gordura, hiperglicemia, hiperinsulemia, hipotermia e infertilidade estão associados a esta mutação45. Os autores observaram que quando comparados com o veículo controle, os camundongos que receberam os peptídeos LEP(106-120), LEP(116-130) e LEP(126-140) durante 7 dias tiveram uma redução de peso de 12.3, 13.8 e 9.8%, respectivamente. Após 28 dias de tratamento, os animais que receberam os peptídeos LEP(106-120) e LEP(126-140) estavam 1.8 e 3.4% mais pesados, enquanto que aqueles que receberam o peptídeo LEP(116-130) estavam 3.4% mais leves. Os demais peptídeos {LEP(136-150), (146-160) e (156-167)} tiveram comportamentos idênticos aos observados com o veículo controle}. Assim sendo, concluíram que a atividade da leptina esta localizada, ao menos em parte, na região entre os resíduos 116 e 130 e que os fragmentos peptídicos tiveram, in vivo, efeitos similares aos da leptina nativa.
Em 2000, Rozhayskaya e colaboradores46descreveram que a seqüência peptídica Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr [LEP-(116-122) ou OB3] apresentou atividade biológica similar aquela do fragmento LEP-(136-150)44. Esta era melhorada em 2,6 vezes com a alteração de configuração da Leu4 de L para D, tendo efeito no controle de glicose, não somente pela supressão de ingestão de calorias, mas também por um aumento da sensibilidade do tecido adiposo à insulina47.
Tabela II. Seqüências sintetizadas e estudadas por Grasso e cols44,46.
Após administrações (ip) de 1 mg/dia dos peptídeos em camundongos ob/ob.
Grasso e colaboradores44
Fragmento Seqüência de Aminoácidos Diferença no peso dos animais (%)
Diferença no consumo alimentar (%)
cLEP106-120 DLLHLLAFSKSCSLP-NH2 -12,32 NR
cLEP116-130 SCSLPQTSGLQKPES-NH2 -13,87 -28,2
cLEP126-140 QKPESLDGVLEASLY-NH2 -9,8 NR
cLEP136-150 EASLYSTEVVALSRL-NH2 SA NR
cLEP146-160 ALSRLQGSLQDILQQ-NH2 SA NR
cLEP156-167 DILQQLDVSPEC-NH2 SA NR
Animais controle -0,18 NR
Grasso e colaboradores46
Fragmento Seqüência de Aminoácidosa Diferença no peso
dos animais (%)
Diferença no consumo alimentar (%)
cLEP95-99 SCSLP-NH2 NR -6,2
cLEP95-100 SCSLPQ-NH2 NR -6,8
cLEP95-101 = (OB3) SCSLPQT-NH2 +0,8 -27,0
cLEP116-122 SCSLPQTS-NH2 NR -23,3
cLEP95-103 SCSLPQTSG-NH2 NR -22,6
[D-Ser1]-OB3 sCSLPQT-NH2 +4,6 -11,9
[D-Cys2]-OB3 ScSLPQT-NH2 +12,8 -5,6
[D-Ser3]-OB3 SCsLPQT-NH2 +13,2 -8,9
[D-Leu4]-OB3 SCSlPQT-NH2 -6,0 -34,9
[D-Pro5]-OB3 SCSLpQT-NH2 +2,4 -28,6
[D-Gln6]-OB3 SCSLPqT-NH2 +4,6 -13,7
[D-Thr7]-OB3 SCSLPQt-NH2 +10,6 +11,3
D-OB3 scslpqt-NH2 +10,0 +4,6
a
500 e 1000 ng do peptídeo, respectivamente (Vide Tabela III).
Em 2005, Oliveira e colaboradores realizaram uma varredura mais completa da molécula de leptina49, pois a região entre os resíduos 71-94 não havia sido explorada por Samson e cols. e nem por Grasso e cols., que estudaram apenas a região C-terminal (Vide Tabela IV). A escolha dos fragmentos teve como base a estrutura tridimensional dessa proteína, proposta por cristalografia de raio X e por RMN. Para tanto, sintetizaram seis fragmentos peptídicos correspondendo a quatro α–hélices antiparalelas: (I) Pro23 -His47; (III) Leu72-Ser88; (IV) Arg92-Lys115 e (VI) Ser141-Ser164 e também, às alças: (II) Thr48 -Thr71 e (V) Ser116-Tyr140 e seus respectivos dímeros (exceção feita ao fragmento II) obtidos a partir de pontes dissulfeto. Esses fragmentos foram testados, quanto à habilidade da expressão da proteína Fos nos núcleos hipotalâmicos de ratos, quando administrados através de injeções intravenosas, comparando os resultados com o padrão apresentado pela leptina íntegra. Os resultados mostraram que os fragmentos IV e V foram capazes de induzir, parcialmente, a expressão da proteína Fos, em três dos cinco núcleos hipotalâmicos estudados, apresentando cerca de 20% de atividade quando comparado à leptina íntegra50. Coincidentemente, esse fragmento V compreende a mesma região que o peptídeo [D-Leu4]-OB3, obtido por Grasso e colaboradores51.
Com o intuito de relacionar a estrutura dos fragmentos de leptina e a atividade apresentada nos ensaios, Oliveira e colaboradores49,52 realizaram um estudo utilizando a técnica de Dicroísmo Circular (CD). A análise dos espectros de CD dos fragmentos de leptina mostrou que os fragmentos tendem a adotar um estrutura randômica em água, e que há propensão à estruturação em α-hélice dos fragmentos, quando se utiliza titulações com SDS e TFE, reconhecidamente indutores estruturais. Tais resultados mostram que a pouca atividade de alguns dos fragmentos, pode estar relacionada à falta de estruturação dos mesmos quando isolados.
Tabela III. Seqüências sintetizadas e estudadas por Samson e cols.48
Após administração (icv) de 500 e 1000 ng/dia dos fragmentos peptídicos.
Samson e colaboradores[Samson, Murphy, Vargas, Tau, and Chang 1996] Fragmento Seqüência de Aminoácidos Diferença no peso
dos animais (%)
Diferença no consumo alimentar (%)
hLEP22-56 VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRIN
DISHTQSVSSKQK
NR 35a e 45b
hLEP57-92 VTGLDFIPGLHPILTLSKMDQT
LAVYQQILTSMPSR
NR SA
hLEP116-167 SCHLPWASGLETLDSLGGVLE
ASGYSTEVVALSRLQGSLQDM LKQLRLSPGC
NR SA
SA = Sem atividade; NR = Experimento não realizado; Administração (icv) de 500 nga 1000 ngb dos
Tabela IV. Seqüências dos fragmentos peptídicos sintetizados e estudados por Oliveira e cols49.
No Nome Seqüência
I Ac-hLEP23-47-NH2 Ac-Pro-Ile-Gln25-Lys-Val-Gln-Asp-Asp30
-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile35-Lys-Thr-Ile-Val-Thr40 -Arg-Ile-Asn-Asp-Ile45-Ser-His-NH2
II Ac-hLEP48-71-NH2 Ac-Thr-Gln-Ser50-Val-Ser-Ser-Lys-Gln55
-Lys-Val-Thr-Gly-Leu60 -Asp-Phe-Ile-Pro-Gly65-Leu-His-Pro-Ile-Leu70-Thr-NH2
III Ac-hLEP72-88-NH2 Ac-Leu-Ser-Lys-Met75
-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala80-Val-Tyr-Gln-Gln-Ile85 -Leu-Thr-Ser-NH2
IV Ac-hLEP92-115-NH2 Ac-Arg-Asn-Val-Ile95
-Gln-Ile-Ser-Asn-Asp100-Leu-Glu-Asn-Leu-Arg105 -Asp-Leu-Leu-His-Val110-Leu-Ala-Phe-Ser-Lys115-NH2
V Ac-[Ser117]-hLEP116-140-NH2 Ac-Ser-Ser-His-Leu-Pro120
-Trp-Ala-Ser-Gly-Leu125-Glu-Thr-Leu-Asp-Ser130 -Leu-Gly-Gly-Val-Leu135-Glu-Ala-Ser-Gly-Tyr140 -NH2
VI Ac-hLEP141-164-NH2 Ac-Ser-Thr-Glu-Val-Val145
Figura 10. Interação dos fragmentos peptídeos derivados da leptina com o seu receptor expresso em células HP-75.
Extraído de Oliveira e colaboradores53.
A
25 30 35 40 45 50 55
VPIQK VQDDT KTLIK TIVTR INDIS HTQSV SSKQK
VPIHK VQDDT KTLIK TIVTR INDIS HTQSV SARQR
VPIQK VQDDT KTLIK TIVTR INDIS HTQSV SSKQK
60 65 70 75 80 85 90
VTGLD FIPGL HPILT LSKMD QTLAV YQQIL TSMPS
VTGLD FIPGL HPILS LSKMD QTLAV YQQIL TSLPS
VTGLD FIPGL HPILT LSKMD QTLAV YQQIL TSMPS
95 100 105 110 115 120 125
RNVIQ ISNDL ENLRD LLHVL AFSKS CHLPW ASGLE
QNVLQ IAHDL ENLRD LLHLL AFSKS CSLPQ TSGLQ
RNVIQ ISNDL ENLRD LLHVL AFSKS CHLPW ASGLE
130 135 140 145 150 155 160
TLDSL GGVLE ASGYS TEVVA LSRLQ GSLQD MLWQL
KPESL DGVLE ASLYS TEVVA LSRLQ GSLQD ILQQL
TLDSL GGVLE ASGYS TEVVA LSRLQ GSLQD MLWQL
165
DLSPG C
DVSPE C
DLSPG C
Figura 11. Comparação das seqüências da leptina
apontadas por Samson48, Grasso44,46,47,51,54-56 e Oliveira53,57 como contendo a porção funcional da molécula.
Figura 12. Comparação das seqüências da leptina
2) OBJETIVOS
Como os resultados da literatura empregando peptídeos sintéticos são ainda conflitantes quanto às regiões ativas da molécula, nos quais os peptídeos apresentam uma mimetização parcial das funções biológicas da leptina, nos propomos a sintetizar e testar dez fragmentos da leptina humana, acetilados e amidados nas porções N- e C-terminais, respectivamente (vide Tabela V).
Tratam-se de seqüências peptídicas que fazem um sobreposição entre os resíduos 98 e 122 da molécula de leptina humana. Esta região foi escolhida, pois engloba os fragmentos Ac-hLEP92-115-NH2(IV) e Ac-[Ser117]-hLEP116-140-NH2(V) (Vide Figura 13) que
foram os fragmentos que apresentaram atividades biológicas importantes em estudos anteriores49,53.
Propusemos-nos, também, a sintetizar sete fragmentos peptídicos da leptina de rato (Vide Tabela V). Com estes fragmentos, pretendemos obter fragmentos estruturalmente mais definidos e que abranjam os sítios importantes para a ancoragem no receptor celular e, os responsáveis pela atividade biológica.
O comportamento conformacional dos peptídeos determinado por dicroísmo circular (em diferentes concentrações de TFE e SDS) foram comparados com as conformações adquiridas pelos peptídeos quando inseridos na molécula de leptina integra, dados estes que foram obtidos por cristalografia e por RMN11,12.
Tabela V. Fragmentos peptídicos sintetizados e estudados, seqüência humana e de rato.
N° Nome Seqüência
I Ac-hLEP98-122-NH2
Ac-S-N-D-L-E-N-L-R-D-L-L-H-V-L-A-F-S-K-S-C-H-L-P-W-A-NH
2II Ac-hLEP98-107-NH2
Ac-S-N-D-L-E-N-L-R-D-L-NH
2III Ac-hLEP101-110-NH2
Ac-L-E-N-L-R-D-L-L-H-V-NH
2IV Ac-hLEP104-113-NH2
Ac-L-R-D-L-L-H-V-L-A-F-NH
2V Ac-hLEP107-116-NH2
Ac-L-L-H-V-L-A-F-S-K-S-NH
2VI Ac-hLEP110-119-NH2
Ac-V-L-A-F-S-K-S-C-H-L-NH
2VII Ac-hLEP113-122-NH2
Ac-F-S-K-S-C-H-L-P-W-A-NH
2VIII Ac-[Ser117]-hLEP98-122-NH2
Ac-S-N-D-L-E-N-L-R-D-L-L-H-V-L-A-F-S-K-S-S-H-L-P-W-A-NH
2IX Ac-[Ser117]-hLEP110-119-NH2
Ac-V-L-A-F-S-K-S-S-H-L-NH
2X Ac-[Ser117]-hLEP113-122-NH2
Ac-F-S-K-S-S-H-L-P-W-A-NH
2XI Ac-rLEP98-122-NH2
Ac-A-H-D-L-E-N-L-R-D-L-L-H-L-L-A-F-S-K-S-C-S-L-P-Q-T-NH
2XII Ac-rLEP98-107-NH2
Ac-A-H-D-L-E-N-L-R-D-L-NH
2XIII Ac-rLEP101-110-NH2
Ac-L-E-N-L-R-D-L-L-H-L-NH
2XIV Ac-rLEP104-113-NH2
Ac-L-R-D-L-L-H-L-L-A-F-NH
2XV Ac-rLEP107-116-NH2
Ac-L-L-H-L-L-A-F-S-K-S-NH
2XVI Ac-rLEP110-119-NH2
Ac-L-L-A-F-S-K-S-C-S-L-NH
2XVII Ac-rLEP113-122-NH2
Ac-F-S-K-S-C-S-L-P-Q-T-NH
2
Obje
tivo
s
3) MATERIAIS E MÉTODOS
Todos os materiais e métodos utilizados neste trabalho foram analisados e aprovados pelo Comitê de Ética da UNIFESP/EPM, segundo parecer de 18/04/2006, projeto número 0554/06.
3.1) Materiais
A metilbenzidrilamino-resina (MBAR) e a benzidrilamino-resina (BAR) foram adquiridas da Advanced Chemtech e os graus de substituição variaram entre 0,4, 0,6 e 0,8 mequiv/g de resina. Os Nα-terc-butiloxicarbonil-L-aminoácidos (Boc-aa) foram adquiridos da Bachem Inc. e da Advanced Chemtech. Os derivados de aminoácidos com cadeias laterais protegidas, utilizados nas sínteses na estratégia t-Boc, foram: Arg(Tos), Asp(OcHex), Cys(MeOBzl), Glu(OcHex), His(Tos), Lys(2-Cl-Z), Ser(Bzl), Thr(Bzl), Trp(For) e Tyr(2-Br-Z).
Os ativadores utilizados (BOP, DIC, TBTU, HOBt) foram adquiridos da NovaBiochem.
Nesse trabalho, foram utilizados reagentes e solventes de graus analítico e cromatográfico, das seguintes empresas: Fluka Chemika, Sigma, Mallinckrodt, Merck, Aldrich, Riedel-de haën, Synth, Vetec e Nuclear. Os mesmos não foram submetidos a nenhum tratamento adicional, salvo algumas exceções, cujos procedimentos de purificação estão apresentados a seguir:
- Ácido trifluoroacético (TFA):destilado.
- Trietilamina (TEA): refluxada durante uma hora, utilizando anidrido acético (100 mL/L de TEA), para eliminar as aminas primárias e secundárias; em seguida, destilada e tratada com KOH (100 g/L de TEA) sob refluxo, para eliminação de água, sendo novamente destilada e estocada, em frascos âmbar, sob peneira molecular do tipo 4Å, 4-8 mesh, da Aldrich.
- Dimetilformamida (DMF): destilada sob pressão reduzida em presença de ninidrina (1 g/L de DMF) para eliminar aminas livres, e estocada, sob peneira molecular, em frasco âmbar. A análise do teor de aminas contaminantes foi realizada periodicamente, consistindo na formação de uma mistura de DMF, com um volume idêntico de uma solução de dinitrofluorobenzeno (1 mg/mL de etanol 95%), a qual, após 30 minutos de repouso, teve sua absorbância medida a 381 nm, não podendo ultrapassar de 0,15.
- Piridina: refluxada por 2 horas com KOH (200 g/L de Pyr), destilada e estocada sob peneira molecular 4Å, 4-8 mesh, em frasco âmbar.
A água utilizada nos experimentos foi previamente purificada através de um sistema Mili-Q da Milipore.
3.2) Métodos
3.2.1) Síntese dos peptídeos
A síntese de peptídeos foi realizada pela estratégia química t-Boc. Onde foi empregado como protetor temporário dos Nα –aminogrupos o agrupamento ácido-lábil terc-butiloxicarbonila (t-Boc)58, enquanto que para as cadeias laterais foram utilizados protetores derivados do grupo benzila (Bzl)59.
A desproteção dos Nα-aminogrupos foi feita com TFA 50% em DCM e a neutralização com 5% de TEA ou DIEA em DCM.
Foi utilizado na etapa de acoplamento os seguintes reagentes: - BOP na presença de DIEA,
- DIC na presença de HOBt, - TBTU na presença de DIEA.
Em todos eles foram utilizados 2,5 equivalentes de excesso, e o tempo de reação variou de 1 a 2 h. O sistema de solventes utilizado na presença de DIC/HOBt foi uma mistura de 50% de DCM em DMF, enquanto que para BOP/DIEA ou TBTU/DIEA utilizou-se 20% de DMSO em NMP.
No caso de falha na terceira tentativa de acoplamento, os grãos de resina foram acetilados. A acetilação envolveu a reação com 20% de anidrido acético em DMF mais três gotas de Pyr, por 20 minutos. Cabe salientar, que as porções Nα- e Cα- terminais dos fragmentos apresentam-se acetiladas e amidadas, respectivamente.
3.2.1.1) Estratégia t-Boc
Nesse trabalho foi utilizada a estratégia t-Boc na síntese em fase sólida manual dos peptídeos e, para tanto foi utilizada a resina MBAR como suporte sólido. A estratégia de síntese t-Boc58,60,61consiste, basicamente, em três etapas:
2- Neutralização: Devido a desproteção ser feita em meio ácido, tem-se que neutralizar o Nα-aminogrupo que por estar protonado não é um bom nucleófilo. Esta etapa é realizada na presença de 5% de TEA ou 10% de DIEA em diclorometano.
3- Acoplamento: Nesta etapa ocorre a formação da ligação peptídica entre o aminoácido que está ancorado à resina com o próximo resíduo de aminoácido que será incorporado à seqüência desejada.
Estas três etapas estão ilustradas no Esquema 1 e na Figura 14.
A etapa de acoplamento foi constantemente monitorada através do teste de Kaiser, conhecido também como teste da ninidrina62. Este teste consiste na transferência de uma pequena alíquota da peptídil-resina para um tubo de Duran. Após a adição de 2 gotas de ninidrina (500 mg)/10 ml de etanol, e 1 gota das seguintes soluções: Pyr e Fenol (80 g)/etanol 20 ml, a mistura foi colocada em uma estufa a 110° C, durante 2 a 3 minutos.
O acompanhamento colorímetro da solução/resina foi feito sempre que se terminava um ciclo de desproteção ou acoplamento. Após a desproteção a coloração azul-intensa foi observada indicando a presença de α-aminogrupos “livres” devido à formação do complexo de Ruheman, como ilustrado na Figura 15. Se fosse observada a mesma coloração após a etapa de acoplamento, procedia-se o reacoplamento.
3.2.1.2) Clivagem dos peptídeos
Os peptídeos foram clivados da resina numa reação com HF anidrido (10 ml/g de peptidil-resina), utilizando 5 a 10% de reagentes seqüestradores de carbocátions (tais como: anisol, dimetilsulfeto, tioanisol e etanoditiol) no aparato ilustrado na Figura 16 durante 1-2 horas e um banho de gelo, com a temperatura em torno de 0° C.
3.2.1.3) Extração dos peptídeos
Após a clivagem dos peptídeos da resina por HF, removeu-se o fluoreto de hidrogênio do tubo de reação. Depois de constatar que o frasco possuía uma quantidade ínfima de fluoreto de hidrogênio, iniciou-se a extração, a qual foi feita através da lavagem do tubo de reação com éter etílico gelado e anidro. Após a filtração a vácuo extraiu-se o material sólido retido no funil de placa porosa com uma solução de 5% AcOH em H2O.
3.2.1.4) Liofilização
Esquema 1. Etapas da síntese manual de peptídeos em fase sólida pela estratégia t-Boc. Passos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
I) Etapa de desproteção
2 X MeOH 3 X DCM
1 X 50% TFA em DCM + 0,5 mL de anisol/g de resina (20 minutos)
__________________________________________________
II) Etapa de neutralização2 X 2% anisol em isopropanol 2 X 10% TEA em DCM
2 X MeOH
2 X 10% TEA em DCM 2 X MeOH
3 X DCM
___________________________________________________________
III) Etapa de acoplamento
2,5 Eq. de Boc-AA e DIC/HOBt em DCM/DMF (1:1;v/v) [duração 1 a 2 horas]
2 X MeOH
2 X 10% TEA em DCM 2 X MeOH
5 X DCM
Teste de Ninidrina [Negativo ⇒ Passo 2 // Positivo ⇒ passo 17]
Reacoplamento ⇒ 2,5 Eq. Boc-AA + 2,5 TBTU + DIEA (pH 8-9) em DCM/NMP (1:1;v/v) [duração 1 hora]
2 X MeOH
2 X 10% TEA em DCM 2 X MeOH
3 X DCM
e pesados.
Para liofilizar o material, foi utilizado o liofilizador Supermodulo 220 (Savant & Boc Edwards, Mountain Vyew, CA, EUA), acoplado a uma bomba de vácuo modelo VLP 285 (17 m3/h).
3.2.2) Purificação dos peptídeos
As purificações dos peptídeos foram feitas após a liofilização do material bruto, em um sistema de cromatografia preparativo da Waters Associates, Milford, MA, EUA (modelo Delta Prep 4000), acoplado a um detector UV-Vis (modelo 486), um coletor de frações LKB-Frac-200 e um registrador Servogor 120, ambos da Pharmacia, Piscataway, NJ, EUA. Os solventes utilizados foram todos de grau cromatográficos e a água utilizada foi obtida através do sistema Milli-Q, da Millipore. As condições experimentais foram:
Coluna: Vydac C18 (21,5 x 250 mm), 300 Å, 15 µm
Solventes: A: 0,1% TFA/H2O
B: 0,1% TFA em 60% ACN/H2O ou
B: 60% ACN em 40% de solvente A Gradiente: 0,33%B / min
Fluxo: 10 ml/min
Comprimento de onda: 220 nm
3.2.3) Caracterização dos peptídeos
3.2.3.1) Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
Todos os peptídeos foram caracterizados analiticamente em um sistema da Waters Associates, Milford, MA, EUA, constituídos por 2 bombas modelo 510,controlador automático de gradiente, detector UV-Vis modelo 486, injetor manual Rheodyne e um integrador modelo 746. O sistema é controlado por uma “Workstation” Compaq através do “software” denominado Millennium-32 – versão 3.2. Os solventes utilizados foram todos de grau cromatográfico e a água utilizada foi obtida em um sistema Milli-Q (Millipore). As condições experimentais foram:
Coluna: Vydac C18 (4,6 x 150 mm), 300 Å, 5µm
Sistema de solventes: A: 0,1% TFA/H2O
B: 0,1% TFA em 60% ACN/H2O
Fluxo: 1,5 mL/min Comprimento de onda: 220 nm
3.2.3.2) Espectrometria de massas – LC/MS
Os espectros de massas foram obtidos através de um sistema LC/MS Waters, constituído por um módulo de separação Alliance modelo 2690, detector do tipo “photodiode array” modelo 996, injetor automático com capacidade de 120 amostras e um detector de massas da Micromass, Altrincham, UK, modelo ZMD. O sistema é controlado por uma Workstation Compaq modelo AP200. Os peptídeos foram dissolvidos em água Milli-Q, na concentração de 1 mg/ml. As condições experimentais foram:
Coluna: Waters Nova-Pak C18 (2,1x150 mm), 60Å, 3,5 µm
Solventes: A: 0,1% TFA/H2O
B: 0,1% TFA em 60% ACN/H2O
Gradiente: 5% a 95% de B 30 minutos
Fluxo: 0,4 mL/min
Comprimento de onda: 190-300 nm
Intervalo de massas: 500-3930 Daltons.
Modo: “Electrospray” Positivo
fluxo de nitrogênio: 4,1 L/h Temperatura da fonte: 150ºC Temperatura de evaporação: 400ºC Voltagem do “cone”: 36 V Energia no capilar: 4 kV Energia do extrator: 5 kV Energia do multiplicador: 700 V Resolução de baixo peso molecular: 15,6 Resolução de alto peso molecular: 8,7
3.2.3.3) Análise de aminoácidos – AAA
concentração de aminoácidos da amostra. Os peptídeos (± 1 mg) foram hidrolisados a partir de dois métodos:
1) Para peptídeos sem Trp:
Aproximadamente 1 mg do peptídeo foi dissolvido em 1 mL de HCl 6 N e adicionado 0,08 mL de uma solução 5% de fenol em H2O. A solução resultante foi
mantida sob borbulhamento com N2 por cerca de 1 minuto. O frasco com tampa
rosqueada contendo a solução foi, então, colocado a 110ºC por 72 horas, em atmosfera de N2. Após a hidrólise, a solução foi concentrada à vácuo e o resíduo resultante foi
dissolvido em citrato de sódio 0,2 M, pH 2,2 (na concentração de 1 mg/mL). Após filtração em filtro Millipore (GV), a solução foi injetada no aparelho.
2) Para peptídeos com Trp:
Aproximadamente 1 mg do peptídeo foi dissolvido em 1 mL de uma solução contendo 5,7 g ácido p-toluenosulfônico + 20 mg triptamina em 10 mL de H2O. A solução
resultante foi borbulhada, com N2, por cerca de 1 minuto. O frasco com tampa rosqueada
contendo a solução foi, então, colocado a 110ºC por 72 horas em atmosfera de N2. Após a
hidrólise, a solução foi transferida para um balão volumétrico de 5 mL, tomando-se o cuidado de lavar o frasco de hidrólise com 2 mL de NaOH 1 M, seguido de água até completar-se o volume de 5 mL. Após filtração em filtro Millipore (GV), a solução foi injetada no aparelho.
A relação molar dos aminoácidos foi estabelecida, considerando-se unitária a concentração do aminoácido mais próximo da média para todos os resíduos. O conteúdo peptídico (CP), em porcentagem, foi obtido relacionando-se o valor médio de milimols/resíduo encontrado ao número de milimols de peptídeos correspondente ao hidrolisado, aplicado na coluna.
3.2.4) Análise estrutural de peptídeos – Dicroísmo circular (CD)
A espectroscopia de dicroísmo circular é uma técnica capaz de analisar a estrutura secundária de proteínas e peptídeos em solução.
circularmente polarizada à direita ou à esquerda conforme a diferença de fase for + π/2 ou - π/2 (Vide Figura 17).
Figura 17. Luz circularmente polarizada, característica da técnica de CD.
Polipeptídeos e proteínas possuem certas regiões em que os cromóforos quirais intrínsecos, ou seja, centros assimétricos, apresentam um alto grau de organização devido à presença de α-hélices, folhas-β e outros arranjos. Dependendo da orientação das ligações peptídicas nesses arranjos, as transições ópticas da ligação amida podem se dividir em múltiplas transições (vide Figura 18).
Desta forma, os comprimentos de onda das transições podem variar, e a intensidade dessas transições pode aumentar ou diminuir. Como conseqüência disso, muitos domínios de estrutura secundária produzem espectros de CD com bandas conhecidas (Vide Figura 19), previamente descritas na literatura63. A intensidade e energia destas transições dependem de Ψ e de Φ, que por sua vez dependem da estrutura secundaria.
Os espectros de CD foram obtidos em um espectropolarímetro Jasco (J810) na faixa de 190-260 nm, utilizando uma cela retangular de quartzo com caminho óptico de 1,0 mm. Os estudos conformacionais dos peptídeos foram feitos em diferentes solventes, tais como, H2O, SDS, LPC e TFE. Todos os peptídeos estavam em uma concentração da
O cálculo de elipticidade molar [θ] é dado pela fórmula:
[θ] = θmdeg / 10 . c . l . n
onde, θmdeg = elipticidade medida
c = concentração da amostra (mols/L) l = caminho óptico
n = número de aminoácidos do peptídeo
n →π* em torno de 220 nm
π→π* em torno de 190 nm
n →π* dos elétrons do O da carbonila
π→π* dos elétrons-π da carbonila
a) UV-CD de -hélice
Positiva (π→π*)perpendicular em 192 nm e negativa (π→π*)paralela em 209 nm Negativa em 222 nm (“red shifted”) (n→π*)
b) UV-CD deβ-sheet
Negativa em 218 nm (π→π*)
Positiva em 196 nm (n→π*)
c) UV-CD de estrutura randômica Positiva em 212 nm (π→π*)
Negativa em 195 nm (n→π*)
Figura 19. Espectros típicos de CD mostrando o perfil característico das estruturas secundárias
(a) -hélice, (b) β-sheet e (c) estrutura randômica.
(a
(c
Para os estudos em micelas de SDS64, manteve-se fixa a concentração dos peptídeos, em um volume final de 200 µL. Variou-se então a proporção de SDS desde 0 mM, passando para 1, 5, 10, 20, 40 e 50 mM. Em relação aos ensaios com TFE, os espectros foram obtidos no intervalo de concentração de 10, 30, 50, 70 e 90%.
3.2.5) Ensaios biológicos
3.2.5.1) Comportamento alimentar de ratos Wistar sob administração (icv)
Os ensaios biológicos foram realizados no Laboratório de Fisiologia da Nutrição da Universidade Federal de São Paulo, sob supervisão da Profa. Dra. Eliane Beraldi Ribeiro.
3.2.5.1.1) Animais
Os animais utilizados foram ratos machos, de linhagem Wistar, com peso aproximado de 240 a 300 g, provenientes do CEDEME (Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais) da Universidade Federal de São Paulo, foram mantidos por uma semana no Biotério da Disciplina de Fisiologia da Nutrição, para que pudessem adaptar-se e adaptar-serem então, utilizados. Os ratos foram mantidos em gaiolas coletivas, com livre acesso a água e alimento (ração balanceada com 4% de gordura e 22% de proteína, Purina), em ambiente com ciclo de luz controlado (claro das 6 às 18 h) e temperatura constante (24 ± 1°C).
3.2.5.1.2) Cirurgia para implante de cânula no ventrículo lateral (icv)
Os animais foram anestesiados com Ketamina/Xilazina (66.6 e 13.3 mg/Kg, respectivamente, i.p.). Em seguida, os animais foram submetidos a uma cirurgia para a implantação da cânula guia (21G, 1,5cm de comprimento) no ventrículo lateral direito, cujos procedimentos foram:
• corte dos pelos da cabeça e limpeza do campo operatório; • fixação do animal no esteriotáxico; (Foto 1)
• corte, com bisturi, no plano sagital mediano; (Foto 2) • raspagem da inserção muscular no osso parietal;
• execução da trepanação, utilizando as seguintes coordenadas esteriotáxicas ( L -1,6 mm, AP -1,3 mm, DV -2,6 mm) 65; (Vide Figuras 20 a 23)
Figura 20. Seqüência de fotos da cirurgia para a implantação dos capacetes nos animais.
Foto1 Foto 2
Foto 4 Foto 3
Foto 5 Foto 6
Figura 22. Representação do ventrículo lateral visualizado em um corte do encéfalo de rato a -1,30 mm do Bregma, adaptado de Paxinos e Watson. Em azul está destacado a
Figura 23. Representação do ventrículo lateral direito visualizado em um corte do encéfalo de rato a 1,40 mm do Bregma, adaptado de Paxinos e Watson. Em azul está
• A cânula foi fixada com resina odontológica, ancorado ao crânio pela presença do parafuso. (Foto 8)
3.2.5.1.3) Cuidados pós-operatório
No pós-cirúrgico, os animais foram mantidos em gaiolas individuais, com livre acesso a água e alimento (ração balanceada com 4% de gordura e 22% de proteína, Purina), em ambiente com ciclo de luz controlado (claro das 6 às 18 h) e temperatura constante (24 ± 1°C). Houve um período de cinco dias de recuperação da cirurgia e, o correto posicionamento da cânula no ventrículo lateral foi testado, através da resposta dipsogênica induzida pela angiotensina66. Uma agulha (27G de 2,0 mm de comprimento) foi introduzida através da cânula guia e administrou-se uma solução de angiotensina II (20 ng/µL), observando-se a ingestão imediata de água. O posicionamento da cânula foi
considerado correto quando o animal iniciou a ingestão de água após receber injeção de até 5 µL da solução. Os animais que não consumiram água após este teste foram
descartados.
3.2.5.1.4) Controle fisiológico e administração dos peptídeos
Durante um período de quatro dias, os animais receberam, diariamente, 1 µg de peptídeo dissolvido em 5 µL de (líquido cerebrospinal artificial, CSF) entre 17h00 e 18h00, diretamente no ventrículo lateral direito, através de uma cânula guia (27G de 2,0 mm de comprimento).
A ingestão alimentar e a massa corporal foram medidas 24 horas após as injeções. Após o término do experimento, os animais foram sacrificados.
3.2.5.1.5) Análise Estatística
4) RESULTADOS
4.1) Síntese de peptídeos
4.1.1) Síntese dos fragmentos I a X pela estratégia t-Boc.
A escala de síntese para cada peptídeo foi de 0,4 mmols, e para tanto partiu-se de 1,0 g de MBAR com grau de subtituição de 0,4 mmol/g de resina.
A Tabela VI apresenta, em vermelho, os resíduos de aminoácidos que necessitaram de reacoplamento em cada seqüência peptídica sintetizada, as massas de partida das resinas, da peptidil-resina obtidas após a síntese e dos peptídeos brutos obtidos após a etapa de clivagem em HF.
4.1.2) Síntese dos fragmentos XI a XVII pela estratégia t-Boc.
A escala de síntese utilizada para os fragmentos XI a XV foi de 0,76 mmols,o qual partiu-se de 1,25 g de MBAR, cujo grau de substituição foi de 0,6 mmol/g de resina. Para os fragmentos XVI e XVII, utilizou-se a escala de 1,0 mmols, pesando-se também 1,25 g de MBAR cujo grau de substituição foi de 0,8 mmol/g de resina (Vide Tabela VII), os aminoácidos destacados em vermelho representam os resíduos que se fez necessário o processo de reacoplamento, a tabela também apresenta os valores de massas obtidas após a síntese e dos peptídeos brutos obtidos após HF.
4.2) Purificação dos peptídeos
Para exemplificar as estratégias de purificação que foram empregadas neste estudo, foi escolhido o fragmento Ac-hLEP101-110-NH2(III)(Tabela V).
O peptídeo foi clivado da resina com HF, para cada 1 g de peptidil-resina utilizou-se 10 mL de HF com 0,5 mL de anisol e de dimetilsulfeto. Após 1 hora e 15 minutos, o HF foi eliminado a vácuo e o peptídeo extraído com 150 mL de 5% AcOH em H2O e 50 mL de
50% AcOH em H2O, que após liofilização resultaram em 100 mg de peptídeo bruto, cujo
perfil em LC/ESI-MS está representado na Figura 24A e 24B e o espectro de massas, na Figura 25. O peptídeo foi purificação através de uma única etapa, descrita a seguir.
O peptídeo bruto foi dissolvido na mínima quantidade possível de água deionizada; a partir de então, o mesmo foi eluído em uma coluna semipreparativa Vydac C18 {(21,5 x
