IN V ESTIG A Ç Õ ES SÔBRE INIBIDORES PA RA O VÍRUS DA POLIOMIE-
LITE, PRESEN TES EM S O R O S DE B O V IN O S *
H e r m a n n G . S ch atzm o ry r **
I n i b i d o r e s c o n t r a a s a m o s t r a s d e p o l i o v í r u s d o t i p o 1, M a h o n e y e C H A T , f o r a m e s t u d a d o s n o s i s t e m a d e g e l d e h i d r ó x i d o d e a l u m í n i o . O i n i b i d o r c o m p o r t o u - s e c o m o u m a m a c r o g l o b u l i n a d o t i p o 19 S ( I g M ) , a t r a v é s f i l t r a ç ã o e m g e l ( S e p h a ã e x G 2 0 0 ) , p a r t i ç ã o e m D E A E C e l u l o s e e s e d i m e n t a ç ã o r^ o r u l t r a -- c e n t r i f u g a ç ã o e m g r a d i e n t e d e s a c a r o s e . O i n i b i d o r f o i a i n d a d e s t r u í d o a t r a v é s o t r a t a m e n t o c o m 2 - M e r c a p t o - E t a n o l .
O i n i b i d o r u n e - s e à s u p e r f í c i e d o v í r u s n a a u s ê n c i a d e c é l u l a s . O c o m p l e x o f o r m a d o p e l o v í r u s e o i n i b i d o r p o d e s e r p r e c i p i t a d o p o r u m s ô r o p r e p a r a d o c o n t r a a g l o b u l i n a b o v i n a ; o m e s m o c o m p l e x o d i s s o c i a - s e e m i d ê n t i c o v a l o r d e p H a o d o c o m p l e x o v í r u s - a n t i c o r p o 19 S .
A c h a m a d a i n f e c c i o s i d a ã e r e s i d u a l ( c ê r c a d e 1 0 % ) q u e p e r m a n e c e a p ó s a n e u t r a l i z a ç ã o d e p o l i o v í r u s c o m s ô r o b o v i n o r e p r e s e n t a u m a d i s s o c i a ç ã o p a r c i a l d o i n i b i d o r d a p a r t í c u l a d e v í r u s , q u a n d o e m p r e s e n ç a d a s c é l u l a s e m c u l t u r a . F o r a m o b t i d a s a m o s t r a s d e v í r u s r e s i s t e n t e s à a ç ã o e s p e c í f i c a d e s o r o s b o v i n o s . E s t a s a m o s t r a s p e r m a n e c e m s e n s í v e i s à a ç ã o d e o u t r o s s o r o s b o v i n o s a t i v o s , b e m c o m o à a ç ã o d e a n t i c o r p o s 7 S e 19 S .
A t r a v é s e x p e r i ê n c i a s d e a d s o r ç ã o d e a t i v i d a d e i n i b i d o r a , f o i p o s s í v e l m o s t r a r a e x i s t ê n c i a d e i n i b i d o r e s m o n o e s p e c í f i c o s , c o m d i f e r e n t e s e s p e c i f i c i d a d e s c o n t r a a s a m o s t r a s C H A T e M a h o n e y , r e s p e c t i v a m e n t e .
INTRODUÇÃO
A a ç ã o in ib id o r a d e so ro s a n im a is , n o r m a is s ô b re a m u ltip lic a ç ã o d e v iru s e s u a in f lu ê n c ia p e rn ic io s a e m in v e s tig a ç õ e s so - ro ió g ic a s e e m e s p e c ia l e m te s te s d e in ib i ção d a h e m a g lu tin a ç ã o , s ã o d e lo n g a d a t a c o n h e c id a s . E s ta s s u b s tâ n c ia s s ã o c la s s i fic a d a s o u e m f u n ç ã o d o s v íru s s ô b re os q u a is e x e rç a m s u a a ç ã o , q u e r sô b re a m u l tip lic a ç ã o d o s m e sm o s, q u e r s ô b re a s u a c a p a c id a d e h e m a g lu tin a n te o u e n tã o e m f u n ç ã o d e s u a p r ó p r ia n a t u r e z a . E x a t a m e n te e s ta n a t u r e z a a p r e s e n ta u m a c a r a c te r iz a ç ã o a in d a in c o m p le ta . I n ic ia lm e n te t o r n a - s e n e c e s s á rio p r o v a r q u e a a tiv id a d e in ib id o ra d o sô ro n ã o e s tá r e la c io n a d a ao s
im u n e - a n tic o r p o s a d q u irid o s . C om o p o n to d e r e f e r ê n c ia , fo i u s a d o in ic ia lm e n te p a r a e s ta d ife re n c ia ç ã o a in a tiv a ç ã o d a a ç ã o in i b id o r a p e lo a q u e c im e n to a 56° C . N o e n ta n to , f r e q ü e n te m e n te sã o o b se rv a d o s, a tr a v é s o u so d e o u tro s c rité r io s d e d if e r e n c ia ç ã o , a p re s e n ç a d e in ib id o re s te r m o - r e - s is te n te s . F in a lm e n te n ã o é p o ssív e l d is tin g u ir, a lg u m a s vêzes, os in ib id o re s d a s im u -
n e -g lo b u lin a s , o u s e ja d o s a n tic o rp o s , p e la sim p le s d e te r m in a ç ã o d e s u a n a t u r e z a . A ssim s e n d o , e x is te n a a tu a lid a d e u m q u a d ro b a s t a n t e v a r ia d o d e in ib id o re s de d if e r e n te s n a tu r e z a s e q u e a g e m d e d if e r e n te s m a n e ir a s s ô b re os v íru s a êles s e n sív e is . D e s ta s s u b s tâ n c ia s a s m e lh o re s e s tu d a d a s s ã o os in ib id o re s d a h e m a g lu tin a
-(* i T f se d e D o u to r a m e n to a p r e s e n ta d a a o I n s t i t u t o d e V ir o lo g ia d a U n iv e r s id a d e d e G ie s se n , n a R e p ú b l i c a F e d e r a l A le m ã , e m d e z e m b r o d e 19GG.
134 R ev. Soc. B ras. M e d . T ro p . Vol. II — N ? 3
ção dos M y x o v i r u s . M e n o s c o n h e c id o s e e s
tu d a d o s sã o os in ib id o re s p r e s e n te s e m s o ro s a n im a is q u e a g e m s ô b re a m u ltip lic a ç ã o d o s e n te ro v iru s , e m e s p e c ia l d o v ír u s d a p o lio m ie lite . A p r e s e n te in v e s tig a ç ã o r e f e - r e - s e u n ic a m e n te a o s in ib id o re s p re s e n te s em so ro s d e a n im a is e q u e s ã o a tiv o s c o n tr a e n te r o v iru s e b a s e ia - s e n o s s e g u in te s ía to s b á sic o s, q u e s e rv e m d e p o n to de p a r t i d a a o tr a b a lh o .
P r in c ip a lm e n te e m so ro s d e b o v in o s m a s ta m b é m n o d e e q ü in o s, s ã o id e n tif ic a d a s s u b s tâ n c ia s q u e im p e d e m a m u ltip lic a ç ã o do v íru s d a p ó lio . A s d e s c riç õ e s e n c o n tr a d a s n a l i t e r a t u r a s ô b re a c a r a c te r iz a ç ã o d e s ta s s u b s ty n c ia s , a s c o lo c a m n o g ru p o d a s im u n e - g lo b u lin a s o u s e ja , p o d e r ia m t r a t a r - s e d e a n tic o r p o s . N o e n t a n t o e x is te m d if e re n ç a s e n tr e ê s te s in ib id o re s e o s a n t i co rp o s n e u t r a l i z a n t e s . A ssim , e x is te m a m o s tr a s d e v íru s , p e r te n c e n te s a o m e sm o tip o so ro ló g ico , q u e s ã o r e s is te n te s à a ç ã o in ib id o r a d e u m d e te r m in a d o sô ro b o v in o . E s ta s a m o s tr a s r e s is te n te s t a n t o p o d e m s e r e n c o n tr a d a s n a tu r a lm e n te , c o m o s e le c io n a d a s p e la m u ltip lic a ç ã o n a p r e s e n ç a d o sô ro in ib id o r . P o r o u tr o la d o , m u t a n t e s r e s is te n te s a o s a n ti- s o r o s tip o -e s p e c ífic o s n ã o f o r a m a té o m o m e n to c o n s e g u id a s . A s m u ta n t e s r e s is te n te s a d e te r m in a d o sô ro d e i x a m - s e n e u t r a l i z a r p o r o u tro s so ro s b o v i n o s e m m a io r o u m e n o r g r a u . N ã o e s tá b e m d e fin id o , n o e n ta n to , se a m o s tr a s d e p ó lio v íru s do m e s m o tip o so ro ló g ic o p o s su e m os m e sm o s p o n to s d e u n iã o n a s u p e rfíc ie d o v ír u s p a r a u m d e te r m in a d o i n i b id o r. E s ta o b s e rv a ç ã o m o s tr a q u e o e s tu do d ê s te s in ib id o re s p o d e r ia le v a r à c o n fe c ç ã o d e u m s is te m a d e p ro p r ie d a d e s do c a p síd e o do v íru s d e t a l s o rte q u e s e r ia c o n s titu íd o u m e s q u e m a d e id e n tif ic a ç ã o d e a m o s tr a s , co m o p o r e x e m p lo o d e K a u f f - m a n n - W h ite p a r a S a lm o n e lla s , s e ja n o in - te rê s s e d e in v e s tig a ç õ e s g e n é tic a s , s e ja s im p le s m e n te n o in te r ê s s e do e s c la re c im e n to d o s a s p e c to s f u n c io n a is e e s tr u tu r a is do c a p síd e o d o v ír u s d a p o lio m ie lite .
A p r e s e n te in v e s tig a ç ã o te v e p o r o b je ti vo a n a lis a r a s re la ç õ e s e n tr e in ib id o re s de sô ro b o v in o q u e p o s s u e m e s p e c ific id a d e d e a m o s tr a s e o v íru s d a p o lio m e ilite , e m u m s is te m a i n v i t r o , n a a u s ê n c ia d e c é lu la s .
Isso p e r m itiu a a n á lis e d o s r e c e p to r e s do c a p síd e o d e p o lio v iru s e m u m s is te m a , e m q u e s ã o e lim in a d o s os f a to r e s d e o rig e m c e lu la r . A n a lis o u -s e a in d a a n a t u r e z a d o
in ib id o r d e u m a m a n e ir a m a is d e ta lh a d a d o q u e a t é e n tã o , b e m c o m o c o m p a ro u - s e a lig a ç ã o d o s in ib id o re s a o s v íru s co m a lig a ç ã o d o s i m u n e - a n tic o r p o s .
P a r a u m a p e r f e ita d e lin e a ç ã o d a p o siç ã o do tr a b a lh o , u m a r á p id a re v is ã o d e l i t e r a t u r a s e r á a s e g u ir a p r e s e n ta d a :
F le x n e r e L ew is (8) d u r a n t e o d e c o rre r d e in v e s tig a ç õ e s s ô b re a s o r o te r a p ia d a p o lio m ie lite d e m o n s tr a r a m , j á n o a n o d e 1910, a p r e s e n ç a , n o sô ro d e c a b r a s n o r m a is , d e f a to r e s te r m o - r e s is te n te s (56° C, 30 m in u to s ) os q u a is , d a m e s m a m a n e ir a q u e os a n tic o r p o s , a f e ta v a m a ín fe c c io s i- d a d e d e m e d u la s d e m a c a c o s in f e c ta d o s c o m o v íru s d a p o lio m ie lite . P o s te r io r m e n t e in v e s tig a ç õ e s f o r a m p o ssív e is q u a n d o d a a d a p ta ç ã o d o vírrus d a p o lio m ie lite a a n i m a is d e la b o r a tó r io ( r a to s e c a m u n d o n g o s )
p o r A m s tr o n g ( 2 ) . H a m m o n e t a l . (11) i n v e s tig a r a m s o ro s d e a n im a is s e lv a g e n s e d o m é s tic o s e m r e la ç ã o a s u a a tiv id a d e n e u - t r a l i z a n t e c o n tr a a a m o s tr a L a n s in g e e n c o n tr a r a m n o s a n im a is d o m é stic o s u m t í tu lo m a is e le v a d o . S a b in e F ie ld s te e l (24) e n c o n tr a r a m n o c o lo s tro e s a n g u e d e b o v i n o s, s u b s tâ n c ia s ta m b é m a tiv a s c o n tr a a a m o s tr a L a n s in g . B a r te ll e K le in (3) e M c F e r r a n (19) d e m o n s tr a r a m n o sô ro d e b o v in o s , a d u lto s , f a to r e s d e in ib iç ã o c o n tr a to d o s os t r ê s tip o s d e p o lio m ie lite . N os p r i m e iro s e s tu d o s s ô b re a m u ltip lic a ç ã o d e p o lio v iru s e m c u ltu r a d e te c id o s (2 3 ), d e te r m in o u - s e u m a a ç ã o in ib id o r a d o s a n g u e d e c a v a lo q u e t i n h a sid o a c r e s c e n ta d o co m o f a t o r e s tim u la n te d o c r e s c im e n to c e lu la r . S u b s tâ n c ia s s e m e lh a n te s f o r a m ta m b é m d e te r m in a d a s e m so ro s d e c o e lh o s (20, 2 6 ). P o r o u tr o la d o , f o r a m d e m o n s tr a d a s , n o sô ro d e h u m a n o s , s u b s tâ n c ia s a tiv a s c o n tr a e n te r o v ir u s d e o rig e m b o v in a , c o m a ç ã o in ib id o r a d a m u ltip lic a ç ã o . •
A lg u m a s q u a lid a d e s d o s c h a m a d o s in ib i d o re s p r e s e n te s e m so ro s d e b o v in o s e e q ü i n o s os a p r o x im a m b a s t a n t e d o s a n tic o rp o s , a s a b e r:
1 — Ê les sã o f o r m a d o s n o o rg a n is m o do p ró p r io a n im a l. E m a lg u n s c a so s e e s p e c ia lm e n te e m a n im a is jo v e n s, n ã o sã o d e m o n s tr á v e is ( 1 9 ) . 2 — O s in ib id o r e s p o ssu e m a lg u m a s v ê
li-M a ic - Ju n h o , 1968 R ev. S oc. B ras. M e d . T ro p . 135
n a s . A p a re c e m a p ó s f iltr a ç ã o co m S e p h a d e x G -2 0 0 n a f r a ç ã o d a s m a - c ro g lo b u lin a s ( 2 1 ).
4 — O s títu lo s a lc a n ç a d o s in d iv id u a l m e n te p e lo s a n im a is s ã o e x tr e m a m e n te v a r ia d o s e s u rg e m d u r a n te d if e r e n te s p o n to s d o d e se n v o lv i m e n to .
5 — In v e s tig a ç õ e s s ô b re a c in é tic a d a n e u tr a liz a ç ã o i n v i t r o p e r m ite m a
c o n c lu s ã o d e q u e , n a a u s ê n c ia d e c é lu la s, ta m b é m o c o rre a u n iã o d o in ib id o r c o m o a n tíg e n o (2 9 ) . T a k e - m o to e t a l. (27) n ã o p u d e r a m , c o m so ro s d e e q ü in o s, d e m o n s tr a r u m a a ç ã o i n v i t r o d o s in ib id o re s , o q u e
fo i n o e n t a n t o p o s te r io r m e n te d e m o n s tr a d o ( 2 8 ).
D ifíc il to r n a - s e , n o e n ta n to , o e s c la r e c i m e n to d a o rig e m d ê s te s in ib id o r e s . T e n t a tiv a s d e in fe c ç õ e s d e b o v in o s c o m p o lio v í- r u s r e s u l t a r a m n e g a tiv a s (24, 3 2 ). U m a d e s c riç ã o d e K o p ro w sk i d o is o la m e n to d e p o - lio v íru s d a s fe z e s d e u m b o v in o c o m a d e m o n s tr a ç ã o d o a u m e n to d o títu lo d e a n t i c o rp o s c ir c u la n te s p e r m a n e c e c o m o ú n i c a (v e ja M c F e r r a n e t a l. (1 8 ).
U m a d ife re n c ia ç ã o e n t r e o s a n tic o r p o s tip o -e s p e c ífic o s n e u tr a liz a n te s e os in ib i d o re s p o d e s e r e n c o n tr a d a n a s d e sc riç õ e s s e g u in te s d e d iv e rs o s a u to r e s .
A pós a d e s c riç ã o d a té c n ic a d e p la c a p o r D u lb e c c o e V o g t ( 5 ), in v e s tig a r a m T a k e - m o ri e t a l . (29) a f o r m a ç ã o d e p la c a s d e p o lio v íru s tip o 1 e 2 n a p r e s e n ç a d e a g a r c o n te n d o so ro s b o v in o s c o m in ib id o r e s . As p la c a s q u e se d e s e n v o lv e ra m e r a m m e n o
r e s e e m m e n o r n ú m e r o d o q u e n o c o n tr o le . A lg u m a s p la c a s p o s s u ia m , n o e n ta n to , t a m a n h o n o r m a l. P e la p a s s a g e m d e s ta s ú l t im a s p la c a s , o b te v e -s e a m o s tr a s d e v íru s q u e n ã o m a is e r a m se n s ív e is à a ç ã o in ib i d o ra do sô ro b o v in o . H ir s t (13) c o n se g u iu a tr a v é s e x p e riê n c ia s d e re c o m b in a ç ã o , m u - t a n t e s d u p la s , a s q u a is e r a m r e s is te n te s ao m e sm o te m p o a u m sô ro e q u in o e u m sô ro b o v in o , p a r tin d o d e a m o s tr a s in d iv i d u a lm e n te r e s is te n te s a u m e o u tr o sô ro , r e s p e c tiv a m e n te . L e d in k o (15) c o n se g u iu ta m b é m m u t a n t e s d u p la s , p o r té c n ic a s s e m e lh a n te s , a s q u a is e r a m r e s is te n te s à a ç ã o d e u m sô ro d e c a v a lo e d e g u a n id in a . P a - g a n o e B õ ttin g e r (20) d e s c r e v e ra m u m sô ro d e b o v in o q u e e r a a tiv o s e le tiv a m e n te c o n t r a a a m o s tr a d e p o lio v íru s a t e n u a d a
C H A T (p o lio v íru s tip o 1) e ta m b é m a tiv o c o n tr a a m o s tr a s o b tid a s a p ó s a v a c in a ç ã o d e c r ia n ç a s c o m e s ta a m o s tr a a te n u a d a . E m in v e s tig a ç õ e s p o s te rio re s P a g a n o e t a l. (21) o b tiv e r a m a m o s tr a s r e s is te n te s de C H A T . A r e s is tê n c ia d e u m a a m o s tr a de p o lio v íru s c o n tr a os a n tic o r p o s n e u tr a liz a n te s tip o e sp e c ífic o s n ã o fo i a té a g o ra d e s c r ita .
M A T E R IA L E M É T O D O S
1 — P r e p a r o d a s c u l t u r a s d e c é l u l a s
T u b o s e g a r r a f a s c o n te n d o c é lu la s de rim d e m a c a c o R h e s u s f o r a m p r e p a r a d a s s e g u n d o m é to d o s d e s c rito s p o r Y o u n g n e r (3 3 ). 2 — S o l u ç õ e s
a — P a r a c u ltu r a d e c é lu la s, fo i u s a d a u m a s o lu ç ã o a 0,5% d e h id ro lis a d o d e la c to a lb u m in a (B io c h e m ic a l C o r p o r a tio n ) e m s o lu ç ã o d e H a n k s com 5% d e sô ro b o v in o , b ic a r b o n a to de só d io e a n tib ió tic o s . P a r a a m u lti p lic a ç ã o d e v íru s , o m e io n ã o c o n t i n h a sô ro d e b o v in o .
b — T a m p õ e s : P a r a a d s o rç ã o d e v íru s ao h id ró x id o d e a lu m ín io (30, 3 1 ), fo i u s a d o u m ta m p ã o e s p e c ia l q u e c o n s to u d e u m ta m p ã o d e f o s fa to s e g u n d o S õ r e n s e n c o m a a d iç ã o d e 0,1 M T r is ." H C l, p H 7,5. A m o ia r id a d e do t a m p ã o , d e f o s f a to fo i a ju s ta d a a v a lo re s a d e q u a d o s ( = T a m p ã o fo s- f a t o / T r i s ) . P a r a a s d ilu iç õ e s d e v í r u s e s ô ro fo i u s a d o u m ta m p ã o c o n s ta n d o d e p a r te s ig u a is d e so lu ç ã o d e H a n k s e T r is . HC1 0,1 M, p H 7,5 ( = T ris H a n k s / T r i s ) . 3 — A m o s t r a s d e v í r u s
F o r a m u tiliz a d a s a s a m o s tr a s d e p o lio v ír u s tip o 1, M a h o n e y e C H A T, e s ta ú ltim a u m a a m o s tr a a t e n u a d a u s a d a p a r a a v a c in a ç ã o o r a l.
4 — C u l t i v o d e a m o s t r a s ã e v í r u s r e s i s t e n t e s e i n i b i d o r e s
136 R ev. S oc. B ros. M e d . T ro p . Vol. II — N ? 3
is o la d a s v a r ia n te s , a s q u a is sã o r e s is te n te s à a ç ã o in ib id o r a d o s so ro s re s p e c tiv o s. E s ta s v a r ia n te s fo r a m is o la d a s d a s e g u in te m a n e ir a : a s a m o s tr a s d e v íru s f o r a m c u ltiv a d a s e m c é lu la s d e r im d e m a c a c o , em p r e s e n ç a do sô ro b o v in o in ib id o r e a p ó s c é rc a d e 10-15 p a s s a g e n s , fo i d e te r m in a d a a s e n s ib ilid a d e d a s a m o s tr a s e m te s te s d e n e u tr a liz a ç ã o ( c in é tic a ) , s e g u n d o té c n ic a a d ia n te d e s c r ita . Q u a n d o a p o p u la ç ã o d e v íru s d e u m a d e te r m in a d a p a s s a g e m a p r e s e n ta v a u m a j á d im in u ta s e n s ib ilid a d e à a ç ã o d o sô ro , a se le ç ã o p a s s o u a s e r r e a li z a d a n o s is te m a d e g e l d e h id ró x id o d e a lu m ín io (30, 31) . F in a lm e n te f o r a m is o la d a s a m o s tr a s re s is te n te s , p e la m u ltip lic a ção de p la c a s is o la d a s o b tid a s so b a g a r . A o b te n ç ã o f in a l d a s a m o s tr a s d e v íru s fo i re a liz a d a n a a u s ê n c ia d e s ô ro .
5 — M a r c a ç ã o d a s a m o s t r a s ã e v í r u s c o m 32p
U s a ra m -s e té c n ic a s a n te r io r m e n te d e s c r ita s a p ó s p a d ro n iz a ç ã o a d e q u a d a (16, 3 1 ). 6 — S o r o s
S o ro s d e b o v in o s a d u lto s f o r a m o b tid o s e m m a ta d o u r o s . I m u n e - a n tic o r p o d o tip o 19 S d e co elh o c o n tr a o v ír u s d a p o lio m ie - lite foi p re p a r a d o d e a c ô rd o co m S v e h a c (26) e te s ta d o a n te s do u so , e m re la ç ã o a s u a s e n s ib ilid a d e ao 2 -M e r c a p to - E ta n o l.
I m u n e - a n tic o r p o s do tip o 7 S ig u a lm e n t e de co elh o s, fo r a m o b tid o s a tr a v é s im u n iz a ç õ e s co m v ír u s c o m a lto s títu lo s i . m . e i .v . e fra c io n a d o s e m D E A E -C e lu lo se a n te s d o u so (7) . A n tic o rp o s p r e c ip ita n te s p a r a g lo b u lin a b o v in a fo r a m o b tid o s a tr a v é s a im u n iz a ç ã o de c o e lh o s co m c ê r c a d e 20 m l d e g lo b u lin a b o v in a , a q u a l n ã o p o s s u ía a tiv id a d e in ib id o r a c o n tr a a s a m o s tr a s CH A T e M a h o n e y .
7 — T e s t e s ã e n e u t r a l i z a ç ã o
F o ra m re a liz a d o s se g u n d o a s té c n ic a s d e D u lb ecco e t c o ls. (6) . O títu lo é e x p r e s so e m p f u / m l .
8 — T i t u l a ç ã o d o s s o r o s e m c u l t u r a ã e t e c id o s
A a tiv id a d e I n ib id o ra p o d e s e r ta m b é m d e te r m in a d a e m c u ltu r a d e te c id o s, e m t u
bos, a tr a v é s a im u n o - in a tiv a ç ã o , G a r d (9) . O títu lo f in a l d o sô ro é e n tã o d e fin id o com o u m a d ilu iç ã o n a q u a l 50% d o s tu b o s in o - c u la d o s m o s tr a m u m e fe ito c ito p a to ló g ic o e m p r e s e n ç a d e 10-15 T C ID 50. Ê ste m é to d o r e s u lta e m v a lo re s m e n o s e x a to s , p o is a p ó s a 4.° d ia d e in c u b a ç ã o , u m a f r a ç ã o d e p a r tíc u la s n ã o n e u tr a liz a d a s o c a s io n a a d e s tr u iç ã o d a s c é lu la s .
9 — D E A E — C e l u l o s e
O s so ro s f o r a m d ia liz a d o s p o r u m a n o i t e c o n tr a ta m p ã o d e f o s f a to 0,02 M e m p H 8,0. A s c o lu n a s (10 c m d e a l t u r a e 1 c m d e d iâ m e tr o ) f o r a m la v a d a s c o m o m e sm o ta m p ã o , c u id a d o s a m e n te , a t é q u e p H u n i fo rm e fo i a lc a n ç a d o . A p ó s a d iç ã o d e 2 m l d e sô ro , e lu a d o s fo r a m o b tid o s c o m a a d i ç ã o d e p o rç õ e s d e 2 m l d e ta m p ã o a s q u a is p o s s u ia m m o la r id a d e c r e s c e n te e v a lo re s de p H d e c r e s c e n te s . C a d a c o lu n a fo rn e c e u c ê r c a d e 40 fra ç õ e s , d e n tr o d a s q u a is tô d a a a tiv id a d e ó tic a p o d e s e r d e te r m in a d a . A s m e d id a s f o r a m r e a liz a d a s c o m u m f o tô m e - tr o Z eiss (tip o P M Q I I ) e m u m c o m p r i m e n to d e o n d a d e 280 m ^ . D e c a d a f r a ç ã o f o r a m m e d id a s , a lé m d isso , a a tiv id a d e i n i b id o r a e m c u ltu r a d e te c id o s e e m te s te s d e a d s o r ç ã o .
10 — S e p h a á e x G -200
15 g do p r o d u to f o r a m d isso lv id o s e m c ê rc a d e u m litr o d e ta m p ã o (0,1 M N a C l e 0,1 M ta m p ã o T ris, p H 8,0) e c u id a d o s a m e n te la v a d o s , co m o m e s m o ta m p ã o , e m u m a c o lu n a d e v id ro (5 x 40 c m ) . 5 m l d e sô ro d ia lis a d o c o n tr a o m e s m o ta m p ã o f o r a m a d ic io n a d o s à c o lu n a e fr a ç õ e s d e 5 m l c o n s e c u tiv a m e n te c o lh id a s . A s fra ç õ e s f o r a m in v e s tig a d a s co m o a c im a d e s c rito . 11 — G r a ã i e n t e ã e s a c a r o s e
Modc - Ju n h o , 1968 R ev. S oc. B ras. M e d . T rop 137
____j
a g u lh a 16. C a d a f r a ç ã o (6 g ô ta s ) fo i co lh id a e m á g u a e in v e s tig a d a p a r a s u a d e n s id a d e ó tic a e a tiv id a d e in ib id o r a .
12 — T r a t a m e n t o c o m 2 - M e r c a p t o - E t a n o l
A s s u b s tâ n c ia s in ib id o r a s p r e s e n te s n o sô ro f o r a in in v e s tig a d a s d e a c ô rd o c o m a s té c n ic a s d e S v e h a g (26) . O s so ro s f o r a m in c u b a d o s n a p r e s e n ç a d e 2 - M e r c a p to - E ta - n o l (c o n c e n tr a ç ã o f in a l 0,2 M ) p o r u m a n o ite a 4o C . A a ç ã o d o 2 -M e r c a p to - E ta n o l fo i e s tu d a d a n o s is te m a g e l d e h id ró x id o d e a lu m ín io , u s a n d o - s e 32P -V íru s , c o m o s e r á d e s c rito n o c a p ítu lo I I I . (4) .
13 — T é c n i c a d e a d s o r ç ã o e m g e l
E s ta té c n ic a fo i u s a d a p a r a d e te r m in a r a a tiv id a d e d e a n tic o r p o s d e c o e lh o s o u d o s in ib id o r e s p r e s e n te s n o s ô ro d e b o v in o s, s e g u n d o m é to d o s j á d e s c rito s ( 3 1 ).
14 — G e l d e h i d r ó x i d o d e a l u m í n i o
N a s c o n c e n tra ç õ e s u s a d a s (0,6 m g /m l) o g e l é e s tá v e l e a d s o rv e , e n t r e os p H 5,0 e 9,0 e e m c o n c e n tr a ç ã o d e f o s f a to d e 0,005 M, q u a s e c o m p le ta m e n te a s p a r tíc u la s d e v íru s d a p o lio m ie lite .
15 — T é c n i c a s d e a b s o r ç ã o d e s o r o s
A s a b s o rç õ e s d e a tiv id a d e s d e so ro s f o r a m r e a liz a d a s c o m v íru s n ã o m a r c a d o s e a a tiv id a d e r e s id u a l t e s t a d a c o m v ír u s m a r c a d o s, c o m o a c im a d e s c rito .
16 — T é c n i c a s d e p r e c i p i t a ç ã o
E m p r e g a r a m -s e o s m é to d o s d e G e r lo f f e t c o ls . (10) c o m a m o s tr a s m a r c a d a s d e p o
lio v íru s, r e s is te n te s e n ã o r e s is te n te s à a ç ã o d e s o ro s in ib id o re s .
17 — D i s s o c i a ç ã o p e l o p H
A d is s o c ia ç ã o p o r a ç ã o d o p H d e c o m p le x o s v ír u s - a n tic o r p o s o u v ír u s - in ib id o r r e a liz a r a m - s e b a s ic a m e n te s e g u n d o a s té c
n ic a s d e M a n d e i ( 1 7 ) . A s m is tu r a s f o r a m
a ju s t a d a s a u m p H á c id o e a ss im m a n t i d a s p o r 30 m in u to s a te m p e r a tu r a a m b ie n te . O p í l fo i e n tã o re c o n d u z id o a v a lo re s d e n e u tr a lid a d e a tr a v é s ta m p ã o do T r is . HC1. O s p ro d u to s d e d isso c ia ç ã o f o r a m e n tã o e x a m in a d o s a tr a v é s a a d iç ã o d o ta m p ã o f o s f a to /T r is e g e l d e h id ró x id o d e a lu m ín io .
18 — . D e t e r m i n a ç ã o á a a t i v i d a d e d o °-P
A s m e d id a s d a r a d io a tiv id a d e f o ra m r e a liz a d a s p o r m e io d e u m a p a r e lh o d e flu x o d e m e ta n o e m c o n e x ã o co m c a m b ia d o r a u to m á tic o d e a m o s tr a s e u m c o n ta d o r d e im p u ls o s ( e q u ip a m e n to d a f ir m a F r ie s a c - k e & H o e p fn e r, n .o 4 0 7 ). A s p ro v a s p a r a c o n ta g e m f o r a m c o lo c a d a s e m c á p s u la s d e m e ta l e s ê c a s e m f o r n o a p ó s a a d iç ã o d e u m a g ô ta d e A rla c e l, v is a n d o m e lh o r u n i fo rm id a d e d e d is trib u iç ã o n a s u p e rfíc ie . V ia d e r e g r a c o n ta r a m - s e p e lo m e n o s 1000 im p u ls o s .
R E S U L T A D O S
1 — F e n ô m e n o b á s ic o
32P -p o lio v iru s (M a h o n e y ) q u a n d o e m p r e s e n ç a d e u m e x c esso d e a n tic o r p o im u n e d e c o e lh o d o s tip o s 19-S « 7 -S e u m c o n tro le , c o n te n d o sô ro n o r m a l d e b o v in o liv re d e in ib id o re s , a o s e r e s tu d a d o n o s is te m a d e g el d e h id ró x id o d e a lu m ín io , a p r e s e n ta o s e g u in te c o m p o rta m e n to . (F ig . 1).
E n q u a n to q u e o v ír u s in c u b a d o co m sô ro d e b e z e rro lig a - s e f r a c a m e n te a o a d s o rv e n - te , a s m is tu r a s v íru s e a n tic o r p o s 19-S e 7 -S u n e m - s e m a is f o r te m e n te e e m d ife r e n te s m a n e ir a s a o g e l. C o m p lex o s f o r m a d o s p o r v ír u s e a n tic o r p o s 7 -S lig a m -s e m a is f o r te m e n te d o q u e o s c o m p le x o s v í- ru s - 1 9 - S . A s c u rv a s d e e lu iç ã o o b tid a s co m o m e s m o s ô ro s ã o c o n s ta n te s , e la s v a r ia m a o s e re m u s a d a s o u tro s so ro s e m c ê rc a de m a is o u m e n o s 10% d o v a lo r d o fo s fa to q u e p ro d u z 50% d e e lu iç ã o . É p o ssív e l d e m o n s tr a r q u e c o m p le x o s v ír u s - a n tic o r p o s e
n ã o v íru s liv re e lu e m d o a d s o rv e n te . 2 — C o m p o r t a m e n t o d e s o r o s d e b o v i n o s
-138 R ev. S oc. B ros. M e d . T ro p .
M F o s f a t o
F i g u r a 1 : — C u r v a s d e e lu iç ã o d e c o m p le x o s f o r m a d o s co m ;l- P - p o l i o v i r u s a m o s tr a M a h o n e y c o m im u n o - a n tic o r p o s t i p o 7 S e V.) .S. C o n tr o le : C o m p o r ta m e n to d e v i r u s a p ó s in c u b a ç ã o c o m s ô ro d e b e z e r r o l i v r e d e i n i b i d o r e s .
O s v a lo r e s d e f o s f a t o a s s i n a l a d o s c o r r e s p o n d e m a c o n c e n tr a ç ã o f i n a l $ o b r e n a d a n te „ a p ó s a c C Jitrifu g a ç ã o d o gel d e h id r o x id o d e a l u m í n i o . O v a l ò r 100% d e o lu ic ã o é d a d o p e la a t i v i d a d e n o s o b r e n a d a n te d a m i s t u r a v ir u s - s ô r o d e b e z e r r o e m 0,2 M d e f o s f a t o .
M F o s f a t o
Mcdc - Junho, 1968
i
Rev. S oc. Brcxs. M e d . T ro p . 139
ç ã o a 56° C p o r 30 m in u to s , f o r a m d a m e s m a m a n e i r a a c im a d e s c r ita in v e s tig a d o s .
E m a lg u n s so ro s, c o m o m o s tr a d o n a F i g u r a 2, d e m o n s tr o u - s e a p r e s e n ç a d e s u b s tâ n c i a s a s q u a is c o n d u z ira m a u m a f o r te u n iã o d o v íru s d o a d s o r v e n te . A p o siç ã o d a c u r v a d e e lu iç ã o c o rre s p o n d e a p r o x im a d a m e n te à p o s iç ã o d a s c u r v a s d e e lu iç ã o d o s c o m p le x o s d e v íru s c o m a n tic o r p o s tip o
19 S . U m d e sv io d a c u r v a p a r a v a lo re s m a io r e s d o q u e 0,06 M d e f o s fa to n ã o foi o b s e rv a d o n e m m e sm o c o m a a d iç ã o de q u a n tid a d e s m a io r e s d o sô ro b o v in o , a p ó s u m a p r im e ir a in c u b a ç ã o , a 37° C p o r u m a h o r a . A c o m p a ra ç ã o e n tr e os so ro s e x a m i n a d o s m o s tr a u m a d if e re n ç a in s ig n ific a n te n a s c u r v a s d e e lu iç ã o o b tid a s .
5 2 DIL. SORO
F ig u r a T itu la ç ã o . d e u m s ô r o i n i b i d o r n o s is te m a gel e h i d r o x id o d e a l u m ín io O .n c e n tr a ç ã o d e f o s f a to = O.Olfi M . V a lo r 100% = e lu iç ã o do u m a m i s t u r a v i r u s - s ô r o dc f/o z c rro . A d i l u i ç ã o d o s ô r o d<* 1 /5 2 r e p r e s e n ta u m a U IC (u n id a d e , i n i b i d o r a c r o m a t o g r á f i c a ) .
A a tiv id a d e p r e s e n te n o s so ro s b o v in o s é q u e m o d if ic a a e lu iç ã o d o p o lio v íru s tip o 1 e p o d e ta m b é m s e r t i t u l a d a n o m e sm o s is te m a d o g e l d e h id ró x id o d e a lu m ín io , d e sd e q u e s e ja m a n t i d a u m a c o n c e n tr a ç ã o d e fo s f a to n a q u a l h a j a s e g u r a m e n te a d s o r - ç ã o a o g e l e s e j a o sô ro d ilu íd o c o n v e n ie n te m e n te . A p o s iç ã o d a c u r v a p a s s a e n tã o a s e r fu n ç ã o d a d ilu iç ã o d o s ô ro . C om o t í tu lo do sô ro c o n s id e r a - s e a d ilu iç ã o q u e c a u s a u m a e lu iç ã o d e 50% n o c o n tr o le . N e s ta d ilu iç ã o o s ô ro c o n té m p o r d e fin iç ã o , u m a u n id a d e in ib id o r a c r o m a to g r á f ic a
(U IC ) p o r m ililitr o .
3 — C o m p a r a ç ã o d a a t i v i d a d e i n i b i d o r a e m t e s t e d e n e u t r a l i z a ç ã o e e m t e s t e d e a d s o r ç ã o e m g e l .
É n e c e s s á rio p r im e ir a m e n te p ro v a r q u e a m e s m a s u b s tâ n c ia q u e m o s tr a s u a a t i v id a d e n o te s te d e c r o m a to g r a f ia e m g el é c a p a z d e in ib ir a m u ltip lic a ç ã o d e v íru s em te s te s d e n e u tr a liz a ç ã o .
a — C o r r e l a ç ã o ã e t í t u l o s
140 Rev. S oc. B ras. M e d . T rop VoL II — N* 3
< 1 :4 1:4 f. » 1:16 1:32 V.SÍ. 1:12»
T í t u lo no S is t e m a G e l H id r. AL.
F i g u r a 4 : — T it u l a ç ã o d o 20 s ô r o s b o v in o s e m te s te s d e n e u t r a l i z a ç ã o e m c é lu l a s d e r i m d e m a c a c o ( te s te em" t u b o s = l e i t u r a n o d i a ) e p a r a l e l a m e n t e e m s is te m a g e l d o h i d r o - x id o d c a lu m í n i o , u s a n d o - s e a a m o s tr a M a h o n e y d e p o l i o v í r u s .
F ra ç õ e s ( 2 m l )
Mcric - Junho, 1968 R ev. S oc. B ras. M e d . T ro p . 141
d e v e s e r c o n s id e r a d o c o m o p r im e ir a i n d i c a ç ã o d e q u e a a tiv id a d e i n v i t r o e s tá li
g a d a d ir e ta m e n te a o in ib id o r .
b — U m a c o r re la ç ã o s e m e lh a n te r e a liz a d a c o m a s fra ç õ e s ;'c o lh id a s a p ó s a s e p a r a ç ã o e m D E A E -C elu lo se d e u m s ô ro in ib i d o r d e b o v in o , m o s tr a (F ig u r a 5) q u e n a f r a ç ã o 7 S n e n h u m a a tiv id a d e in ib id o r a p o d e s e r d e te r m in a d a , p o ré m n a s fra ç õ e s c o lh id a s p o s te r io r m e n te c o r r e s p o n d e n te s a s m a c ro g lo b u lin a s , u m e fe ito in ib id o r é c la r a m e n te d e m o n s tr a d o . A ssim o b s e rv a -s e q u e a a tiv id a d e in ib id o r a e n c o n tr a d a n o s d o is s is te m a s d e te s te , i n v i t r o e i n v i v o ,
d e m o n s tr a - s e n a s m e s m a s fra ç õ e s d o sôro, o q u e é u m a in d ic a ç ã o a m a is d e q u e se t r a t a d a m e s m a s u b s tâ n c ia .
c — P o lio v íru s tip o 1, a m o s tr a M a h o n e y , fo i n e u tr a liz a d o a tr a v é s o sô ro d e b o v in o n.o 8, p o ré m u m a m u t a n t e em p re s e n ç a d ê s te sô ro e q u e c h a m a r e m o s b o 8 é r e s is te n te à a ç ã o d o sô ro a c im a . Ê ste f a to p o d e s e r o b s e rv a d o n a f ig u r a 6 o n d e é a p r e s e n ta d a a c in é tic a d a n e u tr a liz a ç ã o d a s d u a s v a r ia n te s d e v ír u s . A a m o s tr a M a h o
n e y bo ! é in a tiv id a d a p e lo sô ro b o v in o n .° 8 e m c ê rc a d e u m lo g a ritm o (O c a r á te r d a f r a ç ã o r e s id u a l n ã o in a tiv a d a p e lo sô ro s e rá p o s te r io r m e n te e s t u d a d o ) . E m p r e s e n ç a do sô ro d e b e z e rro o m e sm o v ir u s s e r á a p e n a s lig e ir a m e n te a f e ta d o . A a m o s tr a b o 8 n ã o é in a tiv a d a n e m p e lo sô ro d e b e z e rro n e m p e lo sô ro b o v in o n .° 8. (F ig . 6 a ) .
F i g u r a O a: — C in é tic a n a n e u t r a l i z a ç ã o d e a m o s tr a s d e p o l i o v í r u s M a lio n c y s c u s iv r l ( b o + ) e r e s is te n te s (b o 8) e b n t r a o m e s m o s ô r o (S B 8 ) . O s ô r o a g e c o n t r a u a m o s tr a s e n s ív e l e a f r a ç ã o n ã o n e .u tr a liz á v e l é r e c o n h e c í v e l . A a m o s tr a r e s is te n te n a o é a tin g id a
p e lo s ô r o .
O e x a m e d a s d u a s a m o s tr a s d e v íru s a p ó s m a r c a ç ã o c o m isó to p o s fo rn e c e r e s u lta d o s s e m e lh a n te s ( F ig u r a 6 b ) . A a m o s tr a r e s is
te n t e d e p o lio v íru s b o 8 c o m p o r ta - s e d e m a n e i r a s e m e lh a n te n o te s te c r o m a to g rá fic o
142 R ev. S oc. B ras. M e d . T rop. Vol. II — N ? 3
M F o s f a t o
F ig u r a 6 b : — C o m p o r ta m e n to d a s a m o s tr a s M a h o n e y b o 8 e b o 4 - n o s is te m a d e g e l d e h t d r o x id o d e a l u m í n i o . A a m o s tr a r e s is te n te n ã o é l i g a d a a o i n i b i d o r , p o r é m , lig a - s e a o s a n tic o r p o s 10 S e 7 S. A a m o s tr a s e n s ív e l lig a - s c a o i n i b i d o r , b e m c o m o a o s a n t i c o r p o s
11* S e 7 S . C o n tr o le : E lu iç ã o d a s d u a s a m o s t r a s n a p r e s e n ç a d e s ô r o d e b o v i n o .
Mcric - Ju n h o , 1968 R ev. S oc. Bros. M e d . T ro p . 143
Além disso veriíica-se que, ta n to as a m o stra s resisten tes como as sensíveis, con tin u a m sendo n e u tra liz ad a s pelos a n tic o r pos; 19 S e 7 S p rep arad o s em coelhos, o que corresponde e x a ta m e n te ao com portam ento d as m esm as am o stra s em testes de n e u tra li zação em c u ltu ra de tecidos.
4 —
Caracterização do inibidor
As su b stân cias inibidoras do sôro de bo vino foram e stu d ad as com m ais d etalh e vi sando su a caracterização . As titu laçõ es d a
atividade in ib id o ra fo ram realizad as
in
vi-tro,
tendo em v ista u m a m aior ex atid ão . Ofracio n am en to em DEAE Celulose (Figura 5) e o co m p o rtam en to no sistem a de gel de hidróxido de alum ínio (F igura 2) fo rn e ceram as p rim eiras indicações de que o in i bidor p erten ce à classe das m acroglobuli- n a s . A investigação d a sedim en tação do inibidor em g rad ien te de sacarose co n fir m ou e sta h ip ó tese. (Fig. 7 ).
No sistem a de filtração em gel com Se- phadex G-200, com porta-se a su b stân cia inibidora igualm en te como globulina séri- ca do tipo 19 S.
2-M ercapto-E tanol in a tiv a globulinas
do tipo 19 S em bora n ão especificam ente, o que n ão d á ao teste o valor de id en tifica
ção de g lo b u lin as. A ativ id ad e inibidora nos
soros de bovino foi to ta lm e n te d estru íd a após incubação com 2-M ercapto-E tanol. (T abela 1 ). 2 m l de sôro bovino diluídos a 1/3 fo ram m istu rad o s com 2 m l de 2-M er cap to -E tan o l (0,4 M) e guardados um a noi te a 4°C. D esta m istu ra 0,2 m l fo ram m istu rados com 0,2 m l de 32P-Poliovírus m a r cado e incubados d u ra n te u m a h o ra a 37° C. A diciona-se 2 m l de tam p ão fo sfato/T ris, 0,04M, 1,6M de tam p ão H an k s/T ris e 1 m l a e gel de hidróxido de alum ínio. Após 10 m inutos à te m p e ra u tra am biente o tubo foi cen trifu g ad o e a radioatividade do sobrena- d a n te m edida como já descrito. (Tubo A ) . Como controle fo ram p reparados os se g uintes tubos os quais fo ram de m an eira sem elh an te tra ta d o s: Tubo B: 2 m l de sôro de bovino com 2 m l de tam p ão H an k s/T ris; Tubo C: 2 m l de tam p ão H an k s/T ris com 2 m l de 2-M ercapto-E tanol (0,4 M ) ; Tubo D: 2 m l de sôro de bezerro com 2 m l de 2-M ercapto-E tanol (0,4 M ) . Os resultados são ap resen tad o s n a T abela 1.
Após 24 h o ras de ação, o inibidor foi des tru íd o . No tubo A aparece o vírus no so- b ren a d a n te após centrifu g ação do gel de hidróxido de alum inio e no controle B perm aneceu o com plexo v írus-inibidor li gado ao hidróxido de alum ínio. No co n tro le C é d eterm in ad o se o 2-M ercapto-E tanol tem algum a ação n a adsorção do vírus ao hidróxido de alum ínio e em D o v írus elui
» -■-# Otn s id o d c o 'tic o t m 2 6 0 m
X --- - x A liw jd o í# in ib id o ra do soro c o n tra o o lio v ir g s no s is te m a 9 1! d« h id ro *xid o d« a lu m ín io .
144 R ev. S oc. B ras. M e d . T ro p Vol. H — N ' 3
n o r m a lm e n te d o h id r ó x id o ã e a lu m ín io q u a n d o e m p r e s e n ç a d o 2 - M e r c a p to - E ta n o l e u m sô ro n ã o in ib id o r .
T a b e l a 1
A ção d e 2 -M e r c a p to - E ta n o l sô b re s o ro s d e b o v in o in ib id o re s
T u b o A
■■ T u b o B j . . j T u b o C
i
i
T u b o D
786 # (100% )
93 (12% )
1
j 786 ! (100% )
| 726 j (94% )
# Im p u ls o s /M in u to .
5 — I n v e s t i g a ç õ e s s ô b r e a l i g a ç ã o e n t r e o v í r u s e o i n i b i d o r
O s in ib id o re s c o n tid o s n o s s o ro s d e b o v i n o e s tu d a d o s c o m p o r ta r a m - s e c o m o m a - c ro g lo b u lin a s d o tip o 19 S n ã o s o m e n te e m D E A E -C elu lo se, e m f iltr a ç ã o e m g el, e m s e d im e n ta ç ã o e m u ltr a - c e n tr if u g a ç ã o e em p r e s e n ç a d e 2 - M e rc a p to - E ta n o l, c o m o t a m b é m n a m a n e ir a p e la q u a l se lig a m à s u p e r fíc ie d o v ír u s . C o m a a j u d a d o s is te m a d e g e l d e h id ró x id o d e a lu m ín io , in v e s tig o u - -s e a la b ilid a d e do c o m p le x o v ír u s - in ib id o r e m d iv e rso s v a lo re s d e p H , e m c o m p a r a ç ã o a c o m p le x o s s e m e lh a n te s o b tid o s co m v íru s e a n tic o r p o s 7S e 19 S d e c ò e lh o s. :!2P -P o lio v íru s m a r c a d o fo i in c u b a d o com so ro d e b o v in o c o n te n d o in ib id o r, e co m so ro s d e c o e lh o s c o n te n d o im u n e - a n tic o r p o s 7 S e 19 S, t r a t a d o s p o s te r io r m e n te co m d iv e rs o s ta m p õ e s á c id o s e f in a lm e n te e x a m in a d o s n o s is te m a d e g e l-a d s o rç ã o .
M a ic - Ju n h o , 1968 R ev. S o c. B ras. M e d . T rop 145
E n t r e os v a lo r e s d e p H 4,0 e 5,0 d e s f a z - s e a lig a ç ã o e n t r e o v í r u s e o i n i b i d o r e e n t r e o v í r u s e o s a n t i c o r p o s 19 S, d e m a n e i r a q u e o v ír u s , n a s c o n c e n t r a ç õ e s d e f o s f a t o u s a d a s , e lu i d a m e s m a m a n e i r a d o q u e n o c o n t r o l e . O s c o m p le x o s c o n t e n d o a n t i c o r p o s 7 S d e s f a z e m - s e s o m e n t e e m v a l o r e s d e p H m a i s b a i x o s . O i n i b i d o r c o m p o r t a - s e a s s im d a m e s m a m a n e i r a q u e o s a n t i c o r p o s 19 S e m r e l a ç ã o à li g a ç ã o a s u p e r f í c ie d o v í r u s A c i n é t i c a d a n e u t r a l i z a ç ã o e a a n á l i s e d o s p r o d u t o s d e r e a ç ã o e n t r e p o lio v ír u s e s o ro s c o n t e n d o in ib i d o r e s f a z e m s u p o r q u e
o s v ír u s s e n s ív e is à a ç ã o d e i n ib id o r e s a ê le s s e lig a m , e n q u a n t o p a r t í c u l a s r e s i s t e n t e s d e v ír u s p e r m a n e c e m liv r e s n o m e io . P a r a e s c l a r e c e r ê s t e a s p e c to , v í r u s m a r c a d o s f o r a m m i s t u r a d o s c o m in ib id o r e s e e m s e g u id a p r e c i p i t a d o s c o m a n t i g l o b u l i n a d e b o v in o p r e p a r a d a e m c o e lh o s (“ C o o m b s - te s t” ) . O s o r o d e b o v in o u s a d o p a r a a im u n iz a ç ã o d o s c o e lh o s n ã o c o n t i n h a i n ib i d o r p a r a p o lio v í r u s .
O s r e s u l t a d o s p o d e m s e r a n a l i s a d o s n a T a b e l a 2 .
T A B E L A 2
P r e c i p i t a ç ã o d a a m o s t r a M a h o n e y b o + e b o 8 a p ó s i n c u b a ç ã o c o m s ô r o d e b o v in o n .° 8 e s ô r o d e b e z e r r o c o m a n t i g l o b u l i n a d e b e z e r r o p r e p a r a d a e m c o e lh o ( “ C o o m b s - te s t” ) .
bo 3 + S B e z . | b o 8 + S B 8 j Do - S B e z . d o SB8
A . g l. B ov. i 725 # 650 365 310
i
S . B e z . 625 j 625 1 335 63
# I m p /M in . S . B e z . = S ô ro d e b e z e rro A . g l. B o v . = A n ti-g lo b u lin a b o v in a S B 8 -- S ô ro d e b o v in o n . 8
A s a m o s tr a s d e v íru s se n s ív e is b o + fo r a m p r e c ip ita d a s n o te s te q u a n d o lig a d a s a o in ib id o r, p e r m a n e c e n d o n o s o b r e n a d a n te q u a n d o e m p r e s e n ç a d e s ô ro n ã o in ib id o r .
A a m o s tr a r e s is te n te d e v ír u s n ã o fo i p r e c ip ita d a o q u e le v a a c o n c lu s ã o d e q u e e s ta ú ltim a n ã o se lig a a o in ib id o r p elo m e n o s e m q u a n tid a d e d e te c tá v e l p e lo s is te m a d e tr a b a l h o e m p re g a d o .
N a f ig u r a 6a fo i m o s tr a d o q u e u m a d e te r m in a d a f r a ç ã o in fe c c io s a n ã o é n e u t r a liz a d a p e lo in ib id o r . E s ta a tiv id a d e r e s i d u a l q u e e q ü iv a le a c ê r c a d e 10% d o t í tu lo d e v íru s in ic ia l p e r m a n e c e u m e sm o q u a n d o m a io re s q u a n tid a d e s d e so ro f o r a m a d ic io n a d a s à s u s p e n s ã o d e v ír u s .
V is a n d o e s c la r e c e r a n a tu r e z a d e s ta f r a ç ã o , in v e s tig o u -s e se e la lig a - s e a o in ib i d o r i n v i t r o o u n ã o . V íru s m a r c a d o foi
in c u b a d o co m u m so ro in ib id o r. E m s e g u id a a m is tu r a fo i d ilu íd a 1/10 e le v a d a a o s is te m a d e g e l d e h id ró x id o d e a lu m í n io . A ra d io a tiv id a d e e a in fe c c io sid a d e f o r a m d e te r m in a d a s n o e lu a to .
146 R ev. S o c. B ros. M e d . T ro p VoL II — N 9 3
M F o s f a t o
F ig u r a 1 0 : - - T itu la ç ã o d a i n f e c e io s id a d e e m m i s t u r a d e M P - p o l i o v i r u s M a h o n e y e s ô ro b o v in o i n i b i d o r (n'> 4) o u s ô r o d e b e z e r r o l i v r e d o i n i b i d o r , a p ó s c r o m a t o g r a f i a e m g e l d e h k i r o x u lo d e a l u m í n i o .
E . m a x . c o m i n i b i d o r ) : 4 , 6 x 1 0 * P F U / m l ; K. m a x . ( m i s t u r o c o n t r ô l e ) : 4,6 x 1 0 ® I > F l 7 r n l .
Figura
10A possibilidade de que a dissociação do complexo vírus-inibidor te n h a ocorrido de vido ao fa to r diluição é im provável, u m a vez que experiências colaterais m o stra ra m que em m istu ras diluídas 1/100 e assim m a n tid as por 1 a 2 h o ras a n te s d a cro m ato g ra fia m an têm -se seus com ponentes ig u alm en te fo rtem en te unidos, como quando diluí
dos a 1/10.
S u bstâncias contidas ao a g a r adicionado às cu ltu ras p a ra d eterm in ação do títu lo in
feccioso (m étodo de placas) poderiam d e sem p en h ar um papel dissociador do com plexo vírus-inibidor n a experiência a p re se n ta d a n a fig u ra 10. E sta hipótese foi da seguinte m an e ira investigada:
E xtrato s de a g a r p rep aram -se segundo Agor e cols. (4). O p rep aro fin a l n ão d i luído, diluído 1/10 e 1/40, m istu io u -se em
p a rte s iguais com u m a m istu ra virus-sôro inibidor a qual tin h a sido in cu b ad a a n te
rio rm en te a 37» C por u m a h o ra, e em se guida novam ente in cu b ad a n a m esm a te m p e ra tu ra e pelo m esm o tem po. A fração In fecciosa residual foi d ete rm in a d a pelo m é
todo de placas, sendo o a g a r usado n estes testes cuidadosam ente lavado. N enhum a di feren ça pode ser d e te rm in a d a em relação a
um contrôle que n ão c o n tin h a e x tra to de a g a r. Assim sendo, fica indicado que ex tra to s de ag ar, os quais contêm polissaca- rídeos su lfatad o s em razoável quan tid ad e, n ã o exercem ação dissociadora pelos m enos n a s condições estu d ad as.
6 —
Diferentes especificidaães dos inibi
dores de soro de bovino
P agano e cols. (20) m o strara m que exis tem soros de bovinos os quais ap en as con t r a a a m o stra CHAT, a te n u a d a do tipo 1, exercem u m a ação inibidora, não porém c o n tra a am o stra M ahoney.
Mcric - Ju n h o , 1968 R ev. S o c. B ros. M e d . T ro p . 14
F i g u r a 11: b o v i n o s c o n t r a
- • C o m p a r a ç ã o d o t i t u l o q m g e l d e h i d r o x i d o d e a i u m i n i o d c 2 6 s ô r o » d e a s a m o s t r a s M a h o n e y e C H A T d e P o l i o v í r u s .
1 0 0
5 0
ConcsntroçÓo d« fo s fa to O .I6 M T ítu lo do s ô ro n ã o tr o ta d o c o n tra M a hon ey • C H A T T ítu lo d o s ô ro o p ò s a b s o rç ã o com CHAT , c o n tra CHAT t c o n tr a M A H O N E Y . A ---a T it u lo d o s ô ro a p ó s absorção 4 ^ com o a m o s tra M AHONEY c e n tro
CHAT e M A HO NE Y.
1
,
16 2 5 6
D i l . S o r o
148 R ev. S o c. B ros. M e d T ro p . VoL n — N ? 3
A d if e r e n te a ç ã o d e s o ro s b o v in o s c o n tr a a s d u a s a m o s tr a s d e v ír u s d e v e s e r d e v id a a d ife re n te s e s p e c ific id a d e s d e p o n to s d e a d s o rç ã o p a r a os in ib id o re s n a s u p e r fíc ie do v íru s . O c o rre p o r o u tr o la d o a p e r g u n t a se n o s so ro s c o m a tiv id a d e c o n tr a a s
d u a s a m o s tr a s d e v íru s e x is te m r e a lm e n te in ib id o re s d o ta d o s d e a tiv id a d e e s p e c ífic a , ou se ja , se e s ta m o s d ia n te d e m is tu r a s d e in ib id o re s co m d if e r e n te s e s p e c ific id a d e s ou se ê ste s in ib id o re s , p o r e x e m p lo , c o n tê m d u a s e s p e c ific id a d e s p o r m o lé c u la s . E s ta s co n sid e ra ç õ e s le v a r a m à r e a liz a ç ã o d e t e s te s d e a b s o rç ã o d e c a p a c id a d e in ib id o r a se n d o u s a d o s o sô ro n .° 8, o q u a l a p r e s e n ta v a ig u a l a ç ã o in ib id o r a c o n tr a M a h o n e y e C H A T . C om o a p r e s e n ta d o n a f ig u r a 12, a a b so rç ã o d ê s te sô ro c o m C H A T n ã o m o d ific a a p re c ià v e lm e n te o títu lo c o n tr a M a h o n e y e v ic e - v e rs a .
D a e x p e riê n c ia a c im a c o n c lu i-s e q u e o sô ro n .° 8 c o n té m u m a m is tu r a d e in ib i d o res, os q u a is a p r e s e n ta m c a d a u m u m a e s p e c ific id a d e d if e r e n te . A lém d isso , c o n c lu i-s e q u e a s a m o s tr a s M a h o n e y e C H A T n ã o p o ssu e m n e n h u m p o n to d e a d s o rç ã o id ê n tic o e m r e la ç ã o a o s in ib id o re s c o n ti dos n e s te s ô ro .
E m u m a p o p u la ç ã o d e v íru s M a h o n e y fo i p o ssiv el s e le c io n a r u m a a m o s tr a r e s is te n te c o n tr a a ç ã o d o so ro d e b o v in o n .° 8, a m o s tra e s ta q u e p e r m a n e c e u se n s ív e l à a ç ã o d e o u tro s so ro s b o v in o s a tiv o s c o n tr a M a h o n e y . O m e sm o o c o rre u e m r e la ç ã o à u m a m u ta n te r e s is te n te d a a m o s tr a C H A T. D ê ste s re s u lta d o s , p o d e - s e c o n c lu ir a p e n a s , p elo m e n o s a té o m o m e n to , q u e os in ib i d o re s c o n tr a a a m o s tr a M a h o n e y n ã o sã o h o m o g ê n e a s e m r e la ç ã o à s u a e s p e c if ic i d a d e , d e m a n e ir a q u e d e v e s u p o r - s e a e x is tê n c ia d e v á rio s p o n to s d e a b s o rç ã o n a su p e rfíc ie d a p a r tíc u la d o v íru s p a r a os d ife re n te s in ib id o re s .
D ISC U SSÃ O D O S R E S U L T A D O S
D os d iv e rso s in ib id o re s c ita d o s n a li t e r a t u r a os q u a is a g e m s ô b re a m u ltip lic a ção do v íru s d a p ó lio (v e ja I n tr o d u ç ã o ) são os d e s c rito s p o r T a k e m o r i os a té h o je m e lh o r e s tu d a d o s (29) . A p o s s ib ilid a d e d e se re m ê s te s in ib id o re s e s tu d a d o s p o r té c n i c a s id ê n tic a s à s u s a d a s p a r a a d e te r m in a ção d e a n tic o rp o s n e u tr a liz a n te s , fa z s u p o r q u e a a ç ã o d o s in ib id o re s se fa z d ir e ta m e n te sô b re a p a r tíc u la d e v ír u s . P a g a n o e cols.
(21) m o s tr a r a m q u e a a ç ã o in ib id o r a e s tá lo c a liz a d a n a f r a ç ã o m a c r o g lo b u lin a do so ro , a tr a v é s f iltr a ç ã o e m S e p h a d e x G -2 0 0 . A lém d isso , a p r e c ip ita ç ã o d a f r a ç ã o g lo b u li n a ta m b é m p r e c ip ita a a tiv id a d e in ib id o ra .
E s ta s o b se rv a ç õ e s c o n d u z ir a m à h ip ó te s e d e q u e os in ib id o r e s p r e s e n te s n o s ô ro b o v i
n o s e r ia m m a c r o g lo b u lin a s c h a m a d a s a lg u m a s v êzes “ a n tic o r p o s n a t u r a i s ” . E s ta d e n o m in a ç ã o p õ e e m re lê v o n o s so d e s c o n h e c i m e n to d a s u a o rig e m , b e m c o m o d o g r a u d e e s p e c ific id a d e d o a n tíg e n o q u e p ro v o c a seu a p a r e c im e n to . O s “ a n tic o r p o s n a t u r a i s ” sã o e n c o n tr a d o s p o r e x e m p lo n o s ô r j d e c o e lh o s, n ã o s e n d o p o ssív e l d is tin g u i- ío s , sob o p o n to d e v is ta d e s u a n a t u r e z a e c a p a c id a d e d e r e a ç ã o , d o s a n tic o r p o s d o tip o 19 S q u e sã o o b tid o s q u a n d o se i n j e t a n o m e s m o a n im a l p e q u e n a d o se d e p o lio v íru s e se c o lh e o s a n g u e p o u c o s d ia s a p ó s (2 5 ).
O s in ib id o re s p r e s e n te s e m so ro d e b o v in o a p r e s e n ta m p o r é m u m a c a r a c te r ís tic a q u e os d is tin g u e d o s a n tic o r p o s d e m a c r o g lo b u lin a : é p o ssív e l o b te r m u t a n t e s d e p o lio v ír u s a s q u a is n ã o m a is sã o s e n s ív e is à a ç ã o d o s in ib id o re s . E e s ta s m u ta n te s ta n t o p o d e m s e r s e le c io n a d a s e m la b o r a tó r io , c o m o s e r e n c o n tr a d a s n a n a t u r e z a p o p u la ç õ e s d e v íru s r e s is te n te s c o n tr a u m d e te r m in a do s ô ro . Ê s te f a to p o d e s e r u s a d o p a r a e s tu d o s g e n é tic o s d e re c o m b in a ç ã o (13) b e m co m o p a r a id e n tif ic a ç ã o d e a m o s tr a s (2 0 ).
P a r a e s tu d o s c o m in ib id o re s , a s té c n ic a s c o m u n s d e in v e s tig a ç ã o , o u s e ja , a d e te r m i n a ç ã o d a in f e c e io s id a d e re s id u a l a tr a v é s te s te s d e n e u tr a liz a ç ã o e m c u ltu r a d e t e cid o s n ã o sã o re c o m e n d á v e is .
1 — A in o c u la ç ã o d a s m is tu r a s d e v íru s c o m so ro s in ib id o re s e m c é lu la s in tr o d u z v á rio s f a to r e s d e ê rro p r o v e n ie n te s d e s ta s ú ltim a s . P o r e x e m p lo , a d e te r m in a ç ã o do g r a u d e r e s is tê n c ia d e u m a a m o s tr a d e v í ru s a p r e s e n ta r e s u lta d o s b e m d iv e rso s se fô r u s a d a a m u ltip lic a ç ã o e m p r e s e n ç a do sô ro c o n tid o e m p la c a s o u a d e te r m in a ç ã o d a c in é tic a d a n e u tr a liz a ç ã o in c u b a n d o o v ír u s a n te r io r m e n te a o sô ro a n te s d a in o c u la ç ã o n a s c é lu la s p a r a a o b te n ç ã o de p l a c a s .
M a io - Ju n h o , 1968 R ev. S o c . B ros. M e d . T ro p . 149
3 — A d e t e r m i n a ç ã o d a e s p e c i f ic id a d e d e u m d e t e r m i n a d o i n i b i d o r só é p o s s ív e l d e s e r j e a l i z a d a a t r a v é s t e s t e s d e a b s o r ç ã o c o m a m o s t r a s d e v í r u s d e t e r m i n a d a s . P a r a isso s ã o u s a d a s d e p r e f e r ê n c i a a m o s t r a s d e v ír u s n ã o i n a t i v a d a s , a s q u a is , r o e n t a n t o , a o s e r e m i n o c u l a d a s n o s i s t e m a d e c é lu la s , t r a z e m d i f i c u l d a d e s p a r a a l e i t u r a d o s r e s u l t a d o s .
P e lo s m o tiv o s a c i m a e x p o s to s , s e r i a d e g r a n d e u t i l i d a d e o u s o d e u m s i s t e m a p a r a o e s t u d o d a s r e la ç õ e s v í r u s - in i b i d o r , s e m o e tn p r ê g o d e c é l u l a s e m c u l t u r a .
A p lic a m o s n e s t e t r a b a l h o u m m é to d o c r o m a to g r á f i c o , o q u a l p e r m i t e e s t u d a r a lig a ç ã o e n t r e v í r u s e i n ib i d o r e p e r m i t e t a m b é m u m a t i t u l a ç ã o d a c a p a c i d a d e i n ib i d o r a d e u m s ô r o b e m c o m o u m a c a r a c t e r i z a ç ã o d a s s u b s t â n c i a s i n i b i d o r a s p r e s e n t e s . A lé m d is s o , é p o s s ív e l c o m a a j u d a d ê s t e t e s t e m e l h o r c a r a c t e r i z a r a f r a ç ã o r e s i d u a l in f e c c i o s a , s e n d o p o s s ív e l d e m o n s t r a r q u e a m e s m a l i g a - s e o r i g i n a l m e n t e a o i n i b i d o r . F o i a i n d a p o s s ív e l r e a l i z a r t e s t e s d e a b s o r ç ã o d a c a p a c i d a d e i n i b i d o r a d e s o r o s c o m v í r u s n a t i v o t e s t a n d o - s e e m s e g u i d a o r e s t o d e a t i v i d a d e c o m v í r u s m a r c a d o .
O p o n t o d e p a r t i d a d o t r a b a l h o c o n s is t i u e m u m m é to d o d e t r a b a l h o n o q u a l o s c o m p le x o s v í r u s - a n t i c o r p o s s ã o lig a d o s m a i s f i r m e m e n t e a u m g e l d e h id r ó x i d o d e a l u m í n i o d o q u e a v í r u s l i v r e . E s t a lig a ç ã o d e p e n d e p r à t i c a m e n t e c o m e x c lu s iv id a d e d a c a p a c i d a d e d e lig a ç ã o d o a n t i c o r p o p r e s e n t e . (30, 31) .
I n c u b a n d o - s e 32P -p o lio v íru s c o m so ro in ib id o r d e b o v in o , o v íru s ta m b é m se li g a r á m a is f o r te m e n te a o g e l. I n ic ia lm e n te fo i d e m o n s tr a d o q u e o p rin c íp io a tiv o c a p a z d e p ro v o c a r e s ta u n iã o m a is f o r te d o v íru s a o g e l e r a o p r ó p rio in ib id o r, a p ó s f r a c io - n a m e n to e m D E A E -C elu lo se, a tr a v é s t i t u la ç õ e s c o m p a r a tiv a s d e so ro s d e b o v in o s, e o e s tu d o d o c o m p o r ta m e n to d e a m o s tr a s se n s ív e is e r e s is te n te s d e v ír u s . A lém d isso fo i p ro v a d o q u e o in ib id o r u n e - s e a o v íru s a tr a v é s d e p r e c ip ita ç ã o d o c o m p le x o v ír u s - -in ib id o r c o m a n tig lo b u lin a s a d e q u a d a s .
A c a r a c te r iz a ç ã o p o r n ó s f e ita d o s i n i b id o re s d e sô ro b o v in o c o n f ir m a m e c o m p le ta m a q u e la f e ita p o r P a g a n o e c o ls.
(2 1 ). A c r o m a to g r a f ia e m D E A E -C e lu lo se e e m g e l d e h id ró x id o d e A l. f o rn e c e m e le m e n to s d e p r o v a p a r a a p r e s e n ç a d e s e m e l h a n t e s p r o p r ie d a d e s d e s u p e r fíc ie d o s i n i b id o re s e d a s m a c ro g lo b u lin a s 19 S . A lém
d isso a íiltr a ç ã o e m S e p h a d e x m o s tr a u m ta m a n h o s e m e lh a n te , a u ltr a c e n tr if u g a ç ã o m o s tr a u m a ig u a l v e lo c id a d e de s e d im e n ta ç õ e s e a in a tiv a ç ã o p e lo 2 - M e r c a p to -E ta - n o l in d ic a a p re s e n ç a c o m u m d e e s ta b iliz a d o re s m o le c u la r e s . A d isso c ia ç ã o do c o m p le x o v ír u s - in ib id o r p o r b a ix o s v a lo re s de p H c o rre s p o n d e e x a ta m e n te a o q u e o c o rre c o m os c o m p le x o s v ír u s - a n tic o r p o s 19 S . C o m to d o s ê s te s e le m e n to s , é p o ssív e l a f i r m a r , c o m g r a n d e s e g u r a n ç a , q u e a a ç ã o in ib id o r a d o s so ro s b o v in o s e s tá lig a d a a
u m a m o lé c u la d o tip o m a c r o g lo b u lin a . A e s p e c ific id a d e d o in ib id o r c o n s titu i m a té r i a d e d is c u s s ã o . E x is te a p o ss ib ilid a d e d o s p o lis s a c a ríd e o s p r e s e n te s n a m o lé c u la do a n tic o r p o 19 S ( c ê rc a d e 12% ) e x e rc e re m u m a a ç ã o s ô b re a u n iã o v íru s -in ib id o r. A lg u n s p o lis s a c a ríd e o s , co m o s u lf a to d e d e x - t r a n o o u p o lis s a c a ríd e o s e n c o n tr a d o s n o a g a r, e x e rc e m u m a a ç ã o in ib id o ra sô b re p o lio v íru s , a q u a l p a r c ia lm e n te se d ev e a u m a u n iã o d o p o lis s a c a ríd e o a o v íru s (1 7 ). D e n o s s a s p e s q u is a s d e d u z -s e q u e p elo m e n o s o p o lis s a c a ríd io d e a g a r n ã o e x e rc e q u a lq u e r a ç ã o d is s o c ia d o ra s ô b re o c o m p le x o v ír u s - in ib id o r .
A s e x p e r iê n c ia s d e a b s o rç ã o d e s c r ita s s u g e re m a e x is tê n c ia r e a lm e n te d e in ib id o r e s c o m d if e r e n te s e s p e c ific id a d e s o u s e ja in ib id o re s d o s q u a is é p o ssív e l r e t i r a r u m a e s p e c ific id a d e c o n tr a a a m o s tr a M a h o n e y p o r e x e m p lo s e m a l t e r a r s ig n if ic a tiv a m e n te s u a c a p a c id a d e d e u n ir - s e à a m o s tr a C H A T e v ic e -v e r s a .
N e s ta s c o n d iç õ e s, p a r a q u e os in ib id o re s s e ja m c o n s id e ra d o s id ê n tic o s a o s a n tic o rp o s n a t u r a i s to r n a - s e n e c e s s á rio a p e n a s d e m o n s tr a r q u e é p o ssív e l o b tê -lo s a tr a v é s a im u n iz a ç ã o d e a n im a is c o m a n tíg e n o s os q u a is p o s s u a m u m a e s t r u t u r a s e m e lh a n te à s u p e r fíc ie d o v íru s d a p ó lio . P o r v ia p a - r e n t e r a l é p o ssív e l o b te r a n tic o rp o s p a r a o v íru s d a p ó lio e m b o v in o (1 2 ). N ão fo i p o s sív e l a t é a p r e s e n te d a t a i n f e c ta r a n im a is c o m o r e fe r id o v ír u s e n e s s a s c o n d iç õ e s o b t e r u m a fo r m a ç ã o d e a n tic o r p o s (1 4 ). T a m b é m n ã o e x is te m d e s c riç õ e s d e im u n iz a ç ã o p a r e n t e r a l d e b o v in o s c o m a m o s tr a s re s is t e n te s a in ib id o r e s .
