A
RTIGOO
RIGINAL Revista Brasileira de FisioterapiaAção anti-inflamatória da fração lipídica
do
Ovis aries
associado ao ultrassom
terapêutico em modelo experimental
de tendinite em ratos (
Rattus norvegicus
)
Anti-inflammatory action of the
Ovis aries
lipidic fraction associated to therapeutic
ultrasound in an experimental model of tendinitis in rats (
Rattus norvegicus
)
Marcelino Martins1,2, Antonio L. M. Maia Filho1,2, Charllyton L. S. Costa1, Nayana P. M. F. Coelho1,2, Maricilia S. Costa3, Regiane A. Carvalho4
Resumo
Contextualização: Estudos demonstram o efeito benéfico da aplicação tópica de ácidos graxos como agentes cicatrizantes. A fração lipídica do Ovis aries apresenta uma ação anti-inflamatória que acelera o processo de cicatrização. O ultrassom aumenta o fluxo sanguíneo bem como a extensibilidade das estruturas de colágeno e tendões. Objetivos: Analisar a ação anti-inflamatória da fração lipídica do Ovis aries associado ao ultrassom terapêutico (UST) pulsado e à fricção em modelo de tendinite induzida. Métodos: Cinquenta ratos Wistar foram distribuídos nos seguintes grupos: controle, gel Ovis aries – uso tópico – UST pulsátil + loção estéril (oilfree), UST pulsátil + gel Ovis aries, loção estéril (oil free) – uso tópico. Para induzir a tendinite, utilizou-se uma injeção intratendínea de 10µL de colagenase no tendão do calcâneo direito. O tratamento consistiu em aplicações diárias de ultrassom, com os seguintes parâmetros: modo pulsado 10%, frequência de 1 MHz, pulsátil a 10% com intensidade de 0,5W/cm2, durante sete ou 14 dias. Resultados: A variação
do número de células inflamatórias, para os animais tratados por 14 dias, com relação aos grupos controle, UST + oil free e UST +
Ovis aries, apresentou resultados significativos p<0,001. O grupo Ovis aries + massagem e o grupo massagem + oilfree apresentaram resultados significativos, p<0,01. Nos animais tratados por sete dias, observou-se que o grupo UST + Ovis aries, em relação ao controle, é estatisticamente significativo, p<0,05. Conclusão: Pode-se concluir que o tratamento com UST + Ovisaries é mais efetivo que os outros tratamentos, visto que consegue reduzir o número de células inflamatórias no tempo de sete e 14 dias.
Palavras-chave: fisioterapia; reabilitação; movimento; ultrassom; inflamação; tendinite.
Abstract
Background: Studies have demonstrated the beneficial effects of topical application of fatty acids as healing agents. The lipid fraction of Ovis aries have an anti-inflammatory action that accelerates the healing process. Ultrasound increases blood flow and the extensibility of collagen structures and tendons. Objectives: To assess the anti-inflammatory action of the Ovis aries lipid fraction associated to pulsed therapeutic ultrasound and friction in an induced tendinitis model. Methods: Fifty Wistar rats were divided into four groups: control that consisted of
Ovis aries gel for topical use; pulsed ultrasound plus oil free sterile lotion; pulsed ultrasound plus Ovis aries gel; and oil free sterile lotion for topical use alone. To induce tendinitis a 10μL intratendinous injection of collagenase was injected into the right Achilles tendon of rats. Treatment consisted of daily applications of ultrasound using the following parameters: 10% pulsed mode, 10% pulsed frequency of 1 MHz and intensity of 0.5 W/cm² for seven or fourteen days. Results: After 7 days of treatment, only the Ovis aries plus ultrasound group showed statistically significant difference when compared to the control group.The variation in the number of inflammatory cells on animals treated for fourteen days for the control, ultrasound plus oil free, ultrasound plus Ovis aries, Ovis aries plus massage and massage plus oil free groups were statistically significant different, p<0.01. It was observed in animals treated for seven days that the ultrasound plus Ovis aries group was statistically significant better than the control group, p<0.05. Conclusion: It can be concluded that treatment using ultrasound plus Ovis aries
is more effective than other treatments as it produces significantly better reduction on the number of inflammatory cells at 7 and 14 days.
Keywords: physicaltherapy; rehabilitation; movement; ultrasound; inflammation; tendinitis.
Recebido: 09/06/2010 – Revisado: 07/12/2010 – Aceito: 26/04/2011
1 Colegiado de Fisioterapia, Faculdade Integral Diferencial (FACID), Teresina, PI, Brasil
2 Universidade Estadual do Piauí (UESPI), Teresina, PI, Brasil
3 Universidade Vale do Paraíba (UNIVAP), São José dos Campos, SP, Brasil
4 Universidade Nove de Julho (UNINOVE), São Paulo, SP, Brasil
Correspondência para: Marcelino Martins, Coordenação de Fisioterapia, FACID, Av. Rio Poty, 2381, Horto Florestal, CEP 64049-410, Teresina, PI, Brasil, e-mail: marcelinomartins@facid.com.br
Introdução
As lesões dos tendões são comuns na prática esportiva, pressupõe-se que elas correspondam de 30 a 50% do total1. Tais
lesões constituem-se em um grande problema de saúde nos países industrializados, precipitada nos dias atuais pela força de trabalho de uma mão de obra recente, com a ocupação das pessoas exigindo uma série contínua de movimentos repeti-tivos2. Os tendões são estruturas fibrosas, com extremidades
cilindroides ou em forma de fitas resistentes e formados por tecido conjuntivo denso3. A lesão dos tendões pode ocorrer
devido aos mais diversos fatores, como sobrecarga, quando o atleta ou desportista faz um esforço acima de suas possibilida-des, ou por esforço repetitivo de um mesmo movimento, o que pode ocasionar um processo inflamatório. O uso excessivo do tendão poderá levar a um processo degenerativo, comprome-tendo a prática de atividades pelo aparecimento de calcifica-ções na bainha do tendão4.
Os ácidos graxos são compostos que contêm uma longa cadeia hidrocarbonada e grupamento carboxila terminal, apresentando três funções principais: são componentes es-truturais das membranas biológicas; fazem o papel de precur-sores de mensagens intracelulares e, quando oxidados, geram energia – ATP (trifosfato de adenosina)5,6. Existem diversos
estudos que demonstram o efeito benéfico da aplicação tópica de ácidos graxos no tratamento de feridas. São substâncias de baixo custo e amplamente utilizadas como agentes cicatri-zantes pela cultura popular de diversos países, apresentando ainda a propriedade de servir de barreira protetora contra os micro-organismos, evitando a desidratação tecidual além do importante caráter imunomodulador7.
O ultrassom terapêutico (UST) é uma forma não-invasiva de tratamento na reparação de lesões teciduais, sendo o método pulsátil a modalidade mais escolhida por alguns pesquisadores pelos efeitos benéficos, sobretudo, em baixa intensidade8. O efeito térmico do ultrassom gerado pelo atrito
intermolecular nos tecidos ocorre por agitação do meio eletro-lítico dos líquidos intersticiais, tanto da água como dos solutos nela contidos, fazendo com que a onda de ultrassom contínuo seja contraindicada nos processos inflamatórios agudos e trau-matismos recentes, em áreas isquêmicas ou com alterações da sensibilidade. Quanto à resposta do ultrassom na forma pulsada, pela diminuição do efeito térmico, ela é utilizada em outras situações, como a inflamação aguda e subaguda, dor de origem neuropática e edema9.
O ultrassom favorece a penetração transcutânea de várias substâncias, como corticosteroides, dexametasona e hidro-cortisona, em animais; vasodilatador metilnicotinato, em humanos saudáveis, e anti-inflamatório indometacina, em animais10,11. A fonoforese apresenta-se como uma alternativa
favorável por ser uma técnica não-invasiva. Os efeitos térmicos e mecânicos do UST podem levar a alterações físico-químicas dos tecidos biológicos, favorecendo a penetração dos princípios ativos presentes nas substâncias de uso tópico. O aquecimento da área a ser tratada pode aumentar a absorção da medicação nos tecidos, pois ocorre o aumento do fluxo sanguíneo, dila-tação dos folículos pilosos, redução da resistência da pele e aumento da energia cinética da droga, facilitando a absorção. Os efeitos mecânicos do UST agem mesmo que os parâmetros sejam para produzir aquecimento12.
Alguns autores mostraram que o ultrassom é capaz de au-mentar a penetração de alguns fármacos aplicados topicamente. Essa ação do UST, associada a fármacos, vem promovendo in-vestigações nos diversos campos da medicina13. As pesquisas
realizadas nas últimas décadas mostram as lesões tendinosas como uma das principais causas de sofrimento dos trabalhado-res em atividade manual, como também das indenizações tra-balhistas2. A incidência dessas patologias deve-se à exigência de
alta produtividade e qualidade, determinadas pelo trabalho, em detrimento da conservação da saúde do trabalhador. Na maio-ria das vezes, tais patologias se desenvolvem devido à falta de controle do ritmo e à velocidade dos movimentos, associados a maquinários e mobiliários ergonomicamente incorretos14.
O objetivo geral do estudo foi analisar histologicamante a ação anti-inflamatória da fração lipídica do Ovis aries asso-ciado ao UST em modelo experimental de tendinite em ratos.
Materiais e métodos
Foram utilizados, no estudo, 50 ratos machos adultos, da espécie Rattus norvegicus, variedade Wistar (200-250 g), com idade acima de 30 dias, divididos em dois grupos de 25 ratos, com alimentação e água à vontade. O experimento foi realizado no Laboratório de Fisiologia da Faculdade Integral Diferencial (FACID), Teresina, PI, Brasil. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FACID, pelo protocolo nº 492/2008, no dia 11/11/2008, de acordo com a resolução nº 196/96, de 10 de outubro de 1996, do Conselho Nacional de Saúde (CNS).
Grupos experimentais
Os animais foram divididos aleatoriamente em cinco gru-pos, observando-se o período de sete e 14 dias, conforme pe-ríodo de cicatrização, totalizando dez animais por grupo:
• Grupo 1: controle;
• Grupo 2: gel de Ovis aries, uso tópico (massagem);
• Grupo 3: UST + loção estéril (oil free);
• Grupo 4: UST + gel Ovis aries;
• Grupo 5: loção estéril (oil free), uso tópico (massagem).
Indução da tendinite
Inicialmente, os animais foram anestesiados com cloridrato de quetamina a 10%, administrado 0,1 ml para cada 100 gra-mas de peso do animal, associado à mesma dose de cloridrato e xilazina a 2% por via intramuscular, contando com o auxílio de dois colaboradores para segurar o animal.
Para induzir a tendinite experimentalmente, utilizou-se uma injeção intratendínea de 10 µL de colagenase (10mg/ml;
SIGMA; C6885) no tendão do calcâneo direito, usando uma agulha de 30G. A colagenase foi dissolvida em uma solução
salina tamponada estéril de fosfato15.
Preparação do extrato da fração lipídica do
Ovis aries
O procedimento de preparação do extrato de Ovis aries
descrito a seguir foi realizado no Laboratório de Produtos Na-turais do Departamento de Química da Universidade Federal do Piauí (UFPI), Teresina, PI, Brasil. O material adiposo/pro-teico obtido de Ovis aries (caprino) foi submetido à trituração mecânica manual, rendendo 1 kg de material triturado e com fragmentos com dimensões não-superiores a 2 cm. O material adiposo/proteico foi transferido para frasco de extração e, sobre ele, foram adicionados 2l de hexano P. A., marca Vetec. A cada dois dias, o material era filtrado em papel de filtro preparativo, e novo solvente era adicionado ao material, realizando-se um total de três extrações, as quais se deram em temperatura am-biente e com pouca luminosidade. Ao término de cada passo de extração, o filtrado era concentrado sob pressão reduzida a 55°C, em evaporador rotatório. Ao término do processo de concentração do solvente, obteve-se o extrato lipídico de Ovis aries, utilizado no presente trabalho16.
Preparação da loção a 5% de lipídeos de
Ovis aries
Preparou-se uma loção carregada com 5% do extrato lipí-dico de Ovis aries com a finalidade de permitir uma aplicação homogênea sobre os locais lesionados. A loção oil free foi ad-quirida em uma farmácia de manipulação e, então, se adicio-nou quantidade suficiente do extrato lipídico de Ovis aries para estabelecer uma concentração de 5% massa/massa. A consis-tência do preparado foi ajustada com a adição de quantidade suficiente de água destilada. O material foi armazenado em frasco opaco sob refrigeração até sua utilização.
Tratamento da tendinite
Utilizou-se o ultrassom (marca Ibramed, modelo sonopulse) com os seguintes parâmetros: modo pulsado 10%, frequência de
1 MHz, pulsátil a 10% com intensidade de 0,5 W/cm2, método
de acoplamento direto com movimentos oscilatórios numa ERA de 1 cm2, durante 2 minutos. Esse protocolo obedece à
literatura, pois, para lesões superficiais com área pequena, utiliza-se o protocolo acima17,18. O aparelho foi devidamente
calibrado por empresa especializada, antes e após o tratamento proposto, com o intuito de verificar se não tinha havido perda de intensidade durante o tratamento19. Todos os animais foram
tratados diariamente, respeitando o período de sete e 14 dias. O tratamento foi iniciado 24 horas após a indução da tendinite.
Análise histológica
Os animais foram sacrificados após o tratamento, respei-tando o período de cicatrização de sete e 14 dias. Os tendões foram desidratados após fixação e inclusos em parafina; em seguida, foram confeccionados 150 campos para serem cor-tados em micrótomo, de forma semisseriada, com secções de 5 µm de espessura, cinco cortes por animal, para serem
cora-dos com hematoxilina-eosina (H&E) e tricrômico de Masson (TM). A histomorfometria foi realizada com a utilização de um
microscópio óptico binocular, com aquisição de fotos na obje-tiva de 40X, para a diferenciação celular do número de células inflamatórias totais do campo de observação, intratendíneo, utilizando o programa de computador Image J® na sua função
cellconter. Vale considerar que todas as fotos apresentadas nos resultados tiveram o mesmo aumento. Não foi feita diferencia-ção celular e, sim, contadas células totais.
Análise estatística
Os dados coletados foram avaliados quanto ao coeficiente de variação e à distribuição amostral para determinação do teste estatístico, considerando o nível de significância de 5% (p<0,05)20. Realizou-se a análise estatística da variação do
nú-mero de células inflamatórias obtido nos grupos tratados e não-tratados, utilizando-se ANOVA, com pós-teste de Tukey, por meio do programa estatístico GraphPad Prism®, versão 3.0.
Para confecção da barra de rolagem dos gráficos, levou-se em consideração o erro-padrão da amostra. Os dados obtidos apre-sentaram distribuição normal, segundo teste de Kolmogorov-Smirnov.
Resultados
Após análise da Figura 1, comparativo da variação do nú-mero de células inflamatórias foi considerado estatisticamente significativo com valor de p<0,05, porém observou-se não existir diferença estatística significativa quanto ao número de células inflamatórias entre os grupos tratados e não-tratados.
Controle
Óvis aries + massagem UST + Oil free UST + Óvis aries Massagem + Oil free
0 50
Número de células (und - HE7 dias)
100 150 200
Figura 1. Gráfico comparativo da variação (∆) do número de células
inflamatórias após sete dias de tratamento.
*G4 p<0,05 em relação ao G1.
Figura 2. Gráfico comparativo da variação (∆) do número de células inflamatórias após 14 dias de tratamento.
Controle
Óvis aries + massagem UST + Oil free UST + Óvis aries Massagem + Oil free
**p< 0,01 em comparação a G1; ***p< 0,001 em comparação a G1. 0
50
Número de células (und - HE14 dias)
100 150 200
Figura 3. Microscopia do tendão calcâneo de rato. Grupo (3) tratado
com UST+ loção estéril (oil free). Foto A, intratendíneas, sete dias,
coradas com H&E e objetiva de 100X, evidenciando grande celularidade às custas de células inflamatórias (1), fibroblastos (2) e edema (3), o que demonstra tratar-se de tecido de granulação recém-formado. Foto B, intratendíneas, 14 dias, coradas com H&E e objetiva de 100X, evidenciando uma diminuição da celularidade devido à diminuição de células inflamatórias. Os fibroblastos agora predominam e encontram-se mais ordenados (4). Foto C, intratendíneas, encontram-sete dias, coradas com tricrômio de Masson utilizando objetivas de 100X. Foto D, intratendíneas, 14 dias, coradas com Tricrômio de Masson, utilizando objetivas de 40X. As duas últimas fotos evidenciam o amadurecimento do tecido de granulação com o aumento da deposição de matriz extracelular, visto na Foto D, quando comparada com a C.
Figura 4. Microscopia do tendão calcâneo de rato. Grupo (4) tratado
com UST + gel Ovis aries. Foto A, intratendíneas, sete dias, coradas
com H&E e objetiva de 40X, visualizando vasos capilares (5). Foto B, intratendíneas, 14 dias, coradas com H&E e objetiva de 40X. Foto C, intratendíneas, sete dias, coradas com Tricrômio de Masson, utilizando objetivas de 40X, visualizando matriz extracelular – tecido elástico (6). Foto D, intratendíneas, 14 dias, coradas com Tricrômio de Masson, utilizando objetivas de 40X.
Ao se analisar a Figura 2, para os animais tratados por 14 dias, os grupos tratados com ultrassom apresentaram resulta-dos significativos p<0,001.
A Figura 3, Foto A, corada com H&E mostra que, para os
animais tratados durante sete dias, há presença de tecido de granulação em amadurecimento, edema e vasos neoformados, porém em menor quantidade que no tecido de granulação recém-formado, com vasos mais organizados e proliferação de
fibroblastos com deposição de matriz extracelular (ME). Aos
14 dias de tratamento, como ilustrado na Foto B, corada com
H&E, ocorre fibrose em organização, proliferação de fibroblas -tos e vasos mais organizados e em menor quantidade que no tecido de granulação, porém ainda em maior número que no tecido fibroso maduro.
Nos animais tratados por sete dias, corados com TM, Foto C, observa-se deposição de ME de maneira desorganizada,
com fibras mais delgadas que no tecido conjuntivo habitual.
Na Foto D, corada com TM, após 14 dias de tratamento, ocorre área de fibrose com áreas azuis (ME depositada) em maior
quantidade que na área vermelha ( fibroblastos proliferados). A fibrose encontra-se em processo de organização.
Analisando a Figura 4, quanto aos animais tratados por
sete dias, corados com H&E, observa-se, na Foto A, tecido de
granulação em amadurecimento, edema e neoformação vascu-lar, porém em menor quantidade que no tecido de granulação recém-formado. Os vasos também são mais organizados que
no tecido de granulação recém-formado. Há proliferação de fibroblasto e deposição de ME. Após 14 dias de tratamento e
corados com H&E, a Foto B mostra fibrose em organização,
proliferação de fibroblastos, com vasos mais organizados e em menor quantidade que no tecido de granulação, porém ainda em menor número que no tecido maduro.
Para os animais tratados por sete dias e corados com TM,
a Foto C mostra fibras mais delgadas e desorganizadas que no tecido conjuntivo habitual. Para os ratos tratados por 14 dias
e corados com TM, a Foto D mostra áreas de fibrose e outras
vermelhas ( fibroblasto proliferado) e fibrose em organização.
Discussão
A terapia com UST e Ovis aries apresentou resultado signi-ficativo no período de sete dias no que diz respeito ao processo inflamatório. Aos 14 dias de tratamento, observou-se maior
presença de fibroblastos no grupo UST + oilfree e UST + Ovis aries, com tecido colágeno mais organizado, sugerindo a ação anti-inflamatória dessa terapia.
Os autoresrelataram, em estudo, que os ácidos oleico e linoleico, presentes na fração lipídica do Ovis aries, podem ser usados como agentes anti-inflamatórios durante a primeira fase do processo de cicatrização, contribuindo ainda de ma-neira eficaz na aceleração do processo de reparação tecidual7.
Existe a influência da administração tópica dos ácidos
α-linolênico (n-3), linoleico (n-6) e oleico (n-9) no processo de cicatrização de feridas em ratos. Observou-se que, a partir do 5º dia de tratamento, topicamente, com ácidos oleico e lino-leico, houve redução significativa da ferida e inibição de óxido nítrico no local nas primeiras 48 horas21.
Neste trabalho, observou-se uma ação terapêutica im-portante dos ácidos linoleico e oleico, encontrados na fração lipídica do Ovis aries22,23, no processo de cicatrização, cujos
re-sultados da contagem do número de células inflamatórias estão representados na Figura 1. Os resultados obtidos mostram que houve uma diminuição do número de células inflamatórias e evidenciou-se também o poder de aceleração do processo anti-inflamatório, o que está de acordo com a literatura22,23.
Os ácidos graxos têm se mostrado como aceleradores do processo cicatricial, atuando como agentes quimiotáticos para leucócitos, promovendo a angiogênese, como hidratante das feridas24,25.
Os efeitos do UST dependem de vários fatores físicos e bio-lógicos, como: a intensidade; o tempo de aplicação; o estado fisiológico da área a ser tratada e a estrutura espacial e
tempo-ral do campo ultrassônico que vai ser tratado26. Essas variáveis
devem ser entendidas para que se tenha uma correta compre-ensão do mecanismo do UST na ação com o tecido biológico.
A irradiação ultrassônica tem uma importante participação no
processo de cicatrização cutânea, acelerando a reparação teci-dual e colaborando com a velocidade de cicatrização quanto à qualidade do tecido cicatricial29. Essas mudanças incluem
aumento da síntese proteica, mastócitos, granulação, absor-ção de cálcio e mobilidade de fibroblastos que, segundo vários estudos, poderiam acelerar o processo cicatricial27-30.
Os resultados desta pesquisa mostram que a terapia com ul-trassom associado ao Ovis aries apresenta efeito anti-inflamató-rio significativo na fase aguda do processo de inflamação (Figura 1) tratado por um período de sete dias, com relação ao grupo controle. Nesse período da inflamação aguda, ocorre inicial-mente uma resposta vascular, com produção de vasoconstrição pela ação da noradrenalina e contração do endotélio, seguida de vasodilatação, e as células inflamatórias (leucócitos e neutrófi-los) são atraídos para a área da lesão. Nesse momento, os macró-fagos removem os restos celulares e componentes extracelulares alterados, e os fibroblastos iniciam a síntese de colágeno28-30.
Tem-se estudado um melhor entendimento dos ácidos gra-xos poli-insaturados sobre o sistema imune com a finalidade de conhecer a dinâmica dos eicosanoides derivados do ácido
araquidônico na modulação das respostas inflamatórias e na
imunidade, importante para o organismo e para as células31.
O pesquisador32 relata os efeitos positivos do UST na
fo-noforese comparados com os efeitos da aplicação tópica de hidrocortisona no processo de reparo do tendão de Aquiles de rato, após tenotomia. O tratamento demonstrou ser o método mais eficiente, concluindo que o UST estimula a aceleração do processo de reparo tecidual e induz a penetração transcutânea da hidrocortisona.
Este estudo avaliou a aplicação do gel Ovis aries, utilizando o ultrassom pulsátil no processo de aceleração no tratamento da inflamação. O uso concomitante de anti-inflamatórios tópicos na forma de gel e UST vem se tornando uma prática comum nos serviços de reabilitação pelo favorecimento da penetração de substâncias através da via transcutânea13.
Conclusão
O modelo utilizado no presente estudo mostra que o efeito da terapia da fração lipídica do Ovis aries, associado ao ultras-som pulsado e à fricção em modelo de tendinite induzida em
ratos, interfere na cicatrização tendínea. Houve uma variação
do número de células inflamatórias para os animais tratados por 14 dias em relação ao grupo controle, apresentando resul-tado significativo.
Dessa maneira, sugerem-se mais estudos para explicar o mecanismo de ação do UST e da fonoforese bem como validar os parâmetros utilizados.
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