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Alterações morfométricas na retina de camundongos C57BL/6 infectados com Toxoplasma gondii e pesquisa de apoptose

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Academic year: 2017

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(1)

Anna Christina Higino Rocha

Alterações morfométricas na retina de

camundongos C57BL/6 infectados com Toxoplasma

gondii e pesquisa de apoptose.

Belo Horizonte

Faculdade de Medicina da UFMG

(2)

Anna Christina Higino Rocha

Alterações morfométricas na retina de

camundongos C57BL/6 infectados com Toxoplasma

gondii e pesquisa de apoptose.

Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação

em Medicina da Universidade Federal de Minas

Gerais como parte dos requisitos para obtenção do

título de Doutor.

Área de concentração: Oftalmologia

Orientador

: Prof. Dr. Fernando Oréfice

Co-orientador

: Prof. Dr. Anilton César Vasconcelos

Belo Horizonte

(3)

Rocha, Anna Christina Higino.

R672a Alterações morfométrica na retina de camundongos C57BL/6 infectados com Toxoplama gondii e pesquisa de apoptose [manuscrito]. / Anna Christina Higino Rocha. - - Belo Horizonte: 2009.

96f.: il.

Orientador: Fernando Oréfice.

Co-orientador: Anilton César Vasconcelos. Área de concentração: Oftalmologia.

Tese (doutorado): Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Medicina.

1. Toxoplasmose Ocular. 2. Toxoplasma. 3. Apoptose. 4. Dissertações Acadêmicas. I. Oréfice, Fernando. II. Vasconcelos, Anilton César. III. Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Medicina. IV. Título

(4)

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

Magnífico Reitor

Prof. Ronaldo Tadêu Pena

Pró-Reitor de Pós Graduação

Prof. Jaime Arturo Ramirez

Pró-Reitor de Pesquisa

Prof. Carlos Alberto Pereira Tavares

Diretor da Faculdade de Medicina

Prof. Francisco José Pena

Coordenador do Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina

Prof. Carlos Faria Santos Amaral

Coordenador do Curso de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas à Cirurgia e à Oftalmologia

Prof. Edson Samesima Tatsuo

Chefe do Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Fonoaudiologia

Profa. Ana Rosa Pimentel de Figueiredo

Membros do colegiado do Curso de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas à Cirurgia e à Oftalmologia

Prof. Edson Samesima Tatsuo

Prof. Marcelo Dias Sanches

Prof. Alcino Lázaro da Silva

Prof. Márcio Bittar Nehemy

Prof. Marco Aurélio Lana Peixoto

Prof. Tarcizo Afonso Nunes

(5)

A Comissão Examinadora que assina abaixo___________________ a tese intitulada "Alterações morfométricas na retina de camundongos C57BL/6 infectados com

Toxoplasma gondii e pesquisa de apoptose", apresentada e defendida, em sessão pública, por Anna Christina Higino Rocha, para obtenção do Grau de Doutor em Medicina, pelo Programa de Pós-Graduação em Oftalmologia de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais.

____________________________ Prof. Fernando Oréfice Orientador Universidade Federal de Minas Gerais

_____________________________ Prof.Anilton César Vasconcelos Co-orientador Universidade Federal de Minas Gerais

_____________________________ Dr. Roberto Carlos Tedesco Instituto Oswaldo Cruz /Fundação Oswaldo Cruz

_____________________________ Prof. Carlos Eduardo Hirata Universidade de São Paulo

_____________________________ Prof. Wesley Ribeiro Campos Universidade Federal de Minas Gerais

(6)

Suplentes:

__________________________

Dra. Célia Aparecida de Andrade Araújo

__________________________

Dr. Roberto Martins Gonçalves

(7)

"O começo de todas as ciências é o espanto de as coisas serem o que são".

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(9)

AGRADECIMENTOS

À equipe do IOC/FIOCRUZ – Dra. Kátia Calabrese, Dra. Celeste, Dr. Luiz, Dai, Meriele, Leandro, Mari, Lu, Alan – pela fundamental contribuição e pelo carinho com que me receberam. Em especial ao Dr. Roberto Carlos Tedesco, uma pessoa amiga, sempre pronta a ajudar, um cientista brilhante, um exemplo a ser seguido. Sem sua iluminada

presença esse trabalho não seria possível.

À equipe do Laboratório de Apoptose, Profa. Luciana, Laís, Francisco, Núbia, Rafael, Camila, Eloísa. Em especial ao Prof. Anilton, meu co-orientador, pelo carinho, apoio e paciência, Bárbara Laurice Araújo Verçosa e Soraia Silva pela ajuda inestimável.

Ao meu orientador Prof. Fernando Oréfice pela dedicação e competência.

Ao Dr. Miguel Houri Neto pela inestimável ajuda com a análise estatística dos dados.

Especial também é o meu agradecimento ao Prof. Wesley Ribeiro Campos e à Dra. Danuza de Oliveira Machado, que além de profissionais excepcionais, se mostraram muito generosos e amigos ao me ajudarem com o projeto.

À querida Maria Bernadete S. Inocêncio, a, pelo valioso apoio nas horas de angústia. Também à Adriana e à Denimara, sempre presentes e solícitas.

À Alda, Flávia, Thaís, Dra. Célia, Dr. Sidney, Dra. Silvana, Daniel Victor, Mário, Fernanda, Adriana, Gustavo, Roberto, Leandro, Dra. Alba e todos os colegas do setor de uveítes e do São Geraldo.

Ao Dr. Breno Lino, um exemplo de cultura e dedicação.

À Rosemary, pela presença constante e amiga.

A toda minha família, amigos e colegas de trabalho que tornaram essa pesquisa

possível.

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RESUMO

Objetivos. Demonstrar a utilidade da morfometria digital e analizar a apoptose em

retina de camundongos C57BL/6 infectados com Toxoplasma gondii.

Métodos. Vinte camundongos C57BL/6 fêmeas foram divididos em: grupo 1 (n= 8) infectado intraperitonealmente com 30 cistos da cepa ME 49 de T.gondii e grupo 2 (n= 12), o controle, foi submetido a injeção de solução salina 0,9% intraperitonealmente. Os olhos dos animais dos dois grupos foram enucleados no sexagésimo dia após a infecção, fixados e processados para microscopia de luz. Mudanças na espessura da retina e na razão perímetro/área (P/A) das camadas da retina foram analizadas através da morfometria digital.

Resultados. Em camundongos infectados, a retina mostrou aumento de espessura (167,8 ± 24,9 μm versus 121.1 ± 15.4 μm, nos controles) e espessura retiniana aumentada nos focos de retinite (187.7 ± 16.6 µm versus 147.9 ± 12.2 µm fora dos focos de retinite). Foi observada diferença estatisticamente significativa entre a P/A da retina de infectados e não infectados, bem como nas camadas de fotoreceptores, plexiforme externa, nuclear interna e células glanglionares + fibras nervosas (consideradas como camada única). A reação de TUNEL mostrou células marcadas no corpo vítreo, na interface vitreorretiniana e nas várias camadas da retina neurossensorial dos animais infectados, mas principalmente na região perivascular, coincidindo com a localização das células inflamatórias. No grupo controle não foram observadas células marcadas pela reação de TUNEL.

(11)

ABSTRACT

Purpose. To demonstrate the usefulness of digital morphometry and analyze apoptosis in retina of C57BL/6 mice infected with Toxoplasma gondii.

Methods. Twenty C57BL/6 female mice were divided in two groups. Group 1 (n=8), was intraperitoneally infected with 30 cysts of T. gondii ME 49 strain and group 2 (n=12), the control, was subjected to injection of saline 0.9% intraperitoneally. The eyes of mices of both groups were enucleated on the 60th day after infection, fixed and processed for light microscopy. Changes in retinal thickness and the perimeter/area ratio (P/A) of the retinal layers were analyzed by digital morphometry. The TUNEL reaction was performed to research apoptosis.

Results. In infected mice, retina showed increased thickness (167.8 ± 24.9 µm

versus 121.1 ± 15.4 µm, in controls) and increased retina thickness within the retinitis

foci (187.7 ± 16.6 µm versus 147.9 ± 12.2 µm out of the retinitis foci). A statistically significant difference in P/A was observed between infected and uninfected mice retina as well as was observed in photoreceptor layer, outer plexiform layer, inner nuclear layer and ganglionar + nerve fiber layer. In infected mice, apoptotic cells were detected by TUNEL in the vitreous, vitreous-retina interface and various neurosensorial retina layers, but especially in perivascular region, the same place where inflammatory cells were found. In the control group, apoptotic cells were not observed by TUNEL.

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LISTAS DE FIGURAS

Figura 1 – Morfologia da apoptose ...43

Figura 2 – Espessura da retina no foco de retinite...56

Figura 3 – Relação P/A...57

Figura 4 – Olho normal...61

Figura 5 – Cisto de Toxoplasma gondii....62

Figura 6 – Vasculite retiniana e retinite...62

Figura 7 – Migração de células pigmentadas...63

Figura 8 – Desorganização da arquitetura da retina...63

Figura 9 – Desenho experimental da análise estatística dos dados da relação P/A da retina e suas camadas...69

Figura 10 – Análise de variância dos dados de anfractuosidade da retina e suas camadas...69

Figura 11 – Retina de animais não infectados submetida à reação de TUNEL...70

(13)

LISTA DE TABELAS

1 – Estatística simples para a variável contínua espessura da retina...64

2 – Estatística simples para a variável espessura da retina em animais infectados para cada posição...64

3 – Comparação entre as médias da variável espessura da retina para cada posição em animais infectados e não infectados...65

4 – Médias da espessura da retina de animais infectados para cada posição e considerando se a medida foi feita em um foco de retinite ou não...65

5 – Correlações paramétricas de Pearson para espessura da retina em cada posição de medida...65

6 – Comparação entre as médias de espessura em cada posição de medida em animais não infectados...66

7 – Comparação entre as médias de espessura medida no foco e fora do foco de retinite em animais infectados...66

8 – Comparação entre as médias de espessura em cada posição de medida em Indivíduos infectados...66

9 – Estatística simples para a variável P/A da retina e suas camadas...67

10 – Estatística com quebras para a variável P/A, quebra: infecção...68

11 – Testes de normalidade e homocedasticidade da P/A da retina por inteiro...68

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Apaf-1 Apoptosis activating factor 1 – fator ativador de apoptose 1 APC Antigen-presenting cell – célula apresentadora de antígenos

CASPASE Cysteine aspartate cleaving enzime – proteases cisteínicas de ácido aspártico

CETEA Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFMG

CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais da Fundação Oswaldo Cruz

CECAL Centro de Criação de Animais de Laboratório do Instituto Oswaldo Cruz

CFR Camada de fotorreceptores

CGFN Camada de células ganglionares e de fibras nervosas

CMV Citomegalovírus

CNE Camada nuclear externa

CNI Camada nuclear interna

CPE Camada plexiforme externa

CPI Camada plexiforme interna

CTL Célula T CD8+ efetora citotóxica ou citolítica

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DNA Deoxyribonucleic Acid – Ácido Desoxirribonucleico DR Descolamento de retina

EPR Epitélio pigmentar da retina

FADD Fas-associated death domain – domínio de morte associado ao Fas Fas APO1 ou CD95 (Cluster differentiation 95)

Fas L Ligante do receptor Fas

FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz

FR Fotorreceptores

GM-CSF granulocyte-colony-stimulating fator – fator estimulador de colônia de Granulócito

HE Hematoxilina e eosina

HLA Human leucocyte antigens – antígenos leucocitários humanos H2O2 Peróxido de hidrogênio

ICB/UFMG Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais

Ig Imunoglobulina

IL Interleucina

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iNOS Enzima óxido nítrico sintetase

IP Intraperitoneal

NK Natural-killer cell – células natural killers

PARP Poly (ADP-ribose) polymerase

RCST Retinocoroidite supostamente toxoplásmica

PBS Phosphate Buffered Saline – tampão de salina fosfatada

SAEG Sistema de Análise Estatística, versão 9.1, 2007, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG

SAS Statistical Analysis System, versão 8.0, SAS Institute, Cary, NC, EUA STATA/SE Statistics/Data Analysis, versão 10.0, College Station, Texas, EUA TCPN Toxoplasmose congênita pós natal

TCR T Cell Receptor – receptor de célula T

TdT Terminal deoxynucleotidyl Transferase – transferase terminal de Desoxinucleotídeo

Th Linfócitos T auxiliares (helper), ou padrão de resposta imunológica TNF-α Tumor Necrosis Factor-α – fator de necrose tumoral alfa

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TRAIL TNF related apoptosis inducer ligand - ligante indutor da apoptose relacionado ao TNF

(18)

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO...19

REVISÃO DA LITERATURA...23

1 Histórico...24

2 O Toxoplasma gondii....25

3 A Toxoplasmose...28

3.1 Epidemiologia...28

3.2 Resposta imune ao Toxoplasma gondii...30

3.2.1 Imunidade Inata...30

3.2.2 Imunidade Celular...30

3.2.3 Imunidade Humoral...32

3.3 Apresentação clínica...33

3.4 Patologia...35

3.4.1 Toxoplasmose ocular...36

3.4.2 Toxoplasmose ocular no modelo experimental...38

4 Apoptose...41

4.1 Apoptose na toxoplasmose...47

4.2 Apoptose na toxoplasmose ocular...49

OBJETIVOS...50

MATERIAIS E MÉTODOS...52

1 Animais...53

2 Parasitas...53

2.1 Isolamento e purificação dos cistos...53

3 Infecção...54

4 Processamento das amostras...54

5 Morfometria...55

5.1 Mensuração da espessura da retina...55

5.2 Relação perímetro/área da retina...56

5.3 Análise estatística...57

6 Reação de TUNEL...58

RESULTADOS...60

1 Descrição da morfologia do olho normal (grupo controle)...61

(19)

3 Morfometria...64

3.1 Espessura da retina...64

3.2 Relação perímetro/área da retina e suas camadas...67

4 Pesquisa de Apoptose...70

DISCUSSÃO...73

CONCLUSÕES...78

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...80

(20)
(21)

O Toxoplasma gondii é um dos mais bem sucedidos parasitas protozoários, estabelecendo infecções agudas e crônicas em praticamente todos os animais de sangue quente (TENTER et al., 2000). Em humanos saudáveis, a infecção é assintomática em 70% dos casos. Em contraste, em indivíduos imunossuprimidos, tais como portadores da SIDA e pacientes em uso de quimioterápicos ou imunossupressores, a toxoplasmose aguda causa uma infecção potencialmente letal (REMINGTON & McLEOD, 1992; TENTER et al., 2000). Além disso, a toxoplasmose congênita pode causar dano fetal grave, podendo culminar em aborto espontâneo (PETERSEN et al., 2001).

O T. gondii é um parasita intracelular obrigatório e por isso é totalmente depende da formação de um nicho dentro da célula infectada onde possa replicar-se, adquirir nutrientes e neutralizar as defesas do hospedeiro (SINAI e JOINER, 1997).

Apesar da relativa eficiência da imunidade celular, essencial na atividade antiparasitária, o hospedeiro não é capaz de se livrar da infecção. Vários fatores contribuem para a habilidade do parasita em estabelecer e manter uma infecção persistente em hospedeiros imunocompetentes, incluindo alterações na apoptose de populações específicas de células hospedeiras (HEUSSLER et al., 2001).

A apoptose exerce, além do seu papel essencial durante o desenvolvimento e homeostase de organismos multicelulares, um papel crítico na regulação da resposta hospedeira durante infecção por vírus, bactérias e protozoários intracelulares (WILLIAMS, 1994; LILES, 1997). A fim de facilitar sua disseminação ou sobrevivência, os patógenos intracelulares desenvolvem diversas estratégias para induzir ou inibir a apoptose de células parasitadas e não parasitadas e modular a resposta imune do hospedeiro (LÜDER et al., 2001).

(22)

Já nas células parasitadas, o T. gondii inibe a apoptose (GOEBEL et al.,

1998; NASH et al., 1998; GOEBEL et al., 1999; GOEBEL et al., 2001), o que evita sua destruição junto com a célula parasitada. Essa inibição parece ser importante tanto na fase aguda quanto na fase crônica da toxoplasmose (HEUSSLER et al., 2001).

Apesar de vários estudos mostrarem a importância da apoptose no estabelecimento da interação parasita-hospedeiro, pouco se sabe a respeito da apoptose no olho durante a infecção pelo T. gondii. SHEN et al. (2001) demonstraram que os olhos de camundongos tipo selvagem não infectados expressam constitucionalmente níveis mais altos de moléculas pró-apoptóticas que o cérebro e que a apoptose é mais frequente no olho que no cérebro durante a infecção via intraperitoneal. Nesse trabalho, os autores também sugerem que a apoptose no olho não é dependente do Fas e seu ligante.O Fas, também conhecido como APO1 ou CD95 (Cluster differentiation 95), é um receptor frequentemente expresso na membrana de células do sistema imune e relaciona-se com a deflagração da apoptose quando se liga ao Fas-L (ligante do Fas). Apesar de demonstrarem também aumento da frequência de apoptose no olho durante a toxoplasmose, HU et al. (1999) sugeriram que Fas e Fas-L poderiam ser importantes na deflagração da apoptose no olho durante a infecção intracameral pelo T. gondii, resultado que pode ter sido influenciado pelo trauma ocular provocado pela via de infecção utilizada. Os dois trabalhos estudaram o olho em fases precoces da infecção (do primeiro ao 14o dia após a infecção), diferente desta tese que estuda a fase crônica (60º dia após infecção).

(23)

dados objetivos (numéricos) virtualmente eliminando a variabilidade entre examinadores e facilitando a comparação entre os diversos trabalhos na área.

A retinocoroidite supostamente toxoplásmica (RCST) é a mais importante causa de uveíte posterior em humanos em várias partes do mundo (HOLLAND, 2003) e o padrão ouro para seu diagnóstico é a presença de placa de retinocoroidite satélite a uma cicatriz (sinal de recidiva), ocorrências da fase crônica da infecção.

(24)
(25)

1 Histórico do Toxoplasma gondii

O Toxoplasma gondii foi descoberto no Brasil por ALPHONSO SPLENDORE (1908), ao estudar a morte de coelhos por paralisia. O autor necropsiou vários animais e encontrou corpúsculos parasitários císticos, que inoculados em cães reproduziram a doença. O parasita recebeu o nome de Toxoplasma cuniculi, na ocasião. Simultaneamente, NICOLLE e MANCEAUX (1908) em Tunis, identificaram o parasita num roedor (Ctenodactylus gondii) originário do norte da África, identificando-o como Leishmania gondii. Em 1909, estes autores constataram que se tratava de novo protozoário e modificaram o nome para Toxoplasma, derivado do grego toxon, que significa “arco”, uma alusão à forma do parasita (revisto em Oréfice e Bahia, 2005).

O primeiro caso humano da toxoplasmose foi descrito pelo oftalmologista JANKU (1923), na Tchecoslováquia, ao necropsiar uma criança falecida em decorrência de uma doença disseminada grave, com hidrocefalia, microftalmia e coloboma na região macular. O oftalmologista evidenciou os parasitas na retina da criança, mas não os reconheceu como Toxoplasma gondii, o que foi feito retrospectivamente por LEVADITI em 1928. Segundo ORÉFICE e BAHIA-OLIVEIRA (2005), o primeiro caso de toxoplasmose no Brasil foi descrito por MAGARINOS TORRES (1927) que descreveu o parasita em necrópsia de um paciente com meningoencefalite, miocardite e miosite. O primeiro registro fotográfico foi realizado por BELFORT MATTOS em 1933.

Em 1937 a toxoplasmose ganhou impacto na medicina com o trabalho de WOLF e COWEN que reconheceram o T. gondii como um agente de encefalite em recém-nascidos. Dois anos depois foi descrito um caso fatal de um lactente com encefalite granulomatosa (WOLF et al., 1939). Estes autores também realizaram a primeira transmissão experimental da toxoplasmose do humano para animais.

(26)

do gato doméstico. A descoberta de que o gato é o hospedeiro definitivo do T. gondii

proporcionou a oportunidade de se estabelecer estratégias de prevenção da infecção, especialmente em mulheres grávidas.

PINKERTON e WEINMAN (1940) descreveram um caso fatal da doença adquirida, mostrando que o T. gondii pode ser causa de doença adquirida no adulto. Em 1942, após a análise de um caso de toxoplasmose infantil, PAIGE et al.

descreveram a transmissão vertical do T. gondii.

Somente após a introdução de um teste utilizando azul de metileno (dye test), para a detecção de anticorpos anti-T. gondii em humanos, por SABIN e FELDMAN (1948), foi possível diagnosticar a doença laboratorialmente e possibilitou a realização de investigações epidemiológicas.

A associação do T. gondii com a retinocoroidite em humanos foi feita por WILDER em 1952. WEIMANN e CHANDLER (1954) levantaram a hipótese de que a transmissão horizontal em humanos poderia ocorrer através da presença de cistos em carne mal cozida.

2 O Toxoplasma gondii

Classificação taxonômica: Reino: Protista; Subreino: Protozoa; Filo:

Apicomplexa; Classe: Sporozoa; Subclasse: Coccidia; Ordem: Eucoccidia;

Subordem: Eumeriina; Família: Sarcocystidae; Subfamília: Toxoplasmatine;

Gênero: Toxoplasma.

O Filo Apicomplexa engloba os parasitas intracelulares obrigatórios que infectam quase todos os animais homeotérmicos. O gênero Toxoplasma é formado pela única espécie T. gondii.

(27)

Taquizoíta (tachys = rápido) é a forma que se multiplica rapidamente (FRENKEL, 1973a), capaz de invadir ativamente qualquer célula nucleada do hospedeiro e de multiplicar-se em vacuólos citoplasmáticos (vacúolos parasitóforos). Foi a primeira a ser descrita e sua forma de arco deu nome ao gênero. É intracelular obrigatória e mede cerca de 6 µm de comprimento por 2 m de largura. (DUBEY et al., 1998). É a principal forma na fase aguda da infecção, mas pode ser encontrada na reativação da fase crônica (LUFT, 1989). Multiplica-se por endodiogenia, um processo através do qual duas células filhas se desenvolvem dentro de uma célula mãe (FRENKEL, 1973b). A célula hospedeira rompe-se em determinado momento, liberando os parasitas que alcançarão os diversos órgãos, transportados por macrófagos, linfócitos e granulócitos. As formas taquizoítas são frágeis e não sobrevivem ao suco gástrico (LUFT, 1989; revisto em DUBEY et al., 1998).

Bradizoíta (brady = lento) é a forma de multiplicação lenta (FRENKEL, 1973a). É mais delgada e mede cerca de 7 µm de comprimento por 1.5 m de

largura. O bradizoíta pode ser encontrado no interior dos cistos teciduais, cujo tamanho varia de 10-100 µm. Cistos grandes podem conter até 3000 bradizoítas que se dividem lentamente por endodiogenia (revisto em DUBEY et al., 1998). Os cistos teciduais são característicos da fase crônica da toxoplasmose, mas podem ocasionalmente ser encontrados na fase inicial da infecção (começam a se formar entre o sexto e o oitavo dia de infecção). Em estados de imunossupressão, os cistos teciduais se rompem e os parasitas se proliferam rapidamente. Os cistos teciduais representam uma importante forma de transmissão da toxoplasmose já que persistem ao longo da vida nos tecidos dos animais infectados e podem ser ingeridos por carnívoros, incluindo os humanos. Esta forma é resistente à digestão péptica e sobrevive várias horas após a exposição às enzimas digestivas (DUBEY et al.,1998). Após a ingestão, a parede do cisto é rompida liberando bradizoítas viáveis, capazes de invadir o trato digestivo do hospedeiro (revisto em ORÉFICE & BAHIA, 2005).

(28)

esporulados entre o segundo e o vigésimo primeiro dia após a eliminação, dependendo da cepa e das condições do ambiente. O oocisto esporulado contém oito esporozoítas e é a forma madura e infectante do oocisto, que sob condições favoráveis, pode permanecer infectivo por mais de um ano (revisto em ORÉFICE & BAHIA, 2005). A ingestão de alimentos ou água contaminados com oocistos é provavelmente uma das principais formas de infecção dos herbívoros e humanos.

O T. gondii é um parasita com um ciclo de vida heteroxênico facultativo, que tem sido isolado de animais herbívoros, carnívoros e onívoros. Entretanto, somente nos felídeos (hospedeiros definitivos) o parasita pode completar seu ciclo de vida e produzir oocistos. Os gatos podem ser considerados hospedeiros completos desse parasita já que apresentam o ciclo extra-intestinal ou tecidual (fase assexuada) e o enteroepitelial (fase sexuada). Os demais animais mantêm apenas a fase assexuada (LUFT, 1989; TENTER et al., 2000).

A fase sexuada é iniciada quando um felídeo ingere oocistos ou tecidos infectados com cisto. Após a digestão gástrica, os parasitas (esporozoítas ou bradizoítas) invadem as células epiteliais do intestino delgado e inciam o ciclo enteroepitelial (DUBEY et al., 1970; FRENKEL, 1973b) culminando na eliminação de oocistos nas fezes.

A fase assexuada inicia-se quando o hospedeiro suscetível ingere oocisto ou cisto tecidual, a partir dos quais os parasitas são liberados no estômago. No epitélio intestinal, os parasitas (esporozoítas ou bradizoítas) diferenciam-se em taquizoítas e multiplicam-se rapidamente. Após uma infecção aguda caracterizada pela disseminação dos parasitas pelo corpo, cistos teciduais são formados como resultado da diferenciação das formas taquizoítas em bradizoítas.

As fases sexuadas e assexuadas do ciclo de vida são potencialmente independentes. Particularmente, a fase assexuada pode circular infinitamente entre os hospedeiros intermediários.

A infecção pelo parasita pode ocorrer: 1- através da ingestão água e alimentos contaminados com oocistos (transmissão horizontal) (BENESON et al.,

(29)

cozida (transmissão horizontal) (DUBEY,1989); ou 3- através da transmissão transplacentária de formas taquizoítas (transmissão vertical) (DESMONTS,1985).

Outras formas de infecção têm sido descritas, tais como através do leite materno, transfusões de sangue e hemoderivados; acidentes de laboratório e transplantes de órgãos (SACKS et al., 1982). Além disso, moscas, formigas, baratas e minhocas podem servir de meio de disseminação (DUBEY, 1998; BUXTON, 1990).

3 A toxoplasmose

Apesar de a infecção ser muito comum, a doença é rara em humanos, já que no indivíduo imunocompetente a infecção é geralmente assintomática (REMINGTON

et al., 2001). A infecção pelo T. gondii varia de acordo com a forma de infecção, com a cepa do parasita, com a espécie do hospedeiro e, entre os indivíduos da mesma espécie, com os fatores genéticos e imunológicos (OLLE, 1994; SUZUKI et al., 1995; SIBLEY & HOWE, 1996; WILLIAMS et al., 1978).

Os hospedeiros podem ser classificados em sensíveis ou resistentes. Fazem parte dos resistentes os humanos e ratos, enquanto que os camundongos, hamsters e cobaios podem desenvolver uma toxoplasmose aguda fatal, pertencendo ao grupo dos sensíveis (DARCY & ZENNER, 1993).

3.1 Epidemiologia

(30)

gatos são abundantes e o clima favorece a sobrevivência de oocistos (JONES et al.,

2001). Nos EUA, a soropositividade encontrada pelo terceiro National Health Nutrition Examination Survey, realizado entre 1988-1994, foi de 23% do total de 17658 pessoas avaliadas (RHOTOVA, 2003).

No Brasil, os estudos mostram a prevalência sorológica para o T. gondii

variando entre 50 e 83% da população. Mas no município de Erechim-RS, SILVEIRA

et al. (1988) encontraram soropositividade em aproximadamente 98% das crianças de 10 a 15 anos de idade.

Em relação ao acometimento ocular, a toxoplasmose é considerada a causa mais comum de uveíte posterior em várias partes do mundo, incluindo América do Norte, América do Sul e Europa (HOLLAND, 2003). No Brasil, FERNANDES e ORÉFICE (1996) em um estudo realizado em Belo Horizonte (MG), no período de 1970 a 1993, descreveram que a toxoplasmose foi considerada a principal causa de uveíte, correspodendo a 43,1% dos 7680 casos estudados. Esses mesmos autores demonstraram ainda que a retinocoroidite supostamente toxoplásmica (RCST) representou 72% de um total de 1955 uveítes posteriores.

A prevalência do envolvimento ocular na toxoplasmose adquirida não está bem estabelecida, mas estudos sugerem que o envolvimento ocular raramente ocorre (ROTHOVA et al., 1986). FERNANDES e ORÉFICE (1996) descreveram que de um total de 405 pacientes com retinocoroidite ativa, 5,4% apresentavam IgM positivo para toxoplasmose. NOGUEIRA et al. (1996) encontraram retinocoroidite unilateral em 1 a 2% dos casos humanos da toxoplasmose adquirida. Todavia, tem sido observado que a incidência de toxoplasmose ocular adquirida pode ser alta, dependendo da área geográfica de ocorrência da doença. Segundo SILVEIRA et al.

(31)

3.2 Resposta Imune ao Toxoplasma Gondii

3.2.1 Imunidade Inata

A ativação das células natural-killer (NK), dos macrófagos e das células dendríticas pelo T. gondii é importante para a resistência inespecífica que representa a primeira linha de defesa contra a replicação irrestrita do parasita. Além da atividade antiparasitária, essas células são importantes para ativação da imunidade específica através da apresentação de antígenos e da produção de interleucinas e citocinas.

As células dendríticas são as mais eficientes apresentadoras de antígenos (APC: antigen-presenting cell), expressando moléculas dos antígenos leucocitários humanos (HLA: human leucocyte antigens) classes I e II (HART, 1997).

Os macrófagos apresentam apenas HLA classe II, mas secretam mediadores pró-inflamatórios como interferon-gama (INF-), fator de necrose tumoral alfa (TNF-), fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF),

interleucina-12 (IL-12) e interleucina-15 (IL-15).

As células NK, que derivam da linhagem linfocitária e tem função citotóxica, secretam citocinas (especialmente o INF-) ajudando a unir as respostas inata e

antígeno-específica (BLIS et al., 1999). Antes da ativação da imunidade adaptativa, as células NK são muito importantes para a contenção da infecção, exercendo função efetora independente de células T (SHER, 1993; HUNTER et al., 1994).

3.2.2 Imunidade celular

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cronicamente infectados pelo T.gondii não protege outros camundongos não infectados de uma infecção primária. Além disso, camundongos com supressão na produção de linfócitos B, responsáveis pela imunidade humoral, conseguem controlar a infecção primária pelo parasita (REYES & FRENKEL, 1987). Experimentalmente foi observado que camundongos atímicos (que não possuem células T) não são capazes de desenvolver uma resistência contra o T. gondii. Entretanto, após a transferência dessas células, uma imunidade protetora contra essa infecção foi observada (FRENKEL & TAYLOR, 1982).

As células T originadas no timo são responsáveis pela imunidade celular com a função de destruição e lise das células parasitadas (HAYNES & HEINLY, 1995). Infecções experimentais em camundongos mostram que células T CD4+ e CD8+ são necessárias para evitar a multiplicação parasitária descontrolada (SUZUKI & REMINGTON, 1988; GAZZINELLI et al., 1992). Os linfócitos T CD4+ h (auxiliares ou

helper) são necessários para a geração de células T CD8+ efetoras citotóxicas (CTL) capazes de lisar células-alvo infectadas (GAZZINELLI et al., 1991). Dessa interação formam-se células de memória, tanto para as células T CD4+ quanto para as T CD8+. Enquanto o linfócito T CD8+ parece representar a célula efetora mais importante contra o T. gondii, o linfócito T CD4+ cumpre importante função regulatória (DENKER & GAZZINELLI, 1998).

O T. gondii induz rapidamente a uma resposta imune do tipo 1 mediada por linfócitos T, o que limita a infecção e garante a sobrevivência do hospedeiro (YAP & SHER, 1999). O parasita estimula os macrófagos e as células NK a produzirem IFN-, um potente inibidor da diferenciação dos linfócitos T CD4+ em T CD4+ T helper 2 (Th2). Além disso, a IL-12 produzida pelos macrófagos promove a diferenciação dos linfócitos T CD4+ em T CD4+ Th1. A replicação dos taquizoítas é progressivamente restrita pela liberação de interferon gama (INF) pelos linfócitos T (PFEFFERKORN,

1984; HALONEN et al., 2001).

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células leva a um aumento na multiplicação do parasita nos tecidos. Contudo, camundongos com depleção de células T CD4+ sobrevivem à infecção pelo T. gondii devido à redução da resposta inflamatória (apesar de que alguns destes camundongos sucumbem mais tarde devido a infecção), enquanto os camundongos normais não depletados podem morrer precocemente com uma inflamação hiperimune. Mais recentemente, tem sido descrito que células não-T também estão envolvidas na produção de IFN- no cérebro de camundongos (KANG & SUZUKI,

2001). O fator solúvel mais importante na regulação da resposta imune na toxoplasmose é o IFN-. Sua produção após a infecção pelo taquizoíta pode resultar na imunossupressão transitória do hospedeiro, permitindo que o parasita se estabeleça durante a infecção aguda (CHANNON & KASPER, 1996).

Para limitar a replicação dos taquizoítas, a resposta imune do hospedeiro age paradoxalmente promovendo a sobrevivência do T. gondii através da indução da diferenciação de formas taquizoítas para bradizoítas, as quais podem persistir por toda a vida do hospedeiro.

O T. gondii desenvolve várias estratégias para escapar do sistema imune do hospedeiro: 1) invade, persiste e cresce em diferentes tipos celulares, incluindo macrófagos não ativados; 2) suprime as defesas do hospedeiro através da regulação da produção de fatores solúveis como o IFN-; 3) desfaz a ligação de

imunoglobulinas da sua superfície (LUFT, 1989; CHANNON & KASPER, 1996; ROZENFELD et al., 2003) e 4) interfere nos mecanismos de apoptose das células hospedeiras infectadas e não infectadas (LÜDER et al., 2001; HEUSSLER et al.,

2001).

3.2.3 Imunidade humoral

O T. gondii também induz a uma imunidade humoral nos indivíduos infectados (SHER et al., 1995; TAYLOR et al., 1997; LI et al., 2000). A infecção pelo T.gondii

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anticorpos limitam a replicação do parasita, promovendo a lise do taquizoíta através da ativação da via do complemento e também através da opsonização dos parasitas e do aumento da ação fagocitária dos macrofágos (FILISETTI & CANDOLFI, 2004). Esses mecanismos não oferecem proteção contra parasitas intracelulares, mas anticorpos como IgA secretor podem interferir com a interação inicial do parasita com as células hospedeiras das mucosas (ROBERTS & MCLEOD, 1999).

Na prática clínica, a presença de anticorpos do tipo IgM é considerada como marcador da fase aguda, pois são os primeiros a serem secretados (já na primeira semana de infecção), atingindo níveis elevados em poucas semanas e então reduzindo-se bruscamente até desaparecer. No entanto, em virtude da melhora na sensibilidade dos testes laboratoriais, é relativamente frequente que baixos níveis de IgM residual sejam detectados após a fase aguda. Os níveis de IgG surgem ao final da primeira semana de infecção, ascendem rapidamente e persistem ao longo da vida. Em gestantes com IgM positivo, nas quais é imprescindível que seja determinado se a infecção é recente, com o objetivo de avaliar o risco de infecção fetal, podem ser usados o teste de avidez do IgG, pesquisa de IgA e IgE. (revisto em ORÉFICE & BAHIA, 2005).

3.3 Apresentação clínica

A infecção pelo T. gondii pode ser dividida nas fases aguda, subaguda e crônica (PINKERTON et al., 1940; KRICK et al., 1989).

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detecção de anticorpos IgM. Sua presença é considerada como marcador da fase aguda.

A transmissão do T. gondii da mãe para o feto ocorre em 30 a 40 % dos casos e varia de acordo com a idade gestacional em que acontece a infecção aguda (DESMONTS et al., 1985). Quanto maior a idade gestacional, maior a chance de infecção fetal, porém menor a gravidade da doença congênita. A infecção congênita pode apresentar-se no recém nato como: 1) infecção subclínica com cicatrizes de retinocoroidite, calcificações intracranianas e outros sinais que podem passar despercebidos; 2) doença neonatal que apresenta sinais clínicos bem evidentes ao nascimento como icterícia, exatema, petéquias, equimoses, febre ou hipotermia e sinais neurológicos como a tétrade de Sabin: hidrocefalia e/ou microcefalia, calcificações intracranianas, retinocoroidite e retardo mental, ou 3) doença pós-natal em que a criança nasce aparentemente saudável e desenvolve sintomas dias, meses ou anos após o nascimento. A fase subaguda é mais frequente na forma congênita. Uma vez diagnosticada toxoplasmose aguda em gestante, é imprescindível a identificação da infecção intrauterina pelo T. gondii. O teste de polimerase em cadeia (PCR) do líquido aminiótico tem sido utilizado por ser mais sensível, mais seguro e com resultados mais rápidos do que os exames feitos com o sangue do feto. Entretanto, resultados falso-positivos ou falso-negativos também podem ocorrer no PCR (GUY ET al., 1996; FOULON et al., 1999).

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3.4 Patologia

A liberação dos taquizoítas resulta em destruição tecidual, decorrente da ruptura das células parasitadas. As células infectadas também sofrem a ação da resposta inflamatória do hospedeiro. Tais eventos compõem a patologia observada nos tecidos (KIERSZENBAUM, 1994; HOFF & CARRUTHERS, 2002). Não se sabe ainda se o T. gondii produz toxinas citolíticas. Contudo, a destruição tecidual também não parece ser decorrente da apoptose, uma vez que o parasita induz a célula parasitada a um estado anti-apoptótico (GOEBEL et al., 1998) e inibe a apoptose de células do sistema imune, o que diminui a inflamação.

Como observado em outras doenças parasitárias, a patologia da infecção pelo T. gondii resulta da interação entre fatores do parasita (cepa, tamanho do inóculo, via de infecção, etc) e do hospedeiro (idade, estado nutricional e imunológico, fatores genéticos, etc). Isso explica o amplo espectro da patogenicidade, desde uma infecção inaparente até uma doença aguda fatal, com muitas situações intermediárias (DARCY & ZENNER, 1993).

A infecção pelo T. gondii em humanos é muito comum. Em pacientes imunocompetentes é geralmente assintomática, resultado de uma imunidade duradoura contra a doença. Na fase crônica da toxoplasmose apenas a presença de anticorpos é notada e os cistos persistem ao longo da vida do hospedeiro em diferentes tecidos, na maioria das vezes sem provocar sintomas (DARCY & ZENNER, 1993). Torna-se sintomática apenas naqueles pacientes que apresentam RCST.

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toxoplasmose disseminada têm sido observadas em pacientes com imunodeficiências por várias causas, tais como doença de Hodgkin ou terapia imunossupressiva para outras doenças (HO-YEN, 1992).

3.4.1 Toxoplasmose ocular

A retinicoroidite supostamente toxoplásmica (RCST) é a causa mais comum de uveíte posterior em várias partes do mundo, incluindo regiões da Europa e Américas do Norte e do Sul (HOLLAND, 2003). A prevalência da doença ocular em pacientes infectados pelo T. gondii ainda não está bem estabelecida, mas sabe-se que o envolvimento ocular é mais frequente e mais grave em neonatos e adultos imunocomprometidos (BOSCH-DRIESSEN et al., 2002; SMITH & CUNNINGHAM, 2002; HOVAKIMYAN & CUNNINGHAM, 2002). A transmissão transplacentária ou congênita da toxoplasmose foi a primeira a ser conhecida como causadora das lesões em humanos. Entretanto, a importância da toxoplasmose congênita como causa da doença ocular passou a ser reconhecida a partir dos trabalhos de WILDER (1952) e PERKINS (1973). Estes autores mostraram que 70% das infecções congênitas levarão à formação de cicatrizes corioretinianas, dados confirmados por METS et al. (1997). A prevalência da doença ocular na toxoplasmose adquirida é incerta (WILSON et al., 1980; KOPPE & ROTHOVA, 1989) devido a dificuldade do diagnóstico diferencial com a toxoplasmose congênita pós-natal de aparecimento tardio (TCPN). A RCST é encontrada em 2 a 30% dos pacientes com toxoplasmose adquirida segundo GILBERT & STANFORDT (2000). GLASNER et al. (1992), estudando uma população do sul do Brasil, observaram prevalência pouco usual de toxoplasmose ocular e sugeriram que a inflamação congênita é uma improvável causa para a alta prevalência.

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Manifestações atípicas incluem lesões extensas, eventualmente múltiplas e/ou bilaterais, forma punctata externa, neurorretinite, neurite, forma pseudomúltipla, esclerite e vitreíte sem lesão focal aparente (ORÉFICE &BAHIA, 2005; BOSCH-DRIESSEN et al., 2002; SMITH & CUNNINGHAM, 2002; HOVAKIMYAN & CUNNINGHAM, 2002; LABALLETTE et al., 2002).

A toxoplasmose ocular ativa apresenta-se como um foco bem definido de necrose coagulativa na retina, com a presença de um infiltrado inflamatório difuso na retina e na coróide. A resposta imune à infecção pelo T. gondii no olho é menos conhecida. Essa resposta tende a ser mediada por linfócitos T CD8+ e freqüentemente por uma classe do linfócito T CD4+ Th1. A indução dessa resposta imune depende de fatores que incluem a expressão intraocular do ligante do Fas (Fas L) ou CD-95, membro da família TNF, que pode promover a depleção de linfócitos T ativados no olho. Isto ocorre por apoptose após a interação das moléculas de Fas das células do infiltrado com moléculas de Fas L expressas nas células do parênquima do olho. Além disso, mesmo em circunstâncias normais, o fluido intraocular contém citocinas como o fator de crescimento e transformação beta (TGF) e outros mediadores que têm propriedades imunossupressivas (ROBERTS &

McLEOD, 1999).

Lesões oculares graves, extensas e bilaterais caracterizam-se por edema da retina e diversos graus de inflamação envolvendo as áreas necrosadas. A coróide apresenta alterações vasculares, hemorragias, infiltrados inflamatórios e edema. Pode ocorrer neurite óptica. Células mononucleares contendo parasitas são abundantes na retina e as zonas cicatriciais aparecem como áreas bem delimitadas de atrofia da coróide e da retina (HUTCHINSON et al., 1982). As lesões cicatrizam de forma centrípeta e as bordas desta cicatriz, que podem apresentar cistos, às vezes se apresentam hiperpigmentadas (ROBERTS & McLEOD, 1999). Também podem ocorrer microftalmo, nistagmo, estrabismo, irite e/ou atrofia óptica (HUTCHINSON et al., 1982).

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hipersensibilidade e 3) rompimento de cistos com liberação de organismos invasivos e antígenos.

A aparência das lesões oculares nos pacientes com SIDA (frequentemente extensas, graves e algumas vezes multifocais e/ou bilaterais) pode ser confundida com retinite necrosante viral causada por herpes simples, varicela zoster ou citomegalovírus (CMV). O diagnóstico diferencial é feito, às vezes, através de prova terapêutica, sendo que a toxoplasmose ocular responde rapidamente às terapias com perimetamina e sulfadiazina ou outras terapias antiparasitárias alternativas (HOLLAND, 1988), enquanto a retinite viral responde às medicações antivirais.

3.4.2 Toxoplasmose ocular no modelo experimental

O modelo experimental é muito importante para estudar aspectos da doença que por motivos éticos seriam impossíveis de serem estudados em humanos, além de apresentar a vantagem da possibilidade de controle das condições do experimento (linhagem do hospedeiro, cepa do parasita, tamanho do inóculo, via de infecção e outras), o que não ocorre na infecção natural. Como observado em outras doenças parasitárias, a patologia da infecção pelo T. gondii resulta da interação entre fatores do parasita e do hospedeiro. Assim, os resultados obtidos por diferentes laboratórios dificilmente são comparáveis, uma vez que os modelos experimentais geralmente não são idênticos, já que há variações do animal hospedeiro, via de infecção, cepa do Toxoplasma utilizada para a infecção, condições da cultura, e mesmo no número de passagens do parasita (ZENNER et al., 1998).

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BEVERLEY et al. (1954) descreveram independentemente o surgimento da toxoplasmose ocular após uma injeção de parasitas na câmara anterior dos olhos de coelhos. BEVERLEY (1961) mostrou infiltração coroidiana e presença de cistos de

Toxoplasma em todos os tecidos da úvea de coelhos inoculados com T. gondii na câmara anterior. GARWEG (1998), utilizando a inoculação intravítrea de taquizoítas da cepa BK (avirulenta) em coelhos, observou o desenvolvimento de retinocoroidite e infiltrado inflamatório no vítreo, além de descolamento de retina e catarata que foram consideradas como complicações da via intravítrea. O coelho é freqüentemente escolhido como modelo experimental por se tratar de animal susceptível e com olhos grandes o suficiente para uma boa oftalmoscopia, diferente de animais de menor porte (NOZIK & O’CONNOR, 1971).

Um estudo sobre oftalmite toxoplásmica em animais concluíu que a ocorrência do T. gondii é mais comum na coróide e no corpo ciliar do que na retina, na maioria dos animais, inclusive nos gatos (PIPER et al., 1970). Os componentes celulares das lesões intraoculares consistiam principalmente de macrófagos, linfócitos e alguns plasmócitos, observados principalmente ao redor dos vasos.

PAVESIO et al. (1995) utilizaram o hamster inoculado via intraperitoneal com cistos da cepa ME 49 de T. gondii e encontraram retinocoroidite em ambos os olhos de todos os animais em fotografias do fundo de olho. O exame histopatológico dos olhos mostrou cistos e lesões na retina.

Um modelo animal de pequeno porte é necessário para estudos controlados e de larga escala, para pesquisa do desenvolvimento, progressão e resolução da toxoplasmose ocular em resposta aos vários tratamentos. Estudos no modelo murino têm sido amplamente utilizados devido a maior facilidade de obtenção dos animais, especialmente quando são utilizados animais mutantes, o que ocorre frequentemente em experimentos na área de imunologia.

O olho do camundongo, bem como do humano, é composto por três túnicas: túnica externa (esclera, limbo e córnea), túnica média ou úvea (íris, corpo ciliar e coróide) e túnica interna (retina)

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(melanina); 2) camada de fotorreceptores, que contém o segmento externo dos fotorreceptores (FR) sensível à luz; 3) membrana limitante externa, uma linha tênue, acelular, de coloração rósea à coloração por HE e que separa as camadas de FR e a camada nuclear externa; 4) camada nuclear externa, formada pelos núcleos dos FR; 5) camada plexiforme externa, onde ocorrem as sinapses entre os FR e as células bipolares e horizontais; 6) camada nuclear interna, composta pelas células bipolares, horizontais, amácrinas e células gliais de Müller; 7) camada plexiforme interna, região onde ocorrem as sinapses entre as células bipolares, as ganglionares e as amácrinas; 8) camada de células ganglionares; 9) camada de fibras nervosas e 10) membrana limitante interna, que não é vista neste cortes. Nas camadas internas (de 6 a 10) estão localizados os vasos da retina, formados por endotélio tênue.

DUTTON & HAY (1983) evidenciaram em olhos de camundongos congênitamente infectados uma destruição tecidual que variou de pequena a total com calcificação distrófica. Entretanto, alguns camundongos não apresentaram nenhuma anormalidade.

TEDESCO et al. (2005) demonstraram que camundongos C57BL/6 submetidos à instilação conjuntival de 5 x 103 bradizoítas da cepa ME 49 de T. gondii desenvolvem toxoplasmose ocular progressiva semelhante a que ocorre nos camundongos infectados por injeção intra-vítrea, porém sem as lesões no cristalino e retina decorrentes desta última via de inoculação.

Experimentos com o modelo murino indicam o INF como a citocina crucial

para resistência contra o T. gondii (GAZZINELLI et al., 1994; GRAVILESCU & DENKERS, 2001). Estudos mostram que o TNF-α exerce ação sinérgica com o INF na defesa contra o T. gondii (GAZZINELLI et al., 1994). IL-10 age regulando negativamente a produção de INF em camundongos C57BL/6 e BALB/c, sendo

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compararam o nível sérico e na câmara anterior de diversas citocinas durante a infecção pelo T. gondii em camundongos C57BL/6. Apesar dos muitos estudos na área, os mecanismos imunes que controlam a toxoplasmose ocular ainda não estão totalmente claros.

4 Apoptose

Do ponto de vista morfológico e bioquímico, a apoptose é uma forma distinta de morte celular, geneticamente programada, que elimina células indesejadas (supérfluas ou defeituosas) (LÜDER et al., 2001). É filogeneticamente antiga, presente em todos os organismos multicelulares (GAVRILESCU LC & DENKERS, 2003a). É um processo ativo, dependente de energia, com controle intrínseco, influenciado por fatores externos.

KERR et al. (1972), foi quem primeiro descreveu a apoptose como forma distinta de morte celular, e propôs o termo apoptosis (originado do grego) para denominá-la. O termo significa “queda” ou “separação” e foi utilizado em analogia à queda das folhas das árvores no outono, uma alusão ao papel da apoptose como reguladora da população celular (CUMMINGS et al., 1997).

Vários aspectos diferenciam a apoptose da necrose: 1) a apoptose é um processo ativo, que necessita de energia e é caracterizada por uma cascata de eventos bioquímicos decorrente da ativação e expressão de genes específicos e síntese de proteínas; 2) na apoptose não há extravazamento de conteúdo celular para o interstício e consequentemente não há inflamação e danos às células vizinhas e 3) enquanto a necrose envolve grupos de células, a apoptose é um processo que afeta a célula individualmente (WILLIE et al., 1980; SEARLE et al.,

1982).

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citoplasma e aparecem protuberâncias na superfície externa da célula (zeiose – FIG 1B, C e D). As organelas tornam-se compactas, mas permanecem estruturalmente intactas. Ocorre a fragmentação nuclear (FIG 1E) e a formação dos corpos apoptóticos a partir das protuberâncias na superfície celular (FIG 1F). Alguns corpos apoptóticos contêm mais de um fragmento nuclear enquanto que outros contêm apenas elementos citoplasmáticos (SEARLE et al., 1982).

Os corpos apoptóticos são rapidamente fagocitados por células vizinhas (FIG 1G), bem como por macrófagos, monócitos, células epiteliais, endotélio vascular e células tumorais. A apoptose é um processo que está continuamente acontecendo, mas é raramente observada em animais saudáveis, pois as células apoptóticas são potentes gatilhos da fagocitose e, deste modo, são rapidamente removidas do meio. A eversão da fosfatidilserina (um fosfolípide presente na supefície interna da membrana celular de vertebrados) através da ação das flipases é um importante sinalizador para que corpos apoptóticos e/ou células em apoptose sejam fagocitadas (MARTIN et al., 1995; HACKER, 2000). Outros receptores moleculares, dentre estes moléculas da família das citoadesinas, estão também relacionados com a sinalização para fagocitose específica da apoptose.

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FIGURA 1 – Morfologia da apoptose:

A) Anoiquia; B) Zeiose; C) Condensação da cromatina, formando crescentes; D) Condensação da cromatina, formando o “buraco negro”; E) Fragmentação do núcleo; F) Corpúsculos apoptóticos; G) Canibalismo celular.

Na via extrínseca, ocorre a sinalização do meio extracelular para o intracelular através de receptores de morte na superfície, como o Fas produzido pelas células do sistema imune que se liga à molécula ligante Fas L. Pode acontecer também pela ativação da super família dos receptores do fator de necrose tumoral alfa (TNF R1, TNF R2), pelo seu ligante TNF-α ou pela ligação dos receptores do ligante indutor da apoptose relacionado ao TNF (TRAIL R1, TRAIL R2) ao seu ligante TRAIL. O receptor, após ser ativado pelo seu ligante, trimeriza-se e sua porção citoplasmática se liga a uma proteína adaptada. Essa proteína pode ser a TRADD (TNF receptor apoptotic death domine) no caso do TNF-α, ou a FADD (Fas-associated death domain) no caso do Fas (GAVRILESCU & DENKERS, 2003a). Ocorre então a ativação da cascata enzimática intracelular envolvendo “proteases de cisteína aspartato-específicas” ou “cisteíno-proteases” conhecidas como caspases. As caspases são encontradas como proenzimas em células não estimuladas. Durante a ativação, um prodomínio N-terminal de 3 a 24 kDa é clivado, e a enzima remanescente é dividida em uma subunidade maior (17 a 21 kDa) e uma menor (10 a 13 kDa), que juntas formam a molécula ativa. Inicialmente são ativadas as caspases iniciadoras (caspases 8 e 10) que irão por sua vez clivar a procaspase 3 transformando-a em sua forma ativa, a caspase 3. A caspase 3 (caspase efetora) irá promover os eventos que culminarão com a morte celular (NICHOLSON, 1999).

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gama ou ultravioleta, agentes tóxicos, estresse celular, radicais livres ou falta de fator de crescimento (GREEN & REED, 1998). O citocromo C é normalmente encontrado no espaço entre as membranas externa e interna da mitocôndria, e quando liberado para o citoplasma liga-se a Apaf-1 (apoptosis activating factor 1) que na presença de ATP ativa a caspase iniciadora 9 (GREEN & REED, 1998). A caspase iniciadora 9 ativa a caspase 3 e toda a via a jusante desencadeando a apoptose. A mudança de potencial da membrana mitocondrial e a liberação do citocromo C são regulados pelas proteínas da família Bcl-2 encontradas na membrana externa da mitocôndria, algumas com função anti-apoptótica (Bcl-2, Bcl-xl ou Mcl-1) e outras pró-apoptótica (Bax, Bak ou Bik), são encontradas na membrana externa da mitocôndria (ADAMS & CORY, 1998). Segundo JOZA (2001), a via mitocondrial pode ocorrer também através da ativação do fator indutor da apoptose (AIF), que localiza-se entre as membranas interna e externa da mitocôndria e é liberado para o citoplasma após os sinais de morte. O AIF age independentemente das caspases, uma vez que alcança o núcleo e interage diretamente com o DNA, causando condensação e fragmentação deste, através da ativação de endonucleases (GESKE & GERSCHENSON, 2001).

A via grânulo-dependente é o meio efetor através do qual linfócitos T citotóxicos (CTL) e células NK eliminam células-alvo infectadas. O mecanismo envolve a introdução de granzima produzida pelas CTL e células NK, através de uma proteína com função de poro, a perfurina. As granzimas saltam o esquema convencional de ativação da cascata das caspases e ativa diretamente as caspases iniciadora 10 e efetoras 3 e 7 (THORNBERRY et al., 1997). A granzima pode também clivar diretamente fatores intranucleares, resultando em apoptose caspase-independente. Além disso, pode levar a liberação do citocromo C, ativando a via mitocondrial.

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6 e 7. A detecção através do Western Blot, de fragmentos da PARP é amplamente utilizada para revelar a apoptose em células, tecidos e órgãos (GOEBEL et al., 2001).

Outras enzimas importantes participam da apoptose: 1) a endonuclease endógena, presente no núcleo celular, é ativada pelos íons cálcio e magnésio e atua promovendo a fragmentação internucleossômica do DNA formando fragmentos de 180 a 200 pares de bases (ARENDS et al., 1991); 2) a transglutaminase promove a ligação cruzada entre proteínas citoplasmáticas e membrana celular, tendo como principal finalidade manter a integridade da membrana celular durante a formação dos corpos apoptóticos, impedindo a liberação do conteúdo intracelular para o interstício (ARENDS et al., 1991); 3) a enzima flipase fornece energia e promove a eversão da fosfatidilserina, facilitando o reconhecimento dos corpos apoptóticos pelos fagócitos. As caspases também atuam na eversão da fosfatidilserina (MARTIN, 1995; HACKER, 2000).

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Dentre os estados patológicos podemos destacar aqueles decorrentes do aumento da apoptose, como as doenças degenerativas, ou da diminuição da apoptose, como as doenças expansivas ((GAVRILESCU LC & DENKERS, 2003 a). A apoptose exerce também um papel crítico na regulação da resposta hospedeira durante infecção por vírus, bactérias e protozoários intracelulares (WILLIAMS, 1994; LILES, 1997). A apoptose também está envolvida na patogenia de várias doenças oculares tais como retinose pigmentar, glaucoma, uveítes, catarata e doenças da retina (FERGUSON & GRIFFITH, 2007).

No cristalino, normalmente a diferenciação celular é acompanhada de degeneração nuclear (MODAK et al., 1969, MODAK et al., 1970), similar à degradação oligonucleossomal (APPLEBY & MODAK, 1977) frequentemente descrita na apoptose (WILLIE et al., 1980). Apesar das mudanças, as células do cristalino persistem ao longo da vida do indivíduo, enquanto que as células apoptóticas são, normalmente, potentes gatilhos para fagocitose. Diferentemente também do que ocorre nas células apoptóticas que morrem randomicamente, a diferenciação das fibras cristalinianas seguem um padrão altamente ordenado de progressão temporal. Nos pacientes com catarata, no entanto, o sistema de defesa contra o estresse oxidativo e os raios ultravioleta parece ser deficiente o que leva a apoptose nas células epiteliais do cristalino e subseqüente opacificação lenticular (LI

et al., 1995).

O papel central da hipertensão intraocular na fisiopatologia do glaucoma vem sendo questionada desde que alguns pacientes apresentam perda progressiva de células ganglionares apesar da normalização da pressão ocular (BRUBAKER, 1996), além do que, um sexto dos pacientes que fazem lesão glaucomatosa não apresenta hipertensão ocular (LISEGANG, 1997). Existem evidências histológicas e eletrofisiológicas que demonstram que as células ganglionares são as únicas células acometidas. Vários fatores têm sido implicados na morte das células ganglionares, dentre eles a apoptose (KAUSHIK et al., 2009). Esta nova visão sobre o glaucoma tem levado a esforços em busca de uma terapêutica objetivando neuroproteção, além da tradicional terapia hipotensora.

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população ativa de países desenvolvidos. A retinose pigmentar está relacionada com a perda de função e viabilidade dos bastonetes. A despeito da grande heterogeneidade de alterações genéticas que podem causar a retinose pigmentar, estudos em modelos experimentais em animais de pequeno porte indicam que a apoptose é uma via final comum de morte de células fotorreceptoras (PORTERA-CAILLIAU et al, 1994).

RAO et al. (2008) demonstraram não haver evidências de apoptose em fotorreceptores nas fases iniciais da uveíte autoimune experimental (EAU –

experimental autoimmune uveitis), apesar de a liberação de citocromo C para o citosol estar aumentada. O estudo mostrou também que o nível de alfa A-cristalin aumenta trinta e três vezes no segmento externo dos fotorreceptores e parece proteger estas células contra a apoptose induzida pelo estresse oxidativo da mitocôndria.

Células imunocompetentes ativadas são deletadas por apoptose após a fase aguda da inflamação em diversas doenças, mas na doença de Behçet a inflamação persiste. NAKAMURA et al (1996) mostraram que nesta doença os pacientes com uveorretinite ativa apresentam expressão diminuída de Fas em células T CD4+ e alta expressão nas células T CD8+ se comparados aos pacientes sem uveorretinite ativa e aos controles sem a doença, o que sugere que células T CD4+ ativadas com expressão deficiente de Fas, ou seja que não são deletadas por apoptose, podem ser as responsáveis pela inflamação crônica severa.

4.1 Apoptose na toxoplasmose

(49)

como resposta inata das células infectadas por parasitas intracelulares (WILLIAMS, 1994). Assim, o T. gondii como parasita intracelular obrigatório tem duas razões igualmente importantes para interferir na apoptose das células do hospedeiro. Curiosamente, o T. gondii inibe e induz apoptose nas células do hospedeiro. Inibir a apoptose da célula hospedeira é uma estratégia que permite o desenvolvimento e a sobrevivência intracelular do parasita e a induzir a apoptose das células do sistema imune leva a uma imunossupressão relativa permitindo a sua evasão imune. WEI et al. ( 2002) demonstraram que células dendríticas humanas infectadas pelo T. gondii

são resistentes à apoptose, mas deflagram a apoptose contato-dependente em células T citotóxicas. A infecção aguda pelo T. gondii, tanto em humanos quanto em camundongos leva a uma imunossupressão transitória determinada pela diminuição de anticorpos e de resposta de células T a antígenos homólogos e heterólogos (WING et al., 1983; LUFT et al., 1984; YANO et al., 1987). Dentre outros fatores, a apoptose de linfócitos T desencadeada pelo T. gondii inibe a resposta imune contra o parasita (WEI et al., 2002). Altos níveis de apoptose em esplenócitos têm sido associados com multiplicação parasitária irrestrita o que leva a altas cargas parasitárias em vários tecidos (GRAVILESCU & DENKERS, 2001). A apoptose no baço não se restringe a populações específicas, mas foi detectada em linfócitos T CD4+ e CD8+, linfócitos B, células NK e granulócitos (GRAVILESCU & DENKERS, 2003b).

Estudos sugerem que a interação Fas-Fas L é crucial para a apoptose desencadeada pelo T. gondii. A infecção pelo parasita aumenta a expressão de Fas na placa de Peyer (LIESENFELD et al., 1997), nos esplenócitos e nos olhos (HU et al., 1999). Além disso, nos camundongos mutantes sem o sistema Fas-Fas L a apoptose induzida pelo T. gondii é abolida (LIESENFELD et al., 1997; GRAVILESCU & DENKERS, 2003b). A expressão de Fas-Fas L e a apoptose mediada por Fas-Fas L em camundongos infectados com o T. gondii parecem ser reguladas pela secreção de citocinas pró-inflamatórias, IL-12 e INF-, e podem ser contrabalançadas pela ativação do NF-κB2 (CAAMANO et al., 2000).

A inibição da apoptose nas células parasitadas é descrita em diversos trabalhos (NASH et al., 1998; GOEBEL et al., 1999; CHANNON et al., 2002; PAYNE

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humanos e de camundongos tratadas com diversos indutores de apoptose, incluindo citotoxicidade mediada por CTL, irradiação e abstinência de fator de crescimento (HISAEDA et al., 1997; CHANNON et al., 2002).

4.1.1 Apoptose na toxoplasmose ocular

Apesar de vários estudos mostrarem a importância da apoptose no estabelecimento da interação parasita-hospedeiro, pouco se sabe a respeito da apoptose no olho durante a infecção pelo T. gondii. SHEN et al. (2001) demonstraram que os olhos de camundongos selvagens não infectados expressam constitucionalmente níveis mais altos de moléculas pró-apoptóticas que o cérebro e que a apoptose é mais frequente no olho que no cérebro durante a infecção. Nesse trabalho, os autores também demonstram que não há diferenças no grau de inflamação e de apoptose nos dias 1, 14 e 28 após a infecção nos olhos de camundongos B6MRL/1pr e B6MRL/gld (com defeito na expressão de Fas e Fas L, respectivamente) se comparados aos camundongos selvagens, sugerindo que a apoptose no olho durante a infecção intraperitoneal não é dependente de Fas e Fas L. Ao contrário, HU et al., 1999, demonstraram que a intensidade da inflamação foi maior nos mutantes B6MR/1pr e B6MR/gld que nos selvagens, sugerindo que Fas e Fas L poderiam ser importantes na deflagração da apoptose no olho durante a infecção intracameral pelo T. gondii. Entretanto, este resultado pode ter sido influenciado pelo trauma ocular provocado pela via de inoculação utilizada, ao modificar a resposta inflamatória e à apoptose.

CALABRESE et al. (2007) demontraram que durante a infecção pelo T. gondii

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A presente tese teve como objetivos:

1. Analisar as alterações morfométricas na espessura e na relação perímetro/área da retina na toxoplasmose ocular no modelo murino.

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1 Animais

Camundongos C57BL/6 fêmeas, com peso entre 15 a 18 gramas, fornecidos pelo Centro de Criação de Animais de Laboratório (CECAL) do Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ, Rio de Janeiro – RJ.

2 Parasitas

Cistos tissulares da cepa ME-49 de Toxoplasma gondii isolados do cérebro de camundongos C57BL/6, com aproximadamente 30 dias de infecção foram utilizados para as inoculações intraperitoneais (i.p.). Esta cepa foi mantida através de passagens sucessivas (inoculação intraperitoneal) em camundongos da mesma linhagem.

2.1 Isolamento e purificação dos cistos

Após os camundongos serem mortos em câmara de CO2, o cérebro foi retirado através de método cirúrgico em condições assépticas em fluxo laminar e cortado em pequenos fragmentos em Phosphate Buffer Saline (PBS). Seguiram-se sucessivas passagens utilizando seringa e agulhas de diferentes calibres (18G a 23G), para maceração dos tecidos.

O macerado do cérebro, contendo os cistos tissulares homogeneizados em PBS, foi submetido a passagem por tela separadora de células com malha de 60

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(SIGMA), na proporção de um cérebro para cada 2,5 ml de solução, para a remoção dos restos de tecido cerebral. Esta suspensão foi centrifugada por 10 minutos a 2200 g e o sedimento contendo os cistos foi ressuspenso em meio DMEM. Após homogeneização, nova centrifugação foi realizada durante 10 minutos a 400 g, para a retirada do Dextran. A contagem da suspensão foi realizada entre lâmina e lamínula (24 x 32 mm), na área total da lamínula, ao microscópio de luz (FREYRE, 1995 e POPIEL, 1996). A suspensão foi ajustada para chegar a 200 μl

3 Infecção

Oito camundongos foram infectados com 30 cistos de T. gondii cepa ME 49 em 200 μl de meio EAGLE, intraperitonealmente (IP). No 60o dia os animais foram sacrificados em câmara de CO2 e enucleados. Os olhos foram processados para microscopia de luz.

Os doze animais do grupo controle receberam intraperitonealmente 200l de

PBS sem parasitas e foram sacrificados no mesmo período descrito anteriormente.

4 Processamento das amostras

Após enucleação, os olhos foram seccionados sagitalmente em duas metades (medial e lateral), sendo processada para microscopia de luz.

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e morfometria foram corados com Hematoxilina e Eosina (HE). As lâminas foram observadas em microscópio de luz Zeiss - Axioplan dos Departamentos de Ultra-estrutura e Biologia Celular e de Protozoologia do IOC – FIOCRUZ.

5 Morfometria

As imagens foram digitalizadas em microcâmera (JVC TK-1270/JGB) e transferidas para o analisador de imagens (Kontron Elektronics, Carl Zeiss – KS300 versão 2.0).

5.1 Mensuração da espessura da retina

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FIGURA 2 – Espessura da retina no foco de retinite

5.2 Relação perímetro/área da retina

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camadas limitantes externa e interna não foram consideradas por serem vistas como uma linha muito tênue e, portanto, não ser viável a mensuração de suas respectivas áreas. As camadas de células glanglionares e de fibras nervosas foram analisadas em conjunto devido à pequena espessura de ambas.

‘FIGURA 3 – Relação P/A

5.3 Análise Estatística

Os dados foram submetidos à estatística descritiva, teste de normalidade e de homocedasticidade utilizando os programas SAEG (Sistema para Análise Estatística, versão 9.1, 2007, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG) e SAS (Statistical Analysis System, versão 8.0, SAS Institute, Cary, NC, EUA). Para análise de variância foi utilizado o programa SAS. Para estatística inferencial foi feito o teste de correlação de Pearson, utilizando o programa SAEG para o caso de distribuição normal dos dados e teste de Mann-Whitney para análise não paramétrica dos dados de distribuição não normal.

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