A reação em cadeia da polimerase na detecção da resistência à penicilina em Streptococcus pneumoniae.

A re ação e m cade ia da po lim e ras e n a de t e cção da

resistência à penicilina em

Streptococcus pneumoniae*

Po ly m e ras e chain re act io n us e d t o de t e ct

St re pt o co ccus pn e u m o n iae re sis t an ce

t o p e n icillin

EDUARDO WALKER ZETTLER (TE SBPT) _{ROSANE M. SCHEIBE, CÍCERO A. G. DIAS, PATRÍCIA SANTAFÉ,}

JOSÉ DA SILVA MOREIRA, DIÓGENES S. SANTOS, CARLOS CEZAR FRITSCHER

Intrdodução: O Streptococcus pneumoniae é o mais freqüente agente etiológico de infecções respiratórias adquiridas na co m u n id ad e e su a resist ên cia ao s an t im icro b ian o s t em aumentado nos últimos anos. A determinação da resistência é feita rotineiramente por método lento que depende do crescimen t o em cu lt u ra e det ermin ação da con cen t ração inibitória mínima (CIM). A reação em cadeia da polimerase (PCR) det ect a os gen es respon sáveis pela resist ên cia do Streptococcus pneumoniae a penicilina em cerca de 8 horas.

Objetivo: Comparar a PCR com o método da CIM no diagnóstico da resistência da Streptococcus pneumoniae a penicilina.

Método: Foram estudadas 153 amostras de Streptococcus pneumoniae, isoladas de diferentes sítios anatômicos, usando-se para detecção de mutações nos genes que codificam as proteínas ligadoras de penicilina 1a, 2b e 2x, responsáveis pela resistência à penicilina. A ocorrência das mutações foi correlacionada com a CIM de penicilina, determinada pelo teste de difusão em ágar.

Resultados: A resistência global à penicilina do Streptococcus pneumoniae foi de 22,8% (16,3% de resistência intermediária e 6,5% de resistência alta). Em proporções estatisticamente significativas, as amostras sensíveis à penicilina não tinham mu t ações, as in t ermediárias apen as u ma, geralmen t e n a proteína ligadora de penicilina 2x, e as altamente resistentes tinham mutações nas três proteínas investigadas.

Conclusão: A PCR é um método rápido para a detecção da resistência à penicilina do Streptococcus pneumoniae, que poderá vir a ser utilizado na prática clínica.

J Bras Pneumol 2004; 30(6) 521- 27.

De s crit o re s: St rep t o co ccu s p n eu m o n ia e. Resist ên cia à penicilina/métodos. Reação em cadeia por polimerase.

Backg ro u n d : St rep t o co ccu s p n eu m o n ia e is t h e m o st common etiologic agent of community- acquired respiratory in fect ion s. In recen t years, S. pn eu mon iae resist an ce t o an t imicrobial agen t s has in creased. Min imu m in hibit ory concentration (MIC) is routinely used to determine resistance. Polymerase chain reaction (PCR) detects the genes responsible for Streptococcus pneumoniae resistance to penicillin within approximately 8 hours.

Obje ct ive : To co m p a re t h e PCR a n d MIC m et h o d s in d et erm in in g St rep t o co ccu s p n eu m o n ia e resist a n ce t o p en icillin .

Method: A total of 153 Streptococcus pneumoniae samples, isolated from various anatomical sites, were evaluated in order to detect mutations in the genes encoding pbp1a,

pbp2a and pbp2x, which are responsible for Streptococcus

pneumoniae penicillin resistance. A correlation was found between mu tations an d pen icillin MIP, as determin ed by the agar diffusion method.

Results: Overal Streptococcus pneumoniae resistance to penicillin was 22.8% (16.3% intermediate resistance and 6.5% high resistance). In a statistically significant finding, we observed no mutations in the penicillin- sensitive samples and only one mutation, typically in the gene encoding pbp2x, among the samples with intermediate resistance, whereas mutations in all three genes studied were observed in the high-resistance samples.

Conclusion: For det ermin in g St rept ococcu s pn eu mon iae

resistance to penicillin, PCR is a rapid method of detection that could well be used in clinical practice.

* Trab alh o realizad o n o Lab o rat ó rio d e Bio lo g ia Mo lecu lar d o In st it u t o d e Pesq u isas Bio m éd icas d a Po n t ificia Un iversid ad e Cat o lica d o Rio Gran d e d o Su l, PUCRS

En d ereço p a ra co rresp o n d ên cia :Ed u a rd o Wa lker Zet t ler - Ru a Gen era l Ib á Mesq u it a Ilh a Mo reira , 1 8 0 / 1 4 01 - Bo a Vist a . CEP: 91 3 4 0 - 1 9 0 - Po rt o Ale g re , RS - Te l: 5 5 - 11 3 0 2 9 1 2 01 - E- m a il: e z e t t le r@ p u crs.b r

Re ce b id o p a ra p u b lica çã o , e m 1 9 / 2 / 0 4 . Ap ro va d o , a p ó s re visã o , e m 1 2 / 5 / 0 4 .

INTRODUÇÃO

Em t odo o mu n do, o Streptococcu s pn eu mon iae é o m a is freq ü en t e a g en t e et io ló g ico d e in fecçõ es adqu iridas n a comu n idade qu e acomet em o sist ema resp irat ó rio e est á asso ciad o co m 3 a 5 m ilh õ es d e m o rt es p o r a n o(1 )_{. No s EUA, é resp o n sá vel p o r}

500.000 casos an u ais de pn eu m on ia, 50.000 casos d e b a ct erem ia , 3 .0 0 0 ca so s d e m en in g it e e cerca d e 7 m ilh õ es d e ca so s d e o t it e m éd ia a g u d a(2 ,3 )_.

A resist ên cia do pn eu m ococo à pen icilin a vem aumentando de forma significativa nos últimos anos, part icu larmen t e em países eu ropeu s como Espan ha, Fra n ça e Hu n g ria , o n d e a lca n ça a t é 71 % d e resist ên cia(4,5)_{. Nos EUA, ela chega a at in gir 44% em}

algu n s est ados(6,7)_{. J á n a Ásia, podem os en con t rar}

alarm an t es ín dices de 70% a 78% de resist ên cia em Hon g Kon g, Coréia do Su l e Taiwan(8- 10)_.

No Brasil, algu n s est u dos m ost ram n íveis de resist ên cia próxim os a 20%(11- 13)_{, m as u m t rabalho}

recen t e det ect ou resist ên cia à pen icilin a em 42,1% (26,8% de resist ên cia in t ermediária e 15,3% de alt a resist ên cia) dos isolados oriu n dos de t rês países lat in o- american os (Argen t in a, Brasil e México)(14)_.

A resist ên cia do S. pn eu mon iae aos an t ibiót icos beta- lactâmicos deve- se exclu sivamen te a mu tações n as prot eín as ligadoras de pen icilin as (PLP), qu e são o seu alvo n at u ral, qu e im pedem a ligação e as t orn am in diferen t es aos bet a- lact âm icos, ou seja, dimin u em a afin idade de ligação com essas drogas. Em iso la d o s a lt a m en t e resist en t es o co rre u m a redu ção da capacidade de ligação às m olécu las de an t ibiót icos em pelo men os 3 das 5 PLP exist en t es: PLP 1a, PLP 2x e PLP 2b(15- 17)_.

A d e t e rm in a çã o d a re sist ê n cia é re a liz a d a rot in eiram en t e u t ilizan do- se t est es d e m en su ração d a co n ce n t ra çã o in ib it ó ria m ín im a (CIM) d o a n t i b i ó t i c o t e s t a d o , a t r a v é s d e m é t o d o s la b o ra t o ria is co m o o t est e d e d ilu içã o em á g a r, q u e é o reco m en d a d o p elo Nat io n al Co m it t ee fo r Clin ica l La b o ra t o ry St a n d a rd s. Esse s m é t o d o s apresen t am com o prin cipal in con ven ien t e o t em po n e c e s s á r io p a r a a o b t e n ç ã o d o r e s u lt a d o , g era lm en t e su p erio r a 4 8 h o ra s(1 8 )_{.Ut iliza n d o - se a}

rea çã o em ca d eia d a p o lim era se (PCR) é p o ssível d e t e c t a r - s e a s m u t a ç õ e s r e s p o n s á ve is p e la resist ên cia d o p n eu m o co co à p en icilin a em t em p o b em m a is cu rt o , p ró xim o a 8 h o ra s(1 9 ) _.

Co m o a t u a l crescim en t o d a resist ên cia d o pneumococo, torna- se imperioso o desenvolvimento de uma técnica diagnóstica rápida e confiável, capaz

d e p ro p o rc io n a r u m a t e ra p ê u t ic a p re c o c e e a d e q u a d a a o s c a s o s d e in f e c ç ã o p o r c e p a s resist en t es. Assim , est e est u do t em com o objet ivo prin cipal com parar a PCR com o t est e de dilu ição em ágar e det erm in ação da CIM n o diagn óst ico da resist ên cia do S. pn eu mon iae à pen icilin a.

MÉTODO

No período de jan eiro de 1997 a set embro de 2 0 0 0 , n o Lab o rat ó rio d e Bio lo g ia Mo lecu lar d o In st it u t o d e Pesq u isas Bio m éd icas d a Po n t ifícia Un iversidade Cat ólica do Rio Gran de do Su l, foi realizado est e est u do t ran sversal de prevalên cia. Fo ra m e st u d a d a s 1 9 7 a m o st ra s clín ica s d e S. pneumoniae, identificadas pelas técnicas laboratoriais con ven cion ais, isoladas de qu alqu er sítio an atômico n os laborat órios de microbiologia de set e hospit ais de Porto Alegre (RS), representativos da comunidade local, escolhidos por conveniência, e que colaboraram com o est u do (Hospit al de Clín icas de Port o Alegre, Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre, Hospital da Criança Santo Antônio, Hospital Mãe Deus, Hospit al Moin hos de Ven t o, Hospit al Nossa Sen hora da Con ceição e Hospit al São Lu cas da Pon t ifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul)(18)_{. Foram}

con sideradas amost ras colet adas de u m mesmo pacien t e, simu lt an eamen t e ou em t empos dist in t os. Am o st ra s n ã o id en t ifica d a s co m o p n eu m o co co at ravés dos mét odos con ven cion ais padron izados pelo Nat ion al Comit t ee for Clin ical Laborat ory (18)_{, e}

amost ras sem a iden t ificação do gen e lyt A pela PCR, con forme t écn ica descrit a a segu ir, foram exclu ídas do est u do.

A CIM de penicilina foi medida através do teste de diluição em ágar em meio Mueller- Hinton (Oxoid Unipath Ltd.; Hampshire, Inglaterra) contendo 5% de sangue desfibrinado de carneiro. Os pontos de corte foram aqueles publicados pelo National Comittee for Clinical Laboratory (18)_{: sensíveis (CIM £ 0,06 mg/mL),}

resistência intermediária (CIM de 0,12 a 1,0 mg/mL), e alta resistência (CIM ³ 2,0 mg/mL). A cepa de S. pneumoniae ATCC 49619 foi empregada para controle de qualidade do teste de susceptibilidade(18)_.

As amost ras isoladas n os meios de cu lt u ra foram sim u lt an eam en t e su bm et idas à PCR para det ecção do gen e lyt A do S. pn eu mon iae, con forme descrit o p o r Ub u ka t a e t a l.(1 9 )_{, p a r a c o n f ir m a ç ã o d a}

Co lô n ia s iso la d a s d e S. p n eu m o n ia e fo ra m ret ira d a s d o m eio d e cu lt u ra a t ra vés d e ra sp a g em co m a lça d e p la t in a e co lo ca d a s em t u b o co m 5 0 m l d e á g u a b id est ila d a , p a ra a ext ra çã o d o DNA b a ct eria n o . A seg u ir, era m a d icio n a d o s 5 0 m l d e prot ein ase K. O mat erial era en t ão in cu bado a 50°C d u r a n t e 1 6 h o r a s . Em s e g u id a , e r a f e it a a in at ivação da prot ein ase K, a 95°C por 10 m in u t os. P a r a a s e l e ç ã o d o s i n i c i a d o r e s, f o r a m u t iliza d o s o lig o n u cleo t íd eo s in icia d o res (p rim ers) d e riva d o s d o g e n e lyt A d o S. p n eu m o n ia e, e d o s g e n e s q u e c o d if ic a m a s P LP 2 b e 2 x d e S. p n eu m o n ia e sen síveis à p en icilin a e a PLP 1 a d e S. p n e u m o n ia e r e s is t e n t e à p e n ic ilin a , q u e a p re se n t a va m a s se q ü ê n cia s a se g u ir:

Có d ig o Gen e Seq u ên cia (5 ’- 3 ’)

B1 PLP 2 b ACT CAG GCT TAC GGT CAT T B2 PLP 2 b ACG AGG AGC CAC ACG AAC AC X1 PLP 2 x GTC ATG CTG GAG CCT AAA TT

X2 PLP 2 x AAC CCG ACT AGA TAA CCA CC

A1 PLP 1 a AGG TCG GTC CTA GAT AGA GCT

A2 PLP 1 a GAG CTA CAT AGC CAG TGT CTC

SPN1 lyt A TGA AGC GGA TTA TCA CTG GC SPN2 ly tA GCT AAA CTC CCT GTA TCA AGC G

Foram preparadas du as mist u ras para as reações, u m a con t en do os primers para am plificação dos gen es das PLPs 2b e 2x e a ou t ra con t en do os p rim ers d o s g en es d a PLP 1 a e d o g en e lyt A, conforme descrição a seguir: 5 ml tampão específico

para a Taq DNA polimerase, 2 mM MgCl₂, 1U Taq

DNA polim erase 5 U/ m l (Gibco), 200 m M m ist u ra equ im olar dos n u cleot ídeos t rifosfat ados, 50 pm ol de cada u m dos dois pares de primers.

Para a preparação da am ost ra a ser am plificada e dos con t roles n egat ivo e posit ivo, m ist u ravam - se 2 ml do DNA ext raído de S. pn eu mon iae com 48 ml d a m ist u ra - m est ra . Co m o co n t ro le n eg a t ivo d a rea çã o u t iliza va m - se 2 m l d e á g u a b id est ila d a adicion ados a 48 m l da m ist u ra de reação. Com o con t role posit ivo, n a m ist u ra 1, u t ilizavam - se 2 m l de DNA ext raído da am ost ra de S. pn eu mon iae já iden t ificada previamen t e como sen sível à pen icilin a e, n a m ist u ra 2, 2 m l de DNA ext raído de am ost ra iden t ificada com o resist en t e, adicion ados a 48 m l de cada m ist u ra de reação.

Co m rela çã o a o s ciclo s d e a m p lifica çã o , a s am ost ra preparadas com os respect ivos con t roles positivo e negativo eram colocadas no termociclador e su bm et idas a 35 ciclos, após u m a desn at u ração

in icial a 94°C por t rês min u t os. Cada ciclo con sist ia d e d esn a t u ra çã o a 9 4 °C d u ra n t e 3 0 seg u n d o s, an elamen t o a 60°C du ran t e 30 segu n dos e ext en são a 72°C du ran t e dois m in u t os. Após os 35 ciclos de am p lificação , o s t u b o s eram su b m et id o s a u m a ext en são fin al a 72°C du ran t e set e m in u t os.

Pa ra a elet ro fo rese, sep a ra va m - se 2 0 m l d a so lu çã o resu lt a n t e, q u e era m a p lica d o s n o g el d e a g a ro se 2 % (SIGMA), c o n t e n d o 2 m g / m l d e b ro m et o d e et íd io (SIGMA). A elet ro fo rese era r e a liz a d a a 1 5 v o lt s / c m , c o m d u r a ç ã o d e a p r o x i m a d a m e n t e 3 0 m i n u t o s . O g e l e r a visu a liz a d o so b lu z u lt ra vio le t a e g ra va d o n o GELDOC 1000, u t ilizan do- se o soft ware Molecu lar An alyst (Bio rad ). As am o st ras p o sit ivas p ro d u ziam u m a b a n d a visível co m o s seg u in t es t a m a n h o s: PLP 2 b : 3 5 9 p a res d e b a ses, PLP 2 x: 2 7 7 p a res d e b a ses, PLP 1 a : 4 2 3 p a res d e b a ses, g en e lyt A: 2 7 3 p a res d e b a ses (Fig u ra 1 ).

A an álise est at íst ica foi realizada relacion an do-se in icia lm en t e o n ú m ero d e m u t a çõ es em ca d a a m o st ra , d et erm in a d o p ela PCR, co m o g ra u d e resist ên cia das mesmas, det ermin ado pela su a CIM. Em c a d a g ru p o d e a m o st ra s c o m d if e re n t e s n ú m e ro s d e m u t a çõ e s (n e n h u m a m u t a çã o , 1 mu t ação, 2 mu t ações ou 3 mu t ações), foi feit a u ma co m p a ra çã o p a rea d a en t re o s g ra u s d e resist ên cia d a s m esm a s (sen síveis x in t erm ed iá ria s, sen síveis x re sist e n t e s e in t e rm e d iá ria s x re sist e n t e s), u t iliz a n d o - se o t e st e d o Qu i- q u a d ra d o p a ra co m p a ra çã o en t re p ro p o rçõ es (h et ero g en eid a d e), com u m grau de liberdade, aplican do- se a correção de Yat es, con sideran do- se u m n ível de sign ificân cia est a t íst ica d e 9 5 % (p < 0 ,0 5 ). A seg u ir fo i feit a a rela çã o en t re a s m u t a çõ es em ca d a u m a d a s t rês PLP est u d a d a s co m o g ra u d e resist ên cia d a s a m o st ra s d et erm in a d o p ela CIM. Em ca d a g ru p o d e am o st ras co m m u t ação n u m a d et erm in ad a PLP (PLP 1 a , PLP 2 b o u PLP 2 x) fo i rea liza d a u m a co m p a ra çã o p a rea d a en t re o g ra u d e resist ên cia d a s m esm a s (sen síveis x in t erm ed iá ria s, sen síveis x resist en t es e in t ermediárias x resist en t es), t ambém se em p reg a n d o o t est e d o Qu i- q u a d ra d o p a ra co m p a ra çã o en t re p ro p o rçõ es (h et ero g en eid a d e), com u m grau de liberdade, aplican do- se a correção d e Ya t es, sen d o ig u a lm en t e co n sid era d o u m n ível d e sig n ificâ n cia d e 9 5 % (p < 0 ,0 5 ).

RESULTADOS

Da s 1 9 7 a m o st ra s id en t ifica d a s in icia lm en t e c o m o S. p n e u m o n ia e n o s l a b o r a t ó r i o s d e m icrobiologia dos hospit ais de origem , 34 (17,2%) fo ra m exclu íd a s d o est u d o p o r n ã o crescerem n o m eio d e cu lt u ra a p ó s t erem sid o d esco n g ela d a s (m o rt e b a ct eria n a ), o u p o r n ã o se co n firm a r a id en t ifica çã o d a esp écie b a ct eria n a a t ra vés d o s t est es m icro b io ló g ico s.

Rest a ra m 1 6 3 a m o st ra s q u e fo ra m su b m et id a s sim u lt a n ea m en t e a o s t est es d e d et erm in a çã o d a CIM e à PCR p a ra d et ecçã o d a s m u t a çõ es n a s PLP 1 a , 2 b e 2 x e a m p lifica çã o d o g en e lyt A, p a ra c o n f ir m a ç ã o d a id e n t if ic a ç ã o b a c t e r ia n a . A p re se n ça d o g e n e lyt A fo i ve rifica d a e m 1 5 3 a m o st ra s. As 1 0 a m o st ra s q u e n ã o a p resen t a ra m est e g en e fo ra m exclu íd a s d a a n á lise fin a l.

A d ist rib u ição d a resist ên cia d o S. pn eu m on iae n a s 1 5 3 a m o st ra s rest a n t es n o est u d o , t est a d a s a t ra vés d o m ét o d o d e d ilu içã o em á g a r d e a co rd o co m a su a CIM é m o st ra d a n a Ta b ela 1 .

In ic ia lm e n t e , re la c io n o u - se o n ú m e ro d e m u t a ç õ e s e m c a d a a m o s t ra c o m o g ra u d e resist ên cia d a s m esm a s, d et erm in a d o p ela CIM. Ob t eve- se a p ro p o rçã o d e a m o st ra s sen síveis, d e resist ên cia in t erm ed iá ria e d e a lt a resist ên cia co m d et erm in ad o n ú m ero d e m u t açõ es e verifico u - se a sig n ificâ n cia est a t íst ica d a s d iferen ça s (Ta b ela 2 ).

Nã o o co rrera m a m o st ra s resist en t es n o g ru p o d e a m o st ra s sem m u t a çõ es. A co m p a ra çã o en t re a m o st ra s sen síveis e in t erm ed iá ria s m o st ro u - se sig n ifica t iva (

χ

Não ocorreram amost ras com alt a resist ên cia n o gru po de amost ras em qu e havia u ma mu t ação. A co m p a ra çã o d a s a m o st ra s sen síveis co m a s d e resistência intermediária mostrou- se significativa, com predomín io das sen síveis (

χ

Co m re la çã o à s a m o st ra s co m d u a s e t rê s m u t a çõ es, n ã o h o u ve a m o st ra s sen síveis, e h o u ve d i f e r e n ç a s i g n i f i c a t i v a c o m p a r a n d o - s e a s resist ên cias in t ermediária e alt a. Hou ve predomín io d e cep a s co m resist ên cia in t erm ed iá ria n o g ru p o co m d u a s m u t a çõ es (

χ

cep a s co m a lt a resist ên cia n o g ru p o co m t rês m u t a çõ es (

χ

A seguir, correlacionou- se a presença de mutação em cada u m a das t rês PLP isoladam en t e com os ín d ices d e resist ên cia d et erm in a d o s p ela CIM, a p lica n d o - se o t est e est a t íst ico p a ra a n a lisa r a sign ificân cia das diferen ças en con t radas (Tabela 3). A m u t a çã o n a PLP 2 b d et erm in o u a u sên cia d e a m o st ra s sen síveis. Ho u ve p red o m ín io d e a lt a resist ên cia em rela çã o à resist ên cia in t erm ed iá ria (

χ

Quanto à mutação na PLP 2x, a comparação entre amostras sensíveis e intermediárias foi significativa:

χ

= 25,304 (p < 0,0005); a comparação entre amostras

sensíveis e resistentes também foi significativa: Qu i-q u a d ra d o = 18,388 (p < 0,0005); e a comparação entre amostras intermediárias e resistentes não foi significativa:

χ

Co m rela çã o à m u t a çã o n a PLP 1 a , n ã o h o u ve am o st ras sen síveis. Ela d et erm in o u p red o m ín io d e a lt a resist ên cia (in t erm ed iá ria s x resist en t es:

χ

2 1 ,8 4 3 (p < 0 ,0 0 0 5 ) (Ta b ela 3 ).

DISCUSSÃO

A resistência do S. pneumoniae à penicilina em Porto Alegre aumentou consideravelmente nos últimos anos. No estudo de Chatkin et al.(21)_{, de 1989, era de}

apenas 3,2%, e atingiu 22,8% no período de nosso estudo. Este índice é semelhante aos encontrados por Sessegolo et al.(11) _{e Levin et al.}(12) _{no Estado de São}

Paulo na década de 1990 (24%). Mais recentemente,

Mendes et al.(14) _{estudaram amostras pneumocócicas}

isoladas em três países da América Latina (Argentina, Brasil e México) e en con traram n íveis ain da mais elevados de resistência (42,1%).

É im p o rt a n t e re ssa lt a r q u e e n t re a s ce p a s resist en t es qu e en con t ramos, a maioria apresen t ou resist ên cia in t erm ed iária à p en icilin a (1 6 ,3 %), e apenas 6,5% demonstraram alta resistência. Conforme já descrit o por diversos au t ores, as amost ras com resist ên cia in t erm ed iá ria t êm a p resen t a d o b o a respost a clín ica à pen icilin a em alt as doses(22,23)_,

enquanto que as altamente resistentes podem causar uma maior morbi- mortalidade(24,25)_.

Em com paração com levan t am en t os realizados em ou t ros países, a resist ên cia do pn eu m ococo em n osso m eio ain da perm an ece em n íveis in feriores. Nos EUA, por exem plo, o m ais recen t e relat ório epidem iológico, pu blicado por Karlowsky et al.(6)_,

in ve st ig a n d o 2 7 .8 2 8 ce p a s d e S. p n e u m o n ia e isoladas em vários estados norte- americanos, revelou 18,4% de alt a resist ên cia à pen icilin a.

No presente estudo, encontramos uma associação significativa entre a presença de mutações nos genes que codificam as PLP do S. pneumoniae e os índices de resistência à penicilina in vitro, determinados pela CIM. As amost ras sen síveis caract erizaram- se, em proporção estatisticamente significativa dos casos (p < 0,05), pela ausência de mutações nas PLP, as de resistência intermediária pela ocorrência de apenas uma mu t ação, geralmen t e n a PLP 2x, e as alt amen t e resistentes pela presença de mutações nas três PLP. A presença de mutação isolada na PLP 1a ou na PLP 2b ocorreu em n ú m ero sign ificat ivam en t e m aior de

amostras com alta resistência do que naquelas com resistência intermediária. Já a mutação na PLP 2x não foi capaz de ser discriminada entre amostras com resist ên cia in t ermediária ou alt a. A associação de mu t ações em du as ou t rês PLP correlacion ou - se significativamente com a expressão de alta resistência à penicilina. Estes resultados estão em concordância com outros estudos que têm demonstrado que as mutações no genoma da PLP 2x isoladamente resultam em baixo nível de resistência à penicilina, enquanto que a alta resistência à penicilina requer alterações

genéticas também nas PLP 1a e 2b(26- 30)

. TABELA 1

Níveis d e resist ên cia d a s a m o st ra s d e S. p n eu m o n ia e

Nível d e resist ên cia Nú m ero d e a m o st ra s (% ) Sen sível (CIM ≤ 0 ,0 6 m g / m L) 11 8 (7 7 ,2 %) In t erm ed iá ria (CIM 0 ,1 2 a 1 ,0 m g / m L) 2 5 (1 6 ,3 % ) Alt a (CIM ≥ 2 ,0 m g / m L) 1 0 (6 ,5 %)

To t a l: 1 5 3

CIM: co n cen t ra çã o in ib it ó ria m ín im a .

TABELA 2

Rela çã o en t re o n ú m ero d e m u t a çõ es e o n ível d e resist ên cia

Sen sível In t erm ed iá ria Alt a Sem m u t a çõ es 8 6 (7 3 % )* 2 (8 % ) 0 (0 % ) 1 m u t a çã o 3 2 (2 7 % ) 1 8 (7 2 % )* 0 (0 % ) 2 m u t a çõ es 0 (0 %) 4 (1 6 %)** 1 (1 0 %) 3 m u t a çõ es 0 (0 %) 1 (4 %) 9 (9 0 %)***

To t al 11 8 2 5 1 0

* c o m p a ra ç ã o s e n s í ve is x in t e rm e d iá ria s : p < 0 , 0 5 . ** c o m p a ra ç ã o in t e rm e d iá ria s x a lt a re sist ê n c ia : p = n ã o s i g n i f i c a t i v o . *** c o m p a r a ç ã o i n t e r m e d i á r i a s x a l t a resist ên cia : p < 0 ,0 5

TABELA 3

Rela çã o en t re a s m u t a çõ es em ca d a PLP e o n ível d e resist ên cia

Sen sível In t erm ed iá ria Alt a PLP 2 b 0 (0 %) 7 (2 8 %) 1 0 (1 0 0 %)* PLP 2 x 3 2 (2 7 %) 2 1 (8 4 %)** 1 0 (1 0 0 %)*** PLP 1 a 0 (0 % ) 1 (4 %) 9 (90%)****

Tot al 118 25 10

* co m p a ra çã o in t erm ed iá ria s x a lt a resist ên cia : p < 0 ,0 5 ** co m p a ra çã o sen síveis x in t erm ed iá ria s: p < 0 ,0 5 *** c o m p a ra ç ã o s e n s í ve is x a lt a re s is t ê n c ia : p < 0 ,0 5 ; c o m p a ra ç ã o in t e rm e d iá ria s x a lt a re sist ê n c ia : p = n ã o s ig n if ic a t ivo

Ub u ka t a et a l.(1 9 )

e st u d a ra m a p re se n ça d e m u t a çõ es em g en es d a PLP 2 b d e 1 .0 6 2 a m o st ra s c lí n ic a s d e S. p n e u m o n ia e a t r a vé s d a P CR, en co n t ra n d o co rrela çã o co m o s a ch a d o s d a CIM d e p en icilin a em 9 8 ,9 % d a s a m o st ra s sen síveis e 7 0 ,3 % d a s resist en t es.

Nagai et al.(30)

avaliaram a presen ça de mu t ações n o s g en es d a s PLP 2 b e 2 x em 2 1 8 a m o st ra s d e S. p n eu m o n ia e iso la d a s d e cria n ça s n o J a p ã o . As m u t ações n a PLP 2x foram observadas em diversas cep a s co m resist ên cia in t erm ed iá ria à p en icilin a . Em 41 ,3 % d a s a m o st ra s sen síveis a o cefo t a xim e en co n t ra ra m - se m u t a çõ es n o s g en es d a PLP 2 x, o q u e su g ere q u e o m eca n ism o d e resist ên cia p o d e o c o r r e r m e s m o e m c e p a s s u s c e t í v e i s a o s a n t im icro b ia n o s, e p o d e p reced er a resist ên cia d et ect a d a in vit ro. Em n o sso est u d o , est e ach ad o reprodu ziu- se, t en do sido en con t radas em 84% das amost ras com resist ên cia in t ermediária à pen icilin a a p resen ça d e m u t a çã o n a PLP 2 x, o q u e m o st ra q u e est e p o d e ser u m m a rca d o r d e m en o r n ível d e resist ên cia. Assim , n ão foi possível a discrim in ação e n t r e a m o s t r a s in t e r m e d iá r ia s e a lt a m e n t e resist en t es à p en icilin a u t ilizan d o - se as alt eraçõ es n a P LP 2 x is o la d a m e n t e , m a s f o i p o s s í ve l d iferen cia r sig n ifica t iva m en t e a s cep a s sen síveis d a s q u e a p resen t a va m a lg u m g ra u d e resist ên cia (in t erm ed iária o u alt a).

A d e t e cçã o d a P LP 1 a a t ra vé s d a P CR f o i u t iliz a d a p o r d u Ple iss e t a l.(2 9 )

e m 1 8 3 iso la d o s clín ico s d e S. p n e u m o n ia e , q u e o b t ive ra m u m a co n co rd â n cia d e 9 8 ,3 % e n t re o s re su lt a d o s d a PCR e o s d a d o s d e CIM d e p e n icilin a . Os va lo re s p re d it ivo s p o sit ivo e n e g a t ivo d e st a t é c n ic a m o le c u la r f o r a m d e 1 0 0 % n a d e t e c ç ã o d e a m o st ra s co m CIM ³ 1 m g / m L. Sim ila rm e n t e , e m n o s s a s a m o s t r a s c o m a lt a r e s is t ê n c ia à p e n icilin a , e n co n t ra m o s a p re se n ça d e m u t a çã o n a P LP 1 a e m 9 0 % d o s ca so s (9 / 1 0 ca so s). Em a p e n a s u m a a m o s t r a , c l a s s i f i c a d a c o m o a lt a m en t e resist en t e à p en icilin a p ela s d iret rizes d o Na t io n a l Co m it t ee fo r Clin ica l La b o ra t o ry,n ã o se d e t e ct o u a lt e ra çã o n a P LP 1 a . Essa a m o st ra a p re se n t a va CIM = 2 ,0 m g / m L, va lo r q u e se en co n t ra exa t a m en t e em cim a d o p o n t o d e co rt e q u e d ivid e a s a m o st ra s e n t re in t e rm e d iá ria s o u a lt a m e n t e re sist e n t e s à p e n icilin a . No e n t a n t o , e ssa d if e re n ça e n t re o s m é t o d o s f e n o t íp ico s e g e n o t íp ico s n e st e ca so iso la d o n ã o a f e t o u a e f e t ivid a d e d o m é t o d o .

O ú n ico est u do prévio qu e an alisou a presen ça d e m u t a ç õ e s n a s t r ê s P LP (1 a , 2 b e 2 x ), simultaneamente, relacionando- as com a resistência bact erian a, foi o de Jalal et al.(20)

, qu e, est u dan do 230 isolados clín icos de S. pn eu mon iae, iden t ificou 93% das amost ras sen síveis, 85% das in t ermediárias e 100% das altamente resistentes através da PCR. No en t an t o, as mu t ações n a PLP 1a n ão t iveram boa correlação com a resistência in vitro e foram excluídas da an álise de dados, qu e se limit ou à avaliação das PLP 2b e 2x. Mesmo assim, os resu ltados alcan çados f o r a m c o n s id e r a d o s p o t e n c ia lm e n t e ú t e is clinicamente, apesar de não ter sido feita uma análise estatística mais aprofu n dada.

Um fator muito importante na abordagem de um paciente com infecção pneumocócica é a introdução precoce da t erapêu t ica an t imicrobian a, o qu e pode ser decisivo na evolução e prognóstico da doença(31,32)

. At ravés dos mét odos microbiológicos con ven cion ais leva- se, n o mín imo, 24 horas para o crescimen t o e iden t ificação do germe n os meios de cu lt u ra e mais 2 4 h o r a s p a r a a r e a liz a ç ã o d o s t e s t e s d e su scetibilidade(18)

.Todas as etapas da técn ica da PCR

descrit as n o presen t e est u do podem ser realizadas em at é 8 h o ras, e h á a co n firm ação d o ag en t e etiológico e a identificação do seu nível de resistência simu lt an eamen t e, o qu e possibilit a u m in ício de t rat amen t o mu it o mais rápido e adequ ado.

De st a f o rm a , a t ra vé s d o p re se n t e e st u d o pret en demos demon st rar a pot en cial aplicabilidade clín ica d a t écn ica d a PCR n a d et ecçã o p reco ce d a resist ên cia b act erian a d o S. p n eu m o n iae, d evid o à s u a r a p i d e z e f a c i l i d a d e d e e x e c u ç ã o e m lab o rat ó rio s ad eq u ad am en t e eq u ip ad o s.

REFERÊNCIAS

1 . To m a s z A. An t ib io t ic r e s is t a n c e in St r e p t o c o c c u s p n eu m o n ia e. Clin In fect Dis. 1 9 9 7 ;2 4 (Su p p l 1 ):S8 5 - 8 . 2 . Marst o n BJ , Plo u ffe J F, File TM, Hackm an , BA, Salst rom SJ , Lip m an HB, et al. In cid en ce o f co m m u n it y- acq u ired p n e u m o n ia r e q u ir in g h o s p it a liz a t io n : r e s u lt s o f a p o p u la t io n - b a se d a ct ive su rve illa n ce st u d y in Oh io . J AMA. 1 9 9 7 ; 1 5 7 : 1 7 0 9 - 1 8 .

3 . Ru iz- Gon zales A, Falgu era M, Nogu es A, Ru bio- Caballero M. Is St rep t o co ccu s p n eu m o n ia e t h e lea d in g ca u se o f pn eu mon ia of u n kn own et iology? A microbiologic st u dy of lung aspirates in consecutive patients with community-acqu ired pn eu mon ia. Am J Med. 1999;106:385- 90. 4 . J o n es ME, Blo sser- Mid d let o n RS, Crit ch ley IA, Karlo wsky

J A, Th o rn sb erry C, Sa h m DF. In vit ro su scep t ib ilit y o f

St rept ococcu s pn eu m on iae, Haem ophilu s in flu en zae an d

5 . Do b a y O, Ro z g o n yi F, Ha jd u E, Na g y E, Kn a u sz M, Am ye s SG. An t ib io t ic su sce p t ib ilit y a n d se ro t yp e s o f

St re p t o co ccu s p n e u m o n ia e iso la t e s f ro m Hu n g a ry. J An t im icro b Ch e m o t h e r. 2 0 0 3 ; 51 : 8 8 7 - 9 3 .

6 . Ka rlo wsky, J A, Th o rn sb e rry C, J o n e s ME, Eva n g e list a AT, Crit c h le y IA, Sa h m DF. Fa c t o rs a sso c ia t e d w it h r e la t iv e r a t e s o f a n t im ic r o b ia l r e s is t a n c e a m o n g

St rep t o co ccu s p n eu m o n ia e in t h e Un it ed St a t es: resu lt s f ro m t h e TRUST Su rve illa n ce P ro g ra m (1 9 9 8 - 2 0 0 2 ). Clin In fect Dis. 2 0 0 3 ; 3 6 : 9 6 3 - 7 0 .

7 . Ho b a n D, Wa it e s K, Fe lm in g h a m D. An t im ic r o b ia l su scep t ib ilit y o f co m m u n it y- a cq u ired resp ira t o ry t ra ct p a t h o g e n s in No rt h Am e rica in 1 9 9 9 - 2 0 0 0 : fin d in g s o f t h e PROTEKT su rve illa n ce st u d y. Dia g n Micro b io l In fe ct Dis. 2 0 0 3 ; 4 5 : 2 51 - 9 .

8 . Lee HJ , Pa rk J Y, J a n g SH. Hig h in cid en ce o f resist a n ce t o m u lt ip le a n t im ic r o b ia ls in c lin ic a l is o la t e s o f

St rep t o co ccu s p n eu m o n ia e fro m a u n iversit y h o sp it a l in Ko rea . Clin In fect Dis. 1 9 9 5 ;2 0 :8 2 6 - 3 5 .

9 . Kim SN, Kim SW, Ch o i IH. Hig h in cid en ce o f m u lt id ru g -re sist a n t St re p t o co ccu s p n e u m o n ia e in So u t h Ko re a . Micro b Dru g Resist . 1 9 9 6 ; 2 : 4 01 - 6 .

1 0 . Lo WT, Wan g CC, Yu CM, Chu ML. Rat e of n asopharyn geal c a r r ia g e , a n t im ic r o b ia l r e s is t a n c e a n d s e r o t yp e o f

St rep t o co ccu s p n eu m o n iae a m o n g ch ild ren in n o rt h ern Ta iwa n . J Micro b io l Im m u n o l In fect . 2 0 0 3 ;3 6 ,1 7 5 - 81 . 11 . Sesseg o lo J F, Levin AS, Levy CE, Asensi M, Fa ckla m RR,

T e i x e i r a LM . Di s t r i b u i t i o n o f s e r o t y p e s a n d a n t im icro b ia l resist a n ce o f St rep t o co ccu s p n eu m o n ia e

st ra in s iso la t e d in Bra z il fro m 1 9 8 8 t o 1 9 9 2 . J Clin Micro b io l. 1 9 9 4 ; 1 2 : 9 0 6 - 11 .

1 2 . Levin AS, Teixeira LM, Sessegolo JF, Barone AA. Resistance o f St rep t o co ccu s p n eu m o n ia e t o a n t im icro b ia ls in Sã o Paulo, Brazil: clinical features and serotypes. Rev Inst Med Trop São Pau lo. 1996;38:187- 92.

1 3 . Sa d er HS, J o n es RN, Ga les AC, Win o ku r P, Ku g ler KC, Pfa ller MA, et a l. An t im icro b ia l su scep t ib ilit y p a t t ern s fo r p a t h o g en s iso la t ed fro m p a t ien t s in la t in a m erica n m ed ica l cen t ers wit h a d ia g n o sis o f p n eu m o n ia : resu lt s fro m t h e SENTRY An t im icro b ia l Su rveilla n ce Pro g ra m (1 9 9 7 ). Dia g n Micro b io l In fect Dis. 1 9 9 8 ;3 2 :2 8 9 - 3 01 . 1 4 . Men d es C, Ma rin ME, Qu in o n es F, Sifu en t es- Oso rn io J , Siller CC, Ca st a n h eira M, et a l. An t ib a ct eria l resist a n ce o f c o m m u n it y- a c q u ire d re sp ira t o ry t ra c t p a t h o g e n s reco vered fro m p a t ien t s in La t in Am erica : resu lt s fro m t h e PROTEKT su rve illa n ce st u d y (1 9 9 9 - 2 0 0 0 ). Bra z J In fe ct Dis. 2 0 0 3 ; 7 : 4 4 - 61 .

1 5 . Ap p e l b a u m P C. An t i m i c r o b i a l r e s i s t a n c e i n

St re p t o co ccu s p n e u m o n ia e: a n ove rvie w. Clin In f e ct Dis. 1 9 9 2 ; 1 5 : 7 7 - 8 3 .

1 6 . Do wso n CG, Co ffey TJ , Sp ra t t BG. Orig in a n d m o lecu la r e p id e m io lo g y o f p e n icillin - b in d in g - p ro t e in - m e d ia t e d resist a n ce t o b et a - la ct a m a n t ib io t ics. Tren d s Micro b io l. 1 9 9 4 ; 2 : 3 61 - 5 .

1 7 . Iked a F, Yo ko t a Y, Ikem o t o A, Tera t a n i N, Sh im o m u ra K, Ka n n o H. In t e ra c t io n o f b e t a - la c t a m a n t ib io t ic s w it h t h e p e n ic illin b in d in g p r o t e in s o f p e n ic illin -re sist a n t St re p t o co ccu s p n e u m o n ia e. Ch e m o t h e ra p y. 1 9 9 5 ; 41 : 1 5 9 - 6 4 .

1 8 . Ru o ff KL, Wh ile y RA, Be ig h t o n D. St re p t o co ccu s. In : Mu rra y PR, Ba ro n EJ , Pfa lle r MA, e d it o rs. Ma n u a l o f clin ica l m icro b io lo g y. Wa sh in g t o n (DC): ASM P re ss; 1 9 9 9 . p . 2 8 3 - 9 6 .

1 9 . Ub u ka t a K, Asa h i Y, Ya m a n e A, Ko n n o M. Co m b in a t io n a l d e t e ct io n o f a u t o lysin a n d p e n icillin - b in d in g p ro t e in 2 B g en es o f St rep t o co ccu s p n eu m o n ia e b y PCR. J Clin Micro b io l. 1 9 9 6 ; 3 4 : 5 9 2 - 6 .

2 0 . J a la l H, Org a n ji S, Reyn o ld s J , Ben n et t D, O’Ma so n E J r, Milla r MR. Det erm in a t io n o f p en icillin su scep t ib ilit y o f St re p t o co ccu s p n e u m o n ia e u sin g t h e p o lym e ra se ch a in re a ct io n . Mo l Pa t h o l. 1 9 9 7 ; 5 0 : 4 5 - 5 0 .

2 1 . Ch a t kin J M, Frit sch er CC, Ro d rig u es LF. Sen sib ilid a d e d o St re p t o co ccu s p n e u m o n ia e a o s a n t im icro b ia n o s: resu lt a d o s p relim in a res. Rev Med PUCRS. 1 9 8 9 ;1 :81 - 6 . 2 2 . Ewig S, Ru iz M, To rres A, Ma rco F, Ma rt in ez J A, Sa n ch ez, M , e t a l. P n e u m o n ia a c q u ir e d in t h e c o m m u n it y t h ro u g h d ru g - resist a n t St rep t o co ccu s p n eu m o n ia e. Am J Resp ir Crit Ca re Med . 1 9 9 9 ;1 5 9 ,1 8 3 5 - 4 2 .

2 3 . File TM J r. Tre a t in g co m m u n it y- a cq u ire d p n e u m o n ia c a u s e d b y p e n i c i l l i n - r e s i s t a n t St r e p t o c o c c u s p n eu m o n ia e. J Resp ir Dis. 1 9 9 9 ; 2 0 : 8 3 3 - 4 2 .

2 4 . Dowell, SF, Bu t ler J C, Giebin k GS, J acobs MR, J ern igan D, Mu sh er DM, et al. Acu t e o t it is m ed ia: m an ag em en t an d su rveillan ce in an era of pn eu mococcal resist an ce – a report from t he Dru g- Resist an t S. pn eu mon iae Therapeu t ic Workin g Grou p. Pediat r In fect Dis J . 1999;8:1- 9. 2 5 . Pa ch ech o TR, Co o p er CK, Ha rd y DJ , Bet t s RF, Bo n n ez

W. Fa ilu re o f ce fo t a xim e t re a t m e n t in a n a d u lt wit h

St re p t o c o c c u s p n e u m o n ia e m e n in g it is . Am J Me d . 1 9 9 7 ; 1 0 2 : 3 0 3 - 5 .

2 6 . Sm it h AM, Klu g m a n KP, Co ffey TJ . Gen et ic d iversit y o f p e n i c i l l i n - b i n d i n g p r o t e i n s 2 B e 2 X g e n e s f r o m

St rep t o co ccu s p n eu m o n ia e in So u t h Africa . An t im icro b Ag e n t s Ch e m o t h e r. 1 9 9 3 ; 3 7 : 1 9 3 8 - 4 4 .

2 7 . Ba rcu s VA, Gh a n eka r K, Yeo M, Co ffey TJ , Do wso n CG. Gen et ics o f h ig h - level p en icillin resist a n ce in clin ica l iso la t es o f St rep t o co ccu s p n eu m o n ia e. FEMS Micro b io l Le t t . 1 9 9 5 ; 1 2 6 : 2 9 9 - 3 0 4 .

2 8 . Sm it h AM, Klu g m a n KP. Alt era t io n s in PBP 1 a essen t ia l f o r h ig h - le ve l p e n icillin re sist a n ce in St re p t o co ccu s p n e u m o n i a e. An t i m i c r o b Ag e n t s Ch e m o t h e r. 1 9 9 8 ; 4 2 : 1 3 2 9 - 3 3 .

2 9 . d u Ple iss M, Sm it h AM, Klu g m a n KP. Ap p lica t io n o f p b p 1 A P CR in id e n t if ic a t io n o f p e n ic illin - re s is t a n t

St r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e. J Cl i n M i c r o b i o l . 1 9 9 9 ; 3 7 : 6 2 8 - 3 2 .

3 0 . Na g a i K, Ma t su o Y, Tsu m u ra N, Sa ka t a Y, Ka t o H. An t im ic r o b ia l s u s c e p t ib ilit ie s a n d s e r o t yp e s o f

St rep t o co ccu s p n eu m o n ia e in so u t h west ern J a p a n a n d co rre la t io n o f p e n icillin - b in d in g p ro t e in s 2 b a n d 2 x m u t a t io n s in s u s c e p t ib ilit ie s o f p e n ic illin G a n d cefot axime. Diagn Microbiol In fect Dis. 2000;37:107- 13. 3 1 . Ba rt let t J G, Mu n d y L. Co m m u n it y- a cq u ired p n eu m o n ia .

N En g l J Med . 1 9 9 5 ;3 3 3 :1 61 8 - 2 4 .

3 2 . Bo h t e R, He rm a n s J , Bro e k PJ . Ea rly re co g n it io n o f