(1) Parte da Tese de Mestrado do primeiro autor, apresentada ao CPGSNP-DCS, Universidade Federal de Lavras -UFLA. Parcialmente financiado pelo convênio FAEPE/CMM e FAPEMIG. Recebido para publicação em janeiro de 2000 e aprovado em março de 2001. (2) Doutoranda em Solos e Nutrição de Plantas, Departamento de Ciência do Solo, Universidade Federal de Lavras - UFLA. CEP
37200-000. Lavras (MG). Bolsista da CAPES. E-mail: itrannin@ufla.br (3)Professor do Departamento de Ciência do Solo, UFLA. Bolsista do CNPq.
CRESCIMENTO E NODULAÇÃO
DE
Acacia mangium, Enterolobium contortisiliquum
E
Sesbania
virgata
EM SOLO CONTAMINADO
COM METAIS PESADOS
(1)I. C. B. TRANNIN(2), F. M. S. MOREIRA(3) & J. O. SIQUEIRA(3)
RESUMO
Um dos desafios atuais da pesquisa é encontrar plantas e microssimbiontes tolerantes e que possibilitem a revegetação de áreas degradadas por excesso de metais pesados. Este experimento foi realizado no período de agosto a dezembro de 1998, em casa de vegetação do Departamento de Ciência do Solo da UFLA, Lavras (MG), com o objetivo de avaliar a tolerância a metais pesados e a capacidade de estabelecimento de simbiose de rizóbio de diferentes origens com Enterolobium contortisiliquum (tamboril), Acacia mangium (acácia) e Sesbania virgata (sesbânia), em misturas de solos, que continham proporções de solo contaminado (PSC): (0, 15, 30, 45 e 60% v/v) com Zn, Cd, Pb e Cu (18.600, 135, 600 e 596 mg dm-3, extraídos por aqua regia, respectivamente), diluído em Latossolo Vermelho distrófico. Estirpes recomendadas (E) e isolados de solo contaminado (ISC) e de solo não contaminado (ISNC), cuja tolerância a Cu, Cd e Zn foi determinada previamente “in vitro”, foram inoculados. O aumento da PSC nas misturas inibiu o crescimento vegetativo, a produção de matéria seca e a nodulação das três espécies. A simbiose tamboril-BR4406 foi a mais tolerante e acácia-BR3617 a mais sensível à contaminação do solo. Os ISC que foram mais tolerantes “in vitro” formaram nódulos eficientes em solo sem contaminação, mas foram ineficientes em solos contaminados. Na PSC 15% (Zn = 750; Cd = 22,1; Pb = 65,1 e Cu = 111 mg dm-3 extraídos por DTPA) a atividade específica da nitrogenase aumentou 5 e 10 vezes em relação ao solo sem contaminação para as simbioses sesbânia-BR5401e tamboril-BR4406, respectivamente. A tolerância de rizóbio a metais “in vitro” não correspondeu à tolerância da simbiose em solo contaminado.
SUMMARY: GROWTH AND NODULATION OF Acacia mangium, Enterolobium contortisiliquum AND Sesbania virgata IN HEAVY METAL CONTAMINATED SOIL
One of the great challenges in environmental research today is to find tolerant species of plants and microsymbionts to make viable the revegetation of contaminated areas with heavy metals. This experiment was carried out under greenhouse conditions at the Soil Science Department of the Federal University of Lavras (MG), from August to December 1998, to assess the tolerance to heavy metals and the capacity to establish rhizobia symbiosis with Enterolobium contortisiliquum (tamboril), Acacia mangium (acacia) and Sesbania
virgata (sesbânia) in soil mixtures, containing different proportions of contaminated soil (PCS): 0, 15, 30, 45 and 60% (v/v) with Zn, Cd, Pb and Cu (18.600, 135, 600 and 596 mg dm-3
extracted by aqua regia, respectively), diluted in a low fertility Oxisol. The species were inoculated with recommended strains (S) and isolates from soil contaminated with heavy metals (ICS) and isolates from non contaminated soil (INS), whose tolerance to Cu, Cd and Zn was previously determined “in vitro”. PCS increase in the mixtures inhibited vegetative growth, dry matter production and the nodulation of the three species. The tamboril-BR 4406 symbiosis was the most tolerant and acacia-BR 3617 symbiosis the most sensitive to soil contamination. Although the ICSs that were more tolerant “in vitro” formed effective nodules in non contaminated soil, nodules were ineffective in soil mixtures with heavy metal contaminated soil. In the PCS, 15% (Zn = 750; Cd = 22.1; Pb = 65.1 and Cu = 111 mg dm-3
extracted by DTPA) the specific activity of nitrogenase was stimulated, increasing 5 and 10 times in relation to the soil without contamination for the sesbânia-BR 5401 and tamboril-BR 4406 symbiosis, respectively. Rhizobia’s “in vitro” tolerance to heavy metals was not related to symbiosis tolerance in contaminated soil.
Index terms: Bradyrhizobium, Azorhizobium, biological N2-fixation, leguminous, soil
pollution, heavy metal, phytotoxicity, phytoremediation.
INTRODUÇÃO
A fixação biológica de N2 (FBN), realizada por
rizóbio em simbiose com leguminosa, é de grande importância para programas de recuperação de solos degradados, geralmente deficientes em nitrogênio, em virtude da intensa perda de matéria orgânica. Em áreas contaminadas com metais pesados, como solos tratados com lodo de esgoto, os metais são persistentes por longos períodos e, em altas concentrações, tornam-se tóxicos às plantas e microrganismos, podendo reduzir a sobrevivência do rizóbio, a nodulação e a FBN (Reddy et al., 1983; McGrath, 1987; McGrath et al., 1988; Giller et al., 1989; Witter, 1989; Martensson & Witter, 1990).
A magnitude desses efeitos depende das caracterís-ticas químicas do solo, do gênero e das espécies de rizóbio e do tempo de exposição ao solo contaminado (Giller et al., 1993). Bradyrhizobium japonicum apresentou maior tolerância a Zn, Cd, Cu e Ni em meio de cultura do que espécies do gênero Rhizobium, o que refletiu em ótimo desempenho de sua simbiose com soja, em solo contaminado (Angle et al., 1993). Diferenças na sensibilidade de rizóbio a metais foram detectadas também entre isolados, tendo sido Rhizobium leguminosarum bv. trifolii
isolado de parcelas que receberam resíduos de esgoto mais tolerante aos efeitos tóxicos de Zn e Cu do que isolados de parcelas que receberam esterco. Esses isolados, apesar de mais tolerantes, foram ineficientes em simbiose com trevo, em solos tratados com lodo de esgoto, onde o baixo teor de N, a clorose e o atrofiamento das plantas de trevo deveram-se não à fitotoxidez dos metais, mas, sim, à ausência de FBN (McGrath et al., 1988).
Por outro lado, rizóbio eficiente foi isolado de nódulos de planta hospedeira nativa em solos contaminados, independentemente da concentração de metal (Martensson & Witter, 1990; Obbard et al., 1993), sugerindo que os bacteróides são protegidos dos efeitos tóxicos dos metais, no interior dos nódulos radiculares (Rother et al., 1983; McGrath et al., 1988; Giller et al., 1989; Smith & Giller, 1992).
tema de interesse atual que necessita de maiores pesquisas, principalmente relacionadas com a seleção de plantas e microssimbiontes tolerantes, que possibilitem a revegetacão destes solos.
Algumas leguminosas arbóreas tropicais têm sido apontadas como promissoras para programas de recuperação de solos degradados por excesso de metais, destacando-se tamboril (Enterolobium contortisiliquum) (Rojas et al., 1996; Mostasso, 1997) e acácia (Acacia mangium)(Marques et al., 2000) e, entre as arbustivas, a sesbânia (Sesbania virgata) (Mostasso, 1997), sendo as duas primeiras capazes de formar simbiose eficiente com Bradyrhizobium e, a última, com Azorhizobium.
Este estudo teve como objetivo avaliar a capacidade de estirpes e isolados de Bradyrhizobium e de Azorhizobium, tolerantes e sensíveis a metais “in vitro”, em estabelecer simbiose com acácia, tamboril e sesbânia, em misturas de solo que continham proporções crescentes de solo contaminado com metais pesados por rejeitos da industrialização de zinco.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado em casa de vegetação, no Departamento de Ciência do Solo, da Universidade Federal de Lavras (UFLA), no período de 25 de agosto a 3 de dezembro de 1998. Utilizou-se material de solo contaminado com metais pesados, coletado em área industrial da Companhia Mineira de Metais-CMM, no município de Três Marias (MG), classificado como Latossolo Vermelho Amarelo distrófico plíntico (LVAd) (Ribeiro-Filho et al., 1999), e de um Latossolo Vermelho distrófico (LVd) não contaminado, coletado na camada superficial (0-20 cm), na região de Jaguara (MG). Considerando os elevados teores de
(1) Extraído por Mehlich-1. (2) Extraído por DTPA. (3) Extraído por KCl 1M.
Quadro 1. Características químicas e físicas das misturas de LVd não contaminado com diferentes proporções de LVAd contaminado com metais pesados (PSC), após correção de acidez e adubação
metais no solo da CMM (Zn = 18.600, Cd = 135, Pb = 600 e Cu = 596 mg kg-1 de solo, extraídos por aqua
regia) e com base em estudos anteriores (Mostasso, 1997; Marques et al., 2000), foram utilizadas misturas que continham diferentes proporções de solo contaminado (PSC): 0, 15, 30, 45 e 60% (v/v), diluído em LVd. Após calagem do LVd, os solos foram misturados e fumigados com Bromex, durante quatro dias, e receberam adubação básica, com solução nutritiva de sais p.a de NH4NO3; KH2PO4 e H3PO4,
de modo a fornecer: 60 mg de N; 250 mg de P e 150 mg dm-3 de K no solo. As misturas foram
incubadas com umidade correspondente a 70% do VTP, durante 20 dias, em vasos de PVC, com capacidade para 1,250 dm-3 de solo seco ao ar, revestidos com
sacos de polietileno esterilizados. Após esse período, as misturas que continham diferentes PSC foram homogeneizadas e analisadas (Quadro 1).
Foram estudadas três leguminosas, sendo duas arbóreas, tamboril (Enterolobium contortisiliquum) e acácia (Acacia mangium), e uma arbustiva, sesbânia (Sesbania virgata), todas com capacidade para estabelecer simbiose eficiente com rizóbio e com potencialidade para revegetação de solos degradados por excesso de metais (Mostasso, 1997; Marques et al., 2000). As sementes das três espécies foram submetidas à quebra de dormência, conforme Davide et al. (1995), por meio de escarificação com H2SO4,
seguida de lavagem durante uma hora em água corrente e esterilização por imersão em álcool e lavagem em água esterilizada. Foram semeadas três sementes por vaso, mantendo-se uma planta após o desbaste.
A inoculação de rizóbio específico a cada espécie foi efetuada durante a semeadura, por meio da adição de 2,0 mL vaso-1 de cultura em YEM (Vincent,
1970), produzida sob agitação orbital de 105 rpm a 28oC durante 6 dias (109 e 1010 cel mL-1, para
Azorhizobium e Bradyrhizobium,respectivamente).
Química Física
PSC
pH P(1) K(1) Mn(2) Fe(2) Zn(2) Cu(2) Cd(2) Pb(2) Ca(3)Mg(3) Al(3) H + Al M.O. Areia Silte Argila
% _________________________________________________mg dm-3_________________________________________________ ___________cmolC dm-3___________ dag kg-1 _______________g kg-1_______________
0 6,0 29 182 3,2 37,1 0,4 1 0,1 1,4 2,8 1,3 0 1,9 3,1 170 290 540
15 6,1 31 181 4,2 31,4 750 111 22,1 65,1 2,9 1,6 0 2,1 3,1 210 320 470
30 6,1 36 182 2,4 31,0 1.125 184 42,5 87,5 3,0 1,4 0 1,9 3,1 250 310 440
45 6,1 32 182 1,5 26,0 1.250 206 67,5 192,5 3,1 1,9 0 2,3 3,1 310 330 360
Foram utilizadas as estirpes recomendadas pelo CNPAB/EMBRAPA como inoculantes (E) e os isolados de solo contaminado (ISC) e de solo não contaminado (ISNC) selecionados em trabalho anterior (Trannin et al., 2001) quanto à tolerância a metais pesados “in vitro”, como tolerantes (T), sensíveis (S) e de tolerância média (TM), dentro de cada gênero. De Bradyrhizobium, foram testados BR4406 (E,T), UFLA 01-457 (ISC,T) e INPA398 (ISNC,S), simbiontes de tamboril e BR3617 (E,TM), de acácia e de Azorhizobium, BR5401 (Moreira et al., 1998) (E,S), UFLA 483 (ISC,TM) e UFLA 01-515 (ISC,T), simbiontes de sesbânia. Somente a estirpe BR3617 foi utilizada em simbiose com acácia neste estudo, porque não diferiu de outros isolados desta espécie quanto à tolerância a metais, na seleção “in vitro”.
O experimento foi distribuído em delineamento inteiramente casualizado, e os tratamentos para tamboril e sesbânia originaram-se do fatorial 5 x 5 (cinco PSC e cinco tratamentos de N: 3 estirpe/ isolados de rizóbio; fertilizante nitrogenado e controle absoluto), enquanto para acácia os tratamentos originaram-se do fatorial 5 x 3 (cinco PSC e três tratamentos de N: estirpe de rizóbio; fertilizante nitrogenado e controle absoluto), com cinco repetições.
A umidade do solo foi mantida próxima a 70% do VTP, por meio de pesagens dos vasos e irrigação com água deionizada. As plantas foram coletadas 100 dias após a semeadura, quando se avaliaram a altura, o diâmetro do caule e as raízes noduladas foram submetidas à avaliação da atividade da nitrogenase, utilizando o método da redução de acetileno (Dilworth, 1966). Para isto, as raízes foram colocadas em recipien-tes de polietileno com capacidade de 250 mL, herme-ticamente fechados, dos quais se retiraram alíquotas de 25 mL de ar, que foi substituído por acetileno.
Após três horas de incubação, retirou-se do recipiente uma amostra de 1 mL de gás, para a determinação da quantidade de etileno produzido, utilizando o cromatógrafo a gás, VARIAN STAR 3400 CX. Logo após, os nódulos foram destacados das raízes para determinação do número e do peso. A parte aérea e as raízes foram secas em estufa com circulação forçada de ar a 68oC,
anteriormente à pesagem. Os dados foram submetidos à análise de variância, teste de médias e regressão, utilizando-se o programa estatístico SANEST (Zonta et al., 1984). Os modelos de regressão foram selecionados, considerando o maior nível de significância. O número de nódulos foi transformado, seguindo a expressão x+ 0,5. Em
decorrência da morte das plantas de sesbânia, a partir da PSC 30%, nos tratamentos de inoculação com rizóbio, as variáveis desta espécie foram avaliadas somente até à PSC 15%.
Para comparar a tolerância das três espécies vegetais cultivadas com diferentes tratamentos de
N (estirpe recomendada de rizóbio, N mineral e controle absoluto) nas PSC, utilizou-se a fórmula seguinte: [IT = (PSC/CT) x 100], sendo IT = índice de tolerância, PSC = valor da variável de produção e crescimento vegetativo em cada proporção de solo contaminado; CT = valor da variável no controle (solo sem contaminação).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Produção e crescimento vegetativo
A produção de matéria seca da parte aérea (MSPA) e de raízes (MSR), altura e diâmetro do caule (DC) de cada espécie vegetal, em diferentes tratamentos de nitrogênio (N) e proporções de solo contaminado (PSC), encontram-se nos quadros 2, 3 e 4, para tamboril, acácia e sesbânia, respectivamente. O aumento da PSC na mistura de solos exerceu efeito significativo sobre a produção e sobre o crescimento das três espécies, sendo esse efeito dependente dos tratamentos de N. Para tamboril, os tratamentos de N diferiram para MSPA, MSR, altura e DC, somente em 0%, somente em 15%, até 30% e em todas as PSC, respectivamente. Para acácia, com exceção da MSPA, que só diferiu em solo sem contaminação, as demais variáveis diferiram de acordo com os tratamentos de N até a PSC 15%. Plantas de sesbânia sobreviveram até a PSC 15% quando rizóbio foi inoculado e até a PSC 30% quando adubadas com fertilizante nitrogenado, sendo por isso analisadas somente por teste de médias até a PSC 15%. Verificou-se que todas as variáveis de produção e crescimento de sesbânia diferiram com os tratamentos de N somente em solo sem contaminação, mostrando que, independentemen-te do tratamento de N, essa espécie foi muito sensível à contaminação com metais. Isso pode ser atribuído ao crescimento inicial mais vigoroso de sesbânia comparado ao das demais espécies estudadas, tornando-a mais sensível aos metais por acumulá-los mais rapidamente em seus tecidos, o que também foi verificado por Mostasso (1997).
Em geral, a inoculação de rizóbio foi menos eficiente que a adubação nitrogenada na promoção do crescimento inicial dessas espécies, principalmente de acácia e sesbânia. Marschener (1995) atribuiu a deficiência de N em leguminosas inoculadas com rizóbio a um período de carência desse elemento entre a infecção da raiz e o início da fixação de N2,
que é prejudicial à formação da área foliar necessária para suprir os fotoassimilados para a formação do nódulo e sua atividade.
Médias seguidas por letras iguais, na vertical, não diferem entre si (Tukey 1%). ** Significativo (P < 0,01).
Quadro 2. Matéria seca da parte aérea e de raiz, altura e diâmetro do caule, de plantas de tamboril em tratamentos de N e proporções de solo contaminado (PSC), cem dias após semeadura
Médias seguidas por letras iguais, na vertical, não diferem entre si (Tukey 1%). ** Significativo (P < 0,01).
Quadro 3. Matéria seca da parte aérea e de raiz, altura e diâmetro do caule, de plantas de acácia em tratamentos de N e proporções de solo contaminado (PSC), cem dias após semeadura
Proporção de solo contaminado (%) Tratamento de N
0 15 30 45 60 Equação R
2
Matéria seca da parte aérea (g planta-1)
N mineral 3,13 a 0,29 a 0,07 a 0,07 a 0,05 a Y= 2,84 - 0,154 x + 0,0020 x2 0,89**
Controle 1,12 c 0,08 a 0,04 a 0,04 a 0,02 a Y= 1,01- 0,055 x + 0,0007 x2 0,87**
BR3617 2,54 b 0,10 a 0,06 a 0,05 a 0,04 a Y= 2,26- 0,127 x + 0,0015 x2 0,86**
Matéria seca de raiz (g planta-1)
N mineral 1,03 a 0,17 a 0,04 a 0,03 a 0,02 a Y= 0,95- 0,049 x + 0,0006 x2 0,93**
Controle 0,64 c 0,03 b 0,03 a 0,02 a 0,02 a Y= 0,76- 0,042 x + 0,0005 x2 0,85**
BR3617 0,86 b 0,06 b 0,03 a 0,03 a 0,02 a Y= 0,58- 0,031 x + 0,0003 x2 0,89**
Altura (cm)
N mineral 36,1 a 13,7 a 4,8 a 4,8 a 3,0 a Y=34,66- 1,4549 x + 0,0159 x2 0,97**
Controle 23,6 c 4,3 b 3,1 a 2,9 a 2,3 a Y=21,52- 1,0209 x + 0,0120 x2 0,89**
BR3617 31,2 b 5,8 b 3,2 a 3,0 a 2,6 a Y=28,65- 1,4020 x + 0,0170 x2 0,91**
Diâmetro do caule (mm)
N mineral 3,6 a 2,3 a 1,0 a 1,0 a 1,0 a Y= 3,55- 0,1125 x + 0,0012 x2 0,98**
Controle 3,0 b 1,0 b 1,0 a 1,0 a 1,0 a Y= 2,77- 0,1028 x + 0,0013 x2 0,85**
BR3617 3,0 b 1,2 b 1,0 a 1,0 a 1,0 a Y= 2,82- 0,1004 x + 0,0012 x2 0,91**
Proporção de solo contaminado (%) Tratamento de N
0 15 30 45 60 Equação R
2
Matéria seca da parte aérea (g planta-1)
N mineral 3,03 a 0,86 a 0,65 a 0,28 a 0,22 a Y = 2,83 - 0,12 x + 0,001 x2 0,93**
Controle 1,41 c 0,46 a 0,33 a 0,28 a 0,19 a Y = 1,31 - 0,05 x + 0,0006 x2 0,92**
BR4406 2,14 b 0,56 a 0,27 a 0,26 a 0,26 a Y = 2,00 - 0,09 x + 0,001 x2 0,94**
UFLA 01-457 2,50 ab 0,37 a 0,31 a 0,32 a 0,21 a Y = 2,27 - 0,11 x + 0,001 x2 0,87**
INPA398 2,48 b 0,48 a 0,38 a 0,28 a 0,21 a Y = 2,27 - 0,11 x + 0,001 x2 0,89**
Matéria seca de raiz (g planta-1)
N mineral 2,08 a 0,7 ab 0,46 a 0,21 a 0,12 a Y = 1,96 - 0,08 x + 0,0080 x2 0,95**
Controle 1,56 a 0,34 b 0,12 a 0,09 a 0,05 a Y = 1,42 - 0,07 x + 0,0008 x2 0,93**
BR4406 1,72 a 1,23 a 0,18 a 0,13 a 0,14 a Y = 1,82 - 0,07 x + 0,0006 x2 0,94**
UFLA 01-457 1,72 a 0,24 b 0,14 a 0,15 a 0,10 a Y = 1,56 - 0,08 x + 0,0009 x2 0,89**
INPA398 1,92 a 0,42 b 0,17 a 0,15 a 0,12 a Y = 1,78 - 0,09 x + 0,0010 x2 0,93**
Altura (cm)
N mineral 26,6 a 16,6 a 13,9 a 10,9 a 9,30 a Y = 25,86 - 0,58 x + 0,005 x2 0,97**
Controle 14,8 c 10,5 b 9,30 b 8,40 a 8,20 a Y = 13,30 - 0,10 x 0,80**
BR4406 18,2 b 16,4 a 10,2 b 9,20 a 8,80 a Y = 17,76 - 0,17 x 0,87**
UFLA 01-457 18,4 b 12,4 b 9,70 b 9,30 a 7,70 a Y = 17,98 - 0,37 x + 0,004 x2 0,97**
INPA398 17,0 bc 12,8 b 11,0 ab 10,2 a 6,90 a Y = 16,14 - 0,15 x 0,95**
Diâmetro do caule (mm)
N mineral 6,0 a 4,1 a 3,3 a 2,9 a 2,3 a Y = 5,87 - 0,11 x + 0,0009 x2 0,98**
Controle 4,4 b 2,9 b 2,6 ab 2,6 ab 2,7 ab Y = 4,28 - 0,09 x + 0,0010 x2 0,95**
BR4406 4,2 b 2,3 b 1,7 b 1,7 bc 1,5 b Y = 4,05 - 0,12 x + 0,0013 x2 0,95**
UFLA 01-457 5,0 b 2,9 b 2,2 b 1,7 bc 2,0 ab Y = 4,91 - 0,14 x + 0,0016 x2 0,99**
Quadro 4. Matéria seca da parte aérea e de raiz, altura e diâmetro do caule, de plantas de sesbânia em tratamentos de N e proporções de solo contaminado (PSC), cem dias após a semeadura
Quadro 5. Índices de tolerância para produção de matéria seca da parte aérea e de raiz, altura e diâmetro do caule de plantas de tamboril, em diferentes tratamentos de N e proporções de solo contaminado com metais pesados (PSC)
disponibilidade no solo em estudo. A clorose pode ser sintoma de deficiência de elementos, como Fe e Mn, que participam da formação, da multiplicação e do funcionamento dos cloroplastos ou na síntese de clorofila (Malavolta, 1994). A deficiência destes nutrientes está, possivelmente, relacionada com o desequilíbrio no processo de absorção e translocação dos macronutrientes, decorrente da inibição competitiva com outros íons, como, por exemplo, Cd e Zn (Marques et al., 2000), causando o menor crescimento das plantas. O atrofiamento foi mais acentuado em plantas de acácia a partir da PSC 30%. Tamboril apresentou todos estes sintomas, mas em menor intensidade que as demais espécies.
Proporção de solo contaminado (%)
Parte aérea Raiz Altura Diâmetro
Tratamento de N
0 15 0 15 0 15 0 15
______________________________________ g planta-1______________________________________ _________________ cm _________________ ______________ mm ______________
N mineral 4,02 a 0,24 a 2,38 a 0,16 a 39,9 a 9,9 a 5,3 a 2,1 a
Controle 1,96 c 0,21 a 0,93 bc 0,09 a 29,4 bc 9,0 a 4,1 bc 1,8 a
BR 5401 2,80 b 0,15 a 1,02 b 0,21 a 33,8 b 6,9 a 4,5 ab 2,0 a
UFLA 01-483 1,98 c 0,13 a 0,80 bc 0,08 a 30,0 b 6,0 a 3,3 cd 1,6 a
UFLA 01-515 1,49 c 0,14 a 0,56 c 0,08 a 24,8 c 7,8 a 2,8 d 1,7 a
(1) Percentagem de rendimento da variável em relação ao solo sem contaminação.
Índice de tolerância (%(1))
Tratamento de N
PSC Parte aérea Raiz Altura Diâmetro do caule
% _____________ g planta-1_____________ cm mm
N mineral 0 100 100 100 100
15 28 34 62 68
30 21 22 52 55
45 9 10 41 48
60 7 6 35 38
Controle 0 100 100 100 100
15 32 22 71 66
30 23 8 63 59
45 20 6 57 59
60 13 3 55 52
BR 4406 0 100 100 100 100
15 26 71 90 55
30 13 10 56 40
45 12 7 50 40
60 12 8 48 36
Médias seguidas por letras iguais, na vertical, não diferem entre si (Tukey 1%).
das espécies à contaminação do solo foi tamboril > sesbânia > acácia na PSC 15% e tamboril > acácia > sesbânia nas PSC superiores, sendo tamboril a espécie mais tolerante e a mais promissora para programas de revegetação de solos contaminados com metais pesados.
Nodulação e atividade da nitrogenase
A nodulação foi inibida em todas as espécies vegetais com o aumento da PSC e foi ausente nos tratamentos com fertilizante nitrogenado e controle absoluto. A ausência de nodulação também foi verificada nos tratamentos de inoculação com rizóbio,
Quadro 6. Índices de tolerância para produção de matéria seca da parte aérea e de raiz, altura e diâmetro do caule de acácia, em diferentes tratamentos de N e proporções de solo contaminado com metais pesados (PSC)
Quadro 7. Índices de tolerância para produção de matéria seca da parte aérea e de raiz, altura e diâmetro do caule de sesbânia, em diferentes tratamentos de N e proporções de solo contaminado com metais pesados (PSC)
(1) Percentagem de rendimento da variável em relação ao solo sem contaminação.
Índice de tolerância (%(1))
Tratamento de N
PSC Parte aérea Raiz Altura Diâmetro do caule
% _____________ g planta-1_____________ cm mm
N mineral 0 100 100 100 100
15 9 16 38 64
30 2 3 13 28
45 2 3 13 28
60 2 2 9 28
Controle 0 100 100 100 100
15 7 5 18 33
30 3 5 13 33
45 3 3 12 33
60 2 3 10 33
BR3617 0 100 100 100 100
15 4 7 18 40
30 2 3 10 33
45 2 3 10 33
60 2 3 8 33
(1) Percentagem de rendimento da variável em relação ao solo sem contaminação.
Índice de tolerância (%(1))
Tratamento de N
PSC Parte aérea Raiz Altura Diâmetro do caule
% _____________ g planta-1_____________ cm mm
N mineral 0 100 100 100 100
15 6 7 25 40
30 2 2 10 36
45 0 0 0 0
60 0 0 0 0
Controle 0 100 100 100 100
15 11 10 31 44
30 0 0 0 0
45 0 0 0 0
60 0 0 0 0
BR5401 0 100 100 100 100
15 5 21 20 44
30 0 0 0 0
45 0 0 0 0
Quadro 8. Número, peso e atividade da nitrogenase de nódulos de raízes de sesbânia em diferentes tratamentos de N e proporções de solo contaminado com metais pesados nas misturas de solos
a partir das PSC 15, 30 e 45%, para acácia, sesbânia e tamboril, respectivamente. Em solo sem contaminação, a inoculação de BR5401 em sesbânia resultou em número, peso de nódulos e atividade específica da nitrogenase superiores aos dos isolados de solos contaminados UFLA 01-483 e UFLA 01-515, que “in vitro” foram mais tolerantes a metais (Quadro 8). Na PSC 15%, a nodulação foi muito reduzida, e os isolados UFLA 01-483 e UFLA 01-515 não diferiram de BR5401 em peso e número de nódulos, contudo, somente nódulos originados da simbiose com a estirpe BR5401 apresentaram atividade da nitrogenase cinco vezes superior à atividade dos nódulos em solo sem contaminação.
No entanto, esse aumento da atividade específica da nitrogenase não deve ser interpretado como efeito benéfico da contaminação do solo à planta ou à simbiose, visto que, na PSC 15%, ocorreu redução no crescimento vegetativo, produção de matéria seca, número e peso dos nódulos.
Este comportamento também foi observado por Matsuda et al. (1998), para mudas de guandu (Cajanus cajan), e por Mostasso (1997), para espécies arbóreas e arbustivas, e pode estar relacionado com um mecanismo de defesa da simbiose contra os efeitos tóxicos dos metais, ou seja, plantas e microssimbiontes em situação de estresse buscam uma forma de suprir o fornecimento e, ou, armazenamento de N nos tecidos da planta, mantendo elevada a atividade específica da nitrogenase.
Em plantas de tamboril, a estirpe BR4406 e os isolados UFLA 01-457 e INPA398 inoculados não diferiram em número e peso de nódulos em solo sem contaminação, mas a atividade específica da nitrogenase foi superior para a simbiose com BR4406 (Quadro 9). Na PSC 15%, BR4406 não diferiu de
UFLA 01-457 e superou INPA398 em número, mas não diferiu em peso de nódulos. No entanto, como ocorreu para sesbânia, também para tamboril, somente a inoculação com a estirpe BR4406 resultou em nódulos com atividade da nitrogenase 10 vezes superior à determinada em solo sem contaminação, sendo o único tratamento a apresentar nódulos, embora inativos, na PSC 30%.
A simbiose de Bradyrhizobium com tamboril foi mais tolerante que a simbiose com acácia, que só nodulou em solo sem contaminação. Essa ausência de nodulação pode ser atribuída aos efeitos fitotóxicos dos metais com provável decréscimo na quantidade de fotoassimilados liberados na região rizosférica, já que a inoculação de rizóbio e a adição de fertilizante nitrogenado não diferiram na produção de MSPA das plantas de acácia na PSC 15%.
Esta também pode ter sido a causa da formação de nódulos inativos em plantas de tamboril, na PSC 30%, diferindo do estudo de MacGrath et al. (1988), que verificaram que o efeito fitotóxico dos metais pesados foi superado quando plantas de trevo branco foram cultivadas com fertilizante nitrogenado em solo contaminado e concluíram que a FBN foi totalmente suprimida devido ao efeito tóxico do metal sobre o rizóbio, contudo o nível de contaminação do solo estudado por este autor foi bem inferior ao do presente estudo.
A presença dos metais na PSC 15% pode ter causado a morte ou apenas ter interferido nos processos de reconhecimento e infecção entre Bradyrhizobium e acácia, pois sabe-se que esta bactéria pode viver em vida livre por longos períodos, na ausência de planta hospedeira (Nutman, 1975).
Além disso, Smith & Giller (1992), sugerem que a presença de rizóbio tolerante e, ao mesmo tempo,
(1) Números transformados seguindo a expressão x+0,5.
Médias seguidas por letras iguais na vertical, não diferem entre si (Tukey 1%).
Proporção de solo contaminado (%)
Número(1) Peso de nódulo fresco Atividade da nitrogenase
Tratamento de N
0 15 0 15 0 15
_______________ g planta-1_______________ __ moles C2H4 g nod-1 s-1__
BR5401 13,9 a 3,6 a 0,325 a 0,037 a 2336 a 11664 a
UFLA 01-483 9,8 b 2,6 a 0,166 b 0,021 a 1167 b 0 b
UFLA 01-515 11,2 b 3,4 a 0,208 b 0,030 a 1225 b 0 b
Controle 0 c 0 b 0 c 0 b 0 c 0 b
Quadro 9. Número, peso e atividade da nitrogenase de nódulos de raízes de tamboril em diferentes tratamentos de N e proporções de solo contaminado com metais pesados nas misturas de solos
(1) Números transformados seguindo a expressão 0,5.
Médias seguidas por letras iguais na vertical, não diferem entre si (Tukey 1%).
Proporção de solo contaminado (%)
Número(1) Peso de nódulo fresco Atividade da nitrogenase
Tratamento de N
0 15 30 0 15 30 0 15
_____________________ g planta-1____________________ _ moles C2H4 g nod-1 s-1_
BR4406 5,47 a 3,74 a 2,74 a 0,34 a 0,15 a 0,09 a 228 a 2325 a
UFLA 01-457 5,88 a 3,19ab 0 b 0,38 a 0,11 a 0 b 152 b 0 b
INPA398 5,72 a 2,47 b 0 b 0,33 a 0,06 b 0 b 178 b 0 b
Controle 0 b 0 c 0 b 0 b 0 c 0 b 0 c 0 b
N mineral 0 b 0 c 0 b 0 b 0 c 0 b 0 c 0 b
eficiente em fixar N2 com suas plantas hospedeiras,
seja o mais esperado em solos contaminados com metais, devido à adaptação e ao desenvolvimento de mecanismos específicos de tolerância. Os isolados de Bradyrhizobium e de Azorhizobium de solo contaminado foram capazes de formar simbiose efetiva em solos sem contaminação, diferindo do resultado encontrado por Giller et al. (1989), em que Rhizobium leguminosarum bv. trifolii isolado de nódulos de trevo branco cultivado em solo tratado com lodo de esgoto contaminado com metais foi ineficiente em meio sem contaminação.
Com a presença de vários metais em excesso nas misturas de solos, não foi possível determinar qual metal, ou interação de metais apresentou maior toxidez ao rizóbio, planta hospedeira e à simbiose rizóbio-leguminosa. No entanto, Zn, Cd e Cu são os metais em concentrações mais elevadas no solo contaminado por rejeitos da industrialização de zinco, utilizado neste estudo e, de acordo com Giller et al. (1989), são os mais tóxicos para o rizóbio.
Trabalhos com sais de metais adicionados ao solo têm mostrado maior toxidez de Cd, comparado ao Cu ou Zn, para a formação do nódulo e FBN, com ordem de toxidez: Cd > Co > Cu > Zn (Mcllveen & Cole, 1974) e Cd > Ni > Cu > Zn (Porter & Sheridan, 1981; Päivöke, 1983a,b), respectivamente. Chaudri et al. (1992b) mostraram que a ordem de toxidez de metais ao rizóbio e, indiretamente à FBN, foi Cd > Zn > Cu, quando adicionados ao solo em soluções de sulfato. Chumbo é muito insolúvel no solo e, portanto, menos tóxico às plantas e ao rizóbio (McGrath, 1987). A ausência de simbiose eficiente para tamboril-BR4406 a partir da PSC 30% é um fato preocupante, pois indica uma possível dificuldade quanto ao uso de inoculantes em solos com altas concentrações de metais.
Tolerância de Bradyrhizobium e Azorhizobium
a metais “in vitro”e em simbiose
Os testes de tolerância de rizóbio a Cu, Cd e Zn, utilizando o meio YMA modificado e soluções de metais, apresentaram resultados semelhantes e mostraram que, “in vitro”, Azorhizobium foi mais sensível que Bradyrhizobium e que, para ambos os gêneros, os isolados de solos contaminados com metais foram mais tolerantes. Além disso, a ordem de toxidez dos metais foi Cu > Cd > Zn, para todas as estirpes e isolados estudados, concordando com Chaudri et al. (1992a) e Angle et al. (1993).
No entanto, a tolerância de rizóbio a metais “in vitro” não se correlacionou com a tolerância da simbiose em solo contaminado, embora os metais em maiores concentrações nas misturas tenham sido os mesmos testados “in vitro” (Quadro 10). Isso pode ter ocorrido porque os efeitos tóxicos dos metais sobre plantas e microrganismos dependem da atividade química destes na solução do solo, ou seja, vários fatores podem afetar a solubilidade dos metais e, conseqüentemente, sua toxidez. Um desses fatores é a capacidade tamponante do solo, que pode controlar a disponibilidade do metal na solução (Ibekwe et al., 1998). Além disso, o crescimento de um microrganismo no solo pode diferir do crescimento “in vitro”, mesmo quando concentrações equivalentes de metais são adicionadas em meio de cultura (Nannipiere et al., 1990).
As concentrações tóxicas dos metais a Bradyrhizobium “in vitro” e à simbiose em solos contaminados foram muito superiores às encontradas por estudos semelhantes realizados em países de clima temperado, utilizando solos tratados com lodo de esgoto e espécies herbáceas em simbiose com Rhizobium e Bradyrhizobium japonicum, e
Quadro 10. Concentrações máximas toleradas (CMT) a Cu, Cd e Zn, por estirpes e isolados de Bradyrhizobium e de Azorhizobium, em meio YMA (mg L-1) e em simbiose em solo contaminado (mg dm-3), com respectivos coeficientes de correlação
Limites permissíveis no solo pela Comissão da Comunidade Européia (1986) citada em McGrath et al. (1995): 1,0; 50 e 150 mg dm-3 de Cd, Cu e Zn, respectivamente, extraídos por “aqua regia”.
(1) Extraído por DTPA (mg dm-3); ns: Não-significativo.
estão muito acima dos limites permitidos pela Comissão da Comunidade Européia (McGrath et al., 1995) (Zn = 150-300; Cd = 1-3; Cu = 50-140 e Pb = 50-300 mg dm-3 extraídos por aqua regia).
Como exemplo, solo com teores totais de Zn = 334, Cd = 10, Cu = 99 e Ni = 27 mg dm-3 causou redução
de 40% na produção de trevo branco, devido aos efeitos tóxicos sobre Rhizobium, reduzindo em 50% a fixação de N2 (McGrath et al., 1988). Essas
concentrações totais foram muito inferiores às toleradas em solo contaminado por rejeitos da industrialização de Zn do presente estudo, fazendo-se extração por DTPA. Além disso, na PSC 15%, que corresponde a Zn = 750, Cd = 22, Cu = 111 e Pb = 65 mg dm-3, embora tenha havido diminuição na
produção e crescimento vegetativo das plantas, a atividade específica da nitrogenase foi estimulada e aumentou nas simbioses mais tolerantes à contaminação com metais.
CONCLUSÕES
1. A contaminação inibiu o crescimento vegetativo e a nodulação das três espécies, sendo tamboril a mais tolerante e, portanto, a mais promissora para revegetação de solos com excesso de metais.
2. A simbiose de Bradyrhizobium com tamboril foi mais tolerante à contaminação que a simbiose com acácia e também foi mais tolerante que a simbiose de Azorhizobium com sesbânia.
Cu Cd Zn
Estirpe/isolado
Solo(1) YMA Solo(1) YMA Solo(1) YMA
Bradyrhizobium -tamboril
BR4406 184 > 40 42,5 > 40 1125 800
INPA398 111 20 22,1 30 750 500
UFLA 01-457 111 > 40 22,1 > 40 750 800
Azorhizobium – sesbânia
BR5401 111 5 22,1 20 750 300
UFLA 01-483 111 5 22,1 20 750 400
UFLA 01-515 111 5 22,1 30 750 400
Bradyrhizobium – acácia
BR3617 1,2 20 0,08 30 0,4 600
Correlação 0,28ns 0,34ns 0,13ns
3. Estirpes e isolados de rizóbio tolerantes e sensíveis a Cu, Cd e Zn “in vitro” não apresentaram o mesmo comportamento quando comparados “in situ”.
LITERATURA CITADA
ANGLE, J.S.; McGRATH, S.P.; CHAUDRI, A.M.; CHANEY, R.L. & GILLER, K.E. Inoculation effects on legumes grown in soil previosly treated with sewage sludge. Soil Biol. Biochem., 25:575-580, 1993.
CHAUDRI, A.M.; McGRATH, S.P. & GILLER, K.E. Metal tolerance of isolates of Rhizobium leguminosarum biovar trifolli from soil contaminated by past aplication of sewage sludge. Soil Biol. Biochem., 24:83-88, 1992a.
CHAUDRI, A.M.; McGRATH, S.P. & GILLER, K.E. Metal survival of the indigenous population of Rhizobium leguminosarum biovar trifolli in soil spiked with Cd, Zn, Cu and Ni salts. Soil Biol. Biochem., 24:625-632, 1992b.
DAVIDE, A.C.; FARIA, J.M.R. & BOTELHO, S.A. Propagação de espécies florestais. Lavras, Universidade Federal de Lavras, 1995. 41p.
DILWORTH, M.J. Acetylene redution by nitrogen-fixing preparations from Clostridium pasteurianum. Biochem. Bioph. Acta, 127:285-294, 1966.
GILLER, K.E.; NUSSBAUM, R.; CHAUDRI, A M. & McGRATH, S.P. Rhizobium meliloti is less sensitive to heavy-metal contamination in soil than R. leguminosarum bv.trifolii or R. loti. Soil Biol. Biochem., 25:273-278, 1993.
IBEKWE, A.M.; ANGLE, J.S.; CHANEY, R.L. & van BERKUM, P. Zinc and Cadmium Effects on Rhizobia and White Clover using Chelator-Buffered Nutrient Solution. Soil Sci. Soc. Am. J., 62:204-211, 1998.
MALAVOLTA, E. Fertilizantes e seu impacto ambiental: metais pesados, mitos, mistificação e fatos. São Paulo, Produquímica Indústria e Comércio, 1994. 153p.
MARQUES, T.C.L.L.S.M.; MOREIRA F.M.S. & SIQUEIRA J.O. Crescimento e teor de metais de mudas de espécies arbóreas cultivadas em solo contaminado com metais pesados. Pesq. Agropec. Bras., 35:121-132, 2000.
MARSCHNER, H. Mineral nutrition of higher plants. London, Academic Press, 1995. 889p.
MARTENSSON, A.M. & WITTER, F. Influence of various soil amendments on nitrogen-fixing soil microrganisms in a long field experiment, with special reference to sewage sludge. Soil Biol. Biochem., 22:977-982, 1990.
MATSUDA, A.; SIMÃO, J.B.P.; MOREIRA, F.M.S. & SIQUEIRA, J.O. Crescimento e nodulação de leguminosas em solo contaminado com metais pesados. In: FertBIO’98, Caxambu, 1998. Resumos. Caxambu,UFLA/SBCS/SBM, 1998. p.75. McGRATH, S.P. Long-term studies of metal transfers following
aplication of sewage sludge. In: COUGHTREY, P.J.; MARTIN M.H. & UNSWORTH M.H., eds. Pollutant transport and fate in ecosystems. Oxford, Blackwell Scientific, 1987. p.301-317.
McGRATH, S.P.; BROOKES, P.C. & GILLER, K.E. Effects of potentially toxic metals in soil derived from past applications of sewage sludge on nitrogen fixation by Trifolium repens. Soil Biol. Biochem., 20:415-424, 1988.
McGRATH, S.P.; CHAUDRI, A.M. & GILLER, K.E. Long-term effects of metals in sewage sludge on soils, microorganisms and plants. J. Ind. Microbiology, 14:94-104, 1995.
McLLVEEN, W. & COLE, H. Influence of heavy metals nodulation of red clover. Phytopathol., 64:583-588, 1974.
MOREIRA, F.M.S.; HAUKKA, K. & YOUNG, J.P.W. Biodiversity of rhizobia isolated from a wide range of forest legumes in Brazil. Mol. Ecol., 7:889-895, 1998.
MOSTASSO, F.L. Crescimento e nodulação de leguminosas em solo contaminado com metais pesados. Lavras, Universidade Federal de Lavras, 1997. 50p. (Tese de Mestrado)
NANNIPIERE, P.; GRECO, S. & CECCANTI, B. Ecological significance of biological activities in soils. In: BOLLANG, J.M. & STOTZKY, G., eds. Soil biochemistry. New York, Marcel Dekker, 1990. p.293-356.
NUTMAN, P.S. Rhizobium in soil. In: WALKER, N., ed. Soil microbiology. A critical review. London, Butterworths, 1975. p.11-131.
OBBARD, J.P.; SAUERBECK, D.R. & JONES, K.C. Rhizobium leguminosarum bv. trifolii in soil amended with heavy metal contaminated sewage sludges. Soil Biol. Biochem., 25:227-231, 1993.
PÄIVÖKE, A. The long-term effects of zinc on the growth and development, chlorophyl content and nitrogen fixation of garden pea. Ann. Bot. Fennici, 20:205-213, 1983a. PÄIVÖKE, A. The long-term effects of leadand arsenate on the
growth and development, chlorophyl content and nitrogen fixation of garden pea. Ann. Bot. Fennici, 20:297-306, 1983b. PORTER, J.R. & SHERIDAN, R.P. Inhibition of nitrogen fixation in alfafa by arsenate, heavy metals, fluoride, and simulated acid rain. Plant Physiol., 68:143-148, 1981.
REDDY, G.B.; CHENG, C.N. & DUNN, S.J. Survival of Rhizobium japonicum in soil-sludge environment. Soil Biol. Biochem., 15:343-345, 1983.
RIBEIRO-FILHO, M.R.; CURI, N.; SIQUEIRA, J.O. & MOTTA, P.E.F. Metais pesados em solos de área de rejeitos de indústria de processamento de zinco. R. Bras. Ci. Solo, 23:189-483, 1999.
ROJAS, E.P.; SIQUEIRA, J.O. & MOREIRA, F.M.S. Crescimento de Enterolobium contortisiliquum (Vell.) Morong. Com e sem micorrização em solo contaminado com metais pesados. In: SOLO-SUELO-CONGRESSO LATINO AMERICANO DE CIÊNCIA DO SOLO, 23., 1996. Águas de Lindóia. Anais. Viçosa, Sociedade Brasileira de Ciência do Solo, 1996. (CD-ROM)
ROTHER, J.A.; MILLBANK, J.W. & THORNTON, I. Nitrogen fixation by white clover (Trifolium repens) in glasslands on soils contaminated with Cd, Pb, and Zn. J. Soil Sci., 34:127-136, 1983.
SMITH, S.R. & GILLER, K.E. Effective Rhizobium leguminosarum bv. trifolii present in five soils contaminated with heavy metals from long-term applications of sewage sludge or metal mine spoil. Soil Biol. Biochem., 24:781-788, 1992.
TRANNIN, I.C.B.; MOREIRA, F.M.S.; SIQUEIRA, J.O. & LIMA, A. Tolerância de estirpes e isolados de Bradyrhizobium e de Azorhizobium a zinco, cádmio e cobre "in vitro". R. Bras. Ci. Solo, 25:305-316, 2001.
VINCENT, J.M. A Manual for the pratical study of root-nodule bacteria. London, JBP, 1970. 164p. (Handbook,15) WITTER, E. Agricultural use of sewage sludge controlling metal
contamination of soils. Stockholm, Norstedts Tryckeri AB, 1989. 429p.
