Desenvolvimento de um biossensor potenciométrico, à base de soja, para a determinação de uréia

(1)

Katharina Carla Santos de Oliveira

Desenvolvimento de um biosensor potenciométrico,

à base de soja, para determinação de uréia

_______________________________________

Dissertação de Mestrado

Natal/RN, fevereiro de 2008

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA

(2)

Katharina Carla Santos de Oliveira

DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR

POTENCIOMÉTRICO, À BASE DE SOJA, PARA A

DETERMINAÇÃO DE URÉIA

Dissertação realizada sob a orientação do Prof. Dr.Jailson Vieira de Melo, apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da UFRN em preenchimento parcial dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Química.

Orientador: Prof. Dr. Jailson Vieira de Melo

(3)

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / SISBI / Biblioteca Setorial Especializada do Centro de Ciências Exatas e da Terra – CCET.

Oliveira, Katharina Carla Santos de.

Desenvolvimento de um biossensor potenciométrico, à base de soja, para a determinação de uréia / Katharina Carla Santos de Oliveira. – Natal, 2008. 119 f. : il.

Orientador: Prof. Dr. Jailson Vieira de Melo.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências Exatas e da Terra. Programa de Pós-Graduação em Química.

1. Biossensor potenciométrico – Dissertação. 2. Membrana enzimática – Dissertação. 3. Grãos de soja – Dissertação. I. Melo, Jailson Vieira de. II. Título.

(4)

(5)

(6)

AGRADECIMENTOS

Dirijo o meu mais sincero agradecimento...

A Deus, que nos fortalece nos momentos mais difíceis.

Ao Prof. Dr. Jailson Vieira de Melo pelo apoio, confiança, paciência, incentivo e orientação, tornando possível o desenvolvimento deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Marconi Floripe Ginani e a Prof.aMaria de Fátima Vitória de Moura pelos relevantes comentários e sugestões no exame de qualificação;

A Débora Carvalho de Lira, pela longa amizade e com quem eu tive o privilégio de trabalhar. E a Hirla Cunha pelo apoio recebido on-line.

A Cipriano pela colaboração com os seus conhecimentos e pela disponibilidade demonstrada em todos os momentos solicitados.

A Paula, Ângela, Eliane, Isabel Daniela Cristiane e todos os amigos da Analítica.

Aos funcionários do Departamento de Química pela atenciosa e amigável forma com que sempre se dirigem aos alunos.

Aos funcionários da Biblioteca Central e Setorial de Química, cuja eficiência só nos faz enriquecer.

(7)

"A mais alta das torres começa no solo."

(8)

RESUMO

Neste trabalho, o alvo em estudo foi o desenvolvimento de um biossensor potenciométrico para detecção de uréia, a partir da urease extraída de grãos de soja. Inicialmente, fez-se um estudo quimiométrico, através de um planejamento fatorial 24, objetivando-se encontrar condições ótimas para a extração da urease sem que suas propriedades fossem afetadas. A partir deste estudo, determinaram-se as melhores condições para a obtenção de extratos ricos em urease, permitindo a confecção de biossensores com boas características. Estes foram confeccionados usando um eletrodo de platina como transdutor com a urease dispersa em matriz de quitosana e reticulada em vapor de glutaraldeído. Os biossensores obtidos apresentaram um limite de detecção de uréia igual a 0,33 mM e faixa linear entre 0,33 e 3 mM do substrato. O tempo de resposta foi considerado alto, principalmente, em concentrações baixas do substrato, onde se levou cerca de 5 minutos por análise. Para concentrações altas esse tempo foi reduzido para pouco mais de um minuto. O tempo de vida foi limitado pela aderência da membrana enzimática ao transdutor, mas foi possível manter o biossensor com funcionamento por um mês com cerca de 50 medidas realizadas. A aplicação do biossensor para análises de fertilizantes à base de uréia apresentou excelente resultado para uma amostra com poucos interferentes, mas foi diferente quando o fertilizante utilizado era oriundo de uma amostra complexa. Porém o rótulo não expressava se o teor de nitrogênio era totalmente proveniente da uréia. Uma avaliação dos parâmetros cinéticos da reação catalítica do biossensor mostrou coerência com os resultados expostos na literatura.

(9)

ABSTRACT

In this work, the objective in study was the development of a biossensor potencyometric for urea detection, starting from the extracted urease of soy grains. Initially, was made a chemometrics study, through a planning factorial 24, objectified to find great conditions for the extraction of the urease without its properties were affected. Starting from this study, the best conditions were determined for the obtaining of rich extracts in urease, allowing the biossensors making with good characteristics. These were made using a platinum electrode as transducer with the dispersed urease in chitosan head office and reticulated in glutaraldehyde vapor. The biossensors obtained presented a limit of urea detection the same to 0,33 mM and lineal strip between 0,33 and 3 mM of the substratum. The time of answer was considered loud, mainly, in low concentrations of the substratum, where it was taken about 5 minutes by analysis. For high concentrations that time was reduced for not more than one minute. The time of life was limited by the adherence of the enzymatic membrane to the transducer, but it was possible to maintain the biossensor with operation for one month with about 50 accomplished measures. Application of the biossensor for analyses of fertilizers to the urea base presented excellent result for a sample with few interfering, but it was different when the used fertilizer was originating from of a complex sample. Even so the label was not expressed the text of nitrogen it was totally coming of the urea. An evaluation of the kinetic parameters of the catalytic reaction of the biossensor showed coherence with the results exposed in the literature.

(10)

LISTA DE FIGURAS

2.1 Esquema de um biossensor. 24

2.2 Modelo de reação entre a enzima e o glutaraldeído. 58

2.3 Estrutura monomérica dos biopolímeros. 60

4.1 Variação de pH no extrato de soja para uma concentração de uréia

igual a 6,25 mM em diferentes temperaturas 79

4.2 Resposta da atividade enzimática dos extratos de soja para uma

concentração de uréia igual a 6,25 mM.. 81

4.3 Representação geométrica dos resultados. 87

4.4 Gráfico de probabilidade acumulada. 90

4.5 Gráfico de probabilidade acumulada, em destaque os efeitos que se

encontram no limite de significância 91

4.6 Resposta da atividade enzimática do extrato de soja em função do pH. 91

4.7 Potencial do eletrodo de platina em tampão com diferentes valores de

pH. 92

4.8 Sistema de montagem para o eletrodo modificado 93

4.9 Visão geométrica das respostas do biossensor confeccionado a partir

(11)

4.10 Resposta do biossensor elaborado com a enzima purificada para a concentração de uréia igual a 0,065mM em tampão 6,5 fosfato em

diferentes temperaturas 96

4.11 Resposta do biossensor elaborado com a enzima purificada para a concentração de uréia igual a 0,065mM em tampão fosfato em diferentes pH.

97

4.12 Modelo de reticulação da enzima associada ao glutaraldeído e

quitosana 99

4.13 Média da diferença de potencial em relação à porcentagem do extrato enzimático em filmes com diferentes quantidades do extrato de soja (8) e quitosana, com a concentração de uréia igual a 0,065 mM em tampão

fosfato pH 6,5. 100

4.14 Resposta do biossensor elaborado com extrato de soja com a concentração de uréia igual a 0,065mM em tampão fosfato em diferentes

temperaturas. 101

4.15 Curva de calibração com 0,2M de uréia em pH 6,5 para o biossensor

enzimático a partir da soja imobilizada. 102

4.16 Representação linear da curva de calibração para o biossensor

enzimático a partir da soja imobilizada. 102

4.17 Resposta de medidas sucessivas do biossensor confeccionado com 80% de extrato de soja para a concentração de uréia igual a 6,25 mM em

tampão fosfato 6,5 a 30 oC. 103

4.18 Relação entre o tempo de resposta e resistência após sucessivas medidas em um biossensor imobilizado pela soja com uma concentração

(12)

4.19 Gráfico com o tempo de resposta do biossensor com 80% do extrato de soja em diferentes concentrações de uréia em tampão fosfato pH 6,5 a

30oC. 105

4.20 Variação da resposta em função do tempo, para os mesmas condições de análise com diferentes espessuras de membranas enzimática:(a) 10 PL,

(b) 5 PL (c) 15 PL. 106

4.21 Resposta do biossensor enzimático a base de 80% do extrato de soja utilizando concentrações distintas do substrato em pH 6,5 a 30ºC. Nos

sentidos crescente e decrescente da ordem de adição dos substratos. 107

4.22 Curva de calibração utilizando o filme a partir do extrato de soja em

tampão fosfato pH 6,5 a 30 oC. 109

4.23 Representação gráfica da linearização da equação de

Michaelis-Menten. 110

4.24 Curva de calibração a partir dos resultados experimentais modificados

(13)

LISTA DE QUADROS

1 Classificação de sensores e biossensores a partir do transdutor utilizado 25

2.2 Vantagens e desvantagens do uso de tecidos associados a transdutores

eletroquímicos. 32

2.3Combinações típicas bioreceptor/transdutor e seu respectivo sinal. 36

2.4 Tipos de transdutores eletroquímicos. 37

(14)

LISTA DE TABELAS

3.1 Fatores usados com seus respectivos valores dos níveis superiores e

inferiores. 67

3.2 Condições estabelecidas para o preparo dos 16 extratos. 68

4.1 Matriz de planejamento 24, incluindo as interações de 1a, 2a, 3a e 4 a

ordem entre os fatores. 80

4.2 Ensaios experimentais para as análises realizadas no planejamento fatorial 24com suas respectivas respostas em (R1 e R2) em duplicata, além

da média das respostas e desvios 81

4.3 Valores dos efeitos principais e interação dos fatores. 84

4.4 Respostas dos valores obtidos experimentalmente e os calculados pelo

modelo estatístico. 90

4.5 Condições de planejamento e resultados obtidos na análise do biossensor com o uso da enzima purificada. 94

4.6 Efeitos do biosensor manufaturado pela urease pura comercial. 95

4.7 Avaliação da proporção extrato de soja/quitosana nas membranas

enzimáticas. 109

(15)

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético; FET Transistores de efeito de campo;

ENFETs Biossensores potenciométricos com efeito de campo; ISFET Transistores de efeito de campo a íons;

LD Limite de detecção;

ISEFET´s Transdutores, com efeito, em campo sensível a íons; ISES´s Eletrodos de íons seletivos de íons;

LN Limite Nernstiano;

PIM Polímeros de impressão molecular; PNA Ácidos nucléicos peptídicos;

Apts Aptâmeros;

DNA Ácido desoxirribonucléico; RNA Ácido ribonucléico;

LD Limite Nerstiniano; LN Limite de detecção [E] Enzima;

[ES] Substrato; [P] Produto;

pH log da concentração de H+; Ka Constante de equilíbrio do ácido; Et Concentração total da enzima;

Km Constante de Michaelis-Menten;

R Constante dos Gases; pKa - log de Ka;

Eo Potencial padrão da célula; T Temperatura absoluta, zx Carga iônica;

ax Atividade do íon x.

(16)

(17)

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO. 20

1.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 21

2 REVISÃO DA LITERATURA. 23

2.1 BIOSSENSORES. 23

2.2 DEFINIÇÃO DOS BIOSSENSORES 24

2.3 CARACTERÍSTICAS DOS BIOSSENSORES. 27

2.4 DESENVOLVIMENTO DOS BIOSSENSORES. 28

2.4.1 Tipo de interação. 29

2.4.1.1 Sensores biocatalíticos. 30

2.4.1.2 Sensores de bioafinidade. 33

2.4.2 Sistema de transdução. 35 2.4.2.1 Transdutor eletroquímico. 37

2.5 BIOSSENSORES POTENCIOMÉTRICOS. 37

2.5.1 Propriedades dos biossensores potenciométricos 39 2.5.1.1 Estabilidade. 39

2.5.1.2 Sensibilidade. 40

2.5.1.3 Tempo de resposta. 41

2.6 BIOSSENSORES SENSÍVEIS À URÉIA. 42

2.6.1 Métodos Enzimáticos. 44

2.7 ENZIMAS. 45

2.7.1 Cinética enzimática. 46

2.7.2 Atividade enzimática. 49

(18)

2.7.3.2 Influência da concentração da enzima. 50

2.7.3.3 Influência de ativadores. 51

2.7.3.4 Influência dos inibidores. 51

2.7.3.5 Influência da temperatura. 51

2.7.3.6 Influência do pH. 52

2.7.3.7 Influência do sistema tampão. 53

2.8 IMOBILIZAÇÃO ENZIMÁTICA. 53

2.8.1 Técnicas de imobilização. 54

2.8.1.1 Imobilização por oclusão. 56

2.8.1.2 Imobilização por adsorção. 56

2.8.1.3 Imobilização por ligação covalente. 57

2.8.1.4 Imobilização por ligação covalente ou cruzada 57

2.9 MODIFICAÇÃO DO ELETRODO COM O USO DA QUITOSANA E DO GLUTARALDEÍDO 59

2.9.1 Quitosana. 59

2.10 CARACTERIZAÇÃO DA UREASE OBTIDA A PARTIR DA FONTE VEGETAL GLYCINE MAX. 61

2.10.1 Urease. 61

2.10.1.1 Características gerais da urease. 61

2.10.1.2 Principais fontes de urease. 61

2.10.1.3 Ativadores e inibidores da urease. 62

2.11 PLANEJAMENTO FATORIAL. 62

3 METODOLOGIA. 66

3.1 PLANEJAMENTO FATORIAL 66

3.2 PREPARO DOS EXTRATOS E MEDIDA DA ATIVIDADE DA UREASE. 67

(19)

3.4 OBTENÇÃO DA RESPOSTA. 70

3.5 A AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO NERNSTINIANO DO

ELETRODO DE PLATINA. 71

3.6 ATIVIDADE ENZIMÁTICA EM FUNÇÃO DA TEMPERATURA. 71

3.7 ATIVIDADE ENZIMÁTICA EM FUNÇÃO DO PH. 71

3.8 PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES 72

3.8.1 Soluções iniciais. 72

3.8.2 Soluções para obtenção do extrato em pH igual a 6,5 73

3.8.3 Soluções para obtenção do extrato em pH igual a 7,4. 73

3.8.4 Preparação da solução de quitosana 73

3.8.5 Aquisição das amostras: soja e fertilizantes. 74

3.8.6 Preparação das amostras de fertilizante 74

3.9 DETERMINAÇÃO DE NITROGÊNIO PELO MÉTODO KJELDAHL 75

3.10 ESTUDO DO TEMPO DE VIDA DO ELETRODO. 75

3.11 ESTUDO DO TEMPO DE RESPOSTA. 75

3.12 ESTUDO DA REPRODUTIBILIDADE DAS AMOSTRAS. 76

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO. 78

4.1 ESTUDO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DO EXTRATO DE

SOJA. 78

4.1.1 Efeito da temperatura sobre a resposta enzimática no

extrato de soja 78

4.1.2 Avaliação das melhores condições para obtenção dos

extratos de soja. 79

4.1.2.1 Planejamento fatorial 24 79

4.1.2.2 Representação geométrica dos resultados. 86

4.1.2.3 Análise por meio dos gráficos normais. 87

4.1.2.4 Modelo estatístico. 88

(20)

4.1.4 Atividade enzimática em função do pH. 91

4.2 CONFECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO BIOSSENSOR. 92

4.2.1 Comportamento Nerstiniano no eletrodo de platina. 92

4.2.2 Imobilização enzimática da urease pura. 92

4.2.2.1 Efeito da temperatura sobre a resposta do biossensor. 96

4.2.2.2 Influência do pH. 96

4.2.3 Imobilização enzimática do extrato de soja. 97

4.2.4 Influência da temperatura sobre a resposta do biossensor com a membrana de extrato de soja 100

4.2.5 Limite de detecção e faixa linear da resposta 101

4.2.6 Reprodutibilidade dos dados 103

4.2.7 Tempo de resposta 104

4.2.8 Tempo de vida dos biossensores 105

4.2.9 Avaliação da histerese do biossensor 107

4.3 APLICAÇÃO DO BIOSSENSOR NA ANÁLISE DE

FERTILIZANTES 108

4.4 CINÉTICA ENZIMÁTICA 109

5 CONCLUSÕES 113

5.1 PERSPECTIVAS DE TRABALHOS FUTUROS 113

(21)

Capitulo 1

Uma longa viagem de mil milhas inicia-se com o movimento de

um pé.

(22)

Capitulo 1- Introdução 20

1 INTRODUÇÃO

Ao longo das últimas décadas, os avanços nos campos da medicina, biologia clínica, indústria agro-alimentar e no controle ambiental têm exigido o desenvolvimento de métodos analíticos cada vez mais precisos. Os biossensores proporcionam, sem dúvida, uma alternativa muito atraente por serem constituídos de sistemas simples, com detecção rápida, seletiva e de baixo custo e também por permitir uma aplicação vasta, sobretudo com cooperação interdisciplinar. Seu potencial de aplicação é amplo, de modo que inúmeras pesquisas vêm sendo desenvolvidas, em várias partes do mundo, no sentido de aperfeiçoar essa tecnologia. A realização de congressos específicos de âmbito internacional e a publicação de revistas especializadas revelam a importância que se tem dado ao tema, nos últimos anos. Outros inúmeros exemplos, com mesma relevância, sobre possíveis aplicações dos biosensores ainda poderiam ser citados. Contribuindo para o melhor entendimento do assunto desta dissertação, nos capítulos seguintes, serão apresentados da seguinte forma: O terceiro capítulo abordará diversos assuntos, de cunho teórico, a respeito do mundo dos biossensores incluindo os diversos sistemas de transdução, aplicações, etc. O quarto capítulo descreverá, em detalhes, a metodologia utilizada em todas as etapas do trabalho. No quinto capítulo serão apresentados os resultados obtidos com as principais observaçõese conclusões retiradas da interpretação de cada um deles. O sexto capítulo traz um resumo das principais conclusões obtidas sobre este trabalho.

(23)

Capitulo 1- Introdução 21

1.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Estudar a viabilidade de materiais como grafite, aço inoxidável e platina para o desenvolvimento de transdutores;

• Determinar o comportamento Nerstiniano do transdutor utilizado;

• Encontrar, através de um planejamento fatorial 24, os efeitos de parâmetros como EDTA, glicerol, e pH de extração e análise sobre a atividade da urease em extratos de soja;

• Estudar a influência da proporção entre o extrato de soja/quitosana na estabilidade da enzima no biossensor;

• Avaliar os parâmetros como estabilidade, temperatura e pH ótimo, faixa linear de resposta, etc., do biossensor desenvolvido, além de suas constantes cinéticas;

(24)

Capitulo 2

(25)

Capitulo 2- Revisão da Literatura 23

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 BIOSSENSORES

Os biossensores são dispositivos que possibilitam a conversão de uma resposta biológica em um sinal elétrico, arranjados com base em substâncias como enzimas, anticorpos, DNA, ou seja, o elemento de reconhecimento biológico do biossensor será uma substância bioativa, cuja função é determinar, de forma seletiva, as concentrações de diversas substancias em vários campos da ciência (RAYMUNDO, 2002). O primeiro biossensor construído, para analisar a glicose, desenvolvido por Clark e Leons (MAAREF et al., 2006) em 1962 foi comercializado a partir de 1975,

com glicose oxidase. Neste caso, a enzima oxida a glicose produzindo um sinal proporcional à concentração do oxigênio consumido. O termo biossensor só aparece na literatura científica, no final dos anos 70, quando se desenvolveu um dispositivo utilizando microorganismos vivos imobilizados em uma superfície de um eletrodo sensível ao íon amônio. Este dispositivo detectava o aminoácido arginina, o qual foi denominado sensor bio seletivo ou biossensor. Este termo ainda hoje é utilizado para designar a união entre um material biológico e um transdutor. A partir desse momento houve um crescimento de suas aplicações em campos distintos da química analítica, com interesse mais recente nos campos de análises ambientais, químicas e farmacêuticas.

(26)

2.2 DEFINIÇÃO DOS BIOSSENSORES

Por definição, um biossensor é uma ferramenta analítica composta de um elemento biológico sensível chamado bio receptor intimamente ligado a um sistema transdutor. O bio receptor deve ser capaz de reconhecer especificamente uma substância alvo presente em um meio complexo, graças a seu sítio ativo particularmente seletivo (ALFAYA; KUBOTA, 2002; MELO et al., 1999). A interação

específica entre o sítio ativo e a substância alvo, em um sinal elétrico mensurável. Portanto, um biossensor tem como finalidade produzir um sinal proporcional à concentração da espécie a ser detectada ao interagir como o bio receptor. Um esquema de um biossensor pode ser visto na Figura 2.1 o qual mostra os componentes constituintes dos dispositivos completo. Dependendo do bio receptor e da sua reação com o substrato, diferentes transdutores podem ser utilizados para sua confecção (MALHOTRA; CHAUBEY; SINGH, 2006) como mostra o Quadro 2.1.

(27)

O princípio de um biossensor baseia se na detecção de um composto de interesse específico para análise. O resultado dessa união produz uma variação das propriedades físico-químicas como pH, composição, concentração, transferência de elétrons, de calor, mudança de potencial, de massa, variação das propriedades óticas, etc. (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007; RUIZ, 2006) que é detectada pelo transdutor. Este sistema transforma o sinal químico em um sinal elétrico indicando a presença do analito correlacionando sua presença, na amostra (id)

Tipos de

Transdutores Descrição

Ópticos O sinal formado é devido às interações entre o analito e a energia radiante

Eletroquímicos O sinal formado é devido a uma interação eletroquímica entre o analito e o elétrodo

Piezoelétrico Dispositivos que transformam a diferença de massa que ocorre sobre o eletrodo modificado com propriedades piezoelétricas Térmicos Dispositivos capazes de medir a diferença de temperatura

Quadro 2.1: Classificação de sensores e biossensores a partir do transdutor utilizado Fonte: (RUIZ, 2006)

Dentre os transdutores mais utilizados encontram-se os térmicos (RICK et al.,

1978) e os eletroquímicos, e dentre os eletroquímicos podem se destacar os amperométricos (COSNIER; LAMBERT; STOYTCHEVA, 2000; CHO; HUANG, 1998; PEREIRA; SANTOS; KUBOTA, 2002), e os potenciométrico (PEREIRA; SANTOS; KUBOTA, 2002).

(28)

relacionam o potencial elétrico à concentração do analito usando os eletrodos íons-seletivos ou gás seletivo (MALHOTRA; CHAUBEY; SINGH, 2006).

Um aspecto de crucial importância na fabricação de um biossensor é o método de deposição da macromolécula biológica, em grande quantidade, sobre o transdutor, com retenção de sua atividade e especificidade. Por essas razões, um grande número de diferentes procedimentos de imobilização já foi investigado empregando-se procedimentos como a adsorção física, ligação covalente ou microencapsulação da biomolécula em diferentes matrizes (TUNER; KARUBE; WILSON, 1987). Cada um desses métodos apresenta vantagens em relação à atividade enzimática, estabilidade, custo e facilidade de manipulação.

O desenvolvimento dos biossensores tem se centrado, principalmente, no campo de diagnósticos clínicos, como exemplo os biossensores para glicose (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007), e, apesar deste interesse, não há uma saída desses dispositivos dos laboratórios para a fabricação e comercialização, em larga escala, para satisfazer as exigências do mercado. Salvo algumas exceções, devido a uma série de obstáculos relacionados, principalmente, com as características do próprio mercado (legislação, inércia metodológica, capacidade de absorção, etc.).

O uso de diferentes tecnologias, implicadas no desempenho e na construção de biossensores, tem permitido amenizar algumas das dificuldades técnicas inicialmente apresentadas. Um exemplo disso são as diferentes combinações de seus componentes. Esses dispositivos estão classificados de acordo o tipo de interação, entre o elemento de reconhecimento do analito e o método para identificar essa interação. Muitos artigos, publicados, nos últimos anos, relatam a detecção de uréia por métodos de imobilização do tipo enzimáticos (LUO; DO, 2004). Esses dispositivos também podem ser utilizados na determinação de vários compostos tóxicos, por apresentar facilidade de utilização e rapidez na obtenção das respostas. Alguns sensores enzimáticos têm aplicações diretas na análise de toxinas, como por exemplo, os fenóis podem ser detectados pelos biossensores baseados em uma phenol oxidase (SOLDATKIN et al., 2000).

(29)

No entanto, a pesquisa sobre biossensores enzimáticos não se restringe apenas à utilização de enzimas purificadas, visto que é possível a utilização de tecidos de plantas ou animais, que contêm uma multiplicidade de enzimas (PEREIRA; SANTOS; KUBOTA, 2002).

2.3 CARACTERÍSTICAS DOS BIOSSENSORES

As características desejadas em relação aos biossensores (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007) estão apresentadas abaixo:

x Alta sensibilidade: Capazes de detectar quantidades inferiores aos limites exigidos por leis, incluindo concentrações de partes por bilhão (

P

g/l) como no caso de resíduos de praguicidas.

x Alta seletividade: O dispositivo interage exclusivamente com o composto de interesse e não com outros que apresentam propriedades similares, sem interferências com substâncias da mesma família.

x Alta confiabilidade: Sistemas que não sejam alterados pela amostra e não apresentem grandes problemas de ruídos.

x Tempo de vida: A estabilidade química, física e mecânica do elemento de reconhecimento condiciona a duração dos componentes biológicos devido à sua própria natureza, geralmente com limitado tempo de vida.

x Baixo custo de produção: Em geral, estes sistemas podem ser fabricados em escala industrial, mas, apesar disso, a disponibilidade limitada de algumas enzimas e existência de fases críticas em sua construção (processo de imobilização) dificultam, em alguns casos, a fabricação desses dispositivos em massa.

(30)

x Manejo sem técnicos especializados: Esta tecnologia não requer pessoal qualidade, pois quando portáteis tornam-se possíveis realizar análise em tempo real. Esta característica é especialmente interessante, no controle de processos, ou análises clínicas, pois permitem a verificação e correção dos parâmetros desejados de forma imediata e automática.

x Tempo de análise: O ideal que o tempo de análise seja curto e possibilite uma resposta rápida.

x Pré-tratamento das amostras: Geralmente não são necessários, mas em certas determinações, são imprescindíveis como etapas de concentração e purificação. Estas permitem eliminar as interferências e assegurar a presença de uma quantidade suficiente do analito mesmo utilizando um pequeno volume.

x Miniaturizaveis: Graças ao desenvolvimento da microeletrônica e da nanotecnologia se têm reduzido bastante as dimensões, permitindo o uso de vários dispositivos em um mesmo sistema realizado assim várias tarefas ao mesmo tempo. Também é aplicável onde o tamanho físico do dispositivo, o volume da amostra e a localização da medida são fatores limitantes.

x Capacidade de multi-análise: Alguns tipos de biossensores operam com a determinação de diferentes analitos de forma simultânea.

Por existir uma ampla variedade de biossensores distintos, nem todos possuem as características citadas anteriormente. A combinação de vários desses dispositivos poderia proporcionar, a muitos destes dispositivos, algumas vantagens frente às técnicas de análise convencionais como a cromatografia, espectrometria, etc.

2.4 DESENVOLVIMENTO DOS BIOSSENSORES

(31)

materiais plásticos condutores entre outros tipos de substratos menos usuais. (PEREIRA et al. 2002). A preferência pelo substrato deve levar em conta as

características apropriadas adequadas ao método de imobilização a ser utilizado.

2.4.1 Tipo de interação

Dependendo do tipo de interação os biossensores podem ser classificados em sensores biocatalíticos ou sensores de bioafinidade.

2.4.1.1 Sensores biocatalíticos

Este tipo de biossensor utiliza biocatalisadores constituídos por enzimas ou sistemas multi-enzimáticos isolados, organismos celulares, células completas de tecidos animais ou vegetais (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007). A seguir veremos a descrição de alguns dos elementos de reconhecimento do tipo biocatalítico. Estes elementos de reconhecimento podem acoplar-se a distintos tipos de transdutores como eletroquímicos, ópticos e termométricos.

Enzima

(32)

Células completas

Neste caso, em vez de purificar as enzimas, utiliza-se como elemento biológico, uma célula completa que possui em seu interior sistemas multi-enzimáticos em meio natural, sendo capaz de utilizar células modificadas geneticamente. A utilização de células completas oferece uma sensibilidade ampla à variedade de substâncias de ocorrência natural ou mesmo sintética. Além disso, a própria célula fornece o mecanismo de transdução que vincula o reconhecimento molecular de uma substância de teste a um evento mensurável pelo observador humano; podem estar relacionadas células bacterianas, fúngicas, protozoários ou células provenientes de organismos superiores e podem ser viáveis ou não (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007). Células viáveis podem metabolizar diversos compostos orgânicos dando lugar ao surgimento de distintos produtos como amônio, dióxido de carbono e ácidos que podem ser monitorizados com o uso de transdutores específicos. São utilizados para detectar a presença de compostos relacionados ao metabolismo como vitaminas, açucares e ácidos orgânicos ou compostos nitrogenados. Também são úteis para detectar compostos que inibem a respiração microbiana como contaminantes ambientais ou substâncias tóxicas.

(33)

Organismos subcelulares

Os organismos subcelulares podem conter determinados sistemas enzimáticos completos, mas não possuem todos componentes presentes em uma célula completa (ROVER JUNIOR, L. et al., 2001) como é o caso de cloroplastos completos, tilacoides ou mitocôndrias. Mitocôndrias e cloroplastos são organismos que cobrem as membranas que possuem sistemas enzimáticos relacionados com a obtenção de energia do interior da membrana. Determinados agentes tóxicos como praguicidas, metais pesados ou detergentes atuam sobre estes sistemas enzimáticos inibindo, de modo que as membranas internas desses organismos podem ser utilizadas como biossensores para detectar este tipo de compostos.

Tecidos

Existem determinados vegetais que, devido à sua função fisiológica no organismo, são uma fonte de enzimas ou sistemas enzimáticos. Podem ser utilizados tecidos distintos como folhas, raízes, frutas ou sementes, preparados e homogeneizados (LOUZADA et al., 2004). Apesar de haver uma tendência recente

de utilização de tecidos de vegetais e/ou extratos brutos no lugar de enzimas purificadas na confecção de biossensores e/ou procedimentos enzimáticos de análise.

O uso de extratos brutos e/ou tecidos vegetais pode apresentar, em alguns casos, certa desvantagem na seletividade do método analítico (VIEIRA et al., 2004),

(34)

Vantagens Desvantagens

Baixo custo Limitada

seletividade Simplicidade na construção Resposta lenta Elevada estabilidade Baixa sensibilidade Evitam processos de extração e purificação de enzimas

Não requerem a adição de cofatores de regeneração enzimática

Vida útil apropriada Atividade elevada

Quadro 2.2: Vantagens e desvantagens do uso de tecidos associados e transdutores eletroquímicos

2.4.1.2 Sensores de bioafinidade

A interação entre o analito de interesse e o elemento de reconhecimento, sem que exista transformação catalítica é a base para o entendimento dos sensores de bioafinidade (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007). Para medir a interação, onde não existe consumo de substratos nem a geração de produtos, se podem utilizar um marcador no receptor.

O inconveniente deste tipo de sistemas é que se requerem alguns passos posteriores como limpeza e separação do excesso de moléculas marcadas e a adição de substratos.

Existem distintos tipos de receptores de bioafinidade como anticorpos, lectinas, células completas, ácidos nucléicos, PIMs, aptâmeros e PNAs.

Anticorpos

(35)

(DAMOS et al., 2004). Em geral, o antígeno e o anticorpo são espécies

eletroquimicamente inertes e, portanto, o imunosensor eletroquímico requer um marcador que será útil para monitorar a reação de afinidade (RICCARDI et al.,

2002). Nesse sentido, o anticorpo ou o antígeno deve ser marcado com enzima, constituindo então o conjugado.

A especificidade e afinidade da interação antígeno-anticorpo determinam a seletividade e sensibilidade do imunosensor, assim como a possibilidade de regeneração. Na prática, para alcançar uma sensibilidade adequada é necessário que o complexo tenha uma alta afinidade, sendo difícil sua dissociação, porque esses sistemas possuem um único uso. Não obstante, o anticorpo pode regenerar-se por dissociação dos complexos mediante a aplicação de agentes distintos que mudam as condições do meio e favorecem esta dissociação, porém, em alguns casos, essas condições prejudicam a estrutura do anticorpo.

Receptores moleculares

As interações de reconhecimento molecular são eventos importantes considerando-se os aspectos biológicos. Este tipo de afinidade entre biomoléculas tem sido bastante investigado, nos últimos anos (FERREIRA, 2006) Nas membranas celulares existem distintos receptores moleculares, além de proteínas de ligação que podem imobilizar-se em diferentes superfícies e ser utilizadas como elementos de reconhecimento associados aos diversos transdutores. Existem proteínas transportadoras que formam canais que podem acoplar-se a membranas lipídicas sintetizadas de maneira artificial. A união do analito a estes receptores produz a formação de canais através dos quais se gera um fluxo de íons que se pode monitorar mediante tipos distintos de transdutores eletroquímicos (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007).

Células completas

As células completas oferecem uma grande sensibilidade a muitas substancias natural ou sintética, além de detectar um grande número de compostos químicos dentro de um intervalo maio de pH e temperatura (id.). Nas células existem

(36)

correspondente emitindo respostas fisiológicas amplificadas como a abertura de canais iônicos, a ativação de sistemas mensageiros secundários e a ativação de enzimas que podem ser monitoradas por transdutores distintos. Estes tipos de receptores apresentam afinidade por compostos relacionados estruturalmente, tornando-se interessantes para a detecção de multi-analitos.

Lectinas

As lectinas pertencem a um grupo de proteínas, que se unem de maneira seletiva e reversível a alguns sacarídeos como os oligossacarídeos, que se encontram nas paredes celulares das bactérias. São moléculas facilmente disponíveis e econômicas que podem associar-se a transdutores como os piezoelétrico (id.).

Ácidos nucléicos

O comportamento eletroquímico do DNA e os efeitos de sua adsorção sobre diversos tipos de eletrodos vêm sendo pesquisados (LA-SCALEA; SERRANO; GUTZ, 1999). Os biossensores para análise de DNA baseiam-se no processo de hibridização quando ocorre a união de uma cadeia de DNA com sua cadeia complementar, também conhecido como gene chips, utilizados para o reconhecimento e quantificação de DNAs nas amostras de interesse. Este processo pode ser realizado em dissolução de suportes sólidos e em seguida utilizam marcadores específicos que se unem às seqüências híbridadas, como marcadores fluorescentes ou enzimáticos. Podem acoplar-se em sistemas de transdução ópticos, gravimétricos e eletroquímicos. São utilizados para a detecção de organismos modificados geneticamente e microorganismos patógenos.

Polímeros de impressão molecular

(37)

biomimético semelhante aos sistemas específicos enzima-substrato e/ou antígeno-anticorpo. Suas principais vantagens em relação aos materiais biológicos estão na possibilidade de síntese em situações onde nenhuma biomolécula se encontra disponível ou em ambientes adversos, nos quais biomoléculas naturais não resistiriam, como na presença de ácidos, bases, íons metálicos, solventes orgânicos, altas temperaturas e alta pressão.

Aptâmeros

Os aptâmeros (Apts) são pequenas moléculas capazes de reconhecer e ligar-se a proteínas-alvo com afinidade e especificidade muito elevadas (FAROKHZAD et al.,

2006). Por ser uma seqüência de oligonucleotídeos (DNA ou RNA) de cadeia simples sintetizada artificialmente, são capazes de reconhecer diversas moléculas com afinidade e especificidade elevadas (FERIOTTO et al., 2001). Estas moléculas se assemelham aos anticorpos, adquirindo uma conformação determinada podendo unir-se ao analito (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007).

Ácidos nucléicos peptídicos

Os ácidos nucléicos peptídicos ou PNAs são outro tipo de moléculas sintéticas que mimetizam o DNA-RNA. Logo, sua estrutura é muito similar a estes ácidos (FERIOTTO et al., 2001). Estão formados por um esqueleto de monômeros (N-2-aminoetilglicina) unidos por ligações peptídicas com bases nitrogenadas. A diferença dos ácidos nucléicos para os PNAs é ausência de pentoses nos grupos fosfato. A principal vantagem dessas moléculas, frente a seus análogos naturais e sua grande afinidade para estabelecer ligações com cadeias de DNA. (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007).

2.4.2 Sistema de transdução

(38)

escolha do material biológico depende das características do composto que se pretende analisar. No sistema de transdução, o transdutor é o elemento que converte as variações das propriedades físicas ou químicas, que se produzem pela interação entre o elemento de reconhecimento e o analito em um sinal (PEREIRA; SANTOS; KUBOTA, 2002). Sua escolha está condicionada ao tipo de elemento a ser reconhecido, o qual determina que a variação das propriedades físico-químicas ocorra devido às interações (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007), ver Quadro 2.3. O sinal gerado pelo transdutor, em alguns casos, não pode ser interpretado diretamente e se faz necessário à utilização de um software para seu processamento (ORTIZ; PABELLO; PIETRINI, 2007).

Bioreceptor Sinal transmitido Tipo de transdutor

Conversão de substrato Sensores eletroquímicos Consumo de substrato Potenciométrico Geração de produto enzimático Amperométrico

Consumo de cofator Sensores termoquímicos Produção de calor em decorrência da

conversão enzimática

Emissão de luminosidade Sensores ópticos

Anticorpos e material

genético Enlace de antígeno

Massa Sensores SAW,

BAW

Constante dielétrica Sensores capacitivos Índice de refração Sensores SPR

Complexão seletiva de íons Sensores eletroquímicos

Ionóforos naturais Diferença de Potencial Potenciométrico

(39)

3.4.2.1 Transdutor eletroquímico

Os transdutores eletroquímicos transformam o sinal produzido pela interação entre o sistema de reconhecimento e o analito detectado em um sinal elétrico, proporcionando uma informação analítica quantitativa ou semiquantitativa específica. O elemento de reconhecimento biológico e o elemento de transdução devem estar em contato. Diferenciam em quatro tipos de transdutores eletroquímicos: os condutimétricos, potenciométricos, amperométricos e impedimétricos, como mostrado na Quadro 2.4. A pesquisa sobre transdutores potenciométricos recobertos com um filme enzimático, cuja resposta baseia-se na reação da enzima com um substrato orgânico ou inorgânico, que produz uma espécie sensível ao eletrodo, cresceu consideravelmente com o passar dos anos. Esses transdutores podem ser recobertos por uma camada enzimática que reage com o substrato, cofator ou inibidor em ensaio (COUTO; MONTENEGRO, 2000).

Transdutor Tipo de medida Condutimétrico Variação na medida de condutância Potenciométrico Diferença do potencial elétrico

Amperométricos Corrente gerada pela redução ou oxidação das espécies eletroativas

Impedimétrico Aumento da impedância

Quadro 2.4: Tipos de transdutores eletroquímicos

2.5 BIOSSENSORES POTENCIOMÉTRICOS

(40)

ambientes acadêmicos, esses dispositivos analíticos foram pioneiros, tanto em desenvolvimento quanto na produção em escala comercial (RUIZ, 2006).

Os eletrodos íons seletivos podem ser definidos como sensores eletroquímicos que respondem à atividade iônica de acordo com a equação proposta por Nernst:

E = E0 rRT/zxF ln (ax) (1)

No qual Eo é o potencial padrão de redução da célula, R, a constante dos gases, T, a temperatura absoluta, zx a carga iônica e ax a atividade de íon x que se deseja

determinar. O sinal da equação é positivo quando x é um cátion e negativo quando x é um anion. A resposta é considerada como nernstiana sempre que o potencial do eletrodo for proporcional ao logaritmo da atividade do íon em questão, mesmo quando o valor da proporcionalidade não seja exatamente 2,303RT/zF. Para z = 1, essa constante é igual a 59,1 mV a 25°C, porém são referidos como nernstianos valores até 55,0 mV, devido às condições em que cada determinação é feita, o termo subnernstiano é usado quando o valor está abaixo de 55 mV e super nernstiano quando for maior que 60 mV. O íon primário é íon para o qual o eletrodo foi construído, sendo que a maioria dos eletrodos é mais seletiva a uma espécie em relação às outras (ROVER JUNIOR, 1995).

No método potenciométrico, o tempo de resposta é definido com o tempo em que o eletrodo leva, quando ocorre uma mudança instantânea, na atividade do analito, para variar em 1 mV a partir do potencial de equilíbrio; este tempo de resposta depende das condições experimentais usadas, e envolve vários parâmetros. Um gráfico, ou curva de calibração é aceito como a representação da diferença de potencial entre o eletrodo íon seletivo e o eletrodo de referência (com valores positivos no eixo das ordenadas) contra o logaritmo da atividade ou concentração do íon primário na célula medida (eixo das abscissas).

(41)

separando duas outras fases e exibindo resistência à interação de diferentes espécies (RUIZ, 2006).

Os transístores com efeito de campo sensível a íons (ISEFET’s) e suas modificações com membranas seletivas também incluem o grupo de sensores (id.) e

foram, inicialmente, propostos por Bergveld em 1970. A maior parte das referências bibliográficas sobre este tipo de detector refere-se a pH-FET’s, transistores de efeito de campo, biomodificados enzimaticamente, que permitem a determinação de variações de pH provocadas por reações enzimáticas (id.), fundamentalmente

destinadas ao controle de processos biotecnológicos e clínicos (COUTO; MONTENEGRO, 2000; ROVER JUNIOR, 1995). Os Biossensores potenciométricos que utilizam a creatinina têm diversas desvantagens, uma das quais é a interferência devida à amônia e outras substâncias iônicas. Outro inconveniente é que a resposta é muito não-linear, devido às mudanças induzidas no pH e na temperatura provocarem a diminuição drástica da atividade e estabilidade da enzima (PREMANODE; TOUMAZOU, 2006).

2.5.1 Propriedades dos biossensores potenciométricos

As características mais importantes em um biossensor potenciométrico são: a estabilidade, o tempo de resposta e a sensibilidade. Atualmente, os projetos eletroquímicos têm sido mais explorados devido à sua simplicidade e possibilidade de se construir biossensores de baixo custo (CONN; STUMPF, 1976).

2.5.1.1 Estabilidade

(42)

Tipo de imobilização

Os eletrodos como enzimas imobilizadas fisicamente, apresentam-se mais estáveis por menores intervalos após sucessivas determinações (RUIZ, 2006). Imobilizações por métodos químicos produzem eletrodos mais estáveis e com maior tempo de vida útil, devido às ligações mais efetivas entre a enzima e o suporte, diminuindo a lixiviação da camada enzimática (ALFAYA; KUBOTA, 2002).

Geralmente, eletrodos com enzima solúvel são usados por cerca de uma semana sendo possível a execução de 25 a 50 determinações sob determinadas condições, desde que sejam bem acondicionadas quando fora de uso, sob refrigeração.

Quantidade e pureza da enzima

A estabilidade aumenta com a espessura enzimática, porém ocorre a elevação do tempo de resposta. Quanto mais espessa a camada de enzima, mais difícil a difusão dos íons gerados. Há uma quantidade crítica de enzima pura ou de alguma fonte natural que propicie uma resposta nernstiana. (RUIZ, 2006) Às vezes, é mais vantajoso elevar a quantidade da enzima, principalmente, quando a mesma não é purificada.

Condições experimentais

Fazem parte da otimização do sistema o estabelecimento de parâmetros como temperatura, pH, tipo de tampão, concentração dos substratos e outros, levando-se em conta também a estabilidade do sensor base quando se utilizam eletrodos de curto tempo de vida (OLIVEIRA; VIEIRA, 2006).

2.5.1.2 Sensibilidade

(43)

2.5.1.3 Tempo de resposta

O tempo de resposta está associado à difusão do substrato através da membrana enzimática e a difusão do produto formado até a superfície da membrana do sensor base. Os principais fatores que modificam o tempo de resposta são:

Velocidade de Agitação

A velocidade de difusão do substrato é alterada pela agitação da solução. A resposta do eletrodo, valor da diferença de potencial está associado à velocidade de transferência de massa do substrato para o eletrodo e também à velocidade de transferência de massa do produto para fora do eletrodo. Maior velocidade de agitação fornece potenciais mais reprodutíveis como o menor tempo de resposta desde que esta se mantenha constante.

Concentração da enzima

Um aumento na quantidade de enzima pode levar a um aumento no tempo de resposta do sensor. Isso se deve ao fato de que o aumento na espessura da membrana dificulta a difusão do substrato na mesma. É aconselhável a utilização de enzimas com alta atividade, permitindo a obtenção de membranas enzimáticas mais finas e permeáveis.

Membrana de diálise

(44)

2.6 BIOSSENSORES SENSÍVEIS À URÉIA

A uréia é o principal produto final do metabolismo das proteínas dos mamíferos, dos anfíbios e de algumas espécies de peixes (CONN; STUMPF, 1976). Gerada no fígado dos humanos é a principal fonte de excreção do nitrogênio pelo organismo, difundida através da maioria das membranas celulares. A amônia em excesso além do exigido para a biossíntese dos compostos nitrogenados, é convertida em uréia que é excretada pela urina (CONN; STUMPF, 1976)

A dosagem da uréia no sangue é medida para avaliar doenças renais e hepáticas, sendo um importante parâmetro no diagnostico aplicado como indicador da função renal. Sua determinação é um dos exames mais solicitados em laboratórios clínicos, permitindo avaliar a função renal juntamente com a determinação da creatina (ROVER JUNIOR, 1995 ; CONN; STUMPF, 1976).

Em um indivíduo saudável, sua concentração varia de acordo com diferentes fatores , tais como o conteúdo protéico da dieta e a hidratação, sendo o rim um dos principais responsáveis pelo balanço hídrico corporal (TSAI; DOONG, 2004).

Níveis elevados de uréia no sangue e na urina são sinais patológicos de insuficiência renal. Para pacientes que sofrem de doenças renais crônicas a diálise e o transplante de rins são essenciais para o sustento da vida (id.).

O nível de uréia no sangue de um ser humano saudável e normal encontra-se situado entre 10.2 e 49.8 mg dl-l, já a concentração para pessoas com doenças agudas e crônicas pode variar até 720-900 mg dl-l e 300-420 mg dl-l, respectivamente (LUO e DO, 2004). A determinação da concentração de uréia no efluente dialisado é usada extensamente como um marcador para o monitoramento de moléculas tóxicas durante a diálise.

A uréia pode ser sintetizada industrialmente a partir de amônia e de dióxido de carbono. É utilizada em resinas, produtos farmacêuticos, como fonte de nitrogênio não protéico para ruminantes e em fertilizantes nitrogenados (BARHOMI et al., 2006;

SUZUKI; MATSUGI, 2005).

(45)

seletivo de amônio. Este eletrodo respondia a mudança na concentração de uréia entre 5.10-5 e 1.10-1 M, com o tempo de resposta de 35 segundos e tempo média de vida de 14 dias (RUIZ, 20006).

Silva et al. (apud NETO et al., 1994) mediram a uréia em amostras sorológicas

usando um eletrodo sensível a gás amônia e imobilizado pelo extrato enzimático da leguminosa Canavalia marítima com o glutaraldeído na superfície do eletrodo no

qual se obtiveram respostas na concentração variando entre 0,25 a 9,25 mM.

Deng et. a.l (Ibid DENG et al. ,1991) utilizaram feijão de soja como fonte natural

de urease na determinação de uréia em um estudo comparativo entre 5 espécies diferentes de feijões, utilizando eletrodos sensores a gás carbônico e amônia.

Srivasvata et. a.l., (SRIVASTA; KAAYASHA, 2001) utilizando sementes de

pigeompea fixadas em grânulos de gelatina através da reticulação com

glutaraldeído, observou que a urease extraída mostrou uma melhor resposta em pH 7,3 a 6,5. Os grânulos obtidos foram usados para a preparação de um novo biossensor de uréia com um tempo de resposta de menos de 2 minutos e menos que 14 amostras de uréia puderam ser medidas dentro de uma hora. Os grânulos foram usados para analisar a quantidade de uréia em amostras clínicas dos laboratórios de patologia. Os resultados obtidos com o biossensor foram similares àqueles obtidos com os vários métodos geralmente empregados.

A urease obtida de feijões de soja foi a primeira enzima a ser cristalizada em 1926, por J. B. Sumner (apud. WHITAKER, 1972). Eletrodos contendo urease

imobilizada em sensores empregados em medidas de pH, como o de vida e de antimônio-óxido de antimônio (FATIBELLO; VIEIRA, 2002; GUILBAULT et al., 1991)

foram construídos para a determinação de uréia em urina. Outros biossensores propostos envolvem o monitoramento do dióxido de carbono, produzido na reação enzimática, com um eletrodo potenciométrico de membrana de Teflon (id.).

As determinações da uréia podem ser realizadas com o uso de diferentes técnicas, em que as mais conhecidas são (ROVER JUNIOR, 1995):

(46)

2. Método gravimétrico: são muito elaborados e de alto custo, porém devido à sua precisão e exatidão, podem ser utilizados como métodos de referência. 3. Método cromatográfico: sua principal é a determinação quantitativa baseada

numa reação especifica dispensando o uso de aparelhos ou reagentes especiais utilizados especificamente para amostras sorológicas.

4. Método espectrofométrico: é baseado na reação da uréia com diacetilmonoxina em meio fortemente ácido.

5. Método enzimático: São os mais utilizados nas rotinas dos laboratórios clínicos para a determinação enzimática de uréia, onde os mais usados são aqueles que utilizam a hidrólise da uréia como ilustra a equação abaixo.

(NH2)2C=O + 3H2Om o

urease

2NH₄+ CO2+ 2OH- (2)

2.6.1 Métodos Enzimáticos

(

Op.cit. ROVER JUNIOR, 1995)

Os métodos enzimáticos na determinação da uréia podem ser subdivididos em: 1. Métodos condutométricos: Têm como base o aumento da condutividade é

relacionado à concentração inicial da uréia.

2. Métodos espectrofotométricos: A amônia formada na degradação enzimática da uréia é geralmente quantificada pelo reagente de Nessler (VOGEL, 1981) ou pela reação de Berthelof (id.) e ainda podem ser

determinadas pela reação com uma reação com glutamato (ROVER JUNIOR, 1995).

3. Método volumétrico: Esta metodologia consiste na conversão de uréia em carbonato de amônio através da urease e uma quantificação antes e depois da conversão por meio de uma titulação ácido-base usando o alaranjado de metila como indicador.

(47)

na degradação os íons bicarbonato e hidroxila, podem ser detectados, respectivamente, ou por eletrodos íons seletivos a amônio, ou por eletrodos sensores a gases (gás carbônico ou amônia) ou ainda eletrodos de membrana de vidro (id.). Em todos os casos há uma relação logarítmica

entre o sinal obtido e a concentração de uréia.

2.7 ENZIMAS

As enzimas são proteínas que catalisam reações químicas, nos seres vivos (FATIBELLO; VIEIRA, 2002; ORTIZ et al. 2007), e possuem um centro ativo, onde

se processam as reações com determinados substratos. Esse centro ativo é geralmente constituído de alguns resíduos de aminoácidos da cadeia de proteína e um grupo não-protéico, sendo responsável pela atividade biológica. Algumas enzimas dependem somente da sua própria estrutura protéica para exercer sua atividade, enquanto outras necessitam também de um ou mais componentes não protéicos chamados de cofatores, que podem ser íons metálicos ou moléculas orgânicas denominadas de coenzimas, mas, muitas enzimas dependem de ambos (FATIBELLO; VIEIRA, 2002). Enzimas são, portanto, na sua maioria, proteínas que catalisam com grande eficiência reações biológicas. Essas aceleram várias reações metabólicas importantes para a vida sob condições fisiológicas de pH, temperatura, meio iônico, etc.

(48)

2.7.1 Cinética enzimática

(

Op.cit.LEHNINGER, 1993)

A teoria inicial foi desenvolvida por Michaelis-Menten, em que segundo seu modelo, toda enzima E, combina-se com o substrato S a fim de formar um complexo enzima substrato ES, no qual esse complexo resulta de uma interação entre o sítio ativo da enzima (E) e a molécula do substrato intermediário ES. Neste caso a molécula se rompe para formar o(s) produto(s), P, segundo a reação abaixo:

E + S mo1 1

k k

ES (3)

ES + mo2 2

k k

E + P (4)

na qual, k1, k-1, k2 e k-2 são as constantes de velocidade. As reações

consideradas reversíveis. A velocidade de reação diminui com tempo t, ou seja, a velocidade de consumo de substrato ou formação de produto diminui em função do tempo devido à diminuição da concentração do substrato no decorrer da reação.

A concentração total da enzima, Et, é soma da formas livres e combinadas:

[Et] = [E] + [ES] (5)

a equação matemática que define a velocidade inicial da reação catalisada por enzimas está exemplificada como a combinação das etapas (3) e (4):

v0 =

dt P d_[ _]

= k2 [ES] (6)

Uma vez que, nem k2 nem [ES] podem ser determinados diretamente utilizamos

(49)

dt ES d_[ _]

= k1[P] [S] = k1([Et] – [ES]) [S] (7)

Ainda que ES possa também ser formado a partir de P e E, pela reação inversa (4), a velocidade dessa reação pode ser desprezada, uma vez que, estamos considerando o início da reação quando a concentração de um substrato é muito elevada e a concentração do produto é próxima de zero.

A velocidade de desdobramento de ES é dada por:

dt ES d_[ _]

= (k-1 + k2) [ES (8)

Assumindo o estado de equilíbrio temos:

k1 ([Et] – [ES]) [S] = (k-1 + k2) [ES] (9)

Rearranjando a equação (9), obtemos:

([S] ([Et] – [ES])) [ES] =

1 2) 1 ( k k k

= Km (10)

A constante Km é definida como constante de Michaelis-Menten. Deduzindo-se o

valor de [S] da expressão (10):

(

[ES] =

] [ ] ][ [ S K S E M t

([Et] – [ES])

)

(11)

Substituindo o termo [S] na equação da velocidade inicial temos:

v0= v2 [ES] = k2 _¸¸

(50)

Quando a concentração de substrato é elevada toda a enzima presente no substrato está sob a forma do complexo ES, logo quando a enzima esta saturada é alcançada a velocidade máxima, vmáx, dada por:

> @

Et k v

max (13)

A seguir, e obtida a equação de Michaelis-Menten, para um substrato:

> @

S K S v v m máx

0 (14)

Os valores das constantes cinéticas, Km e vmáx’ podem ser obtidos através de um

gráfico vo versus [S]. A velocidade inicial de uma reação enzimática é uma função

entre a concentração da enzima e seu substrato, equação (14). Fixando a concentração da enzima, a velocidade aumenta com a concentração do substrato até certo ponto quando o excesso de substrato é alcançado e a velocidade se mantém constante mesmo com a adição do substrato.

O valor de Km pode ser inversamente proporcional à afinidade da enzima pelo

substrato; quanto menor for seu valor, maior será a afinidade. Logo o Km pode ser

considerado um parâmetro quantitativo de uma reação enzimática, não dependendo da concentração da enzima. Seu valor é igual à concentração de substrato a qual a velocidade inicial da reação é igual à metade da velocidade máxima, sendo expresso em mol/L.

(51)

2.7.2 Atividade enzimática

A velocidade inicial de uma reação enzimática é diretamente proporcional ao número de sítios ativos presentes, quando a concentração de substrato não está em níveis de saturação e outras variáveis são otimizadas e mantidas constantes. A saturação do substrato limita a reação apenas pela concentração da enzima. Nessas condições, a atividade enzimática pode ser estimada pelo acompanhamento da velocidade racional (GUILBAULT, 1884; ROVER JUNIOR, 1995).

A atividade enzimática é função direta de suas estruturas terciárias e quaternárias. Todo tratamento que modifique a conformação da enzima como o aquecimento, alteração do pH do meio e outros, modificam também a estrutura do sítio ativo diminuindo suas propriedades catalíticas. (ROVER JUNIOR, 1995) A unidade de atividade é estabelecida através da medida da velocidade de reação a partir do substrato consumido numa unidade de tempo e temperatura definidos.

2.7.3 Fatores que modificam a cinética enzimática

Alguns fatores atuam no mecanismo cinético dessas reações, podendo aumentar ou diminuir a velocidade reacional pela modificação na estrutura dos sítios ativos das enzimas, alterando assim a atividade catalítica (GUILBAULT, 1884; ROVER JUNIOR, 1995 ).

Os principais são:

x A concentração da enzima.

x Presença ou ausência de ativadores ou inibidores.

x O pH.

(52)

2.7.3.1 Influência da concentração do substrato

Para concentrações muito baixas, a velocidade inicial de reação é diretamente proporcional à concentração do substrato, logo a reação será de 1a ordem.

> @

S k v v

m ¸¸¹

(16)

Quando a concentração do substrato é elevada, a reação é considerada de ordem zero.

v v

0 (17)

Nesse caso, a velocidade inicial não depende da concentração do substrato. À medida que a concentração de substrato vai aumentando, a velocidade inicial da reação se reduz e apresenta uma ordem mista. Pode ocorrer também a diminuição na velocidade da reação por uma elevada concentração de substrato ou por causas como competição ou formação de complexos com duas ou mais moléculas de substrato combinando-se com o sítio ativo da enzima.

2.7.3.2 Influência da concentração da enzima (ROVER JUNIOR, 1995)

(53)

> @

> @ > @

t m

E S K

S k

v _¸¸ ¹ · ¨¨

© §

2

0 (18)

2.7.3.3 Influência de ativadores

Ativadores ou cofatores enzimáticos são substâncias que aumentam a capacidade catalítica. Alguns ativadores são íons metálicos simples como Mn, Cu, Ca ou podem ser substâncias orgânicas complexas como derivados vitamínicos.

2.7.3.4 Influência dos inibidores

Os estudos de inibição geralmente relacionam a especificidade enzimática, arquitetura física e química do sítio ativo e mecanismo cinético da reação. O inibidor é uma sustância que causa uma redução na velocidade da reação catalítica, reagindo com o próprio catalisador ou com o substrato. As enzimas são sensíveis a traços de metais podendo, ou não, sofrer um envenenamento irreversível.

2.7.3.5 Influência da temperatura

(54)

Tds dH

dG (19)

Para cada enzima existe uma temperatura ótima para um determinado conjunto de condições experimentais. A velocidade da reação aumenta na medida em que se eleva a temperatura. Esse aumento proporciona uma elevação da agitação molecular e a freqüência de colisão entre as moléculas da enzima/substrato contribuindo para a desnaturação protéica pela modificação da estrutura espacial da enzima. Para evitar grandes perdas de atividade as enzimas são acondicionadas à refrigeração, entre 2 e 5ºC. A temperatura recomendada para se desenvolver reações enzimáticas é de 25ºC, embora possa aperfeiçoar a mesma de acordo com as condições experimentais de análise mais satisfatórias. Ainda que muitas enzimas sejam inativadas em temperaturas acima de 55ºC, algumas enzimas de espécies termofílicas de bactérias que habitam fontes de água quente apresentam atividade em temperaturas da ordem de 85ºC.

2.7.3.6 Influência do pH

(55)

2.7.3.7 Influência do sistema tampão

A reação enzimática é afetada pela mudança no equilíbrio. A atividade de um sistema enzimático não depende apenas de seu pH, mas também do tipo de solução tampão a ser utilizada, a qual pode afetar a atividade ou estabilidade da enzima devido à presença de cargas, ativação aniônica, termodinâmica da reação entre outros. Para obterem-se resultados reprodutíveis se deve eliminar íons interferentes

e controlar a força iônica para que se assegure a concentração dos reagentes

(

id.

).

2.8 IMOBILIZAÇÃO ENZIMÁTICA

Como foram explicitados nas seções anteriores, os biossensores enzimáticos têm sido de fundamental importância dentro da química analítica devido à possibilidade de associar a seletividade e sensibilidade da enzima com a simplicidade dos eletrodos eletroquímicos. A etapa fundamental no desenvolvimento de um sensor é a imobilização e estabilização das proteínas ou enzimas na superfície da matriz, com intuito de melhorar a estabilidade química dos materiais responsáveis pelo reconhecimento (PEREIRA; SANTOS; KUBOTA, 2002). A imobilização enzimática é o processo em que há o confinamento da enzima no receptor sobre o transdutor eletroquímico na forma insolúvel sem a perda de sua atividade (RUIZ, 2006).

O desenvolvimento de técnicas de imobilização tem sido importante por proporcionar a reutilização das enzimas, aumentarem a estabilidade e reduzir os custos. Esses fatores dependem, principalmente, da escolha apropriada do suporte e dos reagentes utilizados nos processos de imobilização (OLIVEIRA; VIEIRA, 2006). Vários métodos de imobilização enzimática em diferentes matrizes são relatados, as mais convencionais se baseiam em técnicas que imobilizam por ligações covalentes (SAHNEY et al., 2006). Reações enzimáticas de bioprodutos

(56)

variedade dos biossensores tem sido utilizada para determinação seletiva de muitas substâncias, por exemplo, uréia e glucose (TINKILIC; CUBUK; ISILDAK, 2002)

2.8.1 Técnicas de imobilização

(57)

Técnica de

Imobilização Descrição Matriz Vantagens

Adsorção física

União de ER* em uma matriz mediante ligações

iônicas, pontes de hidrogênio e forças de

Van der Waals

Celulose Gel de silício

Colágeno Acetato Baixo custo, Matriz regenerável, Sem modificações no ER*. Entrecruzamento

Uniões irreversíveis dos ER* entre si, mediante

funções reativas Reativos: Glutaraldeído Hexametileno-di-isociamento, 2,4-dinitro-benzeno Custo moderado. Ligações Covalentes

Uniões covalentes dos ER* com grupos químicos

ativados pela matriz ou diretamente no transdutor

Simples manipulação, Estáveis em condições extremas. Atrapiamento

Retenção física dos ER nas cavidades interiores a

matriz

Géis; agár; nylon poliacriamida Matrizes eletródicas

compósitas rígidas: grafite-teflon ou grafite

resina epóxi Necessita de pouca quantidade de ER, Baixo custo, Proximidade no

ER e no transdutor.

*ER: Elemento de reconhecimento

(58)

2.8.1.1 Imobilização por oclusão

Nesse processo, as moléculas da enzima ficam retidas dentro de uma rede tridimensional de um polímero insolúvel em água ou dentro de microcápsulas delimitadas por uma membrana semipermeável, permitindo somente a passagem do substrato e dos produtos reacionais. Polímeros como PVC, poliacrilamida e metacrilato, são utilizados e algumas vezes são adicionados amido ou agentes plastificantes com o propósito de tornar o polímero mais flexível às condições de uso (id.).

A técnica de microencapsulação consiste na mistura de uma solução aquosa da enzima com um monômero hidrofóbico provoca a reação de polimerização, levando à formação de uma membrana ao redor das micro gotículas geradas.

Essa técnica permite que o material biológico esteja em contato com o transdutor, sem que o mesmo se ligue a matriz (CONN; STUMPF, 1976), mantendo, por sua vez, a alta seletividade das enzimas uma vez que não são afetados pelas mudanças de pH, temperatura e força iônica durante a medida (RUIZ, 2006).

2.8.1.2 Imobilização por adsorção

No processo de imobilização por adsorção estão envolvidas forças de interação fracas entre o suporte e a enzima, ligações de Van der Waals e de hidrogênio. A adsorção consiste na dissolução do agente modificador em solvente apropriado e na exposição (PEREIRA; SANTOS; KUBOTA, 2002), em geral, por imersão do eletrodo nesta solução. Inicialmente, os trabalhos envolveram adsorção em eletrodos de platina (PEREIRA; SANTOS; KUBOTA, 2002), porém entre os adsorventes mais usados está o quartzo, o vidro, o carvão ativo, a sílica gel, a alumina e resinas de troca iônica (ROVER JUNIOR, 1995)

(59)

2006). Desta forma, filmes poliméricos têm sido empregados em sensores ou eletrodos quimicamente modificados com o intuito de proteger a superfície dos eletrodos de impurezas, bloquear interferentes, imobilizarem componentes e fornecer biocompatibilidade (PEREIRA; SANTOS; KUBOTA, 2002). Porém, devido às interações envolvidas, no decorrer do tempo há uma dessorção progressiva das enzimas, diminuindo assim o tempo de vida útil do biossensor (ROVER JUNIOR, 1995).

2.8.1.3 Imobilização por ligação covalente

Este método envolve a formação de ligações químicas entre a enzima e grupos reativos de um suporte. Os suportes são escolhidos por características como solubilidade, presença de grupos funcionais, estabilidade mecânica e área superficial. Os mais usados são o vidro poroso, poliestireno, agarose, celulose, carboximetilcelulose, nylon e outros (id.).

Esta técnica utiliza quantidades mínimas de enzimas, o inconveniente se encontra no risco de inativação parcial ou total da enzima no decorrer da reação de fixação (id.).

2.8.1.4 Imobilização por ligação covalente ou cruzada