RICARDO BARROS MARIUTTI
EXPRESSÃO EM Escherichia coli E PRODUÇÃO DE ANTISSORO
POLICLONAL PARA PROTEÍNA P1 DO Southern bean mosaic
virus
Orientador: Prof. Dr. José Osmar Gaspar
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Campus de São José do Rio Preto
Programa de Pós Graduação em Microbiologia
RICARDO BARROS MARIUTTI
EXPRESSÃO EM Escherichia coli E PRODUÇÃO DE ANTISSORO
POLICLONAL PARA PROTEÍNA P1 DO Southern bean mosaic
virus
Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia.
Orientador: Prof. Dr. José Osmar Gaspar
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Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE Campus de São José do Rio Preto - UNESP Mariutti, Ricardo Barros.
Expressão em Escherichia coli e produção de antissoro policlonal para proteína P1 do Southern bean mosaic virus / Ricardo Barros Mariutti. - São José do Rio Preto : [s.n.], 2009.
xx f. : il. ; 30 cm.
Orientador: José Osmar Gaspar
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas
1. Fitopatologia. 2. Vírus de plantas. 3. Sobemovirus. 4. Expressão em E. coli. 5. Sorologia. I. Gaspar, José Osmar. II. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título.
RICARDO BARROS MARIUTTI
EXPRESSÃO EM Escherichia coli E PRODUÇÃO DE
ANTISSORO POLICLONAL PARA PROTEÍNA P1 DO
Southern bean mosaic virus
DISSERTAÇ ÃO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE
BANCA EXAMINADORA
Presidente e Orientador: __________________________________________________
(Prof. Dr. José Osmar Gaspar)
2° Examinador: _________________________________________________________
(Prof. Dr. Mário Tyago Murakami)
3°Examinador: __________________________________________________________
(Prof. Dr. Marinônio Lopes Cornélio)
Aos meus pais Ana e Germano “As pessoas mais importantes da minha
vida”
AGRADECIMENTOS
Aos Meus pais, Ana e Germano, pela educação dada e por sempre me apoiarem em todos
os momentos da minha vida.
Ao Prof. Dr. José Osmar Gaspar, um profissional exemplar, pela amizade, confiança e
comprometimento com este trabalho, me orientando sem nunca poupar esforços.
À Profª. Drª. Priscila Belintani, pela paciência e pelos ensinamentos fundamentais para que eu pudesse iniciar minha carreira científica.
Aos Professores: Dr. Marinônio Cornélio, Dr. Roberto da Silva e Dr. Mário Tyago
Murakami pela participação nas bancas de defesa, contribuindo para a correção e
aprimoramento deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Jorge Rezende e ao pessoal do Laboratório de Virologia Vegetal da ESALQ/USP pela produção do antissoro policlonal utilizado neste trabalho.
Aos amigos e companheiros de Laboratório de Fitovirologia: Aninha, Livia, Luana e Tadaiti pela colaboração no trabalho e pela amizade.
À FAPESP pela bolsa de mestrado concedida, N° Processo 06/59285-0. Ao Programa de Pós-graduação em Microbiologia
RESUMO
No Brasil, foram descritas mais de dez viroses em feijoeiro, citando-se aquela causada pelo Southern bean mosaic virus (SBMV) do gênero Sobemovirus. Este vírus tem uma restrita gama de hospedeiras, confinada quase exclusivamente a espécies da família das leguminosas, sendo algumas de interesse econômico como o feijoeiro comum e a soja. O SBMV é a espécie tipo do gênero, possui partículas isométricas (28-30nm) contendo RNA genômico de 4-4,5kb com polaridade positiva e proteína capsidial com massa molecular de 29-30 kDa. O genoma do SBMV é constituído por quatro Open
Reading Frames (ORFs) com sobreposição entre elas. A ORF 1 codifica uma possível
proteína do movimento, a ORF 2 uma poliproteína, que por clivagem, origina três produtos funcionais: uma serino protease, uma proteína ligadora do genoma viral (VPg) e uma polimerase com atividade relacionada à replicação do RNA viral (RNA polimerase RNA-dependente, RpRd). Dentro da ORF 2 encontra-se a ORF 3, que codifica uma proteína de função desconhecida. A ORF 4 codifica a proteína capsidial, traduzida a partir de um RNA subgenômico. O presente trabalho consiste na expressão da proteína P1 do SBMV-SP em Escherichia coli, sua purificação e a posterior utilização para a produção de antissoro policlonal. As atividades realizadas compreenderam a purificação das partículas virais do SBMV isolado São Paulo (SBMV-SP) a partir de folhas infectadas de Phaseolus
vulgaris ‘Jalo’, obtenção do RNA viral a partir de partículas purificadas, produção de
cDNA utilizando primer anti-senso, amplificação do gene da proteína do movimento, purificação do fragmento amplificado, ligação em vetor de multiplicação pGEM-T, transformação em células competentes de Escherichia coli linhagem TOP 10, purificação do vetor, corte enzimático com as enzimas Bam HI e Hind III, subclonagem nos vetores de expressão pMAL e pET28a e testes de expressão. A análise em gel de poliacrilamida mostrou a eficiência dos testes de expressão. Utilizando-se o vetor pET28a obteve-se a expressão de uma proteína de aproximadamente 22 kDa (17 kDa referentes à MP + 5 kDa referentes à cauda de histidina) que foi purificada utilizando-se coluna com resina à base de níquel. Utilizando-se o vetor pMAL obteve-se a expressão de uma proteína de aproximadamente 60 kDa (17 kDa referentes à MP + 43 kDa referente à Proteína de fusão –“Maltose Binding Protein”) que foi purificada em colunas com resina à base de amilose. A proteína recombinante produzida em pMAL foi utilizada na produção de antissoro em coelhos da raça Nova Zelândia. Os anticorpos produzidos mostraram-se eficientes ao reagirem especificamente e ao detectar as proteínas de interesse mesmo em concentrações relativamente baixas quando analisados em reações de “Dot-blot” e “Western-blot”.
ABSTRACT
In Brazil, more than ten bean viroses were described, including the one caused by
Southern bean mosaic virus (SBMV) from genus Sobemovirus. This virus has a strict host
range, confined almost exclusively to species from leguminosas family, and some of them have economic importance, like the common bean and soya. SBMV is the type species from this genus, has isometric particles (28-30nm) that contains genomic RNA of 4-4,5kb with positive polarity and a capsidal protein with molecular mass of 29-30kDa. SBMV genome consistis of four Open Reading Frames (ORFs) with overlap between them. ORF 1 encodes a possible movement protein, ORF 2 a poliprotein, which origin three functional products by clivage: a serin protease, a viral genomic biding protein (VPg) and a polimerase. Inside ORF 2 is situated the ORF 3, that encodes a protein with unknow function. ORF 4 encodes the capsidal protein, translated by a subgenomic RNA. The activities performed until this moment were the purification of SBMV isolated São Paulo(SBMV-SP) viral particles, obtention of viral RNA from SBMV purified partcles, cDNA production using anti-sense primer, amplification of the supposed gene of movement protein, purification of the amplified fragment and later biding on expression vector pGEM-T. The recombinat vector were transformed in Escherichia coli cells competent and than purified and digested with Bam HI and Hind III enzime. The released fragment was subcloned in pMAL and pET28a, which were used on competent cells for expression tests. Analysis of gel poliacrialamida showed the efficiency of tests of expression. Using pET28a was observed an expression of a protein of approximately 22 kDa (17 kDa relating to MP + 5 kDa relating to the tail of histidine) which was purified in resin Ni-NTA by affinitive chromatography.Using pMAL was observed an expression of a protein of approximately 60 kDa (17 kDa relating MP + 43 kDa referring to Maltose-Binding Protein) which was purified by affinity chromatography on amylose resin , the protein purified was used in the production of anti-serum in habbits of race New Zealand. The antibodies produced have proved efficient and to respond specifically to detect the proteins of interest even at relatively low concentrations when analyzed in reactions of dot-blot and western-blot.
Keywords : Sobemovirus, plant virus, expression in E. coli, serology.
SUMÁRIO
I INTRODUÇÃO... ..11
I.1 - O GÊNERO Sobemovirus... ..11
I.2 – ORGANIZAÇÃO DO GENOMA ... . 12
I.3 - PRODUTOS GÊNICOS E SUAS POSSÍVEIS FUNÇÕES... ..14
I.3.1 - PROTEINA P1 ... ..14
I.4- CITOPATOLOGIA ... ..15
I.5- O Southern bean mosaic vírus NO BRASIL ... ..16
I.6.-PROTEÍNA DO MOVIMENTO ... ..18
II OBJETIVOS ... ..21
III MATERIAL E MÉTODOS ... ..22
III. 1 - PURIFICAÇÃO DAS PARTÍCULAS VIRAIS ... ..22
III. 2 - OBTENÇÃO DE RNA VIRAL ... ..22
III. 3 – DESENHO DOS OLIGONUCLEOTÍDEOS ... ..22
III. 4 - PRODUÇÃO DE cDNA ... ..23
III. 5 - AMPLIFICAÇÃO DO GENE DA PROTEÍNA DO MOVIMENTO... ..23
III. 6 - PURIFICAÇÃO DO FRAGMENTO AMPLIFICADO... ..23
III. 7 - LIGAÇÃO DO FRAGMENTO AMPLIFICADO EM VETOR PARA MULTIPLICAÇÃO (pGEM).... ..23
III. 8 – SEQUENCIAMENTO DO VETOR PGEM+INSERTO ... ..24
III. 9 - TRANSFORMAÇÃO EM CÉLULA COMPETENTE (E. coli – TOP 10)... ..24
III. 10 - PURIFICAÇÃO DO PLASMÍDEO RECOMBINANTE ... ..24
III. 11 - DIGESTÃO ENZIMÁTICA COM Bam HI E Hind III ... ..25
III. 12 - DIGESTÃO ENZIMÁTICA E DEFOSFORILAÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO( pMAL) ... ..25
III. 13 - LIGAÇÃO DO DNA EM VETOR DE EXPRESSÃO (pMAL)... ..25
III. 14 - TRANSFORMAÇÃO EM CÉLULAS COMPETENTES (E. coli - DH5α) ... ..25
III. 15- TESTES DE EXPRESSÃO ... ..25
III. 16 - ANÁLISE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE) 10%... ..26
III. 17- EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE (pMAL)... ..26
III. 18 - PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE ... ..26
III. 19 - PRODUÇÃO DE ANTICORPOS... ..27
III. 20 - EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DA PROVÁVEL MP EM VETOR DE EXPRESSÃO (pET28a) .... ..27
III. 21 - TESTE DE TITULAÇÃO DO ANTI-SORO POLICLONAL POR “DOT-BLOT”... ..27
III. 22 - TESTE DE TITULAÇÃO E ESPECIFICIDADE DO ANTI-SORO POR “WESTERN-BLOT”... ..28
IV RESULTADOS... ..29
IV. 1 - PURIFICAÇÃO DAS PARTÍCULAS VIRAIS ... ..29
IV. 2 - EXTRAÇÃO DO RNA VIRAL... ..30
IV. 3 - AMPLIFICAÇÃO POR PCR DO GENE DA POSSÍVEL PROTEÍNA DO MOVIMENTO ... ..31
IV. 4 - DIGESTÃO ENZIMÁTCA DO VETOR pGEM COM Bam HI e Hind III ... ..31
IV. 5 - TESTES DE EXPRESSÃO DA MP EM VETOR pMAL E PURIFICAÇÃO DA ´PROTEÍNA RECOMBINANTE MP-MBP ... ..32
IV. 6- EXPRESSÃO DA PROVÁVEL MP EM VETOR pET28a ... ..33
IV. 7 - TESTE DE TITULAÇÃO DO ANTISSORO POR “DOT-BLOT” ... ..34
IV. 8 – TESTE PARA DETERMINAÇÃO DA ESPECIFICIDADE DO ANTISSORO POR “WESTERN-BLOT” ... ..34
IV. 9 - TESTE PARA DETERMINAÇÃO DA EFICIÊNCIA ANTISSORO POR “DOT-BLOT’’ ... ..35
V DISCUSSÃO ... 35
VI CONCLUSÕES ... 38
ANEXOS ... 39
ABREVIAÇÕES DE SUBSTÂNCIAS UTILIZADAS
2-ME: 2ß-mercaptoetanol
BCIP/NBT: 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro-blue tetrazolio
BSA: soro albumina bovina
dATP, dCTP, dGTP, dTTP: desoxinucleotídeos (ATP: adenina trifosfato; CTP:
citosina trifosfato; GTP: guanidina trifosfato; TTP: timidina trifosfato)
DEPC: dietil pirocarbonato de sódio
dsDNA: DNA de fita dupla
DTT: ditiotreitol
EDTA: ácido etileno diamino tetra acético
IPTG: isopropil- ß-D-galactosidase
KCl: cloreto de potássio
LB: meio Luria-Bertani
MgCl2: cloreto de magnésio
NaCl: cloreto de sódio
NaOH: hidróxido de sódio
ORF: Open Reading Frame
PBS: solução salina tamponada com fosfato
PBS-T: PBS contendo Tween 20 0,3%
PEG: polietileno glicol
SDS: lauril sulfato de sódio ou dodecil sulfato de sódio
ssRNA: RNA de fita simples
Tris-HCl: tampão Tris-base com pH ajustado com HCl
I. INTRODUÇÃO
O feijão (Phaseolus vulgaris L.), leguminosa comum da família das fabaceas
(Leguminoseae) (Cronquist, 1981), constitui uma das culturas mais importantes existentes, sendo consumida por todo o mundo, devido principalmente ao seu valor nutritivo. A cultura do feijão no Brasil assume um grande valor social, pois constitui a base da alimentação da população, sendo fonte de proteína vegetal de baixo custo. A dupla feijão com arroz é o prato principal na alimentação da maioria da população brasileira (Cultura, 2000). Dados das safras (2008) mostram que o Brasil produziu cerca de 3,52 milhões de toneladas de feijão, sendo a região sudeste a maior produtora (CONAB, 2009).
A produtividade da cultura é grandemente afetada pela ocorrência de doenças que diminuem sensivelmente a produção e, conseqüentemente, reduzem a sua oferta, provocando um aumento nos preços de mercado (Cultura, 2000). Estas doenças têm exercido um papel relevante na baixa produtividade de feijoeiros no Brasil e outros países latino-americanos (Jayasinghe, 1982; Costa & Costa, 1983). As mais numerosas são ocasionadas por fungos seguindo-se as de etiologia viral, várias com expressiva importância econômica (Gamez, 1977).
No Brasil, foram descritas mais de dez viroses em feijoeiro (Costa et al., 1972;
Bianchini et al.,1997), citando-se aquela causada pelo Southern bean mosaic virus (SBMV), do
gênero Sobemovirus (Hull & Fargette, 2005). Este vírus tem uma restrita gama de hospedeiras,
confinada quase exclusivamente a espécies da família das leguminosas, sendo algumas de interesse econômico como o feijoeiro comum e a soja. Muito embora o SBMV não seja no momento um problema fitossanitário, observações de campo no Estado do Paraná têm indicado a sua presença em infecções mistas principalmente com o Bean golden mosaic virus (Gênero Begomovirus, Família Geminiviridae), levando à possibilidade de problemas futuros para a
cultura do feijoeiro (Bianchini, A. Comunicação pessoal).
I.1 GÊNERO Sobemovirus
O nome Sobemovirus é originado das iniciais da espécie tipo do gênero Southern
bean mosaic virus e o gênero compreende 13 espécies definitivas, sendo elas: Blueberry
shoestring virus (BSSV), Cocksfoot mottle virus (CoMV), Lucerne transient streak virus
virus (SeMV), Solanum nodiflorum mottle virus (SNMoV), Southern bean mosaic virus (SBMV),
Southern cowpea mosaic virus (SCPMV), Sowbane mosaic virus (SoMV), Subterranean clover
mottle virus (SCMoV), Turnip rosette virus (TRoV) e Velvet tobacco mottle virus (VTMoV)
(Hull & Fargette, 2005). As espécies SBMV e SCPMV eram a princípio consideradas como isolados do SBMV (respectivamente isolados feijão e caupí) (Fauquet & Mayo, 1999). Há ainda 4 possíveis espécies no gênero, cujas características são similares aos sobemovírus, mas que necessitam de informações adicionais para serem incluídas. São elas: Cocksfoot mild mosaic virus (CMMV), Cynosurus mottle virus (CnMoV), Ginger chlorotic fleck virus (GCFV) e
Rottboellia mottle virus (RoMoV) (Hull & Fargette, 2005).
A maioria das espécies dos sobemovírus apresentam distribuição geográfica limitada, mas algumas espécies são encontradas em várias partes do mundo (Hull, 1988). Os sobemovírus infectam plantas tanto mono como dicotiledôneas, mas a gama de hospedeiras de cada espécie é relativamente restrita. Os sintomas induzidos são, principalmente, mosaico e mosqueado e, em geral, causam infecção sistêmica invadindo quase todos os diferentes tipos de tecidos das plantas hospedeiras (Hull, 1988). São transmitidos mecanicamente, por vetores e por sementes. Para a maioria das espécies (CoMV, RYMV, SNMoV, SBMV, SCPMV, TRoV) a transmissão é feita por besouros coleópteros enquanto o BSSV é transmitido por afídeos, o VTMoV por mirídios e o SoMV por dípteros, homópteros e hemípteros (Hull, 1988; Tamm & Truve, 2000).
I.2 ORGANIZAÇÃO DO GENOMA
A poliproteína do SCPMV é codificada por uma longa e contínua ORF2, contendo também uma região codificadora interna, ORF3. Organização semelhante do genoma já foi descrita para o isolado Arkansas do SBMV (SBMV-Ark) (Lee & Anderson, 1998), isolado “Ivory Coast” do RYMV (RYMV-CI) (Yassi et al., 1994) e LTSV (Feffries et al., GenBank U31286).
Por outro lado, na organização genômica do CoMV falta a ORF2 contínua e uma região codificadora similar à ORF3 do SCPMV. Em vez disso, CoMV possui duas ORFs sobrepostas, ORF2a e ORF2b, e a poliproteína é expressa através de um mecanismo de mudança de fase (“frameshift”) ribossomal -1 (Mäkinen et al., 1995a; Ryabov et al., 1996).
A única exceção com relação a esta subdivisão dos sobemovírus é o genoma do SBMV seqüenciado por Othman & Hull (1995). Neste, as ORFs 1, 2 e 4 não se sobrepõem como acontece com o SBMV-Ark e SCPMV (Fig.2).
Diferentemente do SBMV, o isolado SBMV-Ark contém quatro ORFs que se
sobrepõem, tornando-o mais similar em organização genômica (mas não em seqüência de
FIG. 1. Organização genômica dos sobemovírus Southern cowpea mosaic virus (SCPMV) e Cocksfoot mottle
virus (CoMV). Figura obtida de Hull & Fargette (2005).
aminoácidos de suas proteínas) ao SCPMV (Lee & Anderson, 1998). Foi proposto que essa diferença na organização genômica entre o SBMV e SMBV-Ark resulta ou de mutações ou de erro no seqüenciamento do SBMV.
I.3 PRODUTOS GÊNICOS E SUAS POSSÍVEIS FUNÇÕES
Os RNA de vários sobemovírus já foram traduzidos in vitro em sistemas de “lisado
de reticulócitos de coelho” e de “extrato de germe de trigo”. Os RNA do SBMV e SCPMV codificam a tradução de 4 proteínas nesses sistemas: 105 kDa, 75 kDa, 29 kDa e 14 kDa para o SBMV e 100 kDa, 70 kDa, 30 kDa e 20 kDa para o SCPMV (Mang et al., 1982; Salerno-Rife et al., 1980). Quatro polipeptídeos foram também traduzidos a partir dos RNA do CoMV (Mäkinen et al., 1995), LTSV (Morris-Krsinick & Forster, 1983), SNMoV (Kiberstis & Zimmern, 1984) e TRoV (Morris-Krsinick & Hull, 1981), apresentando somente ligeiras diferenças na massa molecular.
Estudos têm demonstrado que as proteínas de 100 e 70 kDa do SCPMV são relacionadas e traduzidas a partir do RNA genômico enquanto a proteína de 20 kDa é presumivelmente codificada pela ORF1 (Mang et al., 1982; Wu et al., 1987). Já a poliproteína codificada pela ORF2 do SCPMV é processada por clivagem proteolítica para dar o produto de tradução de 70 kDa (Wu et al., 1987). A proteína de 30 kDa (proteína capsidial) é traduzida a partir de um pequeno RNA subgenômico (sgRNA) que já foi encontrado em tecidos infectados por sobemovírus bem como em partículas virais (Rutgers et al., 1980; Weber & Sehgal, 1982; Ryabov et al., 1996; Tamm et al., 1999). Estudos com o CoMV, utilizando a síntese de proteínas
in vitro e imunoprecipitação com anticorpos específicos, mostraram que as proteínas de 12 kDa,
71 kDa e 100 kDa são sintetizadas a partir do RNA genômico do vírus. A proteína 12 kDa é produzida a partir da ORF1, a proteína 71 kDa a partir da ORF2a e a 100 kDa é a poliproteína produzida a partir das ORFs 2a e 2b. A proteína de 34 kDa (proteína capsidial) é produzida a partir de um sgRNA.
I.3.1 Proteína P1
são relacionadas com qualquer outra proteína conhecida. Análises de mutantes incapazes de produzir P1 ou mutantes produtores de proteínas truncadas indicaram que as proteínas P1 do RYMV ou do SCPMV não são necessárias para a replicação viral, porém são necessárias para o movimento célula-a-célula e movimento sistêmico (Bonneau et al., 1998; Sivakumaran et al., 1998). Proteína P1 recombinante do CoMV foi capaz de interagir com RNA de fita única (ssRNA) numa maneira independente da seqüência mas não com dsDNA (Tamm & Truve, 2000). Assim, levando-se em conta que nenhum outro produto gênico dos sobemovírus estaria relacionado com o movimento célula-a-célula ou movimento sistêmico do vírus, é proposto que a proteína P1 representa a proteína do movimento dos sobemovírus. Entretanto, a localização da proteína P1 in vivo ainda não foi possível para nenhum sobemovírus. Foi também descrito que a
proteína P1 do RYMV funciona como supressora do mecanismo de silenciamento gênico (“posttranscriptional gene silencing”, PTGS) (Voinnet et al., 1999).
I.4 CITOPATOLOGIA
I.5 O Southern bean mosaic virus NO BRASIL
O nome Southern bean mosaic virus deve-se ao fato de o vírus ter sido primeiramente
descrito infectando feijoeiros na região sul dos Estados Unidos da América do Norte (Zaumeyer & Harter, 1942). Atualmente, sabe-se que o SBMV apresenta-se amplamente disseminado, sendo encontrado também em outros países como México, Nicarágua, Venezuela, Gana, Nigéria, Senegal, França, Índia, Paquistão e Espanha (Hull & Fargette, 2005; Tamm & Truve, 2000; Verhoeven et al., 2003; Segundo et al., 2004).
No Brasil, o SBMV foi detectado pela primeira vez no Distrito Federal (SBMV-DF) (Cupertino et al., 1982) e, posteriormente, mas ainda nos anos 80, foi também encontrado no Estado de São Paulo (SBMV-SP) (A.S. Costa. Dados não publicados). Mais recentemente, um isolado do SBMV foi encontrado no Estado do Paraná (Gasparin et al., 2005). No entanto, devido à facilidade de transmissão do SBMV (Sehgal, 1981; Hull, 1988), pode-se aventar que a distribuição geográfica do vírus pelo Brasil seja mais ampla.
Os besouros crisomelídeos Diabrotica speciosa e Ceratoma arcuata são os principais
vetores do SBMV no Brasil (Costa & Batista, 1979; Silveira Jr. et al., 1983; Meyer et al., 1992), sendo que C. arcuata foi identificado como o vetor mais eficiente na transmissão desse vírus
(Silveira Jr. et al., 1983), porém as relações vírus/vetor ainda não são bem conhecidas (Meyer et al., 1992). Também foi descrita a transmissão do SBMV pelas larvas de C. arcuata, do sistema
radicular de plantas infectadas para o de plantas sadias, em uma taxa de 5,1% (Meyer et al., 1993). Esta taxa é pequena se comparada com a taxa de transmissão pelo inseto adulto (58,3%) (Silveira Jr. et al., 1983), no entanto, as larvas constituem população mais numerosa, o que torna a transmissão substancialmente importante (Meyer et al., 1993). Isso evidencia a possibilidade de transmissão do vírus através do solo, fato importante para a epidemiologia do SBMV.
Algumas propriedades moleculares foram determinadas para o isolado SBMV-SP: (a) as partículas virais apresentam diâmetro de 28-30 nm e a proteína capsidial possui massa molecular de 30 kDa; (b) das partículas virais foram extraídos RNAs de vários tamanhos, sendo o de 4,2 kb o RNA genômico e o de 1,0 kb supostamente um RNA subgenômico que codifica a proteína capsidial (Moreira & Gaspar, 2002).
complementar ao RNA ribossomal 18S. A ORF1 codifica uma proteína de 147 aminoácidos com massa molecular estimada de 17080 Da. A extremidade 3’-terminal da ORF1 do SBMV-SP sobrepõe a extremidade 5’-terminal da ORF2 em 34 nucleotídeos. A região 3’-terminal foi também caracterizada (Espinha et al., 2005) mostrando a ORF4 (proteína capsidial) contendo 801 nt (incluindo o códon de terminação UGA) com seqüência deduzida de 266 aminoácidos e massa molecular estimada de 28.800 Da. Sessenta e um aminoácidos terminais da ORF2 estão sobrepostos na ORF4. A seqüência da ORF4 do SBMV-SP apresentou identidade de nucleotídeos e aminoácidos de, respectivamente, 91% e 93% com o isolado Arkansas (SBMV-Ark) descrito nos EUA, indicando serem isolados muito proximamente relacionados. Mais recentemente, o genoma completo do SBMV-SP foi determinado através do seqüenciamento da ORF2 (Ozato Jr. et al., 2006). Os domínios para serino protease, VPg e RpRd (poliproteína) foram identificados bem como a presença da ORF3 contida na ORF2. Juntos, esses dados permitem concluir que o genoma do SBMV-SP possui 4133 nucleotídeos, com 3 ORFs sobrepostas e uma ORF2 contínua contendo uma região codificadora interna (ORF3). Assim, a organização do genoma do SBMV-SP mostra-se semelhante ao SBMV-Ark (Lee & Anderson, 1998) e diferente do SBMV (Othman & Hull, 1995), corroborando a proposição de erro no seqüenciamento do SBMV. A Figura 3, mostra a organização do genoma do SBMV-SP.
FIG.3. Organização do genoma do Southern bean mosaic virus isolado São Paulo (SBMV-SP).MP, proteína do
I.6 Proteína do Movimento
Para realizar uma infecção sistêmica na planta hospedeira, os fitovírus precisam superar diversas barreiras. Eles devem entrar na célula através de um ferimento ou inoculação por vetores, iniciar a multiplicação, translocar para as células vizinhas (movimento célula a célula) e finalmente para as outras partes da planta (movimento a longa distância).
Os fitovírus empregam comunicações intercelulares para se movimentarem pela planta. No movimento célula a célula os vírus utilizam os plasmodesmos para atravessar a parede celular. Os plasmodesmos são canais estreitos revestidos pela membrana plasmática e atravessados por um túbulo de retículo endoplasmático modificado, conhecido como desmotúbulo. Esses canais permitem a continuidade do citoplasma e do sistema de endomembranas entre as células (Raven et al., 2001). Em células vegetais sadias, apenas moléculas com massa molecular inferior a 1 kDa são capazes de atravessar passivamente esses canais, que possuemlimite de exclusão muito inferior à massa molecular dos menores fitovírus, ou mesmo de seus RNAs ou DNAs genômicos (Wolf et al., 1987). Para suprir essa restrição física, os fitovírus codificam proteínas especializadas, denominadas Proteínas do Movimento (MPs), capazes de dilatar os plasmodesmos permitindo a passagem de complexos formados por proteínas mais ácidos nucléicos virais ou mesmo de vírions inteiros (Deom et al., 1992).
Para o transporte a longa distância, além dos plasmodesmos, foi proposta a utilização do sistema vascular da planta (floema) (Carrington et al., 1996).
Durante todo esse processo de transporte, uma ou mais proteínas virais exercem papel fundamental. A maior parte dos vírus de plantas estudados parece expressar uma proteína especificamente relacionada com o movimento, denominada “Proteína do Movimento” (“Movement Protein” - MP), que está envolvida no transporte dos vírus através dos
plasmodesmos (Lazarowitz & Beachy, 1999). O papel da MP no movimento a longa distância ainda é mal compreendido, no entanto alguns autores sugerem que a MP realize funções específicas no espalhamento dos vírus sistemicamente (Hilf & Dawson, 1993). Os fitovírus são classificados em três grupos principais com base na necessidade ou não da proteína capsidial (CP) para atravessarem os plasmodesmos. O grupo I compreende os vírus que não necessitam da CP para realizarem o movimento. Nos vírus do grupo II a CP age auxiliando a MP no movimento e protegendo o genoma viral. Os vírus do grupo III também requerem a CP, porém, são transportados como partículas inteiras (Scholthof, 2005). O movimento envolvendo CP pode ocorrer através de túbulos (movimento “túbulo-guiado”) e é utilizado por uma grande variedade de vírus de planta, dentre eles: tospovírus, comovírus, caulimovírus, bromovírus, alfamovírus (Lazarowitz e Beachy, 1999; Carrington et al., 1996). Nesses casos, os plasmodesmos das células infectadas são drasticamente modificados, os desmotúbulos são removidos e um túbulo formado por MP é inserido no poro plasmodesmal (Figura 5). É por esse túbulo que as partículas virais são transportadas, sendo que neste tipo de transporte a proteína capsidial é também requerida (Lazarowitz e Beachy, 1999; Carvalho et al., 2004).
As MPs virais podem ser agrupadas em quatro superfamílias: I) MPs codificadas pelo bloco triplo de genes dos potexvírus e vírus relacionados; II) MPs dos tymovírus; III) uma série de pequenos polipeptídeos menores que 10 kDa, codificados pelos carmovírus e alguns geminivírus; IV) a superfamília ‘30 K’, relacionada com a MP de 30 kDa do TMV. Para a superfamíla ‘30 K’ foram propostos dois modelos de movimento, o primeiro é exemplificado pelo Tobacco mosaic virus (TMV) e está relacionado com o aumento do limite de exclusão dos
II. OBJETIVOS
III. MATERIAL E MÉTODOS
III. 1 Purificação das partículas virais
Folhas de Phaseolus vulgaris (L) ‘Jalo’ infectadas pelo SBMV-SP foram trituradas
em liquidificador com 2 volumes de tampão fosfato de sódio 0,1 M pH 7,2, contendo 0,5% 2-mercaptoetanol. A solução foi filtrada em gaze, clarificada com clorofórmio (0,5 ml/g de folha) e centrifugada 20 min a 16.000 g e 4°C. O vírus foi precipitado pela adição de polietilenoglicol (PEG 8000) a 10% e NaCl 1,0%, sob agitação por 2 h a 4°C, e então centrifugado por 10 min a 16000 g e 4°C. O sedimento foi ressuspendido em 1/10 do volume inicial de tampão fosfato 0,01 M pH 7,2 e submetido a um ciclo de baixa e alta rotação (16000 g/10 min e 100000g/90min). O “pellet” final foi ressuspendido em tampão fosfato e aplicado em gradiente de sacarose (10-50%) em tampão fosfato 0,01 M pH 7,2. por 1:30 h a 100000 g. A banda formada pelo vírus purificado foi coletada, diluída e ultracentrifugada por 1 h a 100000 g, dissolvendo-se o sedimento final em 1 ml de tampão fosfato 0,01 M pH 7,0.
III. 2 Obtenção de RNA viral
O RNA foi obtido a partir de partículas purificadas do SBMV. A extração do RNA viral foi feita utilizando-se o “RNeasy Plant Mini Kit” conforme especificações do fabricante (QIAGEN). O extrato foi eluído em água DEPC e estocado a -20°C.
III. 3 Desenho dos oligonucleotídeos
Os oligonucleotídeos foram desenhados utilizando-se o programa “Primer 3.0” a partir da seqüência (DQ875594) do genoma do SBMV depositada no GenBank.
A seqüência da possível proteína do movimento foi amplificada utilizando-se os oligonucleotídeos:
SBMVMP-pETF: 5’ – CCGGATCCATGAGCTATCGT – 3’
SBMVMP-pETR: 5’ – AAGCTTCCGCGCAGATAA – 3’
Os sítios de restrição, para as enzimas Bam HI (oligonucleotídeo senso) e Hind III
III. 4 Produção de cDNA
Oligonucleotídeo anti-senso (3’-AAGCTTCCGCGCAGATAA-5’) e o RNA viral foram desnaturados por aquecimento a 94°C por 10 min, imediatamente resfriados em gelo, e, em seguida os demais componentes foram adicionados. A reação teve volume total de 20 µl, consistindo de: 50 mM Tris.HCl pH 8,3; 75 mM KCl; 10 mM DTT; 0,1 mM cada dCTP, dGTP, dATP, dTTP; 0,4 µM do oligonucleotídeo, 2 unidades de inibidor de RNAse; 1µg RNA viral e 40 unidades de Transcriptase Reversa “Superscript II” (Invitrogen). A reação permaneceu incubada por 2 h a 42°C.
III. 5 Amplificação do gene da proteína do movimento (PCR)
O volume de cada reação da PCR foi de 25µl consistindo de tampão (Tris.HCl 20mM pH 8,4; KCl 50 mM); 5,0 mM MgCl2; 0,2 mM cada dCTP, dGTP, dATP, dTTP; 10µg/mL de cada
oligonucleotídeo (senso e anti-senso); 1 µl da mistura de reação de cDNA; e 2 unidades de Taq
polimerase (Invitrogen). O programa da PCR foi realizado em Termociclador MJ Reserch que consiste em uma desnaturação inicial a 94°C por 4 minutos, 1 minuto de anelamento a 53°C e um minuto de extensão a 72°C. Após 35 ciclos e uma extensão final por 10 minutos a 72 °C os fragmentos de DNA amplificados foram separados por eletroforese em gel de agarose 1% como descrito no item a seguir.
III. 6 Purificação do fragmento amplificado
Uma alíquota da reação de PCR foi submetida à eletroforese em gel de agarose 1% em tampão TAE (Tris.HCl 0,04 M; acetato de sódio 0,02 M; EDTA 0,001 M pH 8,3). A banda, referente ao fragmento amplificado, foi retirada do gel com lâmina e purificada com o “Mini Elute Gel Extraction Kit” (Invitrogen) seguindo-se as orientações do fabricante. O DNA foi quantificado em gel de agarose 1%, utilizando-se “Low DNA Mass Ladder” (Invitrogen) como marcador.
III. 7 Ligação do fragmento amplificado em vetor para multiplicação (pGEM)
III. 8 Sequenciamento do vetor pGEM + inserto
As reações de sequenciamento foram feitas utilizando-se o seqüenciador automático “ABI 377 DNA Sequencer” e o “ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit” (Perkin Elmer), seguindo as instruções do fabricante. Para o sequenciamento do DNA purificado foi utilizado o oligonucleotídeo senso “T7” (Promega). A reação consistiu em: 200µg de DNA, 1µL de primer (10 pmol/µL) e 2 µL da solução de BigDye.
As comparações com seqüências existentes no banco de dados do GenBank foram feitas através do programa BLAST do “National Center for Biotechnology Information” (NCBI).
III. 9 Transformação em célula competente (Escherichia coli - TOP 10)
Após a reação de ligação o vetor recombinante foi transformado em E. coli linhagem
TOP 10, utilizando-se 50µL de células competentes e 5µL da reação de ligação. Essa mistura permaneceu no gelo durante 1 hora e, então, submetida ao choque de temperatura a 42ºC por 1 min e 2 min no gelo. Em seguida foram adicionados 250µL de meio líquido SOC (meio SOB + 200mM de glicose) e as bactérias foram submetidas à regeneração (1 hora a 37ºC com agitação à 250 rpm). Posteriormente, as bactérias foram plaqueadas em meio sólido seletivo (LB +
ampicilina 100µg/mL), contendo ainda 40µL de X-Gal 20mg/mL (5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β -D-Galactopyranoside) e as colônias brancas testadas para comprovar a existência do inserto através de PCR. As colônias que apresentaram o inserto foram inoculadas em tubos individuais de 5mL de meio líquido seletivo (LB + ampicilina 100µg/ml) sob agitação e aeração constantes a 37ºC para posterior extração do DNA plasmidial.
III. 10 Purificação do plasmídeo recombinante
O DNA plamidial foi purificado utilizando-se o “Pure Link Quick Plasmid Miniprep Kit”, seguindo-se as orientações do fabricante (Invitrogen). O DNA plasmidial foi eluído em 50
III. 11 Digestão enzimática com Bam HI e Hind III
Para cada 1 µg de DNA foram utilizadas 10 unidades (1µl) de cada enzima Bam HI e
Hind III (Promega). A reação de digestão de 50 µl consistiu de: 25 µl de vetor (125 ng/µl), 3 µl
de cada enzima, 5 µl de tampão E 10X, 5,0 µl de BSA 10X e 9 µl de água. A mistura foi submetida à temperatura de 37°C por 2h e a 65°C por 15 min. Em seguida, a mistura foi submetida à eletroforese em gel de agarose e a banda referente ao fragmento extraída conforme o item III. 6.
III. 12 Digestão enzimática e defosforilação do vetor de expressão (pMAL)
O vetor de expressão pMAL-2c do “pMAL Protein Fusion and Purification System” (Bio Labs) foi digerido seguindo os passos descritos no item VI.9. Em seguida, o vetor digerido foi defosforilado utilizando-se a enzima CIAP (Fosfatase alcalina de intestino de bezerro) (Invitrogen), 5 unidades de enzima para cada 1µg de DNA. A mistura foi submetida a 37°C por 30 min e a 75°C por 10 min.
III. 13 Ligação do DNA em vetor de expressão (pMAL)
Para esta reação de ligação foram utilizados 50 ng de vetor pMAL previamente digerido e defosforilado, 50 ng de DNA, 3 unidades de T4 DNA ligase (Promega) e tampão de ligação (Promega). A mistura foi submetida a 4°C por 16h.
III. 14 Transformação em célula competente (E. coli linhagem DH5αααα)
A transformação do vetor recombinante pMAL em E. coli linhagem DH5α seguiu o mesmo protocolo descrito no item III.9. As colônias que apresentaram o inserto foram
inoculadas em tubos individuais de 5mL de meio líquido seletivo (LB + ampicilina 100µg/ml) sob agitação e aeração constantes a 37ºC, o que serviu como pré-inóculo para o teste de expressão.
III. 15 Testes de expressão
Inicialmente 700 µl do pré–inóculo foram transferidos para um novo tubo contendo 7
de expressão foi feita com IPTG 1 mM por 4 horas. Foram coletadas amostras após 30 min, 2 h e 4h da indução.
III. 16 Análise em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 10%
A eletroforese foi feita em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE) segundo Laemmli (1970). As proteínas foram desnaturadas por fervura (3min a 100°C) em tampão de amostra (Tris.HCl 0,125 M pH 6,8, contendo SDS 4%, glicerol 20%, 2-ME 10% e azul de bromofenol 0,001 M). As amostras foram centrifugadas por 5 min a 16.000 g e 10 µl do
sobrenadante de cada amostra foram aplicados no gel. A eletroforese foi conduzida por 90 min a 100 V em aparelho Mini Protean II (BioRad). Os géis foram fixados e corados em mistura contendo metanol, água, ácido acético (50:50:10) e Comassie Blue 0,25% por 3 h e descorados com metanol e água (1:1) por 18 h.
III. 17 Expressão da proteína recombinante (pMAL)
Inicialmente, 4 ml de pré-inóculo foram transferidos para um novo tubo contendo 250 ml de meio líquido seletivo (LB + ampicilina 100µg/ml). O tubo foi mantido sob agitação e aeração a 37°C por 3h e em seguida foi feita uma leitura da amostra em espectrofotômetro (a OD550 deverá estar entre 0,5 e 0,65 para que a expressão possa ser induzida). A indução de
expressão foi feita com IPTG 1 mM por 4 horas. Em seguida, o meio foi centrifugado por 20 min a 4.000 g e 4°C. O “pellet” foi ressuspendido em 12,5 ml de tampão de lise (20 mM tampão fosfato, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,2) e mantido a –20°C por 16h. A solução foi descongelada em banho de gelo e submetida a pulsos de 15s a 300 W em sonicador (Marconi, modelo MA 103) para lise celular. Esta amostra foi centrifugada por 20 min a 4.000 g a 4°C. A fase aquosa foi coletada e utilizada para a purificação da proteína de interesse.
III. 18 Purificação da proteína recombinante
III. 19 Produção de Anticorpos
A produção do antissoro policlonal para a proteína recombinante do SBMV-SP foi realizada no Laboratório de Virologia (Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola da Esalq/USP – Piracicaba) sob orientação do professor Dr. Jorge A. M. Rezende. A proteína purificada foi injetada em coelho branco da raça Nova Zelândia através de cinco injeções intramusculares, a intervalos semanais, com 300 µg de proteína por injeção.
III. 20 Expressão e purificação da provável MP em vetor de expressão pET-28a
Os passos anteriores à construção do vetor de expressão foram idênticos aos descritos nos itens III.5 até III.13. Para a construção do vetor de expressão foram utilizados 50 ng de vetor pET-28a (Novagen), previamente digerido e defosforilado, 50 ng de DNA, 3 unidades de T4 DNA ligase e tampão de ligação (Promega). A mistura foi submetida a 4 °C por 16 h. A transformação em E. coli linhagem BL21(DE3)-RIL foi feita como descrito no item III.14. As
colônias foram testadas por PCR, sendo que uma das colônias positivas foi utilizada para o pré-inóculo. Inicialmente, 4 mL de pré-inóculo foram transferidos para um novo tubo contendo 250 mL de meio líquido seletivo (LB + canamicina e cloranfenicol 100 µg/mL). O tubo foi mantido sob agitação e aeração a 37 °C por 1h30 e em seguida foi feita uma leitura da amostra em espectrofotômetro. A indução de expressão foi feita com IPTG 1 mM por 4 h. Em seguida, o meio foi centrifugado a 3.000 x g por 20 min. O “pellet” foi ressuspendido em 20 mL tampão de lise (20mM fosfato de potássio, 500 mM NaCl e 6 M Guanidina). A solução foi submetida a 6 pulsos de 15 s a 300 W em sonicador (Marconi - MA 103) para lise celular. A purificação foi feita em coluna de afinidade utilizando resina de níquel (ProBond) conforme instruções do fabricante (Invitrogen).
III. 21 Teste de Titulação do antissoro policlonal por “Dot-blot”
III. 22 Teste de Titulação e especificidade do antissoro policlonal por “Western blot”
Alíquotas da proteína purificada pelo sistema pET28a foram aplicadas em gel desnaturante de SDS-poliacrilamida. As proteínas foram transferidas para membrana de
nitrocelulose em um eletrotransferidor (Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell Bio-Rad) operando sob voltagem constante (100V) por 60 minutos utilizando tampão de transferência Tris-Glicina (Tris 0,025 M, Glicina 0,192 M) contendo Metanol 20%. A membrana foi incubada com o antissoro específico em diluição 1:1000. Alíqotas de Soro de Albumina Bovina (BSA) e Polimerase recombinante do SBMV-SP foram utilizadas para testar a especificidade do
antissoro.
III. 23 Detecção
A detecção da proteína na membrana de nitrocelulose foi feita incubando a membrana em tampão PBS (Fosfato de sódio 0,01 M, NaCl 0,15 M, pH 7,2) contendo Tween-20 0,3% (PBS-T) e albumina de soro bovino (BSA) 3% por 3h. Em seguida, a membrana foi incubada por 1h com o antissoro específico diluído 1:1.000 em tampão PBS-T contendo BSA 0,3% e heparina (20 µg/ml). A membrana foi lavada com tampão PBS-T e incubada com soro anti-IgG de coelho acoplado com fosfatase alcalina (Sigma) diluído em tampão PBS-T contendo BSA 0,3% na proporção de 1:30.000 por 1 h. Após lavagens com tampão PBS, a membrana de nitrocelulose foi incubada com mistura de BCIP/NBT
VI. RESULTADOS
IV.1 Purificação das partículas virais
Uma fração do vírus purificado foi observada em gel SDS-PAGE 12% (Figura 6). Observou-se uma única banda de aproximadamente 30kDa referente à proteína capsidial do vírus. A amostra não apresentou contaminantes, mostrando a eficiência do procedimento de purificação. A relação da leitura da absorbância à luz ultravioleta 260nm/280nm foi de 1,648. Os dados de absorbância permitiram o cálculo da concentração viral que foi de 9,06mg/ml e um rendimento de 45,3mg/kg de folha.
IV.2 Extração do RNA viral
O RNA viral extraído a partir de partículas purificadas foi analisado em gel de agarose 1% evidenciando única banda com massa molecular de aproximadamente 4,2 kb, correspondente ao RNA genômico do SBMV-SP (Figura 7).
IV.3 Amplificação por PCR do gene da possível proteína do movimento
O produto da reação de PCR, amplificado com os oligonucleotídeos específicos, foi analisado em gel nativo de agarose 1%, apresentando única banda de aproximadamente 500pb correspondente ao fragmento de tamanho esperado para o possível gene codificador da proteína do movimento (Figura 8). O fragmento amplificado foi purificado e ligado ao vetor pGEM-T.
IV.4 Digestão enzimática do vetor pGEM com Bam HI e Hind III
A digestão do vetor recombinante pGEM-T com as enzimas Bam HI e Hind III
liberaram o fragmento clonado de 500 pb, conforme esperado (Figura 9). O fragmento foi purificado e utilizado na reação de ligação ao vetor pMAL.
IV.5 Testes de expressão da MP em vetor pMAL e purificação da proteína recombinante
MP-MBP
Em SDS-PAGE 10% (Figura 10) ficou evidenciada a expressão de uma proteína de cerca de 60 kDa (17 kDa referentes à provável MP viral + 43 kDa referentes à proteína de fusão do pMAL – “Maltose Binding Protein”). A partir de agora, a proteína recombinante de 60 kDa, será denominada MP-MBP. Esta proteína foi purificada em condições nativas e as frações referentes às eluições da proteína de interesse estão evidenciadas em SDS-PAGE 10% (Figura
10). As frações de G a L (sem contaminantes) foram juntadas, concentradas e utilizadas para produção de antissoro.
IV.6 Expressão da provável MP em vetor pET28a
O fragmento amplificado foi também ligado em pET28a, transformado em E. coli
linhagem BL21(DE3)-RIL e a proteína expressa foi purificada em coluna contendo resina de níquel. Neste sistema a proteína é expressa contendo uma cauda contendo 6 histidinas, aumentando sua massa molecular em 5kD como observado na figura 11.
Figura 10. SDS-PAGE 10% mostrando a expressão da proteína de fusão MP-MBP. (M) Marcador para proteínas, Bench Mark Protein Lader (Invitrogen) (A) Amostra-controle sem indução. (B) Amostra após 1hora de indução, (C) Etapa de Lavagem do processo de purificação, (D ,E, F, G, H, I, J, K e L) Frações referentes às eluições
Figura 11. Gel de poliacrilamida 12% mostrando a expressão da proteína de aproximadamente 22 kDa (MP-His).
IV.7 Teste de titulação do antissoro policlonal por “Dot-blot”
O teste de titulação para o antissoro MP-SBMV produzido foi realizado aplicando-se 20 ng de proteína purificada obtida pelo sistema de expressão e purificação pET 28a, MP-His. Para cada “dot” foi testada uma diluição diferente do antissoro (Figura 12).
IV.8 Teste para determinação da especificidade do antissoro por “Western-blot”
A especificidade do antissoro produzido foi determinada por testes de “Western-blot” e representados pela Figura 13. As proteínas mostradas na Figura 13A (gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12%) foram transferidas para membrana de nitrocelulose, que foi incubada com o AS-MP-SBMV (Figura 13B).
Figura 12. Teste de titulação do antissoro policlonal obtido em coelho contra a proteína MP-His do SBMV. As letras de
A a F representam as diluições do antissoro na seguinte ordem: 1:1.000; 1:2.000; 1:4.000; 1:8.000; 1:16.000; 1:32.000.
Figura 13. Quadro (A) SDS-PAGE 12% : (M) Marcador de massa molecular, Dalton Mark VII-L (Sigma); (A)
IV.9 Teste para determinação da eficiência do antissoro por “Dot-blot”
Em membrana de nitrocelulose foram aplicadas, nos diferentes “dots”, concentrações decrescentes de proteína purificada. A Figura 14 mostra o resultado do teste de eficiência realizado com o AS-MP-SBMV a uma diluição de 1:1000. Concentrações maiores que 1,8ng foram detectadas.
V. DISCUSSÃO
A primeira evidência de que uma proteína relacionada com o movimento era codificada pelos fitovírus foi dada pelos estudos de Nishiguchi e coloboradores em 1978. Através de estudos com mutantes do TMV sensíveis a uma temperatura específica ficou comprovado que na ausência de uma determinada proteína o vírus se replicava normalmente, porém, não se espalhava pela planta. Esses experimentos permitiram identificar uma proteína de 30 kDa como a proteína responsável pelo movimento célula a célula do TMV. Desde então, proteínas relacionadas com a movimentação viral de uma célula a outra têm sido identificadas para a maioria, senão todas, as famílias de vírus de plantas (Carrington et al., 1996; Hull, 2002). As MPs, assim como as replicases, são proteínas não estruturais que, em geral, são produzidas em baixa concentração nas plantas, o que dificulta a identificação, localização e a purificação (Hull, 2002).
Uma das técnicas moleculares utilizadas para estudo de proteínas não estruturais é a expressão em Escherichia coli, o que permite que grandes quantidades de proteínas sejam
produzidas, purificadas e, posteriormente, utilizadas para, por exemplo, a produção de antissoros policlonais específicos. As células procarióticas (E. coli) são normalmente preferidas para a
expressão de proteínas heterólogas pelo fato de oferecerem algumas vantagens como (1) fonte de
carbono de baixo custo para o crescimento, (2) rápido acúmulo de biomassa, (3) possibilidade de uso em processo de fermentação com alta densidade de células, (4) possibilidade de produção de proteínas em larga escala (Panda, 2003). Um variável número de protocolos está à disposição, os quais descrevem várias estratégias de expressão (Sahdev et al., 2008).
Nos sistemas pET (Novagen) e pMAL (BioLabs), a expressão da proteína recombinante está sob o controle do promotor de transcrição do bacteriófago T7. A grande vantagem destes vetores é que eles podem ser induzidos por IPTG em E. coli BL21(DE3) e são
transcritos pela T7 RNA polimerase, a qual é muito seletiva e ativa, sendo capaz de elongar cadeias de RNA aproximadamente 5 vezes mais rápido que a RNA polimerase de E. coli. A
linhagem BL21(DE3) contém ainda o plamídeo pLysS que fornece um controle mais rigoroso dos níveis basais da proteína expressa e facilita a lise bacteriana (Studier et al.,1990).
No presente trabalho, a clonagem do gene da provável proteína do movimento do SBMV-SP em vetor de expressão pMAL permitiu que grandes quantidades dessa proteína fossem produzidas e, em seguida, purificadas no sistema de purificação pMAL. Neste sistema de expressão e purificação a proteína é obtida em sua forma nativa, porém, é uma proteína de fusão, ou seja, está ligada a uma outra proteína (“Maltose Binding Protein”, MBP) codificada pelo genoma do vetor. Devido à afinidade de ligação da MBP colunas contendo resina de amilose são utilizadas para a purificação da proteína de fusão a partir de extratos de bactérias. Além de permitir que a proteína se ligue à resina, alguns autores (Kapust e Waugh, 1999) têm observado que a MBP não só aumenta a imunogenicidade, como também, a solubilidade da proteína expressa. Vários testes foram realizados visando obter amostras mais puras, sendo que, tampões de eluição que possuíam quantidades maiores de maltose apresentaram maior eficiência. A utilização de baixas concentrações de maltose no processo de lavagem permitiu que proteínas não específicas, ligadas mais fracamente à resina, fossem eluídas. Já aquelas que estavam ligadas especificamente à resina precisaram de concentrações mais elevadas de maltose para se desligarem da matriz.
quelatado (o centro de adsorção) e certos resíduos de aminoácidos, tais como imidazol da histidina, tiol da cisteína e indol do triptofano, os quais doam elétrons para o íon metálico. Diferentes testes para uma purificação mais eficiente evidenciaram que altas concentrações de NaCl nos tampões permitiam ligações mais específicas da proteína de interesse à resina, livrando-a de proteínlivrando-as contlivrando-aminlivrando-antes. Como conseqüêncilivrando-a mlivrando-ais níquel estlivrando-arilivrando-a exposto plivrando-arlivrando-a livrando-a retenção de mais proteína recombinante por volume de resina. No entanto, nesse sistema a proteína obtida encontra-se desnaturada e, como a intenção deste estudo era a produção de antissoro policlonal, optou-se pela utilização da proteína em sua forma nativa, acreditando-se que nessa forma os epitopos permaneceriam preservados.
VI. CONCLUSÕES
• O sistema de expressão pMAL, utilizado neste trabalho, foi eficiente para a produção da provável proteína do movimento do SBMV-SP em concentrações suficientes para obtenção de antissoro policlonal.
ANEXO 1 – Mapas dos vetores utilizados neste trabalho
Vetor pGEM – “T Easy Vector System I” (Promega)
ANEXO 2 – Sistema de expressão e purificação pMAL (BioLabs)
Gene de interesse
Clonagem e Expressão
Ligação e Lavagem
amilose
Eluição com maltose Proteína de
interesse
Proteína de interesse
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