Novos compostos de paládio e rutênio com atividade antitumoral

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Texto

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FABIANA DO AMARAL SERRANO

NOVOS COMPOSTOS DERIVADOS DE PALÁDIO E RUTÊNIO COM ATIVIDADE ANTITUMORAL

São Paulo 2010

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FABIANA DO AMARAL SERRANO

NOVOS COMPOSTOS DERIVADOS DE PALÁDIO E RUTÊNIO COM ATIVIDADE ANTITUMORAL

Orientadora: Profª. Dra. Elaine Guadelupe Rodrigues

São Paulo 2010

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Serrano, Fabiana do Amaral

Novos compostos de Paládio e Rutênio com atividade antitumoral/ Fabiana do Amaral Serrano – São Paulo, 2010.

165 folhas.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Programa de Pós-graduação em Microbiologia, Imunologia e Parasitologia

Título em inglês: Novel palladium and ruthenium antitumoral compounds

1. Compostos de Paladio 2. Compostos de Rutênio

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MY WAY - Frank Sinatra

And now the end is near And so I face the final curtain My friend, I'll say it clear I'll state my case of which I'm certain I've lived a life that's full I traveled each and every highway And more, much more than this I did it my way Regrets, I've had a few But then again, too few to mention I did what I had to do And saw it through without exemption

I've planned each charted course Each careful step along the byway And more, much more than this I did it my way

Yes there were times, I'm sure you knew When I bit off more than I could chew But through it all when there was doubt I ate it up and spit it out

I faced it all and I stood tall And did it my way

I've loved, I've laughed and cried I've had my fill, my share of losing And now as tears subside I find it all so amusing

To think I did all that And may I say, not in a shy way Oh no, oh no, not me I did it my way

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Aos meus pais Antonio e Lídia;

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AGRADECIMENTOS

Agradeço minha orientadora, Dra. Elaine Guadelupe Rodrigues, por me aceitar como aluna e pela oportunidade de desenvolver um trabalho maravilhoso. Sou grata por todos os ensinamentos ao longo desta trajetória, pela confiança depositada em mim, pela paciência, pelas conversas, pelos chás, e pelas broncas merecidas.

Agradeço ao Profº Dr Luiz Rodolpho Travassos pela grande contribuição durante o desenvolvimento deste trabalho. Pelas dicas, pelas conversas, por ser o grande cientista que é.

Aos Professores e colaboradores que participaram deste trabalho:

- Profº Dr. Antonio Carlos Caíres, pela síntese do composto Ciclopaladado 7A;

- Profº Dr. Douglas Wagner Franco e a sua aluna, Renata Osti, pela síntese dos compostos de Rutênio;

- Profª Dra. Soraya Smaili e sua aluna, Priscila Monteforte, pela colaboração estabelecida para identificar o mecanismo de ação do ciclopaladado 7A; agradeço pelas reuniões esclarecedoras e por tudo que foi aprendido através desta parceria;

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- Aos meus amigos doutores da Unidade de Oncologia Experimental (UNONEX) Dr. Alisson Matsuo, pelo auxílio nos experimentos finais com o ciclopaladado 7A; Dra. Thaysa Paschoalin, pelos ensaios de angiogênese; Dra. Denise Arruda, por ajudar a determinar o mecanismo de ação dos compostos sulfatados.

Agradeço aos professores e alunos da Disciplina de Biologia Celular, por disponibilizarem seus laboratórios e reagentes para a conclusão desta tese.

Agradeço aos profissionais técnicos da Discilpina de Biologia Celular: Antonio Furlaneti (Tutis) e Luizão, pela disposição e ajuda durante os

experimentos.

Agradeço aos funcionários da sala de lavagem Maria e Américo. Sem eles nada disso (de verdade!) seria possível!

Agradeço ao pessoal da Secretaria, que está sempre “quebrando nossos galhos”, Marcelo e Márcia. Márcia, pelas risadas, pela amizade, por me ouvir, obrigada!

Agradeço meus pais Lidia e Antonio, por todo amor, pela confiança e por estarem sempre ao meu lado em todos os momentos da minha vida. Obrigada por serem meus pais....tenho muito orgulho de vocês. Tenho certeza de que vocês também estão orgulhosos de mim. Sem vocês, nada disso seria verdade...obrigada! Amo vocês!

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analista de sistemas, que possibilita eu queimar o notebook, sumir com os

dados do pen-drive, e mesmo assim você consegue recuperar todas as

informações! Obrigada por todo o apoio durante esta fase da minha vida, por acreditar em mim, por achar que as coisas que eu faço são sempre “as mais bonitas”, “as melhores”, por ter certeza de que tudo o que eu faço vai dar certo...por ser meu amor!

Aos meus queridos amigos que pertencem, ou algum dia fizeram parte da Unidade de Oncologia Experimental: Ana Beatriz, Andrey, Alisson, Bianca, Carla, Cíntia, Denise, Ellen, Eliana, Flávia, Filipe, Felipe, Jorge, Juliana, Karina Luana, Luis, Manoela, Mariana, Natasha, Rafael (Toddy), Tiemi, Thaysa...espero não ter esquecido de ninguém. Gostaria de deixar explícito que todos vocês contribuíram, de alguma forma, para meu crescimento profissional e pessoal. Obrigada por me ouvirem, por estarem sempre querendo o meu melhor. Foram muitas risadas e tensões, mas todos os momentos passados juntos foram igualmente inesquecíveis. Pelos grandes amigos que eu fiz, este trabalho valeu muito à pena.

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ÍNDICE

RESUMO...i

ABSTRACT...iii

1.0 INTRODUÇÃO...1

1.1 Origem do Melanoma...1

1.2 O Melanoma...2

1.3 Dados Epidemiológicos...3

1.4 Quimioterapia Antitumoral...4

1.5 Compostos de Coordenação...8

1.5.1 Compostos de Platina...9

1.6 Exemplos de Compostos metálicos em Ensaios Pré-clínicos...11

1.6.1 Complexos de Ferro...11

1.6.2 Compostos de Ouro...12

1.6.3 Compostos de Paládio...13

1.7 Exemplos de Compostos Metálicos em Ensaios Clínicos...16

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1.7.2 Compostos de Rutênio...17

1.8 Apoptose...23

1.8.1 Apoptose mediada pela Via Extrínseca...25

1.8.2 Apoptose mediada pela Via Intrínseca...26

1.8.3 Alterações celulares ausadas pelo estímulo apoptótico...28

2.0 OBJETIVOS...33

3.0 MATERIAIS E MÉTODOS...34

3.1 Quimioterápicos...34

3.2 Linhagens de células tumorais e condições de cultivo...36

3.3 Animais...37

3.4 Obtenção de macrófagos derivados de medula óssea...38

3.5 Dosagem protéica...38

3.6 Ensaio de citotoxicidade celular in vitro...39

3.7 Ensaio de inibição da citotoxicidade do complexo 7A in vitro com DTT...39

3.8 Ensaio de citotoxicidade in vitro em presença de inibidores de proteases: Ca074-Me (catepsina B) ou E-64 (cisteíno-proteases)...40

3.9 Quantificação da acidificação extracelular...40

3.10 Microscopia ótica...41

3.11 Microscopia de Transmissão Eletrônica...41

(11)

3.13 Translocação da Proteína Bax-GFP em células transfectadas....43

3.14 Determinação da concentração intracelular de cálcio...43

3.15 Ativação de caspases...44

3.16 Avaliação de condensação nuclear por microscopia de fluorescência...45

3.17 Ensaio de degradação de DNA...46

3.18 Ensaio de TUNEL (Terminal Transferase dUTP Nick End Labeling)...47

3.19 Detecção da translocação da fostatidilserina (PS) para a superfície celular...48

3.20 Ensaio de Angiogênese...49

3.21 Ensaio de hemólise...49

3.22 Ensaio de colonização pulmonar e tratamento com os quimioterápicos...50

3.23 Desenvolvimento tumoral subcutâneo in vivo...50

3.24 Análise estatística...51

4.0 RESULTADOS: CICLOPALADADO...52

4.1 Efeitos sobre células tumorais humanas in vitro...52

4.2 Efeito antimetastático do Ciclopaladado 7A...60

4.3 Alterações morfológicas provocadas pelo Composto 7A...62

4.4 Interação do Ciclopaladado 7A com mitocôndrias...64

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4.6 Participação do cálcio no processo de morte induzido pelo

Ciclopaladado 7A...74

4.7 Ativação de caspases...76

4.8 Alterações nucleares e degradação de DNA induzidas pelo Cciclopaladado 7A...78

4.9 A morte celular causada pelo Ciclopaladado 7A em células tumorais não é dependente de catepsinas...81

4.10 Efeito do Ciclopaladado 7A no processo angiogênico...84

5.0 RESULTADOS: COMPOSTOS DE RUTÊNIO...86

5.1 Compostos de Rutênio apresentam ação citotóxica in vitro...86

5.2 Alterações morfológicas causadas por Compostos de Rutênio nas células tumorais in vitro...91

5.3 Degradação de DNA provocada por Compostos de Rutênio...93

5.4 Efeito do RuImNO na angiogênese...95

5.5 Estabelecimento de protocolo terapêutico in vivo para avaliação do efeito antitumoral dos Compostos de Rutênio...98

5.6 Determinação do mecanismo de ação do Composto RuImSO4...108

6.0 DISCUSSÃO...118

6.1 Composto Ciclopaladado C7A: mecanismo de ação...118

6.2 Compostos de Rutênio...130

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8.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...141

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RESUMO

O melanoma é a forma mais agressiva de câncer de pele em virtude do elevado grau de proliferação, invasão e metástase das células tumorais. Menos de 10% dos pacientes com melanoma metastático sobrevivem por 5 anos. Quimioterapias com um único composto são bem toleradas, mas associadas a baixas taxas de resposta terapêutica. Associações de quimioterápicos já aprovados para uso humano também foram relacionadas a baixas taxas de resposta, sem redução da toxicidade. Logo, a identificação de novos agentes antitumorais é crítica para o tratamento do melanoma, e este trabalho buscou avaliar a atividade antitumoral de novos quimioterápicos derivados de paládio e rutênio no modelo pré-clínico de melanoma murino B16F10-Nex2.

Um composto ciclopaladado, [Pd2(S(-)C2, N-dmpa)2 (µ-dppe)Cl2], denominado C7A, avaliado anteriormente pelo nosso grupo, demonstrou elevada atividade antitumoral e baixa toxicidade in vivo, porém, seu mecanismo

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murino B16F10-Nex2. Observou-se que células tumorais humanas são sensíveis ao C7A, e o mecanismo de ação do composto nessas células parece ser idêntico ao observado em células murinas. O ciclopaladado 7A reduziu significativamente o número de nódulos pulmonares sem toxicidade aparente, indicando sua eficiência também contra tumores metastáticos.

A atividade antitumoral de diversos compostos nitrosil-tetraamina-rutênio (trans-[RuII(NH3)4(L)NO+], onde L corresponde a diferentes ligantes de estabilização, e que são doadores de óxido nítrico (NO) em meios biológicos foi avaliada. Todos os compostos testados foram citotóxicos in vitro para células

tumorais murinas e humanas. Alguns compostos foram selecionados e avaliados in vivo, mostrando uma elevada toxicidade em paralelo a uma

atividade antitumoral. No entanto, observou-se que os compostos onde o NO havia sido substituído por um radical sulfato, utilizados como controles dos compostos doadores de NO, apresentaram elevada atividade antitumoral e baixa toxicidade in vivo, retardando o desenvolvimento do tumor subcutâneo e

prolongando a sobrevida dos animais tratados. Os compostos sulfatados também apresentaram baixa toxicidade ao reduzir o número de nódulos metastáticos dos animais tratados. Esses compostos também foram citotóxicos

in vitro para células tumorais humanas, e as alterações morfológicas,

externalização de fosfatidilserina, condensação nuclear e degradação de DNA observados sugerem que os compostos tetraamina rutênio sulfatados levam a célula tumoral à morte por apoptose.

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ABSTRACT

Melanoma is the most aggressive form of skin cancer mainly because of the high degree of tumor cell proliferation, invasion and metastasis. Less than 10% of metastatic melanoma patients show 5 years survival. Single drug chemotherapy is well tolerated but associated with low response rates. Associations of chemotherapeutic agents approved for human use are related to low response rates, without improvement on side effects. Therefore, the identification of new antitumor agents is critical to melanoma treatment, and this study aimed to evaluate the antitumor effect of novel palladium and rutheniun derived chemotherapeutic drugs in the preclinical model of murine melanoma B16F10-Nex2.

A cyclopalladated compound, [Pd2(S(-)C2, N-dmpa)2 (µ-dppe)Cl2], named C7A was previously evaluated by our group. The complex showed high antitumor and low toxicity in vivo, however, the targets for this compound in

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on these cells. Cyclopalladated 7A significantly reduced the number of pulmonary nodules with no apparent toxicity, indicating that this compound is also active against metastatic melanoma lesions.

Antitumor activity of several nitrosyl tetraammine ruthenium compounds with general formula (trans-[RuII(NH3)4(L)NO+], where L corresponds to different stabilization ligands, were evaluated. These compounds are nitric oxide (NO) donors in biological media. All tested compounds were cytotoxic in vitro to

human and murine tumor cells. Some compounds were selected and evaluated

in vivo, showing numerous side effects in association with the antitumor effect.

However, it was found that the compounds where the NO was replaced by a sulfate group, used regularly as a negative control for NO-donor ruthenium complexes, showed a pronounced antitumor activity and low toxicity in vivo,

delaying subcutaneous tumor development and extending survival of treated animals. Sulfate compounds also reduced the number of metastatic lung nodules with no apparent toxicity. These compounds were also cytotoxic for human tumor cells in vitro, and the morphological alterations,

phosphatidylserine externalization, nuclear condensation and DNA degradation observed after cell treatment suggested that sulfate tetraamine compounds induced an apoptotic cell death.

Both evaluated chemotherapeutic drugs open new possibilities for

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1.0 INTRODUÇÃO

O presente trabalho concentra-se na avaliação de novos quimioterápicos com atividade antitumoral no modelo de melanoma murino B16F10-Nex2 in

vivo e in vitro. Foi também analisado o modo de ação destes compostos que

futuramente poderão ser empregados como agentes antitumorais na clínica médica.

1.1 Origem do Melanoma

O melanoma desenvolve-se a partir da transformação maligna dos melanócitos. Os melanócitos são células produtoras de melanina, que residem na camada basal da epiderme na pele humana. Os melanócitos cutâneos originam-se da alta mobilidade dos progenitores presentes na crista neural, que migram para a pele durante o desenvolvimento embrionário (Chudnovsky et al,

2005). É possível que a habilidade de rápida metastatização das células de melanoma seja uma característica semelhante à propriedade de migração dos melanócitos precursores, antes de alcançar os tecidos epiteliais (Balch et al,

1993).

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riscos para o desenvolvimento do melanoma. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, sensibilidade ao sol, pele clara e exposição excessiva são fatores que predispõem ao desenvolvimento do melanoma. Dessa forma, medidas preventivas para se evitar a doença devem ser tomadas, tais como, evitar a exposição prolongada ao sol, principalmente em horários onde a incidência de radiação ultravioleta (UVB) dos raios solares é maior, além do uso de equipamentos de proteção, como óculos escuros, chapéu e filtro solar.

1.2 O Melanoma

O melanoma cutâneo pode ser subdividido em vários subtipos, dependendo de sua localização anatômica e do seu padrão de crescimento. Clark et al (1978) propuseram um modelo classicamente aceito para a

progressão de melanomas. Os melanócitos de lesões névicas, originados direta ou indiretamente de melanócitos imaturos, poderiam se converter progressivamente em melanócitos de nevos displásicos, melanomas de crescimento radial (invasivo in situ), melanomas de crescimento vertical e

finalmente melanomas metastáticos. Alternativamente, como em todos os modelos de progressão, melanócitos imaturos poderiam originar ab initio

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pele normal se dá a partir do aparecimento de uma pinta escura com bordas irregulares, acompanhada de coceira e descamação. Em casos de uma lesão pigmentada pré-existente, ocorre um aumento no tamanho e alteração na coloração e na forma da lesão que passa a ser assimétrica com bordas irregulares (Instituto Nacional do Câncer - http://www.inca.gov.br).

1.3 Dados epidemiológicos

A incidência do melanoma está aumentando drasticamente na população ocidental. Estima-se que 2 a 3 milhões de casos de câncer de pele sejam diagnosticados no mundo a cada ano, e apesar do melanoma representar aproximadamente 132.000 destes casos (cerca de 7%), esta é a forma mais agressiva de câncer de pele, e pode levar o indivíduo à morte (Gray-Schopfer

et al, 2007). De acordo com o Instituto Nacional do Cancer (INCA), foram

relatados no Brasil cerca de 470.000 novos casos de neoplasias em 2008. Destes, 6.000 eram casos de câncer do tipo melanoma, com taxas de equivalência entre homens e mulheres (Instituto Nacional do Câncer -http://www.inca.gov.br).

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desenvolvimento, a sobrevida média desses pacientes é de 56%. Entretanto, se detectado apenas nos estágios avançados da doença, o melanoma maligno metastático é altamente resistente às terapias disponíveis atualmente e possui um prognóstico ruim, com uma média de sobrevida de apenas 6 meses, e de 5 anos para menos de 5% dos pacientes. Dessa forma, novas estratégias de tratamento precisam ser urgentemente desenvolvidas (Gray-Schopfer et al,

2007).

1.4 Quimioterapia antitumoral

Atualmente, os maiores problemas associados ao tratamento do melanoma, bem como da maioria dos cânceres, estão relacionados ao rápido crescimento tumoral e ao desenvolvimento de metástases. Portanto, a utilização de drogas que interfiram nestes dois processos é de fundamental importância clínica (Dua et al, 2007). Diferentes abordagens vêm sendo

desenvolvidas para o tratamento do melanoma, incluindo quimioterapia e bioquimioterapia, como terapia simples ou ainda em combinação.

A quimioterapia é considerada o tratamento padrão para o melanoma em estágios mais avançados. Entretanto, o melanoma é considerado um tumor resistente às quimioterapias. Os quimioterápicos poderiam teoricamente atingir as células metastáticas, porém os tratamentos atuais não promovem benefício terapêutico significativo (Soengas & Lowe, 2003). Vários quimioterápicos podem ser utilizados no tratamento do melanoma (Tabela 1), e o único quimioterápico aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration, USA) é a

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permite remissão completa em apenas 5 a 10% dos pacientes tratados (Serrone et al, 2000). Termozolomide, um derivado da dacarbazina mostrou-se

um agente eficaz contra metástases cerebrais, mas não demonstrou aumento significativo nos índices de sobrevida (Atkins, 2000). Ambos os agentes promovem alquilação e metilação dos ácidos nucléicos, levando à inibição da síntese de proteínas e de ácidos nucléicos (Soengas & Lowe, 2003). Outros compostos que não foram eficazes em estudos randomizados incluem as nitrosuréias (carmustina, lomunstina) que provocam quebra do DNA da célula tumoral; taxanos (taxol, docetaxol) e alcalóides da vinca (vincristina, vimblastina), que agem alterando a divisão celular, motilidade e transporte intracelular por impedir os mecanismos de despolimerização das proteínas do microtúbulo no citoesqueleto; e derivados de platina (cisplatina, carboplatina). Além disso, o melanoma é notavelmente resistente ao tratamento com outros quimioterápicos considerados padrão, como, por exemplo, doxorubicina (que age provocando quebra e inibição de síntese do DNA e ainda impede replicação do DNA) e etoposide (que atua inibindo a enzima topoisomerase II).

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sugerido que essas duas drogas possam ainda ser combinadas com novas e efetivas drogas quimioterápicas, desenvolvendo um protocolo terapêutico que leve a um aumento real na sobrevida total dos pacientes tratados. Combinações de quimioterápicos têm sido utilizadas com sucesso no aumento da sobrevida de outros tumores sólidos como, por exemplo, no carcinoma de cólon, que atualmente utiliza a associação de fluorouracil (5FU) e leucovorin (Yang & Chapman, 2009).

As células tumorais podem responder aos tratamentos com quimioterápicos de diversas formas. Kerr et al (1972) foram os primeiros a

descrever alterações morfológicas, como formações de blebbing na membrana,

condensação de cromatina e fragmentação nuclear, após tratamento com compostos que levam as células tumorais à morte. Estas características foram posteriormente descritas como indicativas de uma morte celular por apoptose. Atualmente, está bastante claro que apoptose é um, e não o único, dos eventos que contribuem para o efeito dos quimioterápicos convencionais (Johnstone et

al, 2002). Proteínas que controlam o processo apoptótico mostram-se alvos

promissores para diversos tipos de tumores, incluindo o melanoma (Reed, 2001a).

Sabe-se que o melanoma é extremamente resistente a agentes quimioterápicos, e os mecanismos de resistência variam de acordo com o quimioterápico avaliado (Zigler et al, 2008). Os mecanismos de escape e

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no controle das vias de apoptose e sobrevivência celular não se dá apenas pela ação da própria célula tumoral, mas também por mecanismos oriundos das células vizinhas presentes no estroma e no microambiente tumoral. A produção de produtos inesperados e eventos autócrinos e/ou parácrinos contribuem bastante para os eventos de resistência aos quimioterápicos.

Tabela 1: Quimioterápicos utilizados no tratamento do melanoma. (Yang & Chapman, 2009; Soengas & Lowe, 2003)

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1.5 Compostos de coordenação

Para um futuro imediato, a combinação de modalidades terapêuticas, como cirurgia, radioterapia e quimioterapia é a melhor escolha para o tratamento das neoplasias. Entretanto, para que avanços terapêuticos sejam alcançados é necessária a descoberta de quimioterápicos mais efetivos. A maioria dos novos compostos estudados é de origem inorgânica ou produtos naturais, incluindo antibióticos, agentes alquilantes, alcalóides, enzimas e hormônios. A alta reatividade dos compostos metálicos é a razão pela qual estes compostos tem sido frequentemente usados como agentes diagnósticos ou terapêuticos (Bonati et al, 2006; Clarke, 2003, Galanski et al, 2003). O

sucesso limitado da pesquisa com agentes antitumorais derivados de metais pode ter sido causado pela falta de diversidade estrutural dos compostos avaliados em ensaios clínicos, que na sua maioria são derivados do quimioterápico Cisplatina, o primeiro agente quimioterápico a ser descrito (Matesanz & Souza, 2007).

A aplicação de quimioterápicos contendo átomos de metais no tratamento do câncer teve seu início em 1969, quando Rosenberg, acidentalmente, descobriu que a eletrólise de um eletrodo de platina gerou vários compostos que inibiram a fissão binária da bactéria Escherichia coli, que

cresceu cerca de 300 vezes seu tamanho normal sem divisões celulares. Ao testar esses compostos em um modelo de sarcoma inoculado em ratos, observou que o composto mais ativo foi a cis-platina (cis-Pt(NH3)2Cl2) (Rosenberg et al, 1969). Esta descoberta abriu perspectivas para uma nova

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1.5.1 Compostos de Platina

A Cisplatina [Pt(NH3)2Cl2] é um dos agentes antitumorais mais utilizados no mundo. É um agente efetivo no tratamento de vários tipos de câncer, especialmente no tratamento de tumores testiculares, como uma taxa de cura de 90% (Zhang & Lippard, 2003). No tratamento do melanoma, a Cisplatina como agente único tem atividade que varia de 10 a 20% (Chapman & Yang, 2009). A Cisplatina entra na célula por difusão passiva (Ziegler et al, 1999) e

também através de transporte ativo mediado por receptor (Ishida et al, 2002). A

citotoxicidade da Cisplatina inicia-se pela ligação da droga ao DNA e formação de adutos de platina. A interação da Cisplatina com o DNA causa uma distorção significativa da sua estrutura helicoidal, resultando em inibição da replicação, transcrição e reparo desse DNA (Ziegler et al, 1999). A Cisplatina

induz a apoptose por aumentar a atividade da caspase-8, aumentar a expressão de p53, quebra de Bid para sua forma truncada, ativação e translocação mitocondrial de Bax, indução de permeabilidade da mitocôndria, liberação de citocromo C no citosol, ativação da caspase-9 e consequente entrada na fase de execução da apoptose. Está também envolvida na degradação proteolítica da procaspase-3 e ativação da caspase-3, redução de Bcl-2 e aumento de Bcl-xL, todos esses fatores levando a célula a um processo de morte por apoptose (Henkels et al, 1999). Curiosamente, a ativação das

duas vias de apoptose, extrínseca e intrínseca, são também responsáveis pelos efeitos tóxicos do quimioterápico (Florea et al, 2009). Há evidências que

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O sucesso clínico da Cisplatina é limitado pela grande quantidade de efeitos colaterais e pela rápida indução de células tumorais resistentes ao quimioterápico. Para contornar esses problemas, novos compostos derivados de platina foram desenvolvidos para que apresentassem uma melhora no desempenho farmacológico e um grande espectro de atividade antitumoral. Vários compostos de platina foram aprovados para uso na terapêutica antitumoral, como por exemplo, carboplatina, oxaliplatina, nedaplatina e

lobaplatina, todavia, estes novos complexos não demonstraram vantagens com relação à Cisplatina, principalmente com relação aos efeitos de toxicidade gastrointestinal e hematológicos induzidos (Zhang & Lippard, 2003). A resistência das células à Cisplatina e seus análogos está associada a um aumento na atividade do sistema de reparo do DNA e também com a captura e inativação do composto por componentes macromoleculares do sangue e/ou tiol-proteínas que atuam como redutoras, podendo modular a sensibilidade das células ao quimioterápico (Timerbaev et al, 2006). Mais importante, somente

um número limitado de tumores podem ser tratados com quimioterápicos contendo platina (Galanski et al, 2005).

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redescoberto e demonstra uma completa remissão em pacientes com leucemia promielocítica aguda (Soignet et al, 1998). O uso deste composto foi aprovado

pelo FDA (Food and Drug Administratrion, USA) em 2000, para o tratamento da

leucemia, mieloma e para pacientes com alto risco de desenvolver neuroblastoma (Bahlis et al, 2002; Munshi et al, 2001). Este composto, em

baixas concentrações, causa inativação da proteína de fusão oncogênica PML-RARα, enquanto que em altas concentrações induz as células ao processo

apoptótico, causando quebra no DNA e estresse oxidativo (Dilda & Hogg, 2007).

Complexos de titânio, gálio e rutênio estão sendo preparados e testados, sendo que alguns deles já estão em ensaios clínicos de fase II e III (Alama et

al, 2009). Em fase pré-clínica estão complexos de ferro, cobalto, ouro e

paládio, que demonstram uma promissora atividade antitumoral, mas também complexos de outros metais estão em avaliação, como bismuto, antimônio, estanho, vanádio, rádio e cério (Ott & Gust, 2007).

1.6 Exemplos de compostos metálicos em ensaios pré-clínicos:

1.6.1 Complexos de Ferro

Os primeiros complexos de ferro que mostraram alguma atividade antitumoral foram os sais de ferroceno, picrato e tricloroacetato, com o íon ferro em estado de oxidação +III (Köpf-Maier et al, 1984). Estes compostos

apresentaram atividade antiproliferativa in vitro, e in vivo no modelo utilizando

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(Köpf-Maier, 1985) A atividade citotóxica destes compostos não é baseada na ligação direta com o DNA, e sim à capacidade de formar espécies reativas de oxigênio, que acarreta em dano ao DNA (Ott & Gust, 2007).

Mais recentemente, outros compostos contendo ferro foram sintetizados e testados, mostrando efeito apoptótico ou antiproliferativo in vitro, como por

exemplo, um derivado ferroceno do tamoxifeno (Ott & Gust, 2007).

1.6.2 Compostos de Ouro

Compostos contendo átomos de ouro são bastante conhecidos devido a sua aplicação clínica no tratamento da artrite reumatóide, sendo também agentes antitumorais. Complexos de ouro mostram um enorme espectro de atividade antitumoral in vitro, especialmente em linhagens tumorais resistentes

à cisplatina. Estudos demonstram que, ao contrário da cisplatina, o DNA não é o primeiro alvo destes compostos. A sua citotoxicidade é mediada pela capacidade de alterar as funções mitocondriais e inibir a síntese de proteínas (McKeage, 2002). Pillarsetty e colaboradores (2003) relataram a atividade de um complexo de ouro (I), sobre células de carcinoma de cólon humano. Neste caso houve um prolongamento na fase G1 do ciclo celular. Complexos de ouro (III) são candidatos promissores como agentes antitumorais. Ensaios de citotoxicidade in vitro demonstram intensa atividade antiproliferativa em

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1.6.3 Compostos de Paládio

Antes dos estudos desenvolvidos por Khan et al (1991), os compostos

de paládio possuíam pouca ou nenhuma aplicação como agentes antitumorais, devido a sua extrema instabilidade em fluidos biológicos. Entretanto, complexos ciclopaladados são mais estáveis, além de menos tóxicos, sugerindo que podem ter uma atividade antitumoral mais específica in vivo

(Navarro-Ranninger et al, 1993). A atividade citotóxica de diversos compostos

ciclopaladados foi testada in vitro contra várias linhagens tumorais humanas, e

os resultados mostraram que a maioria desses complexos são mais eficientes que a cisplatina, carboplatina e oxaliplatina, levando as células a um processo de morte por apoptose (Caires, 2007)

Em colaboração com o Prof. Antonio Carlos Favero Caires, da Universidade de Mogi das Cruzes, foram sintetizados diversos compostos ciclopaladados. Esses complexos ciclopaladados foram obtidos a partir dos agentes de ciclometalação N, N-dimethyl-1-phenethylamine (dmpa), phenyl-2-pyridinyl-acetylene e 1-phenyl-3-N,N-dimethylamine-propine, que foram complexados ao ligante bifosfínico dppe [1, 2 ethanebis (diphenylphosphine)] (Rodrigues et al, 2003).

Os compostos foram testados in vitro e in vivo no modelo de melanoma

murino B16F10-Nex2, com o objetivo de avaliar uma possível atividade antitumoral. A sublinhagem de melanoma murino B16F10-Nex2 é pouco imunogênica e possui a capacidade de desenvolver-se in vivo tanto como um

(31)

De acordo com o esperado, os compostos ciclopaladados sintetizados foram mais estáveis em ambientes biológicos, permitindo a utilização de doses baixas, reduzindo a toxicidade. Três dos compostos sintetizados apresentaram atividade citotóxica in vitro com baixas doses, menores que 1,25 µM.

Entretanto, uma resposta efetiva contra o tumor in vivo depende de

vários parâmetros, incluindo metabolismo e clearance da droga, concentração

plasmática e acesso às células tumorais. Características estruturais dos compostos podem afetar drasticamente as suas propriedades antitumorais. Quando testados in vivo, apenas o complexo [Pd2(C2,N-S(-)(dmpa)2(µ-dppe)Cl2]

(Figura 1), denominado 7A, (mas não o seu estereoisômero [Pd2(C2,N-R(-)(dmpa)2(µ-dppe)Cl2]), provocou um retardo no desenvolvimento

do tumor, aumentando significativamente a sobrevida dos animais tratados (Rodrigues et al, 2003).

O complexo 7A causou degradação de DNA, mas não aumentou os níveis das caspases 1 e 3, sugerindo a indução de um processo apoptótico caspase-independente in vitro. Principalmente, o complexo demonstrou efeito

no metabolismo respiratório da célula, causando um colapso no gradiente de prótons mitocondrial, como demonstrado por uma abrupta e total redução na acidificação extracelular em tempo curto de incubação, cerca de 100 minutos (Rodrigues et al, 2003). Mais importante, não foi observada toxicidade em

(32)

Outro complexo ciclopaladado, derivado do N,N-dimethyl-1-phenethylamine e o ligante de coordenação 1,1’-bis(diphenylphosphine) ferrocene, apresentou atividade antitumoral in vitro contra células leucêmicas

humanas. O complexo [Pd2(C2,N-S(-)(dmpa)(dppf)Cl2] mostrou-se um potente inibidor reversível da atividade da Catepsina B (Bincoletto et al, 2005), (Figura

1). Ratos inoculados subcutaneamente com tumor de Walker e tratados com uma dose do composto tiveram 90% do crescimento tumoral inibido. Por outro lado, esse complexo ciclopaladado não protegeu ratos desenvolvendo ascites após inoculação do tumor de Erlich, embora tenha apresentado baixa toxicidade (Bincoletto et al, 2005). O complexo ciclopaladado-dppf induziu apoptose em linhagem celular de leucemia humana (HL60) por uma via não-clássica (Bincoletto et al 2005), e quando foi testado em células de leucemia

K562, foi sugerido uma via de apoptose dependente da permeabilização da membrana de lisossomos, sendo essa organela o alvo inicial da droga e a catepsina B liberada no citoplasma atuaria como mediador do processo de morte celular (Barbosa et al, 2006). Esses resultados introduziram o complexo

ciclopaladado-dppf como um novo agente antitumoral.

Curiosamente, esse ciclopaladado não apresentou efeito in vivo contra o

melanoma murino B16F10-Nex2, embora tenha apresentado efeito citotóxico in

(33)

Figura 1: Representação esquemática dos compostos ciclopaladados. (A) Ciclopaladado 7A, com atividade antitumoral in vitro e in vivo contra o

melanoma murino B16F10-Nex2. (B) BCP, com atividade in vitro contra células

leucêmicas humanas e inibitória sobre Catepsina B.

1.7 Exemplos de composto metálicos em ensaios clínicos:

1.7.1 Compostos de Gálio

Toxicidade e atividade antitumoral dos sais de gálio foram descritas no início da década de 70 (Hart & Adamson, 1971), e desde então, várias outras propriedades biológicas vêm sendo relatadas. O mecanismo de ação do gálio está relacionado à inibição da enzima ribonucleotídeo redutase, que catalisa a conversão entre ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos (Louie & Meade,1999). Assim como o Fe(II), o gálio também é transportado pela transferrina e é encontrado principalmente nos lisossomos das células. Dessa forma, a toxicidade do gálio eleva-se bastante devido ao aumento do transporte através da transferrina (Collery et al, 2002). Além de ser bastante eficiente nas

[Pd2(C2,N-S(-)(dmpa)2(µ-dppe)Cl2] [Pd2(C2,N-S(-)(dmpa)2(µ-dppe)Cl2]

A

B

(34)

fases de crescimento exponencial dos tumores, estes compostos também apresentam atividade nas fases estacionárias do crescimento tumoral e este efeito depende exclusivamente do tempo de exposição das células tumorais aos quimioterápicos (Collery et al, 2002; Rasey et al, 1982).

Ensaios clínicos de fases I e II estão sendo realizados utilizando nitrato e maltolato de gálio. Nitrato de gálio, quando administrado intravenosamente, não foi efetivo no tratamento de diversos tipos de câncer, entre eles melanoma e câncer de mama. Mas em estudo de fase II para o tratamento de carcinoma urotelial metastático utilizando uma combinação de nitrato de gálio, vimblastina e ifosfamida, observou-se uma resposta antitumoral em 67% dos pacientes. Entretanto, efeitos colaterais bastante acentuados foram relatados e os pacientes ficaram protegidos em média por apenas vinte semanas (Einhorn et

al, 1994).

O complexo gálio 8-quinolinolato (KP46), em estudo de fase I, demonstrou atividade antitumoral em carcinoma de células renais; uma resposta parcial foi observada em um paciente, enquanto que dois pacientes mantiveram a doença estabilizada por 11 meses (Hofheinz et al, 2005).

1.7.2 Compostos de Rutênio

(35)

câncer, substituindo ou em associação aos tradicionais compostos de platina (Kostova, 2006).

Complexos de Ru (III) mantém o estado de oxidação do metal até alcançar o tumor, onde a baixa concentração de oxigênio permite a ativação pela redução para Ru (II). Estudos demonstram que a atividade antitumoral destes compostos depende exclusivamente deste processo de redução (Clarke, 2003), que in vivo pode ser induzido por glutationa ou outros agentes

redutores presentes nos tecidos (Ott & Gust, 2007). A atividade antitumoral dos complexos de rutênio envolve interação com o DNA, mas outros mecanismos adicionais também são possíveis. A forte capacidade de ligação com a albumina e transferrina influencia muito a biodistribuição destes compostos. Uma importante característica destes compostos é a capacidade de inibir o processo angiogênico e metaloproteases presentes na matriz, consequentemente interferindo na formação de metástases in vivo (Alama et al,

2009).

Entre os diversos complexos de rutênio (III) que estão sendo testados em ensaios clínicos, os mais promissores são os compostos KP1019 (trans

-[tetrachlorobis(1H-indazole)ruthenate(III)] e NAMI-A, abreviatura do nome New

Anti-tumour Metastasis Inhibitor –A, [(ImH)trans-Ru(Im)(Me2SO)Cl4).

KP1019 apresenta efeitos inibitórios na proliferação celular in vitro e,

(36)

transferrina (Piccioli et al, 2004). Após incubação das células com este agente,

55% do rutênio intracelular é encontrado na região do núcleo da célula. Este valor é significativamente elevado, se compararmos com a cisplatina, um outro composto de metal, onde apenas 10% do metal intracelular é encontrado no núcleo das células (Heffeter et al, 2004). Resultados promissores em ensaios

clínicos de fase I são demonstrados utilizando este composto. Cinco de seis pacientes com tumores sólidos, submetidos a este quimioterápico permaneceram com a doença estabilizada. Apenas alguns efeitos colaterais foram observados (Clarke, 2003).

O complexo de rutênio NAMI-A pertence a uma classe de compostos de rutênio sintetizados com o objetivo de, seletivamente, atingir a massa de um tumor sólido e somente ser ativado no microambiente tumoral, reduzindo a toxicidade para os tecidos normais. Quando foi testado sobre linhagens tumorais in vitro, mostrou-se pouco efetivo. Apesar desta baixa atividade in

vitro, NAMI-A apresenta atividade antitumoral bastante significativa in vivo

(Pluim et al, 2004). Em estudo clínico de fase I, observou-se que a infusão de

NAMI-A (300mg/dia; cinco dias durante três semanas) mostrou-se segura para 24 pacientes com câncer de pequenas células progressivo de pulmão, sendo que um paciente permaneceu estável por 21 semanas (Rademaker-Lakhai et

al, 2004). Este efeito antitumoral é atribuído a propriedades anti-metastáticas

deste agente, que in vivo, demonstra efeito antiangiogênico pela inibição do

fator de crescimento para células endoteliais (VEGF), que pode ser resultado da inativação do óxido nítrico (Vacca et al, 2002).

(37)

compostos nitrosil-tetraamina rutênio, sendo que a particularidade destes compostos é a capacidade de serem doadores de óxido nítrico. Compostos capazes de liberar óxido nítrico podem ter uma grande aplicação e serem úteis no estudo da ação fisiológica do óxido nítrico em diversos sistemas (Oliveira et

al, 2007).

A descoberta de diversas funções biológicas para o óxido nítrico (NO) tem estimulado e facilitado o desenvolvimento de alvos farmacêuticos. Processos biológicos mediados pelo óxido nítrico incluem neurotransmissão, regulação da pressão sanguínea e respostas imnunológicas. Além disso, o óxido nítrico é um excelente ligante para íons metálicos. Como conseqüência, complexos de metais nitrosilados demonstram grande valor terapêutico (Zang & Lippard, 2003).

O óxido nítrico pode ter ações dicotômicas durante o desenvolvimento de diferentes tumores. Em alguns modelos o óxido nítrico tem efeito antineoplásico (inibindo metástases, e levando as células tumorais ao processo de apoptose) ou pode ter efeito pró-neoplásico (causando progressão, invasão e angiogênese). Acredita-se que os efeitos biológicos mostrados pelos doadores de NO dependem da meia-vida da droga utilizada e do tipo celular exposto ao composto (Huerta et al, 2008).

(38)

dissociação dos complexos nitrosil levará à síntese de compostos mais efetivos em condições biológicas (Zanichelli et al, 2007).

A fórmula geral dos compostos nitrosil-tetraamina rutênio testados é [RuII(NO+)(NH3)4L]3+ (Figura 2), onde L corresponde a diferentes ligantes, que determinam a velocidade de liberação do NO em meio aquoso (Toledo et al,

2005). Esses compostos apresentam baixa toxicidade, alta solubilidade e estabilidade em água/meios aquosos na presença de oxigênio, e são ativados para a liberação do NO por agentes redutores presentes em meios biológicos (Zanichelli et al, 2006). Dois dos complexos de rutênio doadores de NO, trans

-[Ru(NO)(NH3)4isn](BF4)3 e trans-[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3, apresentaram efeitos anti-proliferativos e tripanocidas contra o parasita Trypanosoma cruzi,

protegendo 80% dos animais tratados, e esses efeitos foram dependentes do NO liberado (Silva et al, 2007). Os compostos eliminaram também formas

amastigotas do parasita de ninhos formados no miocárdio, e observou-se que a

(39)

Figura 2: Representação esquemática dos compostos de Rutênio. A. Fórmula geral do composto doador de óxido nítrico [RuII(NO+)(NH3)4L]3+; B. Estrutura

dos ligantes.

N N Imidazol (imN) L NO NO NO NO A B N Pyridina (Py) N CH3 4-Picolina (4-Pic) N N H2 O

Isonicotinamida (isN) N NH2 O Nicotinamida (Nic) N

N NH2

O O H L-histidina (L-his) N N Imidazol (imN) L NO NO NO NO A B N Pyridina (Py) N CH3 4-Picolina (4-Pic) N N H2 O

Isonicotinamida (isN) N NH2 O Nicotinamida (Nic) N N Imidazol (imN) N N Imidazol (imN) L NO NO NO NO A B N Pyridina (Py) N CH3 4-Picolina (4-Pic) N N H2 O

Isonicotinamida (isN) N NH2 O Nicotinamida (Nic) L NO NO NO NO L NO NO NO NO A B N Pyridina (Py) N Pyridina (Py) N CH3 4-Picolina (4-Pic) N CH3 4-Picolina (4-Pic) N N H2 O

Isonicotinamida (isN) N

N H2 O

Isonicotinamida (isN) N NH2 O Nicotinamida (Nic) N NH2 O Nicotinamida (Nic) N

N NH2

O O H

L-histidina (L-his)

N

N NH2

O O H

(40)

1.8 Apoptose

Nos últimos anos tem ficado claro que existem várias modalidades de morte celular, tais como apoptose, entosis, catásfrofe mitótica, necrose, necroapoptose e piroapoptose. De acordo com um Comitê específico formado para estudos em morte celular, o Nomenclature Comitee on Cell Death (NCCD,

Kroemer et al 2009), regras foram estabelecidas para a correta denominação

da morte celular, e vários fatores devem ser analisados para a correta classificação da mesma.

O processo de apoptose é largamente caracterizado por uma resposta antiproliferativa aos agentes quimioterápicos e, portanto é o modelo prevalente para se explicar o sucesso da maioria das terapias antitumorais (Portugal et al,

2009).

Apoptose é o processo de morte celular programada mais bem definido. Este mecanismo de “suicídio celular” programado é essencial para o desenvolvimento embrionário, funções do sistema imune e manutenção da homeostase em organismos multicelulares (Jacobson et al, 1997). A

desregulação da apoptose está implicada em várias condições patológicas, incluindo doenças neurodegenerativas, autoimunidade e câncer (Okada & Mak, 2004). Esse mecanismo de morte celular é mediado por uma família de cisteíno proteases conhecida como caspases (Alnemri et al, 1996). As caspases estão

(41)

Existem duas vias apoptóticas que podem ser iniciadas pela ativação das caspases: uma via extrínseca, mediada por receptores presentes na superfície celular, e uma via intrínseca, onde eventos extra e intracelulares induzem alterações mitocondriais que culminam no processo de morte celular (Figura 3).

(42)

1.8.1 Apoptose mediada pela Via Extrínseca

A morte celular induzida através da ativação da via extrínseca ocorre pela interação de um ligante a um receptor específico, localizado na membrana celular. Procaspases são convertidas em caspases ativas após a ativação desses receptores pelos seus respectivos ligantes (Van Cruchten & Broeck, 2002). Os ligantes mais bem conhecidos são o ligante de Fas e o Fator de Necrose Tumoral α (TNFα) (Saikumar et al, 1999). O Fas ligante interage com

um receptor Fas, enquanto que TNFα liga-se ao TNFR1. Ambos os receptores

apresentam um domínio citoplasmático responsável pela transdução do sinal de apoptose. Este domínio citoplasmático é também conhecido como “domínio de morte” (death domain ou DD) (Boldin et al, 1995). O acoplamento do

receptor de morte com seus respectivos ligantes provoca o recrutamento de proteínas adaptadoras, FADD e TRADD. Este recrutamento provoca o acúmulo de várias moléculas de caspase-8, promovendo assim o seu autoprocessamento e ativação (Taylor et al, 2008). TRADD medeia a apoptose

através da ligação com FADD, portanto, eventualmente ambas Fas e TNFR1 utilizam FADD para transdução do sinal de morte celular. A transdução do sinal mediada pelos dois receptores acontece via caspase-8 (Enari et al, 1995).

(43)

1.8.2 Apoptose mediada pela Via Intrínseca

A apoptose mediada por receptores não é o único mecanismo de morte celular programada. Alguns agentes citotóxicos e radiação causam apoptose por uma via que envolve a mitocôndria e, mais especificamente, a proteína mitocondrial Citocromo C (Van Cruchten & Broeck, 2002). A ativação do processo apoptótico desencadeado por alterações mitocondriais é conhecido como morte celular através da via intrínseca.

As barreiras para indução de apoptose dependem da integridade das membranas mitocondriais, responsáveis por manter isolada uma grande variedade de proteínas apoptóticas na sua forma ativa, confinadas no espaço inter-membranar mitocondrial (Armstrong, 2006). O estímulo apoptótico induz aumento da permeabilidade mitocondrial, permitindo liberação de agentes proapoptóticos (tais como Citocromo C) no citosol. O Citocromo C liga-se à proteína Apaf-1, recrutando e ativando caspase-9, formando assim o complexo apoptossomo (Li &Yuan, 2008). Uma vez que o Citocromo C liberado, a cascata de ativação de caspases torna-se irreversível (Goldstein et al, 2000). O

complexo apoptossomo e caspase-9 ativam a caspase 3 e/ou caspases 6 e 7, desencadeando eventos proteolíticos que culminam em uma desintegração celular coordenada (Acehan et al, 2002). Portanto as caspases 3, 6 e 7 são

consideradas caspases executoras do processo apoptótico, enquanto que caspase-9 age apenas como um regulador do processo (Green & Kroemer, 1998).

(44)

consequente diminuição dos índices de ATP, perda do potencial de membrana e liberação de agentes proapoptóticos são eventos envolvidos no processo de morte celular (Bras et al, 2005). Portanto, podemos afirmar que

permeabilização da membrana mitocondrial é um fator crucial para a indução do processo apoptótico pela via intrínseca.

A permeabilização da membrana mitocondrial resulta em dissipação no potencial de membrana, um parâmetro indispensável para as funções essenciais desta organela, tais como, transporte de íons, biogênese e produção de energia (Gordon et al, 2000; Smaili et al, 2000). Este evento de

permeabilização da membrana mitocondrial é regulado por genes pertencentes à família Bcl-2 (Yip & Reed, 2008). A família consiste em proteínas antiapoptóticas do grupo Bcl-2 e proteínas proapoptóticas do grupo Bax e proteínas da família BH3 (Danial, 2007).

As proteínas antiapoptóticas da família Bcl-2, tais como Bcl2 e Bcl-XL seqüestram as proteínas com domínio BH3 impedindo assim a formação de um complexo proapoptótico (Li & Yuan, 2008). O grupo das proteínas proapotóticas inclui a proteína Bax e Bak. Bak está associada constitutivamente à mitocôndria. Já a proteína Bax está localizada predominantemente no compartimento citoplasmático na sua forma monomérica, em células viáveis (Carvalho et al, 2004). Após algum estímulo

apoptótico, uma fração significante desta proteína forma dímeros e se transloca para a membrana mitocondrial (Wolker et al, 1997). A translocação de Bax para

(45)

Estudos demonstram que a proteína Bax e outros membros proapoptóticos da família Bcl-2 podem modular os estoques de cálcio no retículo endoplasmático e também causar alterações no conteúdo de cálcio na matriz mitocondrial (Nutt et al, 2001; Pan et al, 2000). Além disso, a integridade

da membrana mitocondrial é alterada pela captação excessiva de cálcio (Andreyev et al, 1998). Bax e outra proteína, Bak, podem translocar para o

retículo endoplasmático, depletando cálcio e ativando caspase-12 (Zong et al,

2003). Entretanto, ainda são necessários estudos mais avançados para entender a função de Bax e outras proteínas proapoptóticas no retículo endoplasmático, interação mitocondrial e redistribuição do cálcio entre estas organelas durante o processo apoptótico (Carvalho et al, 2004).

Alterações no cálcio citosólico podem ocasionar a apoptose. Algumas dessas alterações incluem mudanças na captação do cálcio pelas mitocôndrias promovido por estímulos apoptóticos, a qual aumenta a probabilidade de ativação do poro de transição de permeabilidade. Depleção dos estoques de cálcio intracelular também está relacionada com indução de apoptose, já que uma diminuição nas concentrações de cálcio provocado pelo aumento da captação deste íon pelas mitocôndrias determina a quantidade de liberação de Citocromo C (Gogvadze et al, 2008) e apoptose (Pinton et al, 2001).

1.8.3 Alterações celulares causadas pelo estímulo apoptótico

(46)

por apoptose. Estas características baseiam-se em alterações da estrutura celular levando às alterações clássicas do processo de morte induzido por apoptose.

Após a ativação das caspases, estas têm a capacidade de clivar constituintes do citoesqueleto celular. Estes substratos incluem microfilamentos de actina como, por exemplo, a própria actina, e proteínas associadas à actina, tais como, miosina, espectrina, α-actinina, gelsolina e filamina (Browne et al,

2000). Algumas proteínas de microtúbulos também são substrato para as caspases, incluindo tubulinas e proteínas associadas aos microtúbulos (Adrain

et al, 2006). Proteínas dos filamentos intermediários também são afetadas (Ku et al, 1997). A proteólise dos constituintes do citoesqueleto provavelmente

contribui para o arredondamento e retração da célula nos estágios iniciais da apoptose. O enfraquecimento do citoesqueleto provoca a formação de blebbing

na membrana celular, uma característica de células em apoptose (Cotter et al,

1992).

Outra característica importante das células nos estágios iniciais do processo apoptótico é a capacidade de liberação da matriz extracelular. Estas células tipicamente se retraem das células vizinhas e perdem o contato com a matriz. Este processo de descolamento envolve mecanismos dependentes de caspases que, provavelmente tem como objetivo facilitar a remoção das células apoptóticas pelos fagócitos (Rosenblatt et al, 2001). Outra forma de facilitar o

trabalho dos fagócitos é a geração dos chamados corpos apoptóticos. Estas estruturas provavelmente são uma conseqüência do processo dirigido pela actina-miosina para a formação dos blebbings (Cotter et al, 1992) Esta é talvez

(47)

estas possam ser engolfadas com facilidade. Isso tem como objetivo minimizar possíveis falhas na fagocitose da célula morta a fim de se evitar liberação de sinais de perigo que podem provocar ativação do sistema imune inato (Taylor

et al, 2008).

Apesar da importância da fagocitose, não está claro como a célula apoptótica é reconhecida pelos fagócitos. O exemplo melhor caracterizado de ligante fagocítico é o fosfolipídio de membrana fosfatidilserina. A fosfatidilserina está confinada internamente na membrana plasmática de células saudáveis, mas esta se transloca para a face externa da membrana após um estímulo proapoptótico, induzindo assim a fagocitose (Martin et al, 1995). Esta

translocação também é caspase-dependente, mas como estas cisteíno-proteases promovem esta translocação ainda não foi definido (Martin et al,

1996).

Alterações nucleares também estão presentes no processo de apoptose. Apesar da fragmentação nuclear ser uma das características mais marcantes da apoptose, permanece desconhecido o motivo pelo qual o núcleo fragmenta-se e fragmenta-se dispersa ao longo da célula durante este processo de morte celular (Taylor et al, 2008). A fragmentação nuclear depende da desintegração da

lâmina nuclear e do colapso do envelope nuclear. O primeiro destes eventos envolve a proteólise das proteínas laminas A, B e C através das caspases (Rao

et al, 1996). O citoesqueleto de actina também tem um papel na fragmentação

nuclear. Por causa das ligações entre o citoesqueleto de actina e do envelope nuclear, ocorre destruição nuclear durante apoptose (Croft et al, 2005). A

(48)

mas pode enfraquecer a membrana nuclear, permitindo que o envelope nuclear se rompa (Croft et al, 2005). Na fragmentação do núcleo, os microtúbulos do

citoesqueleto têm sido implicados na dispersão de fragmentos nucleares na membrana plasmática para a formação dos blebbings (Moss et al, 2006).

Um dos primeiros sinais bioquímicos a ser identificado como característico de um processo apoptótico é a degradação do DNA genômico em fragmentos (ladder of fragments) (Wyllie, 1980). Este padrão de

fragmentação é resultado da clivagem da cromatina em sítios internucleossomais mediada por endonucleases. E este processo é tipicamente acompanhado de condensação da cromatina (Schulze-Osthoff et al, 1994). A

fragmentação do DNA durante o processo apoptótico exclui qualquer outra possibilidade de divisão celular, tornando cromatina mais gerenciável para posterior eliminação por células fagocíticas (Taylor et al, 2008).

Pelo exposto nesta Introdução, fica claro que as alternativas terapêuticas disponíveis para o tratamento do melanoma apresentam efeitos limitados, logo, o desenvolvimento de novos agentes que atuem inibindo o desenvolvimento tumoral é de extrema importância. Além da descoberta de novas drogas, é fundamental compreender o modo de ação das mesmas, para que os mecanismos de resistência da célula tumoral ao quimioterápico, tão frequentemente induzidos durante o tratamento, possam ser compreendidos e eventualmente contornados.

(49)

induz nas células tumorais uma morte por apoptose caspase-independente, levando ao final do processo à degradação de DNA de células tratadas (Rodrigues et al, 2003). No entanto, como o mecanismo de ação do

ciclopaladado 7A ainda não foi totalmente elucidado, é de nosso interesse determinar os eventos que precedem a degradação de DNA observada nas células tumorais após tratamento com o ciclopaladado 7A.

(50)

2.0 OBJETIVOS

O objetivo geral deste trabalho foi a avaliação de novos compostos organometálicos derivados de Paládio e Rutênio em ensaios pré-clínicos.

Os objetivos específicos foram:

• Avaliar os efeitos citotóxicos do Complexo ciclopaladado 7A, [Pd2(S(-)C2, N-dmpa)2 (m-dppe)Cl2], sobre linhagens celulares tumorais humanas;

• Avaliar a atividade do Ciclopaladado 7A no modelo metastático de melanoma murino B16F10-Nex2;

• Elucidar o mecanismo pelo qual o Ciclopaladado 7A causa a morte das

células tumorais;

• Avaliar a atividade in vitro dos compostos tetraamina nitrosil Rutênio e os

respectivos equivalentes sulfatados sobre células de melanoma murino B16F10-Nex2 e sobre células tumorais humanas;

• Avaliar a atividade in vivo dos compostos tetraamina Rutênio

previamente selecionados como ativos in vitro no modelo subcutâneo de

melanoma murino B16F10-Nex2;

• Investigar o mecanismo pelo qual os compostos tetraamina Rutênio

(51)

3.0 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Quimioterápicos:

Complexo ciclopaladado 7A (C7A): O composto ciclopaladado foi obtido através da síntese de N,N-dimethyl-1-phenethilamida, complexado com o ligante 1,2 ethanebis (diphenylphosphina), conforme descrição detalhada em

Rodrigues et al, (2003) Fórmula molecular C44H52N2Cl2P2Pd2, com rendimento

de síntese de 92%. O complexo ciclopaladado foi sintetizado pelo Prof. Antonio Carlos F. Caires, Centro Interdisciplinar de Investigação Bioquímica, da Universidade de Mogi das Cruzes.

Compostos de Rutênio: Todos os compostos de Rutênio foram sintetizados pela aluna Renata Osti, sob orientação do Prof Douglas Wagner Franco, do Departamento de Química e Física Molecular, Universidade de São Paulo, campus São Carlos. Os compostos de partida para a síntese dos complexos de rutênio, trans-[Ru(NH3)4SO2Cl]Cl, trans -[Ru(NH3)4(P(OEt)3)2](PF6)2 e K[Ru(Hedta)Cl], foram preparados seguindo procedimentos descritos na literatura (Vogt et al, 1965). A partir desses

(52)

A) trans-[Ru(NH3)4L(SO4)]+ : Os compostos trans-[Ru (NH3)4 L (SO4)]+ (L: py = piridina; 4-pic = 4-picolina; isn = isonicotinamida; nic = nicotinamida; ImN = imidazol; L-his = L-histidina) foram preparados dissolvendo-se 100 mg do complexo trans-[Ru(NH3)4SO2Cl] Cl em 3,5 ml de solução de NaHCO3 10-2 mol.l-1 previamente desaerada, e em seguida excesso de 10 vezes do ligante L foi adicionado (2 vezes para a L-his). A mistura permaneceu em reação sob atmosfera de argônio durante 20 minutos. Em seguida, 1 ml de HCl 6 mol.l-1 e 2,5 ml de H2O2 30 % foram adicionados. Acetona (aproximadamente 70 ml) foi acrescentada, e a mistura permaneceu em refrigerador por 12 horas. O sólido foi coletado por filtração, lavado com acetona, seco e estocado sob vácuo e na ausência de luz.

(53)

C) trans-[Ru(NO)(NH3)4P(OEt)3](PF6)3 : Dissolveram-se 0,20 g de trans

-[Ru(NH3)4(P(OEt)3)2](PF6)2 em 200 ml de solução desoxigenada de CF3COOH 0,001 mol.l-1. A mistura permaneceu em reação por 6 horas sob fluxo de

argônio, a 40 oC. Acompanhou-se a formação da banda em 316 nm (ε = 650 M -1) por UV-visível. Evaporou-se o excesso de solvente em evaporador rotatório

(a 40 oC) até volume de aproximadamente 3,0 mL, transferiu-se para 2,0 mL de solução 2,0 mol.l-1 de CF

3COOH, previamente desoxigenada. Adicionaram-se 0,200 g de NaNO2. A solução adquiriu uma coloração rósea. Acrescentaram-se 0,300 g de NH4PF6 e deixou-se no refrigerador até a formação de sólido cristalino róseo. Coletou-se por filtração, lavando-se com éter. O complexo foi seco e estocado a vácuo e ao abrigo da luz.

D) [Ru(NO)Hedta] : O complexo [Ru(NO)Hedta] foi preparado

dissolvendo-se 500 mg de K[Ru(Hedta)Cl] em 20 ml de uma solução 10-2 mol.l-1 de HCl em balão de fundo redondo. O balão foi tampado e permaneceu sob atmosfera de argônio durante 30 minutos. Após este tempo, NO e argônio foram borbulhados na solução durante 3 horas e 30 minutos. Etanol foi adicionado à mistura e o nitrosilo composto formado precipitado na forma de um sólido de cor lilás o qual foi então isolado, seco e armazenado sob vácuo e protegido da luz.

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B16F10 (Fidler et al, 1975 que mantém as características da linhagem original de baixa imunogenicidade e alta eficiência na implantação in vivo (Freitas et al,

2004). Células tumorais humanas isoladas de adecarcinoma de mama (SKBr-3 e ZR753A), adenocarcinoma de cólon (HCT-8 e LS-180), leucemia promielocítica (HL-60), adenocarcinoma de cérvix uterino (HeLa, CasKi e SiHa), melanoma (Me91 e SKMel-25) e glioblastoma (U-87 ) foram utilizadas. Para os ensaios de angiogênese, foi utilizada a linhagem de células endoteliais humanas isoladas de veia de cordão umbilical (HUVECs). Todas as células foram cultivadas in vitro em meio RPMI-1640, suplementado como 10mM de

HEPES, 24mM de bicarbonato de sódio, 40mg/ml de gentamicina, pH 7.2 e 10% de soro fetal bovino. Para manuseio das células, foram utilizados PBS (140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH 7.4) para lavagem e, PBS/EDTA (PBS com 0,02% de EDTA) para liberação das células dos frascos e placas de cultura.

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3.4 Obtenção de macrófagos derivados de medula óssea: Precursores de macrófagos presentes na medula óssea foram coletados de ossos femurais de animais C57BL/6. Os ossos foram retirados e em seguida lavados em álcool 70%, álcool iodado e PBS. As epífises foram cortadas e a medula foi coletada por pressão positiva com o auxílio de uma seringa de 10ml contendo meio de diferenciação (meio RPMI acrescido de 30% de “meio L” e 20% de soro fetal bovino). O meio L é constituído do sobrenadante das células L929, que secretam constitutivamente CSF e G-CSF. O sobrenadante destas células foi coletado, testado para garantir a ausência de Mycoplasma, e em seguida,

utilizado para a constituição do meio de diferenciação. Utilizamos placas de Petri próprias para cultura celular (Corning) para diferenciar os macrófagos in

vitro. As células foram incubadas durante 4 dias em estufa a 37°C e 5% de

CO2, sendo então adicionados mais 10ml de meio de diferenciação. No sétimo dia, as células diferenciadas foram coletadas. O meio metabolizado foi aspirado para a adição de meio de troca (meio RPMI acrescido de 25% de “meio L” e 15% de soro fetal bovino). A placa permaneceu a 4°C por 1 hora, ou até que os macrófagos diferenciados estivessem soltos da placa. A partir daí, as células foram utilizadas para os ensaios.

3.5 Dosagem Protéica: O método de Bradford foi utilizado para quantificação protéica (Bradford, 1976), adaptado a uma micrométodo. 10mg do Corante Commasie Brilliant Blue G-250 (Sigma) foram diluídos em 5mL de etanol absoluto (Merck) seguido da adição de 10mL de ácido ortofosfórico (Merck), e completando-se o volume para 100mL com água destilada. Após agitação a

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reagente foi adicionado a 20µL da amostra, previamente diluída ou não, com

leitura imediata. A cada dosagem construiu-se uma curva padrão (de 0,2 a

1,0µg) a partir de uma solução de PBS/BSA 1mg/ml e a leitura da absorbância foi feita em espectofotômetro de placas em 620nm (Titertek Multiskan MCC/340 MKII).

3.6 Ensaio de citotoxicidade celular in vitro: Células B16F10-Nex2

(1x104/poço), células tumorais humanas (2x105/poço), macrófagos murinos (1x105/poço) e células HUVECs (5x103) foram cultivadas em placa de 96 poços (TPP) e tratadas com diferentes concentrações do complexo 7A e com compostos de rutênio. Após 24h de incubação a 37°C, os poços foram lavados com PBS e o número de células viáveis aderentes foi determinado em câmara de Neubauer, utilizando o corante de exclusão Trypan Blue (Invitrogen). Gráficos de concentração da droga versus número de células viáveis foram

construídos, e a Concentração Inibitória 50% (IC50) foi calculada usando-se o Programa Microsoft Excel, do software Microsoft Office.

3.7 Ensaio de inibição da citotoxicidade do complexo 7A in vitro com DTT:

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Referências