RESTRIÇÃO ALIMENTAR INTRA-UTERINA E SUAS REPERCUSSÕES SOBRE O DESENVOLVIMENTO DA TERMORREGULAÇÃO DA PROLE
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências
Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina
RESTRIÇÃO ALIMENTAR INTRA-UTERINA E SUAS REPERCUSSÕES SOBRE O DESENVOLVIMENTO DA TERMORREGULAÇÃO DA PROLE
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências
Orientadora: Profa. Dra. Jacqueline Luz
Co-Orientadora: Profa. Dra. Silvia Saiuli Miki Ihara
Souza, Thais Ladeira Vieira de
Restrição alimentar intra-uterina e suas repercussões sobre o desenvolvimento da
termorregulação da prole. / Thais Ladeira Vieira de Souza. -- São Paulo, 2009.
xiii, 79f.
Tese (Mestrado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Pediatria.
Título em inglês: Maternal food restriction and its impact on offspring's development of thermoregulation.
Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina
Departamento de Fisiologia
Disciplina de Fisiologia Renal e Termometabologia
Chefe do Departamento de Fisiologia: Prof. Dr. Sérgio Luiz Domingues Cravo Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Pediatria e Ciências Aplicadas à Pediatria: Profa. Dra. Olga Maria Silverio Amancio
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Termometabologia da Disciplina de Fisiologia Renal e Termometabologia do Departamento de Fisiologia da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, na vigência dos auxílios financeiros concedidos pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) sob o processo número 04/14749-4 e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
RESTRIÇÃO ALIMENTAR INTRA-UTERINA E SUAS REPERCUSSÕES SOBRE O DESENVOLVIMENTO DA TERMORREGULAÇÃO DA PROLE
PRESIDENTE DA BANCA:
Profa. Dra. Jacqueline Luz
BANCA EXAMINADORA:
Prof. Dr. Mauro Antonio Griggio
Profa. Dra. Viviane Louise Andree Nouailhetas
Profa. Dra. Olga Maria Silverio Amancio Profa. Dra. Daniela Maria Alves Chaud
“Onde uns vêem um abismo, outros vêem um caminho. Enquanto uns têm pressa para atingir o sucesso e fracassam, outros têm objetivo, equilíbrio, persistência, e se tornam vencedores.”
“O Senhor é meu pastor, nada me faltará” (Salmos 22, 1)
A Deus, que está acima de tudo, pelo dom da vida e pelas infinitas bênçãos que concede a mim e à minha família.
Aos meus pais, João e Maria Ivone, pelos exemplos de vida e de honestidade; pela incansável e incondicional oferta de carinho, apoio, atenção e amor.
Ao meu amado marido, Ricardo, pelo incentivo e apoio na minha vida pessoal e profissional; por seu companheirismo, respeito, lealdade, paciência e amor, e por acreditar sempre que posso ir ainda mais longe.
Aos meus irmãos e padrinhos, Fábio e Simone, que sempre me apóiam e torcem por meu sucesso e felicidade.
Aos meus sobrinhos, Gustavo, Gabriela e Ighor, a quem amo muito e a quem quero poder dar ao menos metade da alegria que me dão.
A todos eles, meu sincero amor e minha eterna gratidão.
À Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, ao Programa de Pós-Graduação em Pediatria e Ciências Aplicadas à Pediatria e ao Departamento de Fisiologia, pela acolhida e pela oportunidade a mim concedida de realizar o presente trabalho.
À FAPESP e à CAPES, pelo suporte financeiro que viabilizou a realização desta pesquisa.
À Profa. Dra. Jacqueline Luz, que me concedeu a oportunidade de mergulhar no
mundo da pesquisa científica e sempre me incentivou a caminhar com minhas próprias pernas. A ela agradeço muito por ter acreditado em mim, por todos os ensinamentos e pela amizade solidificada dia a dia.
À Profa. Dra. Silvia Saiuli Miki Ihara, que não apenas me orientou quanto à metodologia deste trabalho, mas principalmente me apoiou e me incentivou a progredir profissionalmente.
À Profa. Dra. Maria Tereza Nunes, pela contribuição na realização das dosagens hormonais.
À Profa. Dra. Aparecida Emiko Hirata, que é exemplo de determinação, humildade, paciência, perseverança e alegria e com quem aprendi muito sobre ciência e sobre a vida também.
À Profa. Dra. Guiomar Nascimento Gomes, pela amizade, carinho e apoio desde o início.
À Profa. Dra. Frida Zaladek Gil, pela sabedoria que transmite a todos da Disciplina.
À Profa. Dra. Celina Oshima e seus alunos, que me ajudaram nos experimentos de imuno-histoquímica.
À Sylvia Maria Affonso da Silva, pelas orientações técnicas no laboratório e auxílio na realização deste trabalho.
À Leonice Lourenço Poyares, pelo auxílio técnico nas dosagens hormonais. À Patrícia Felix da Silva, que muito além de suas contribuições como secretária da Disciplina, me ajudou diretamente como amiga.
Ao Edson, bioterista, pela contribuição no cuidado com os animais.
Aos técnicos Toninho e Joaquim, pelos ensinamentos técnicos em imuno-histoquímica e Tissue Microarray.
respectivamente, pela dedicação e gentileza nos serviços a mim prestados. À Thais Maria da Fonseca Pletiskaitz, pela acolhida, pelo apoio e, principalmente, pela amizade verdadeira e gratuita.
À Janaína Thais Thomal, pela amizade, pelo carinho e pelas boas conversas. À Maria de Fátima Cavanal, pelo apoio e pelos bons momentos de convivência. À Caren de Quadros e à Elisângela Chinen, pela amizade e por compartilharem comigo muita alegria e sabedoria em meio a deliciosas gargalhadas.
A todos os Docentes desta Universidade com os quais tive a oportunidade de aprender bastante durante o período de execução deste trabalho.
E a todos os colegas do Departamento, em especial à Mariana, Neila, Daniele, André e Eduardo, pelos bons momentos de convivência.
Resumo xiii
1. INTRODUÇÃO 1
1.1. Restrição alimentar intra-uterina (RAIU) 1
1.2. Desenvolvimento da termorregulação 6
2. OBJETIVO 14
3. MATERIAL E MÉTODOS 15
3.1. Delineamento do estudo 15
3.2. Animais 16
3.3. Coleta dos tecidos 17
3.4. Confecção de blocos de parafina e de Tissue Microarray 17
3.5. Imuno-Histoquímica 20
3.6. Coleta de sangue e dosagens hormonais 21
3.7. Análise estatística 22
4. RESULTADOS 23
5. DISCUSSÃO 34
6. CONCLUSÃO 52
7. ANEXOS 53
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 67
Abstract 79
Figura 1 Ingestão alimentar diária (g) dos animais dos grupos controle e
restrito durante o período gestacional. 23 Figura 2 Ingestão alimentar total (g) dos animais dos grupos controle e
restrito durante o período gestacional. A ingestão alimentar total representa a soma das ingestões diárias.
23
Figura 3 Peso corporal (g) dos animais dos grupos controle e restrito
durante o período gestacional. 24
Figura 4 Ganho de peso corporal (g) dos animais dos grupos controle e
restrito durante o período gestacional. 25 Figura 5 Peso corporal (g) dos filhotes, 15 horas após o nascimento,
segundo gênero e grupo. 25
Figura 6 Número total de filhotes, segundo gênero e grupo. 26 Figura 7 Expressão (pixels) da proteína desacopladora UCP1 no TAM
das proles dos grupos controle e restrito. 27 Figura 8 Expressão (pixels) da proteína desacopladora UCP2 no TAM
das proles dos grupos controle e restrito. 28 Figura 9 Expressão (pixels) da proteína desacopladora UCP3 no TAM
das proles dos grupos controle e restrito. 28 Figura 10 Expressão (pixels) da SERCA1 no TAM das proles dos grupos
controle e restrito. 29
Figura 11 Expressão (pixels) média da proteína desacopladora UCP3 no
músculo esquelético das proles dos grupos controle e restrito. 30 Figura 12 Expressão (pixels) média da SERCA1 no músculo esquelético
das proles dos grupos controle e restrito. 30 Figura 13 Concentração plasmática de insulina (ng/ml) das proles dos
grupos controle e restrito. 32
Figura 14 Concentração plasmática de leptina (pg/ml) das proles dos
grupos controle e restrito. 32
Figura 15 Concentração plasmática de T3 (ng/ml) das proles dos grupos
controle e restrito. 33
Figura 16 Concentração plasmática de T4 (ng/ml) das proles dos grupos
controle e restrito. 33
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Peso corporal (g) dos filhotes, 15 horas após o nascimento e número médio de filhotes por ninhada, segundo gênero e grupo. 26 Tabela 2 Valores (pixels) da expressão das proteínas UCP1, UCP2, UCP3 e
SERCA1 no TAM, e da UCP3 e da SERCA1 no músculo esquelético. 31 Tabela 3 Perfil plasmático de insulina, leptina, T3 e T4 dos filhotes dos grupos
controle e restrito. 33
Tabela A1. Dados individuais de ingestão alimentar (g) diária das ratas do grupo controle (CON) durante o período gestacional. 54 Tabela A2. Ingestão alimentar (g) diária das ratas do grupo restrito (RES)
durante o período gestacional. 55
Tabela A3. Dados individuais de peso corporal (g) diário e ganho de peso (g) das ratas do grupo controle (CON) durante o período gestacional. 56 Tabela A4. Dados individuais de peso corporal (g) diário e ganho de peso (g)
das ratas do grupo restrito (RES) durante o período gestacional. 57 Tabela A5. Dados individuais de peso corporal (g) dos filhotes do grupo
controle (CON), 15 horas após o nascimento. 58
Tabela A6. Dados individuais de peso corporal (g) dos filhotes do grupo restrito
(RES), 15 horas após o nascimento. 59
Tabela A7. Dados individuais de número de filhotes por ninhada, dos grupos controle (CON) e restrito (RES), separados por gênero. 60 Tabela A8. Dados individuais da expressão (pixels) de UCP1, UCP2, UCP3 e
SERCA1 no tecido adiposo marrom dos filhotes dos grupos controle (CON) e restrito (RES).
61
Tabela A9. Dados individuais da expressão (pixels) de UCP3 e SERCA1 no músculo esquelético dos filhotes dos grupos controle (CON) e restrito (RES).
63
Tabela A10. Dados individuais da concentração plasmática de insulina (ng/ml), leptina (pg/ml), T3 (ng/ml) e T4 (ng/ml) dos filhotes dos grupos controle (CON) e restrito (RES).
64
xiii
RESTRIÇÃO ALIMENTAR INTRA-UTERINA E SUAS REPERCUSSÕES SOBRE O DESENVOLVIMENTO DA TERMORREGULAÇÃO DA PROLE.
Introdução: Estudo previamente realizado em nosso laboratório demonstrou que a restrição alimentar intra-uterina (RAIU) provoca um retardo na termorregulação dos recém-nascidos. Em neonatos o tecido adiposo marrom (TAM) é essencial para a termogênese, principalmente devido à presença de proteínas desacopladoras (UCPs), cuja expressão pode ser modificada pela ação de hormônios como os hormônios da tireóide, a leptina e a insulina, que podem ser afetados pela restrição alimentar. A bomba de cálcio do retículo sarcoplasmático (SERCA1), presente no músculo e recentemente identificada no TAM, pode contribuir para a produção de calor.
Objetivo: Avaliar a expressão das proteínas UCP1, UCP2, UCP3 e da SERCA1 no TAM e da UCP3 e da SERCA1 no músculo esquelético (ME) de animais submetidos a RAIU, bem como o perfil plasmático de insulina, leptina e hormônios tireoidianos destes filhotes.
Métodos: Ratos fêmeas Wistar EPM-1 controle (C) receberam ração ad libitum
durante todo o período gestacional e o grupo restrito (R) recebeu 50% desta quantidade. Quinze horas após o nascimento (pico de expressão das UCPs), os filhotes foram pesados e decapitados para coleta de sangue (pool) para a
dosagem plasmática de insulina, leptina, T3 e T4 por ELISA. Foram coletados TAM e ME, para determinação da expressão das UCPs e da SERCA1 por imuno-histoquímica. Para análise dos resultados, utilizou-se o teste “t” de Student não pareado, com nível de significância de 5%.
Resultados: Os animais R (n=16) apresentaram durante a gestação um ganho de peso corporal (g) significantemente inferior quando comparado ao C (n=16), (27,6 ± 3,8 e 109,0 ± 4,1). Os filhotes R (n=172) apresentaram redução significante do peso corporal (g) ao nascimento em relação aos filhotes C (n=169) (4,82 ± 0,05 e 5,83 ± 0,04); entretanto, não houve redução no número de filhotes por ninhada. A RAIU levou a um aumento significante na expressão (pixels) da UCP1 e da UCP2 no TAM da prole R em relação à prole C (em 42% e 53%, respectivamente). Não observamos diferença significante entre os grupos em relação à expressão da UCP3 e da SERCA1 no TAM e no ME. A concentração plasmática de insulina (ng/ml) foi significantemente maior nos filhotes R (n=8) em relação aos C (n=13) (3,34 ± 0,78 e 1,17 ± 0,18) e os níveis plasmáticos de T3 (ng/ml) foram significantemente menores nos filhotes R (n=10) quando comparados aos C (n=14) (0,82 ± 0,06 e 1,09 ± 0,08). Não houve diferenças significantes para as dosagens plasmáticas de leptina (pg/ml) (R (n=8) 987,79 ± 261,08 e C (n=11) 1255,54 ± 392,37) e T4 (ng/ml) (R (n=10) 20,99 ± 3,74 e C (n=12) 16,00 ± 1,68).
1. INTRODUÇÃO
1.1. Restrição alimentar intra-uterina (RAIU)
Apesar de vivenciarmos em nosso país uma transição nutricional, caracterizada pelo aumento do número de adultos e crianças com sobrepeso e obesidade e pelo declínio da prevalência do déficit de peso na população, a desnutrição e as suas conseqüências são temas que ainda devem ser considerados pertinentes para discussão (ENDEF, 1975; PNSN, 1989; POF, 2003).
Dados recentes do Ministério da Saúde indicam que a insegurança alimentar grave foi observada em 4,8% dos domicílios brasileiros, o que significa que seus moradores tiveram restrição quantitativa importante na sua alimentação nos três meses que antecederam a pesquisa, com prevalências mais altas no Norte (13%) e Nordeste (7%), revelando assim uma realidade de subnutrição ainda presente na nossa população (PNDS, 2006).
A desnutrição se torna ainda mais relevante quando acomete o binômio mãe-feto, uma vez que a nutrição do bebê depende direta e exclusivamente do compartimento materno. A dieta materna é de suma importância para o ambiente intra-uterino, uma vez que o suprimento de nutrientes para o feto é um dos principais fatores ambientais que influenciam seu desenvolvimento (Wu et al., 2004; Maloney e Rees, 2005).
adequada é disponível, o feto pode atingir seu potencial de crescimento, resultando em um recém-nascido saudável e de tamanho adequado (Martin-Gronert e Ozanne, 2006). Por outro lado, o suprimento nutricional inadequado no período gestacional gera conseqüências graves para o bebê, principalmente decorrentes do baixo peso ao nascer.
O peso ao nascimento é o fator isolado mais importante na determinação da sobrevivência infantil, pois crianças com baixo peso (menos de 2.500 g) apresentam um risco aumentado de morrer ou adoecer no primeiro ano de vida (McCormick, 1985).
De acordo com dados da UNICEF (2007), 16% dos bebês nascidos em países em desenvolvimento, o que representa mais de 19 milhões de crianças, nasceram com peso inferior a 2500g. No Brasil, 8% das crianças que nasceram no período de 1999 a 2006 apresentaram baixo peso corporal ao nascimento, tendo assim uma probabilidade 20 vezes maior de morrer na infância do que bebês que nascem pesando mais de 2500g e sendo também mais susceptíveis a doenças crônicas na vida adulta (UNICEF, 2007).
(Van Stuijvenberg et al., 1995). Comparados com recém-nascidos de mulheres
que não apresentam hiperemese, os índices de baixo peso ao nascer e parto prematuro são substancialmente maiores em filhos de mães com hiperemese, e este quadro está intimamente relacionado ao baixo ganho de peso gestacional deste grupo (Dodds et al., 2006).
Além das causas orgânicas, sugere-se que a alta prevalência de gestantes com desnutrição e baixo peso corporal para a idade gestacional encontrada na população se deva ao consumo alimentar insuficiente decorrente principalmente do baixo poder aquisitivo (Hedrich et al., 2007).
Dados observados recentemente no Brasil demonstraram que a baixa renda familiar e o baixo nível de escolaridade materna influenciam o comportamento alimentar das gestantes (Baião e Deslandes, 2008). Além disso, uma pesquisa realizada na Índia com gestantes de áreas rurais indicou uma associação entre a deficiência de ácido fólico e o nível educacional baixo em famílias de baixa renda, demonstrando que a desnutrição durante a gestação é mais freqüente entre mulheres cujo acesso à educação foi menor. Além disso, foi observada nestas gestantes baixa ingestão dietética em calorias, proteína, ferro e vitamina C (Gautam et al., 2008).
Melo et al. (2007), avaliando gestantes em acompanhamento
observaram que a incidência de baixo peso ao nascer entre filhos de parturientes desnutridas foi de 23,6%.
Bréant et al. (2006) reforçam que a RAIU aumenta o risco para baixo
peso ao nascimento, conseqüentemente aumentando as chances de desenvolvimento posterior de doenças como hipertensão arterial sistêmica, diabetes, obesidade, resistência insulínica e doenças cardiovasculares.
Dados epidemiológicos e experimentais sustentam a hipótese de "programação fetal" (Barker, 1991), que propõe que alterações no ambiente intra-uterino levam a adaptações permanentes nos mecanismos homeostáticos fetais, produzindo assim mudanças fisiológicas que perduram por longo prazo e determinam a susceptibilidade ao desenvolvimento tardio de doenças (Chadio
et al., 2007).
Tais mudanças puderam ser estudadas na população dos Países Baixos, que ao término da II Guerra Mundial sofreu com a grave escassez de suprimentos alimentícios. Este episódio, que ficou conhecido como “The Dutch famine” ou “Hunger winter” permitiu a realização de diversos estudos longitudinais a respeito dos efeitos tardios da RAIU, que constataram que sujeitos cujas mães haviam sofrido restrição alimentar durante a gestação apresentaram maior risco de desenvolver obesidade (Stein et al., 2007) e
doenças cardiovascularesna vida adulta (Roseboom et al., 2001).
Entre as conseqüências da RAIU em roedores, podemos citar retardo de crescimento intra-uterino (Woodall et al., 1996); aumento do nível
plasmático de corticosterona das mães desnutridas durante a gestação e da sua prole ao nascimento (Lesage et al., 2001); inibição das atividades
alterações no sistema nervoso simpático, na glândula adrenal e no eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) (Molendi-Coste et al., 2006), entre outras.
A gravidade das conseqüências para o feto depende da magnitude e do tempo da restrição sofrida, conforme resultados obtidos experimentalmente através de estudos envolvendo restrição calórica global (Woodall et al., 1996;
Budge et al., 2004), restrição protéica (Zambrano et al., 2006; Toscano et al.,
2008) e insuficiência placentária (Nüsken et al., 2008).
Dados semelhantes são observados em modelos experimentais, nos quais filhotes de ratas gestantes que sofreram restrição alimentar de 50% durante a última semana de gestação tiveram seu peso corporal significativamente reduzido ao nascimento (Lesage et al., 2001). Entretanto,
Griggio et al. (1997) impuseram a mesma restrição alimentar (50%) apenas na
primeira metade da gestação e observaram que as ratas aumentaram sua ingestão alimentar no final do período gestacional, conseguindo recuperar seu peso corporal e obtendo assim fetos de peso normal ao nascimento. Por outro lado, estes autores verificaram que a restrição alimentar imposta sobre as gestantes na segunda metade do período gestacional, ou durante todo o período, repercutiu de maneira mais grave sobre as gestantes e sobre a prole, uma vez que ao final da gestação ocorre hipertrofia dos fetos (Griggio et al.,
1997).
Segundo Roberts et al. (2001), a restrição alimentar materna provoca
restrição do crescimento fetal devido à alteração na estrutura placentária, em decorrência do déficit nutricional. Esta, por sua vez, compromete a maturação placentária natural da gestação, levando assim à redução da sua capacidade em prover nutrientes para o feto.
A subnutrição materna interfere também no perfil hormonal do feto, uma vez que o desenvolvimento endócrino fetal em termos de capacidade funcional inicia-se logo nos primeiros meses de gestação e continua até o momento do nascimento, com o objetivo de preparar o feto para sua vida pós-natal (Symonds et al., 2001; Symonds et al., 2003).
Mahajan et al. (2006) atestaram que a desnutrição materna restringe
o crescimento do feto, adaptando-se ao ambiente. Entre as adaptações, ocorrem modificações no perfil endócrino, como as que ocorrem com os hormônios tireoidianos (Mahajan et al., 2005), a insulina (Martin et al., 2005) e
a leptina (Léonhardt et al., 2002).
1.2. Desenvolvimento da termorregulação
homeotermos e poiquilotermos, na dependência das condições ambientes (Hensel et al., 1973).
De uma forma geral, pequenos roedores não estão aptos a manter sua homeotermia logo após o nascimento (Satinoff, 1991 apud Gordon, 1993),
necessitando em média de um período de 3 a 4 semanas para conseguir manter sua temperatura corporal.
Existe uma considerável variação entre as espécies quanto à estabilidade do sistema termorregulatório em roedores neonatos. Esta variação é atribuída, em parte, à duração do período gestacional. Animais de espécies com períodos gestacionais menores (camundongos, gerbil, hamster, e rato) são relativamente poiquilotermos ao nascimento e tornam-se totalmente homeotermos após um período de aproximadamente 20-30 dias (Gordon, 1993).
Embora não haja controle termorregulatório de roedores ao nascimento, desde a fase intra-uterina, os mamíferos, de uma forma geral, já são aptos a produzir calor. O feto usualmente se encontra numa temperatura superior à materna em cerca de 0,3 a 0,5oC. A oferta de oxigênio abundante no
meio uterino possibilita a alta TMB do feto (aproximadamente duas vezes a de um indivíduo adulto), fazendo com que ele se mantenha a uma temperatura superior à da mãe. Além disso, há uma produção extra de calor realizada pela placenta e pela parede uterina (Asakura, 2004).
Ao nascimento, o feto encontra o ambiente externo a uma temperatura aproximadamente 10oC inferior à intra-uterina e por isso deve aumentar sua produção de calor. Esse aumento é causado por um aumento da TMB e também pela ativação de mecanismos termogênicos, principalmente a termogênese sem tiritação, sendo o tecido responsável por esse fenômeno o tecido adiposo marrom (TAM) (Asakura, 2004).
Animais de todas as espécies, principalmente pequenos roedores, apresentam ao nascimento significativas massas de TAM, que exerce papel fundamental no controle da temperatura (termogênese sem tiritação) e peso corporal (termogênese regulatória induzida pela dieta) (Gordon, 1993). Estudos evidenciam que o TAM é fundamental para a termogênese no período neonatal para proteger os recém-nascidos da hipotermia (Porras et al., 1990; Yahata e
Kuroshima, 1993).
idade, indicando que o tecido é importante no período neonatal, entretanto, parece ter pouca relevância fisiológica na vida adulta.
Os principais locais de deposição do TAM são as regiões interescapular, subescapular, axilar e intercostal. Histologicamente o TAM é classificado como multilocular, sendo altamente inervado e vascularizado, o que confere a ele sua coloração castanha, juntamente com a alta concentração de mitocôndrias (Himms-Hagen, 1985). Sua ativação ocorre via sistema nervoso simpático através da liberação de noradrenalina via receptores β3
-adrenérgicos, sendo o sinal transmitido via AMP-c e proteína kinase A, levando à liberação de ácidos graxos a partir da quebra de triglicerídeos (Cannon e Nedergaard, 2004).
O eficaz papel termogênico deste tecido se deve à presença de proteínas desacopladoras (uncoupling proteins - UCPs) que dissipam o gradiente de prótons através da membrana interna da mitocôndria, na qual estão localizadas, produzindo calor de forma desacoplada à produção de ATP (Ricquier et al., 1991; Cannon e Nedergaard, 2004).
Entre as UCPs, destacamos a UCP1, que foi primeiramente descrita em 1978 por Nicholls et al. recebendo o nome de “termogenina”. A UCP1 é a
proteína capaz de mediar a termogênese sem tiritação (Golozoubova et al.,
2006), e vem sendo considerada por alguns autores como a única proteína desacopladora com a função fisiológica de produzir calor, evidenciando que a UCP2 e a UCP3 têm outras funções fisiológicas e que não substituem a UCP1, apesar de todas estarem presentes no TAM (Matthias et al., 2000).
musculatura lisa do útero (Nibbelink et al., 2001), em timócitos (Adams et al.,
2008) e na epiderme humana (Mori et al., 2008).
A UCP2 é encontrada em diversos tecidos, em humanos e roedores (Fleury et al., 1997), entretanto suas funções são, provavelmente,
tecido-dependentes (Erlanson-Albertsson, 2003). Entre as funções da UCP2 no organismo, podemos destacar seu papel no balanço energético, na regulação do peso corporal, na termorregulação e na defesa aos estímulos inflamatórios (Fleury et al., 1997), além de atuar também na regulação das espécies reativas
de oxigênio (EROs) (Arsenijevic et al., 2000) e liberação de insulina (Chan et al., 1999), possivelmente relacionada à obesidade e diabetes mellitus do tipo 2
(Ježek, 2002).
A UCP3 está presente exclusivamente no tecido adiposo marrom, no tecido adiposo branco e no músculo esquelético (Boss et al., 1997; Vidal-Puig et al., 1997). Essa localização específica pode direcionar sua provável função
no controle do metabolismo energético do músculo esquelético, podendo influenciar no gasto energético de todo o organismo (Erlanson-Albertsson, 2003). Schrauwen e Hesselink (2003) demonstraram que o aumento do gasto energético total do organismo causado pelo exercício pode estar relacionado com o aumento da expressão da UCP3 no músculo.
Diferentes autores encontraram aumento da expressão de UCP2 (Fleury et al., 1997; Boss et al., 1997) e UCP3 (Lin et al., 1998) em animais
expostos ao frio, sugerindo assim, seu papel termogênico.
sua função é pouco esclarecida, mas possivelmente estão relacionadas à termogênese no sistema nervoso e neutralização de EROs (Adams, 2001).
Estudos recentes têm sugerido a participação de outras proteínas na termorregulação. De Meis (2003) demonstrou a expressão da bomba de Ca++
do retículo sarcoplasmático (SERCA1) no TAM e sugeriu que esta proteína poderia representar uma rota alternativa de produção de calor, o que contribuiria para aumentar a função termogênica deste tecido. Arruda et al.
(2008) demonstraram que coelhos expostos ao frio apresentam em suas fibras musculares vermelhas um aumento na expressão de SERCA1, o que indica que esta proteína possa estar também relacionada à termogênese no tecido muscular esquelético.
Carmona et al. (1998), estudando a expressão das UCPs no TAM
de camundongos durante diferentes fases do desenvolvimento, verificaram que UCP1 e UCP2 já são expressas na fase intra-uterina, ao contrário da UCP3, que só é expressa na fase pós-natal. Durante as primeiras 48h após o nascimento ocorre uma super-expressão de UCP1, UCP2 e UCP3, sendo que quinze dias após o nascimento seus níveis encontram-se diminuídos. Os autores atribuem este aumento pós-natal na expressão das UCPs ao estresse térmico causado pela transição do ambiente intra-uterino para o extra-uterino.
Hormônios como a insulina, a leptina e os hormônios tireoidianos, reconhecidos como reguladores metabólicos, recentemente têm sido relacionados ao controle das UCPs e à termorregulação (Mostyn et al., 2005).
A leptina, além de reconhecidamente participar da regulação energética, parece também exercer um papel na regulação das UCPs, em particular a UCP1, e na termogênese (Mostyn et al., 2004; Scarpace et al.,
2007). O cortisol, hormônio adrenal com papel crucial na maturação do tecido fetal, parece também influenciar na abundância de UCP1 no feto (Mostyn et al.,
2004).
A UCP2 e a UCP3 também são sensíveis aos hormônios da tireóide (Masaki et al., 1997), à leptina (Scarpace et al., 1998), às citocinas
como o fator de necrose tumoral α (TNF- α), aos ácidos graxos (Wu et al.,
1999; Weigle et al., 1998) e também à ativação do receptor β2-adrenérgico
(Nagase et al., 2001).
Estudos em ratos adultos demonstraram que a restrição alimentar prolongada reduz a capacidade termogênica e o tamanho do TAM, contribuindo para o aumento da eficiência metabólica dos animais quando realimentados, facilitando assim a reposição dos estoques de energia (Himms-Hagen, 1985).
Harun et al. (1997) demonstraram que patos submetidos a
restrição alimentar demoram mais tempo para se manterem homeotérmicos sob estresse térmico, em relação aos animais que receberam alimentação ad libitum, e foram capazes de aumentar sua temperatura corporal somente
quando realimentados.
Luz et al. (2003) investigaram as conseqüências da RAIU sobre o
desenvolvimento da termorregulação em pesquisa realizada em nosso Laboratório e observaram que filhotes de ratas que sofreram restrição alimentar de 50% durante a gestação, quando expostos ao frio, apresentaram retardo de 30 dias em relação ao grupo controle no desenvolvimento dos processos termorregulatórios peri-natais, ou seja, levaram mais tempo para manter a temperatura corporal sob estresse térmico. Seguindo esta pesquisa, o mesmo grupo verificou a expressão do RNAm das UCPs no TAM dos filhotes de mães controle (alimentação ad libitum durante a gestação) e restritas (50% da ingestão alimentar das mães controle durante a gestação), para confirmar a hipótese de que o atraso no desenvolvimento da termorregulação dos filhotes do grupo restrito observado no trabalho anterior poderia ser justificado por um comprometimento das UCPs (Coelho, 2005). Surpreendentemente, nosso
grupo verificou que a expressão do RNAm da UCP1 e da UCP2 no TAM dos filhotes de mães desnutridas foi significantemente maior que os da prole controle.
A fim de confirmar os resultados descritos por Coelho (2005), o presente estudo visa verificar se o aumento da expressão do RNAm das UCPs é acompanhado por um aumento destas proteínas. Além disso, considerando que a expressão das UCPs pode ser alterada por ação da insulina, leptina e hormônios tireoidianos (Reitman et al., 1999), e que estes podem ser afetados
pela restrição alimentar materna (Oberkotter e Rasmussen, 1992; Chisari et al.,
2. OBJETIVO
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Delineamento do estudo
RATOS WISTAR FÊMEAS
CONSTATAÇÃO DA PRENHEZ
ACASALAMENTO
GRUPO CONTROLE Alimentação ad libitum
GRUPO RESTRITO Restrição alimentar de 50%
FILHOTES CONTROLE FILHOTES RESTRITOS
Controle de peso e ingestão alimentar (21-22 dias)
Parto espontâneo
Coleta de TAM e Músculo Esquelético
de cada filhote Coleta de sangue (pool de cada prole)
Dosagem de insulina, leptina, T3 e T4 por ELISA
Montagem de Tissue Microarray
Análise Imuno-Histoquímica TAM: UCP1, UCP2, UCP3, SERCA1 Músculo Esquelético: UCP3, SERCA1 Pesagem e sacrifício
3.2. Animais
Ratos (Rattus norvegicus, albinus, Rodentia mamalia) fêmeas
virgens da linhagem Wistar EPM-1 com 3 meses de idade, provenientes do Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais (CEDEME) da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) foram utilizados para os experimentos do presente trabalho, previamente analisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP (no 1152/06) (anexo).
Os animais foram mantidos em sala com temperatura pré-ajustada (22±2°C) e ciclo claro-escuro de doze por doze horas durante todo o experimento. Após um período de adaptação de 3 a 5 dias no biotério da Disciplina de Fisiologia Renal e Termometabologia da UNIFESP, os animais foram submetidos ao acasalamento, que consistiu na colocação de um rato macho em gaiolas plásticas coletivas com no máximo três fêmeas após as 18:00h. Às 7:00h do dia posterior foi realizado teste de prenhez, no qual, com a ajuda de um conta-gotas plástico, foi realizada lavagem vaginal com solução fisiológica e sucção deste material, que foi então colocado em lâminas e observado ao microscópio óptico, em aumento de 40x, sem uso de corante ou lamínulas. O estado de prenhez foi determinado quando observada a presença de espermatozóides no material.
Uma vez consideradas prenhes, as ratas foram separadas e colocadas em gaiolas plásticas individuais contendo maravalha, onde permaneceram durante todo o período gestacional recebendo ração (NUVILAB CR-1, NUVITAL) ad libitum (Grupo Controle - CON) ou 50% de ração (Grupo
ratos de laboratório, baseado em recomendações do National Research Council e do National Institute of Health (USA) segundo o fabricante e fornece 16,39 kJ/g, segundo medições calorimétricas realizadas periodicamente em nosso laboratório. Ambos os grupos receberam água ad libitum durante todo o
experimento.
Durante o período gestacional, os animais tiveram seu peso corporal medido diariamente em Balança Filizola BP-6.
Após o nascimento por parto espontâneo, os filhotes foram mantidos com as mães em gaiola plástica. Quinze horas após o nascimento (Carmona et al., 1998) os filhotes foram separados das mães, um a um, pesados (Balança
Marte AS 5500) e sacrificados por decapitação para coleta de sangue, tecido adiposo marrom interescapular e tecido muscular esquelético da região posterior do membro posterior direito do animal.
3.3. Coleta dos tecidos
A coleta do tecido adiposo marrom interescapular e do tecido muscular esquelético foi realizada utilizando-se material cirúrgico apropriado. Os tecidos foram mantidos em formol tamponado a 10% para posterior processamento imuno-histoquímico.
3.4. Confecção de blocos de parafina e de Tissue Microarray
Após fixação em formol tamponado a 10%, os tecidos foram
processados e corados com hematoxilina-eosina (HE) para identificação do material.
De cada um destes blocos de parafina formados, denominados blocos doadores, foram retirados fragmentos cilíndricos de 1mm de diâmetro de amostras teciduais (TAM e músculo esquelético dos filhotes) previamente demarcadas, baseadas na coloração em HE. O critério de seleção considerou a retirada de fragmentos que representassem a amostra tecidual de cada filhote a ser analisado, para confecção de um único bloco de Tissue Microarray (TMA). A utilização deste método permite a realização da reação em todas as amostras simultaneamente, evitando as variações intra e inter-ensaios, além de minimizar a utilização de anticorpos e reagentes (Andrade et al., 2007).
O bloco de TMA foi construído com o uso do aparelho BeecherTM
(Beecher Instruments, Silver Spring, MD, USA) e foi composto por amostras teciduais de TAM e de músculo esqueléticos dos filhotes dos grupos controle e restrito. As amostras teciduais foram dispostas no bloco de TMA seguindo uma ordem pré-determinada, de acordo com uma planilha (anexo) que foi elaborada para possibilitar a identificação e localização de cada amostra na lâmina histológica, sendo que a primeira amostra consistia de um fragmento de tecido hepático, com o objetivo de orientar a seqüência empregada.
Cortes de 4µm em micrótomo do bloco de TMA foram fixados em lâminas silanizadas a 4% (3 aminopropiltrietoxisylano – Sigma, USA).
A. Tissue microarrayer, Beecher Instruments®
B. Bloco de TMA
3.5. Imuno-histoquímica
Os cortes histológicos obtidos do bloco de TMA e dispostos em lâminas silanizadas foram desparafinizados em xilol, em estufa por 30 minutos, desidratados em álcool absoluto e hidratados em água corrente. Em seguida, foram submetidos à recuperação antigênica em panela a vapor a 98oC
(Steamer - Wallita) com tampão citrato pH 6.0, bloqueio da peroxidase
endógena em H2O2 a 3% e bloqueio das ligações inespecíficas com solução de
leite em pó desnatado a 3%.
Cada lâmina recebeu um anticorpo primário, UCP1, UCP2, UCP3 ou SERCA1 (diluição 1:100) (Santa Cruz Biotechnology Inc.), ou BSA (bovine serum albumin) para controle negativo, e foram incubadas overnight em
geladeira.
Após lavagem com tampão PBS (phosphate-buffered saline), utilizou-se o kit LSAB, HRP (Labeled Strepavidin-Biotin-Peroxidautilizou-se Complex System) (DAKO, CA, USA), incubando-se com anticorpo secundário biotinilado por 30 minutos e após lavagens com PBS, com o complexo streptavidina-biotina-peroxidase, por 30 minutos.
As lâminas foram reveladas com DAB (diaminobenzidina) líquido (Sigma, Co-USA) por 5 minutos, coradas com hematoxilina e montadas com lamínulas em Entellan (Sigma, Co-USA).
ao microscópio. Inicialmente, as imagens digitalizadas foram tratadas no programa Corel Photo Paint 10, selecionando-se pela cor as áreas marcadas pelo anticorpo específico utilizando-se a mesma máscara de cor para todas as imagens. Em seguida, utilizando-se o programa de morfometria Image Tool, a intensidade de cor das imagens foi quantificada e expressa em pixels, sendo a intensidade da coloração diretamente proporcional à expressão protéica.
3.6. Coleta de sangue e dosagens hormonais
O sangue do tronco dos filhotes de cada ninhada foi coletado conjuntamente (pool), imediatamente após a decapitação individual, em tubo
de ensaio contendo 1ml de EDTA a 2%, centrifugado a 2500rpm (Centrífuga Eppendorf 5810R) a 5°C por quinze minutos. O plasma foi separado e armazenado em freezer (- 20°C). O pool sangüíneo dos filhotes foi utilizado
para a dosagem plasmática de insulina, leptina, T3 e T4.
Todas as dosagens hormonais foram realizadas no Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade de São Paulo (USP), sob a supervisão da Profa. Dra. Maria Tereza Nunes, segundo o método ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), utilizando os kits descritos abaixo, sendo cada um deles realizado conforme instruções de seus respectivos fabricantes:
- Insulina: Ultra Sensitive Rat Insulin ELISA Kit; Crystal Chem. Inc – USA; - Leptina: Rat Leptin Assay Kit; Immuno-Biological Laboratories Co – USA;
O teste de ELISA é uma metodologia que apresenta alta sensibilidade e especificidade, utilizada para detecção de proteínas presentes no soro ou plasma, baseada no princípio de ligação antígeno-anticorpo. O procedimento realizado em cada um dos testes consistiu basicamente na incubação das amostras de plasma e da curva-padrão fornecida pelo fabricante em placas de superfície inerte, com 96 poços sensibilizados contendo o anticorpo específico adsorvido.
Após incubação, as placas foram lavadas com solução tampão e incubadas com o conjugado enzimático contra o hormônio específico (leptina, insulina, T3 e T4); posteriormente foi adicionado o substrato enzimático para conferir a coloração e adicionada solução “stop” para interromper as reações. Após o bloqueio da reação enzimática, as placas foram submetidas à leitura em espectrofotômetro para medir a absorbância em comprimento de onda específico para cada hormônio e, comparando os valores à curva-padrão estabelecida, foram calculadas as concentrações de cada hormônio. A intensidade da cor formada foi proporcional à quantidade de enzima presente e proporcional (insulina e leptina) ou inversamente proporcional (T3 e T4) à quantidade de hormônio na amostra.
3.7. Análise estatística
4. RESULTADOS
A figura 1 mostra os valores diários de ingestão alimentar (g) durante o período de gestação dos animais dos grupos controle (CON) e restrito (RES). A ingestão alimentar total (g) das gestantes CON foi de 413,6 ± 9,3 e das gestantes RES foi de 214,2 conforme está representado na figura 2.
0 5 10 15 20 25
0 10 20 30 Controle (n=16) Restrito (n=16) Tempo (dias) In g est ão a lim en ta r (g )
Figura 1. Ingestão alimentar diária (g) dos animais dos grupos controle e restrito durante o período gestacional. Os pontos representam as médias ±
erro-padrão. 0 100 200 300 400 500 Controle (n=16) Restrito (n=16) In ge st ão al im en ta r t o ta l (g )
O peso corporal (g) diário das gestantes dos grupos CON e RES está representado na figura 3.
0 5 10 15 20 25
150 200 250 300 350
Controle (n=16) Restrito (n=16)
Tempo (dias)
Pe
so
c
o
rp
o
ra
l
(g
)
Figura 3. Peso corporal (g) dos animais dos grupos controle e restrito durante o período gestacional. Os pontos representam as médias ± erro-padrão.
0 50 100 150 Controle (n=16) Restrito (n=16) * G an ho d e pe so cor p or al (g )
Figura 4. Ganho de peso corporal (g) dos animais dos grupos controle e restrito durante o período gestacional. As barras representam as médias ± erro-padrão (* p<0,0001).
Na figura 5 é mostrado o peso corporal (g) dos filhotes, 15 horas após o nascimento, separados por gênero e por grupo. Em ambos os gêneros, observamos valores de peso significantemente menores (p<0,05) nos filhotes do grupo RES em relação aos CON, o que também foi verificado para os valores médios de peso da prole (p<0,0001).
0.0 1.5 3.0 4.5 6.0 7.5 Controle Restrito * * **
Machos Fêmeas Total
P es o co rp or al ( g )
Na figura 6 podemos observar o número de filhotes segundo gênero e grupo, onde é evidenciada a homogeneidade entre os grupos. É importante ressaltar que não houve diferenças significativas no tamanho da prole (p>0,05), ou seja, os grupos foram semelhantes em relação ao número de filhotes por gênero e por ninhada. Na tabela 1 podemos observar com mais detalhes o peso corporal (média ± erro-padrão) e o número de filhotes por grupo e por ninhada.
0 2 4 6 8 10 12 14
Machos Fêmeas Total
N
ú
m
er
o
d
e filh
o
te
s
Figura 6. Número total de filhotes, segundo gênero e grupo. As barras representam as médias ± erro-padrão.
Tabela 1. Peso corporal (g) dos filhotes, 15 horas após o nascimento e número médio de filhotes por ninhada, segundo gênero e grupo. Os valores representam as médias ± erro-padrão. O tamanho da amostra (n) de cada grupo é mostrado entre parêntesis.
MACHOS FÊMEAS TOTAL
CON RES CON RES CON RES
Peso corporal (g) 5,95±0,06
(91) 4,97±0,08 * (80) 5,69± 0,07 (78) 4,69±0,07 * (92) 5,83±0,04 (169) 4,82±0,05 ** (172)
Número médio de
Nas figuras 7, 8, 9 e 10 encontram-se os resultados da imuno-histoquímica para UCP1, UCP2, UCP3 e SERCA1, respectivamente, realizada no TAM interescapular das proles dos grupos CON e RES. Acima de cada barra podemos observar a fotomicrografia correspondente ao resultado de cada grupo (Controle – A e Restrito – B), em aumento de 400x.
A B
0 1000 2000 3000 4000
5000 Controle (n=34)
Restrito (n=51) *
E
xp
ressã
o d
a
U
C
P
1
(p
ixel
s)
A B 0 2500 5000 7500 Controle (n=38) Restrito (n=52) * E xp ressão d a U C P 2 (p ixel s)
Figura 8. Expressão (pixels) da proteína desacopladora UCP2 no TAM das proles dos grupos controle e restrito. As barras representam as médias ± erro-padrão (*p<0,0001).
A B
0 2500 5000 7500 10000 Controle (n=34) Restrito (n=18) E xp ressão d a U C P 3 (p ixel s)
A B
0 2500 5000 7500 10000
Controle (n=37) Restrito (n=52)
E
xpr
ess
ão
d
a
SE
RC
A1
(p
ixel
s)
Figura 10. Expressão (pixels) da SERCA1 no TAM das proles dos grupos controle e restrito. As barras representam as médias ± erro-padrão.
A partir das figuras apresentadas acima, podemos observar que no tecido adiposo marrom a expressão da UCP1 foi significantemente maior na prole RES em relação à prole CON (p<0,0001). Da mesma forma, a expressão da UCP2 foi significantemente maior na prole do grupo RES quando comparada à prole do grupo CON (p<0,0001). Entretanto, em relação à expressão da UCP3 e da SERCA1 não encontramos diferença significante entre os grupos (p>0,05).
A B 0 2500 5000 7500 Controle (n=21) Restrito (n=11) E xp ressão d a U C P 3 (p ixel s)
Figura 11. Expressão (pixels) média da proteína desacopladora UCP3 no músculo esquelético das proles dos grupos controle e restrito. As barras representam as médias ± erro-padrão.
A B
0 2500 5000 7500 Controle (n=24) Restrito (n=18) E xpr ess ão d a SE RC A1 (p ix el s)
Tabela 2. Valores (pixels) da expressão das proteínas UCP1, UCP2, UCP3 e SERCA1 no TAM, e da UCP3 e da SERCA1 no músculo esquelético. Os valores representam as médias ± erro-padrão. O tamanho da amostra (n) de cada grupo é mostrado entre parêntesis.
Intensidade da coloração (pixels)
CON RES
TAM
UCP1 3288,04 ± 341,44 (34) 4671,59 ± 290,85 (51) p<0.0001 UCP2 3910,52 ± 211,33 (38) 5993,58 ± 403,50 (52) p<0.0001
UCP3 8532,62 ± 703,52 (34) 6458,37 ± 529,38 (18) NS
SERCA1 9058,08 ± 698,18 (37) 8460,03 ± 505,76 (52) NS
ME UCP3 5097,03 ± 866,38 (21) 5564,51± 939,68 (11) NS SERCA1 5179,29 ± 406,09 (24) 5088,06± 325,32 (18) NS NS, não significante.
Nas figuras 13, 14, 15 e 16 está representado o perfil plasmático de insulina, leptina, T3 e T4, respectivamente, a partir do pool sanguíneo de cada
0 1 2 3 4 5 Controle (n=13) Restrito (n=8)
*
C oncent ra ção pl as m át ica de in su li na (n g/ m l)Figura 13. Concentração plasmática de insulina (ng/ml) das proles dos grupos controle e restrito. As barras representam as médias ± erro-padrão (* p<0,05).
0 1000 2000 Controle (n=11) Restrito (n=8) C o n ce n tr aç ão p la sm át ic a d e le p tin a (p g/ m l)
Media 1 Leit Chau Res
CONTROLE RESTRITO 0.0 0.5 1.0 1.5 Controle (n=14) Restrito (n=10)*
C o n cen tr ação pl as m át ic a de T3 ( n g /ml )Figura 15. Concentração plasmática de T3 (ng/ml) das proles dos grupos controle e restrito. As barras representam as médias ± erro-padrão (* p<0,05).
0 10 20 30 Controle (n=12) Restrito (n=10) C o n cen tr ação pl as m át ic a de T4 ( n g /ml )
Figura 16. Concentração plasmática de T4 (ng/ml) das proles dos grupos controle e restrito. As barras representam as médias ± erro-padrão.
Tabela 3. Perfil plasmático de insulina, leptina, T3 e T4 dos filhotes dos grupos controle e restrito. Os valores representam as médias ± erro-padrão. O tamanho da amostra (n) de cada grupo é mostrado entre parêntesis.
Insulina (ng/ml) Leptina (pg/ml) T3 (ng/ml) T4 (ng/ml)
CON RES CON RES CON RES CON RES
1,17 ± 0,18
(13)
3,34 ± 0,78 *
(8)
1255,54 ± 392,37
(11)
987,79 ± 261,08
(8)
1,09 ± 0,08
(14)
0,82 ± 0,06 *
(10)
16,00 ± 1,68
(12)
20,99 ± 3,74
(10)
5. DISCUSSÃO
A gestação representa um estado fisiológico caracterizado pelo ganho de peso materno que reflete o crescimento fetal e o desenvolvimento do útero, da placenta, do líquido amniótico, do tecido mamário e das reservas energéticas maternas. A mãe é responsável por suprir as necessidades de macro e micronutrientes e o aporte calórico necessário não apenas ao desenvolvimento fetal, mas também às suas próprias necessidades nutricionais (Eidelman et al., 2001). Assim, a manutenção de uma alimentação balanceada
e o fornecimento adequado de nutrientes neste período são fundamentais para atender às demandas fisiológicas maternas próprias da gestação, ao desenvolvimento do concepto (Padilha et al., 2007) e às reservas energéticas
necessárias para a amamentação (Andrews et al., 1986).
Durante a primeira metade da gestação, o crescimento fetal ocorre principalmente por hiperplasia, com formação de novas células e, na segunda metade da gestação, o crescimento fetal se dá pela hipertrofia destas células (Winick, 1968). Portanto, o ganho de peso gestacional ocorre gradualmente, entretanto é mais pronunciado no final da gestação, pois neste período há um importante aumento de peso do feto. Além disso, ao final da gestação o armazenamento de gordura materna deve aumentar para preparar a mãe para a lactação, que representa um período de alta demanda energética (Trayhurn, 1989).
esperado nas gestantes do grupo controle, uma vez que obtiveram livre acesso à ração, permitindo assim a nutrição adequada para a prole e para seu próprio organismo.
As gestantes do grupo restrito, por sua vez, apresentaram uma redução significante do ganho de peso gestacional em relação às gestantes do grupo controle, como reflexo natural à restrição alimentar imposta. Contudo, mesmo não atingindo o mesmo ganho de peso ao final da gestação, as gestantes do grupo restrito apresentaram o mesmo padrão de crescimento na curva de ganho de peso que as gestantes do grupo controle.
Reconhecendo que a nutrição adequada durante a gestação é essencial para o desenvolvimento e o estado nutricional do bebê, melhorias no estado nutricional materno são indiscutivelmente imprescindíveis para garantir um resultado adequado (Maloney e Rees, 2005; Rodriguez et al., 1991). Por
outro lado, reduções no aporte nutricional durante o período gestacional podem levar a alterações no desenvolvimento fetal e determinar a susceptibilidade ao desenvolvimento tardio de doenças (Chadio et al., 2007).
energia dos filhotes.
Em nosso estudo foi imposta sobre as gestantes do grupo restrito uma restrição alimentar de 50%. Outros estudos realizados em nosso laboratório já haviam utilizado esta intensidade de restrição alimentar e observado na prole redução de ganho de peso e de energia, sem encontrar diminuição no número de filhotes (Luz et al., 2003; Coelho, 2005).
É descrito que restrições alimentares impostas na segunda metade da gestação causam nascimento por parto prematuro e aborto (Matsuoka et al.,
2006). Entretanto, Griggio et al. (1997) não observaram redução no tamanho
da prole quando a restrição é imposta apenas durante a primeira ou a segunda metade da gestação, encontrando redução no número de filhotes somente quando esta foi imposta durante todo o período gestacional.
Considerando a gravidade das repercussões da desnutrição intra-uterina sobre o estado nutricional materno e fetal, diversos estudos clínicos e epidemiológicos têm sido realizados a fim de avaliar condições clínicas como a hiperemese gravídica (Dodds et al., 2006; Van Stuijvenberg et al., 1995),
intervalos curtos entre gestações, baixo peso pré-gestacional, peso materno insuficiente durante a gestação, gestações múltiplas e gestações precoces (Luther et al., 2005). Segundo dados do IBGE, 12,2% da população feminina
brasileira em idade fértil apresenta déficit de peso (POF, 2003).
Experimentalmente, diversos estudos são realizados a fim de reproduzir os efeitos da RAIU, que pode ser obtida por meio de restrição protéica (Zambrano et al., 2006;Toscano et al., 2008), insuficiência placentária
1996; Griggio et al., 1997; Budge et al., 2004; Kind et al., 2005), sendo este
último modelo o adotado no presente trabalho.
Em nosso estudo, como era esperado, observamos uma diminuição no peso ao nascimento dos filhotes que sofreram RAIU. Tal fenômeno se deve às deficiências no aporte nutricional para o feto, levando a alterações no crescimento e desenvolvimento fetal (Luz et al., 1996; Griggio et al., 1997;
Coelho, 2005; Kind et al., 2005). Apesar da redução do peso, o número de
filhotes por ninhada não foi alterado pela RAIU. Conforme já relatado, a restrição alimentar materna de 50% pode causar diminuição de peso corporal e de energia corporal da prole, entretanto não alterar o número de filhotes por ninhada (Luz et al., 2003; Coelho, 2005).
Não houve diferenças para o tempo de gestação entre os grupos estudados, bem como não observamos abortos ou partos prematuros em nossos experimentos. Os filhotes de ambos os grupos nasceram por parto espontâneo entre o 21o e o 22o dia de gestação (dados não apresentados), similarmente ao que foi observado por Zambrano et al. (2006) em seu estudo.
temperatura corporal. Neste momento, o recém-nascido deve então ativar mecanismos de produção de calor, na tentativa de manter a homeotermia (Asakura, 2004).
Com o objetivo de preparar o feto para esta transição, ocorre uma considerável mudança endócrina no recém-nascido que contribuirá para o início da auto-regulação dos mecanismos respiratórios, circulatórios, termorregulatórios e de homeostase glicêmica, bem como da alimentação (Gluckman et al., 1999).
O desenvolvimento do sistema termorregulatório de neonatos é variável entre diferentes espécies e parece estar relacionado à duração do período gestacional. Alguns animais, como o homem e ovelhas, apresentam capacidade termorregulatória já desenvolvida ao nascimento. Animais de espécies com períodos gestacionais menores, como pequenos roedores, são virtualmente poiquilotermos ao nascimento e tornam-se totalmente homeotermos após um período de aproximadamente 20-30 dias (Gordon, 1993; Nazarova e Petrova, 1999; Symonds et al., 2003). Corroborando estes
dados, Frankel & Lange (1980) descreveram que a maturação do eixo hipotálamo – tireóide não ocorre até aproximadamente a sétima semana de vida nestes animais.
Luz et al. (2003), avaliando a capacidade termorregulatória de ratos
provocar um retardo no desenvolvimento do TAM, levando assim à ineficiência termorregulatória dos neonatos.
Ao nascimento uma quantidade significativa de TAM está presente em humanos (Yahata e Kuroshima, 1993) e outros mamíferos (Gordon, 1993) para protegê-los da hipotermia. O TAM é responsável pela termogênese sem tiritação e pela grande capacidade de gerar calor. O alto poder termogênico do TAM se deve principalmente à presença de UCPs na membrana interna de suas mitocôndrias, especialmente a UCP1 (Himms-Hagen, 1985).
Experimentos realizados por Coelho (2005) avaliaram a expressão do RNAm das UCPs no TAM de proles submetidas à RAIU (50%). Os resultados indicaram níveis significantemente aumentados de RNAm de UCP1 e UCP2 nas proles restritas, em relação aos controles, em 9 vezes e 2,5 vezes, respectivamente. Tais resultados sugerem um possível aumento na atividade do TAM, contrariamente à hipótese levantada anteriormente pelo grupo (Luz et al., 2003). O autor observou também uma tendência de aumento na expressão
de RNAm para UCP3 no TAM, mas esta diferença não foi significante.
Para avaliar a expressão destas proteínas utilizamos em nosso estudo a metodologia imuno-histoquímica associada à técnica do Tissue Microarray (TMA), que garante a uniformização das reações, além de possibilitar grande economia de reagentes pelo estudo simultâneo das amostras (Andrade et al. 1997).
respectivamente). Não foram observadas diferenças significantes para a expressão de UCP3 no TAM em nosso estudo, o que também foi demonstrado para RNAm por Coelho (2005).
Diferentemente dos humanos, pouca quantidade de gordura é encontrada em roedores neonatos, uma vez que esses animais têm o desenvolvimento de gordura fetal incompleto. Logo, grande parte dos depósitos de gordura encontrados em pequenos roedores provêm do TAM e esse depósito pode ser alterado pelo estado nutricional materno. Redução no teor de gordura corporal de filhos de mães submetidas à restrição alimentar já foi anteriormente descrita por diferentes autores (Symonds et al., 1998; Engelbregt et al., 2004; Coelho, 2005). Já foi demonstrado em cobaias que a RAIU leva a
uma diminuição da gordura marrom dos fetos (Kind et al., 2005).
A ausência de pelagem e a reduzida quantidade de gordura em pequenos roedores dificultam seu isolamento térmico ao nascimento, tornando-os muito susceptíveis ao estresse térmico (Gordon, 1993). Estes animais apresentam grande relação superfície/ volume e o baixo peso ao nascimento decorrente da RAIU acentua esta relação. Assim, poderíamos sugerir que estes filhotes apresentam elevada taxa de termólise, com maior perda de calor por condução e convecção, o que estimularia o aumento da termogênese sem tiritação e a maior produção de proteínas desacopladoras para aumentar a produção térmica e compensar a grande perda de calor. Este aumento é mais significativo para a UCP1, considerando que esta é a principal proteína termogênica do TAM (Himms-Hagen, 1985).
Boss et al. (1997) observaram aumento significante do RNAm da
achados que descrevem a participação da UCP2 na termorregulação, o aumento da expressão de UCP2 no TAM encontrado nos animais submetidos à RAIU em nosso estudo nos leva a supor que esta proteína poderia estar exercendo papel na termogênese destes filhotes, assim como a UCP1, como mecanismo compensatório da alta taxa de termólise observada nas proles do grupo restrito.
Por outro lado, podemos considerar também que o aumento de UCP2 encontrado nas proles restritas possa talvez estar envolvido na proteção contra danos celulares, o que já foi demonstrado por outros autores (Busquets
et al., 1998; Arsenijevic et al., 2000; Mattiasson et al., 2003; Degasperi et al.,
2008). Echtay et al. (2002) observaram que a administração de superóxido nos
rins, baço, coração, fígado e células β pancreáticas de ratos provocou aumento nos níveis de UCP2 mitocondrial, sugerindo que o aumento de espécies reativas de oxigênio ativa a produção de UCP2.
Kumar et al. (2008) observaram em seu estudo que recém-nascidos
de baixo peso são deficientes em vários importantes antioxidantes, estando predispostos a um maior estresse oxidativo. Outros autores também demonstraram que a desnutrição intra-uterina está associada a significantes níveis de estresse oxidativo em neonatos (Gupta et al., 2004).
De Meis (2003) descreveu a presença da bomba de Ca++ do retículo
aumento das UCPs, particularmente da UCP1, uma vez que também não foram detectadas diferenças na expressão da UCP3 no TAM.
Sabemos que neonatos produzem calor basicamente por termogênese sem tiritação, mediada pelo TAM e que animais adultos, entretanto, aumentam sua produção de calor primeiramente através da termogênese com tiritação, ou seja, pela contração involuntária da musculatura esquelética (Griggio, 1988).
Considerando-se o papel termogênico descrito para a UCP3 (Lin et al., 1998) e SERCA1 na musculatura esquelética (De Meis, 2001), avaliamos a
expressão destas proteínas dos filhotes submetidos à RAIU a fim de verificar alguma eventual contribuição da termogênese com tiritação na produção de calor apresentada por estes animais. Da mesma maneira que Coelho (2005) não encontrou diferenças significantes na expressão do RNAm destas proteínas na musculatura esquelética dos filhotes restritos, não observamos expressão diferenciada destas em nosso grupo restrito, sugerindo que, apesar da grande necessidade de aumentar sua produção de calor a fim de compensar o aumento da termólise, estes animais, assim como os animais controle, aumentam sua termogênese logo após o nascimento somente através do TAM.
convecção, particularmente nos animais submetidos à RAIU, em função da alta relação superfície/ volume, já discutida anteriormente.
Considerando-se que a transição do meio intra para o extra-uterino representa um grande estresse ao recém-nascido (Symonds et al., 2003),
diversos hormônios estão envolvidos nesta transição, dentre os quais podemos destacar a insulina, a leptina e os hormônios da tireóide (Cannon e Nedergaard, 2004), que têm sido relacionados à termorregulação e à expressão das UCPs (Mostyn et al., 2005).
Os experimentos realizados em nosso trabalho puderam mostrar o perfil plasmático destes hormônios nas proles, ao nascimento. Primeiramente, os resultados obtidos em nosso estudo demonstraram nas proles do grupo restrito uma concentração plasmática de insulina significantemente maior que as proles do grupo controle.
É descrito que o pâncreas endócrino é particularmente susceptível aos efeitos da restrição alimentar materna, uma vez que os períodos fetal e neonatal são críticos para o desenvolvimento das células β e para a maturação da função pancreática (Alvarez et al., 1997). Entretanto, os estudos sobre os
efeitos da RAIU sobre os níveis sangüíneos de insulina maternos e da prole apresentam resultados controversos.
Mericq et al. (2005) verificaram que bebês nascidos com baixo peso
entre o baixo peso ao nascimento e o desenvolvimento posterior de resistência à insulina.
Mahajan et al. (2004) demonstraram que os níveis de insulina de
fetos que haviam sofrido desnutrição ou anemia durante o período gestacional foram menores quando comparados aos de recém-nascidos saudáveis.
Em estudo experimental, Woodall et al. (1996) avaliaram os efeitos
da restrição alimentar de 70% durante a gestação de ratos Wistar e encontraram para a prole restrita uma redução significativa dos níveis plasmáticos de insulina ao nascimento, bem como reduzidos níveis plasmáticos de IGF-I. Estudo semelhante demonstrou que a subnutrição materna durante o período gestacional provoca diminuição significativa da concentração plasmática de insulina dos ratos recém-nascidos, bem como das mães que sofreram a restrição alimentar (Wang et al., 2007).
Em contrapartida, no estudo de Alvarez et al. (1997), os filhotes de
ratas gestantes que sofreram restrição alimentar de 65% durante a segunda semana ou na última semana de gestação apresentaram níveis insulinêmicos significativamente superiores àqueles apresentados pelas proles controle.
Da mesma maneira, Martin et al. (2004, 2005) impuseram sobre os
ratos uma restrição alimentar de 35% durante a 3ª semana gestacional, período crucial para o desenvolvimento do pâncreas, e verificaram nos filhotes desnutridos níveis de insulina plasmática superiores aos dos filhotes controle. Neste mesmo estudo, os autores observaram que o conteúdo de insulina nas ilhotas pancreáticas foi significativamente maior nos fetos desnutridos, apesar do menor peso do pâncreas observado nestes animais.
alimentar de 30% durante todo o período gestacional e receberam dieta hipercalórica e hiperlipídica na vida adulta, apresentaram níveis superiores de insulina e leptina plasmáticas, quando comparados aos níveis dos ratos controle, cujas mães haviam recebido alimentação ad libitum.
Poderíamos supor que o aumento dos níveis de insulina plasmática observado nos fetos que sofreram RAIU em nosso estudo poderia ser justificado como um mecanismo fisiológico de proteção contra a desnutrição, numa tentativa do organismo de preservar a massa magra e estimular o crescimento compensatório. Conforme Coelho (2005) demonstrou em seu estudo, os filhotes submetidos à RAIU de 50% apresentaram diminuição significante no conteúdo lipídico, entretanto o conteúdo protéico da carcaça destes animais não foi alterado, indicando que nestes animais a massa magra foi preservada.
Podemos assim sugerir que a insulina, neste momento de estresse catabólico promovido pela RAIU, torna-se essencial, sendo preservada nestes filhotes, uma vez que a insulinemia aumentada poderia contribuir para aumentar a captação de glicose. Entretanto, este aumento peri-natal nos níveis de insulina poderia provocar conseqüências tardias, programando uma futura obesidade e resistência à insulina nestes filhotes (Mericq et al., 2005).
Valverde et al. (2003) demonstraram em adipócitos de TAM
interescapular de fetos de camundongos que a insulina tem papel fundamental na estimulação da expressão da UCP1, sendo esta regulação mediada pelo receptor IRS-1 por meio da cascata de sinalização da insulina via PI-3-kinase/AKT, indicando que a expressão da UCP1 pode ser induzida pela insulina, por meio deste receptor. Entretanto, os autores observaram que esta via de regulação de insulina não induziu a expressão da UCP2 ou da UCP3.
Rehnmark et al. (1990) demonstraram um cross-talk entre insulina e
noradrenalina em meio de cultura células do TAM, sugerindo que a ação deste hormônio sobre a expressão da UCP1 no TAM é regulada por ação simpática.
A leptina é uma proteína da família das citocinas, sintetizada principalmente pelo tecido adiposo branco. A possível presença da leptina também no TAM foi investigada, mas os autores vieram a demonstrar por imuno-histoquímica que a leptina deriva de adipócitos de tecido adiposo branco presentes no TAM (Cinti et al., 1997).
A leptina age através de seus receptores regulando várias funções fisiológicas no organismo, entre as quais destacamos a regulação do balanço energético e a sinalização da massa gordurosa presente no organismo (Scarpace et al., 1997). Evidências apontam que a leptina esteja também
relacionada ao controle de temperatura, participando da termogênese em situações de estresse térmico, juntamente com a participação de outros hormônios. Animais ob/ob, por exemplo, são caracterizados por hiperfagia e
intolerância ao frio, evidenciando o papel da leptina na termogênese (Ukropec
