Efeitos determinados pela administraçã subaracnoidea de
dexmedetomidina, em dose
́
nica, sobre a medula espinal e as
meninges de coelhos
Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Anestesiologia.
Orientadora: Profa. Titular Eliana Marisa Ganem
preferível arriscar coisas grandiosas. Alcançar
triunfo e glória mesmo expondo-se à derrota, do que formar filas com os pobres de espírito, que nem gozam
muito e nem sofrem muito porque vivem nesta penumbra cinzenta que não conhece vitória e nem derrota".
Theodore Roosevelt
É
Dedico este trabalho a três pessoas muito especiais, três mulheres:
à Elvira, minha mãe, sem a qual nada disso existiria, sendo elemento principal da minha formação;
à Iara, minha irmã, pode-se dizer uma segunda mãe;
AGRADECIMENTO ESPECIAL
À Prof. Titular Eliana Marisa Ganem,
Esse trabalho não seria possível sem o apoio de pessoas, que foram de fundamental importância ao longo da minha vida. Um muito obrigado!
Ao meu pai, que se aqui estivesse estaria radiante.
À Ticiana pelo apoio, compreensão, carinho e companheirismo.
À minhas irmãs, Maria Teresa, Ana, Iara e Regina, pelo exemplo e apoio ao longo do tempo.
Ao Jeconias Neiva Lemos, pelo apoio, amizade e exemplo de vida.
Ao Bruno Gardélio Pedreira de Cerqueira, pelo incentivo e amizade.
Ao Anderson Cardoso Gazineu, que levou todos nós para Unesp.
Ao Rodrigo e Jonga, pela amizade e companheirismo nessa jornada.
Ao Luciano Garrido, pela amizade e oportunidades.
Ao Carlos Eduardo, pela amizade e exemplo, sem falar no apoio durante essa jornada.
Ao José Admirço Lima Filho, pelo apoio incondicional nesses anos, seja de forma direta ou indireta, você foi fundamental.
À Stela, pela ajuda e colaboração.
À dona Joana Jacirene Costa Teixeira, secretária do Departamento de Anestesiologia, pela presteza e pelo trabalho gráfico.
À Nelí Aparecida Pavan e demais funcionários do Departamento de Anestesiologia da Unesp, pela disponibilidade e auxílio.
À aluna de graduação da Faculdade de Medicina de Botucatu Natália Castro Fim, pelo auxílio na execução da pesquisa experimental.
À Profa. Dra. Vânia Maria Vasconcelos Machado, do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, pelo auxílio com a ultrassonografia.
À Profa. Adjunta Mariângela Esther Alencar Marques, do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu, pelo auxílio na leitura das lâminas histológicas.
Ao Prof. Dr. Hélio Miott, do Departamento de Dermatologia e Radioterapia da Faculdade de Medicina de Botucatu, pelo auxílio na avaliação dos marcadores imuno-histoquímicos.
Figura 1 Segmento da região posterior da medula espinal. GFAP
40x... 33 Figura 2 A. Área selecionada do tecido neural. B. Área binarizada
após o processamento da imagem, resultando em 45% do
tecido marcado... 34
Figura 3 Tecido nervoso (A), vasos sanguíneos (B) e meninges (C)
normais de animal do G1 (C5). H&E 2... 39 Figura 4 Tecido nervoso (A), vasos sanguíneos (B) e meninges (C)
normais de animal do G1 (C5). H&E 10... 39
Figura 5 Tecido nervoso normal (A), vasos sanguíneos normais (B) e
discreto infiltrado inflamatório linfoplasmocitário entre na pia-máter e aracnoide com áreas focais de adesão (C) de
animal do G2 (C6). H&E 3,5... 40 Figura 6 Tecido nervoso normal (A) e discreto infiltrado inflamatório
linfoplasmocitário entre na pia-máter e aracnoide com áreas focais de adesão (B) de animal do G2 (C6). H&E
18... 40 Figura 7 Tecido nervoso normal (A) e discreto infiltrado inflamatório
linfoplasmocitário entre na pia-máter e aracnoide com áreas
focais de adesão (B) de animal do G2 (C6). H&E 30... 41 Figura 8 Tecido nervoso normal (A), infiltrado linfoplasmocitário
perivascular com áreas de espessamento da pia-mater e da
aracnoide (B e C) de animal do G2 (C7). H&E 6... 41 Figura 9 Tecido nervoso normal (A), infiltrado linfoplasmocitário
perivascular com áreas de espessamento da pia-mater e da
aracnoide (B e C) de animal do G2 (C7). H&E 20... 42 Figura 10 Tecido nervoso normal (A), infiltrado linfoplasmocitário
perivascular com áreas de espessamento da pia-mater e da
aracnoide (B e C) de animal do G2 (C7). H&E 40... 42 Figura 11 Box-Plot da mediana e 1º e 3º quartis do percentual das
células do tecido nervoso marcadas pelo GFAP dos grupos
expressos em média ± desvio padrão (dp)... 37 Tabela 2 Resultados histológicos do tecido nervoso e das meninges dos animais
dos animais pertencentes ao G2... 38
Quadro 1 Algoritmo de processamento das imagens para quantificação
3 MÉTODO... 22
3.1 Animais utilizados... 23
3.2 Grupos experimentais... 23
3.3 Sequência experimental... 23
3.4 Técnicas utilizadas... 25
3.4.1 Preparo do animal... 25
3.5 Punção subaracnóidea... 25
3.5.1 Técnica de punção... 25
3.5.2 Volume injetado... 26
3.5.3 Solução administrada... 26
3.6 Observação clínica... 27
3.7 Sacrifício... 27
3.8 Exame histológico... 28
3.8.1 Técnica imuno-histoquímica para GFAP... 28
3.9 Comissão d Ét ca em Experimentaç̃o em Animal... 34
3.10 Modelo de estudo... 35
3.11 Método estatístico... 35
4 RESULTADOS... 36
5 DISCUSSÃO... 44
5.1 Discussão da metodologia... 45
5.1.1 Ultrassonografia como guia de punção... 45
5.1.2 Grupos experimentais... 46
5.1.3 G F A P... 47
5.1.4 Tempo de observação clínica no cativeiro... 48
5.1.5 Dexmedetomidina... 48
5.2 Discussão dos resultados... 50
6 CONCLUSÃO... 52
(Doutorado em Anestesiologia), Faculdade de Medicina da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, câmpus de Botucatu.
RESUMO
Introdução: a dexmedetomidina é um enantiômero dextrógiro da medetomidina, possui importantes ações sedativas e analgésicas. A dexmedetomidina é empregada como medicaç̃o pré-anestésica ou associada ̀ anestesia pelas vias intravenosa, muscular, peridural ou subaracnoidea. Estudos clínicos mostram que quando utilizada no espaço peridural de seres humanos a dexmedetomidina não desencadeou lesões neurológicas. Pela via subaracnoidea a associação de pequenas doses do fármaco (3-10 g) com o anestésico resultou em aumento no tempo dos bloqueios sensitivo e motor, com manutenção da estabilidade hemodinâmica e algum grau de sedação. Os estudos sobre os efeitos da dexmedetomidina introduzida no espaço subaracnoideo, além de escassos, não asseguram que o agente não causa lesões neurológicas.
Objetivo: avaliar os efeitos que a dexmedetomidina, administrada pela via subaracnoidea em dose única, determina sobre a medula espinal e as meninges de coelhos. Método: vinte coelhos adultos jovens, fêmeas, pesando entre 3200 a 4900 gr com comprimento de coluna vertebral entre 36 e 40 cm foram divididas, por sorteio, em dois grupos (G): G1 solução fisiológica 0,9%, G2 dexmedetomidina (10 μg). Após anestesia venosa com cetamina e xilazina foi realizada punção subaracnoidea em S1-S2 guiada por ultrassom e injetada a solução sorteada. Os animais permaneceram em cativeiro por 21 dias sob observação clínica e foram sacrificados por decapitação e retirada a porção lombo-sacral da medula espinal para exame histológico [Hematoxilina e eosina (HE) e imuno-histoquímica para proteína glial fibrilar ácida (GFAP)].
Resultados: nenhum animal apresentou lesão histológica de tecido nervosa, entretanto 9 animais apresentaram alterações em meninges. Conclusão: neste modelo experimental em coelhos, a dexmedetomidina administrada no espaço subaracnoideo em dose única, não desencadeou alterações histológicas sobre o tecido medular, entretanto foram encontradas alterações histológicas em meninges.
Cardoso HEDP. Effects of dexmedetomidine, administered by the intrathecal route in single puncture, determines on the spinal cord and meninges of rabbits. Botucatu, 2015. 60p. Thesis (PhD degree in Anesthesiology), Faculdade de Medicina da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, câmpus de Botucatu.
ABSTRACT
Background: dexmedetomidine is a dextrorotatory enantiomer of medetomidine, has important sedative and analgesic actions. This drug is used as premedication or associated with anesthesia by intravenous, muscular, epidural or subarachnoid. Clinical studies show that when used in the epidural space of human’s dexmedetomidine did not cause neurological damage. By subarachnoid way the association of small drug doses (3-10 μg) with the anesthetic resulted in an increase in the time of sensory and motor block, maintaining hemodynamic stability and some degree of sedation. Studies on the effects of dexmedetomidine introduced into the subarachnoid space, besides scarce do not ensure that the agent does not cause neurological damage. Objective: to evaluate the effects of dexmedetomidine, administered by the intrathecal route in single dose, determines on the spinal cord and meninges of rabbits. Method: twenty young adult female rabbits, weighing 3200-4900 g with 36 spine length and 40 cm were divided by lot into two groups (G ): 0.9% saline G1 , G2 dexmedetomidine (10 μg). After intravenous anesthesia with ketamine and xylazine spinal puncture was performed in S1 - S2 ultrasound guided and injected a random solution. The animals remained in captivity for 21 days under medical observation and were sacrificed by decapitation and removal of the lumbosacral portion of the spinal cord for histologic examination [hematoxylin and eosin (HE)] and immunohistochemistry for glial fibrillary acidic protein (GFAP). Results: no animal showed histological lesions of nerve tissue; however 9 animals showed changes in meninges.
Conclusions: in this experimental model in rabbits dexmedetomidine triggered no histological lesions of nerve tissue, but showed changes in meninges.
Introdução 16
A dexmedetomidina, enantiômero dextrógiro da medetomidina, é um
agonista 2 adrenérgico super-seletivo, apresentando relaçã de seletividade entre os
receptores 2: 1 de 1600:1. Apresenta importantes ações sedativa e analgésica podendo
reduzir em até 95% a concentração alveolar ḿnima (CAM) do halotano, resultados
observados em estudo experimental1. O efeito sedativo, mesmo em doses elevadas, ño
é acompanhado de depressão respiratóri , sendo que o fármaco também possibilita que
os pacientes sejam facilmente despertados, permanecendo cooperativos promovendo
analgesia e sedação no peŕodo ṕs-operat́rio e na unidade de tratamento intensivo2.
Os 2-agonistas foram sintetizados no ińcio da década de 60 e utilizados,
inicialmente, como descongestionantes nasais e, posteriormente, como agentes
anti-hipertensivos3. Pesquisas subsequentes mostraram que esse grupo farmacológico
apresentava ação ansiolítica e a simpaticolítica4 podendo ser empregado com o objetivo
de reduzir o consumo de anestésicos e opioides e diminuindo o risco de eventos
cardiovasculares adversos no período perioperatório5,6.
Com o desenvolvimento de agentes com maior especificidade pelos
receptores 2-adrenérgicos, como a dexmedetomidina, que por apresentarem ação mais
intensa sobre a vigí ia, proporcionar bom controle hemodinâmico desencadeado pelo
estresse e produzir, por si só, anestesia7, tornaram-se nova opção de fármaco utilizado
em Anestesiologia7,8.
A dexmedetomidina é empregada como medicaç̃o pré-anestésica ou
associada ̀ anestesia pelas vias intravenosa9,10, muscular9, peridural11 ou
subaracnoidea12 .
Os efeitos antinoceptivos dos agonistas α213 são decorrentes de ação nos
promovem antinocicepção local efetiva no interior do sistema nervoso central após
serem administrados pelas vias peridural e subaracnoidea, com efeitos colaterais
mínimos14.
Está descrito que a dexmedetomidina injetada no espaço peridural é cinco
vezes mais efetiva em produzir efeitos antinociceptivos do que aqueles produzidos após
administração sistêmica15.
Quando introduzida no espaço peridural de seres humanos a
dexmedetomidina não desencadeou lesões neurológicas16. Pela via subaracnoidea a
associação de pequenas doses do fármaco (3-10 g) com o anestésico resultou em
aumento no tempo dos bloqueios sensitivo e motor17,18, com manutenção da estabilidade
hemodinâmica e algum grau de sedação19.
O mecanismo de ação pelo qual a administração subaracnoidea de agonistas
α2 adrenérgicos prolonga o bloqueio sensitivo e motor dos anestésicos locais não é
conhecido. O anestésico local atua nos canais de sódio enquanto os agonistas α2 atuam
pela ligação nas fibras C pré-sinápticas e nos neurônios pós-sinápticos do corno dorsal.
As ações analgésicas deste grupo de fármacos poderia ser decorrente da depressão da
liberação de neurotransmissores da fibra C e da hiperpolarização dos neurônios do
corno dorsal da medula20. Como os mecanismos de ação dos anestésicos locais e α2
agonistas são diferentes, quando ambos são utilizados em associação podem apresentar
efeitos aditivos ou sinérgicos21.
Em ratos, o emprego da dexmedetomidina pela via subaracnóideamostrou
efeitos antinociceptivos importantes17,18. Em ovelhas, nas quais foram administradas
Introdução 18
ou sinais de comprometimento neurológico após a observação clínica que durou período
de 7 dias 22.
Os estudos sobre os efeitos da dexmedetomidina introduzida no espaço
subaracnoideo, além de escassos, não asseguram que o agente não causa lesões
neurológicas. E, quando o fármaco foi administrado pela via peridural, por meio de
cateter, em coelhos, associado ou não ao anestésico local, foram observadas lesões
histológicas compatíveis com toxicidade do tecido nervoso, tanto no grupo que recebeu
apenas anestésico local quanto naqueles que receberam a dexmedetomidina14.
Quando se propõ estudar neurotoxicidade, a seleção da espécie animal
deve ser realizada com cuidado, especialmente se os resultados obtidos ser̃o
extrapolados para os seres humanos23. Por exemplo, no rato o espaço subaracnoideo
possui tamanho limitado, o que provoca menores diluições e misturas dos fármacos no
líquor, favorecendo o maior contato da substância estudada com o tecido nervoso,
podendo induzir resultados superestimados. Já o c̃o, cujo espaço subaracnoideo é
comparável ao dos seres humanos, é uma boa espécie para estudar neurotoxicidade24.
Coelhos são utilizados para o estudo de neurotoxicidade desde meados do
século passado. Diversos autores pesquisaram, nesta espécie, os efeitos de anestésicos
locais25-26, dos benzodiazepín cos27,28, de anticolinesterásicos28, de antagonistas do
receptor N-metil-D-apartato29,30, dentre outras soluçõ s31.
Na grande maioria destas pesquisas, a solução foi introduzida no espaço
subaracnoideo por meio de cateter implantado de forma crônica23-26,28-31 e, em alguns
estudos, foram observadas, nos animais do grupo controle, células inflamatóri s nas
alterações neuroimunes que se manifestaram pelo aumento de marcadores gliais e pela
expressão d citocinas específi as32 .
A presença de um cateter no espaço subaracnoideo e o tempo de
implantação do mesmo podem comprometer a administração do fármaco e as respostas
desencadeadas pelo agente estudado33,34. Somando-se a isto, a cateterizaç̃o crônica do
espaço subaracnoideo e do peridural produz alteraçõ s histoĺgicas no tecido nervoso
medular, em torno do cateter35,36. Alguns autores29 afirmaram que estas alterações s̃o
facilmente distinguí eis daquelas determinadas pelos efeitos tó icos das soluçõ s
estudadas e que a técnica de injeção subaracnoidea com punção única também induziu
ao edema das raí es nervosas, em macacos37.
Estudos experimentais utilizando a injeção subaracnoidea com punção única
para a introduç̃o subaracnoidea de soluções s̃o aqueles cuja técnica mais se aproxima
Objetivo 20
O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos que a dexmedetomidina,
administrada pela via subaracnoidea, em dose única, determina sobre a medula espinal e
Método 22
3.1 Animais utilizados
Após a aprovação da Comissão de Ética em Experimentação Animal da
Faculdade de Medicina de Botucatu (Protocolo CEEA 918/2012), foram utilizados 20
coelhos adultos jovens, fêmeas, da raça Grupo Genético de Botucatu, com pesos entre
3200 gramas e 4900 gramas e comprimento de coluna entre 36 e 40 cent́metros,
fornecidos pelo Biotério do Campus de Botucatu da Universidade Estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho”.
Na seleção dos animais foram exclúdos aqueles que ño apresentaram
aspecto sadio e que tiveram necessidade de mais de uma punção subaracnoidea.
Os animais foram randomizados em dois grupos experimentais.
3.2 Grupos experimentais
Os animais foram distribuíd s por lista gerada por computador e envelopes
selados em dois grupos experimentais, com 10 animais em cada grupo, submetidos,
inicialmente, ̀ anestesia intravenosa com xilazina e cetamina e, em seguida, ̀ punç̃o
subaracnoidea. Os grupos diferenciaram-se pelo tipo de solução administrada, ou seja:
Grupo 1 (G1) – solução fisioló ica a 0,9%
Grupo 2 (G2) – dexmedetomidina (10 μg)
3.3 Sequência experimental
Em todos os animais foi realizada a sequência experimental que se segue:
Jejum alimentar de 12 horas com livre acesso à água.
Método 24
Anestesia com xilazina e cetamina.
Posicionamento do animal em decúbito ventral em mesa cirúrgica.
Medida do comprimento da medula espinal.
Limpeza local com água e sabão.
Tricotomia.
Limpeza do local com solução salina fisiológica estéril.
Antissepsia com gluconato de clorexidina a 2%.
Colocação de campo estéril.
Palpação e identificação dos espaços intervertebrais.
Punção subaracnoidea sob orientação de ultrassom.
Injeção da solução sorteada.
Retirada do animal da mesa.
Observação clínica até recuperação da anestesia venosa.
Manutenção em cativeiro durante 21 dias sob observação clínica.
Sacrifício do animal.
Remoção da medula espinal em sua porção lombar e sacral.
Fixação da peça anatômica.
3.4 T́cnicas utilizadas
3.4.1 Preparo do animal
Após período de jejum de 12 horas com livre acesso à água, os animais foram
pesados e anestesiados com injeção intravenosa de cloridrato de xilazina, na dose de 3
mg.kg-1 de peso corporal, e cloridrato de cetamina, na dose de 10 mg.kg-1 de peso
corporal.
Após a anestesia venosa, os animais foram posicionados em decúbito ventral
sobre a mesa cirúrgica e obtido o comprimento da medula espinal, medida pela
distância entre a base do crânio e o espaço lombossacral25.
Foi realizada a limpeza da pele e pêlos da região da coluna vertebral com água
e sabão seguida de tricotomia em área de 10 cm ao redor do local onde foi realizada a
punção, correspondente ao espaço intervertebral S1 – S2. Esta região foi lavada com
solução fisiológica a 0,9% e, após a antissepsia com solução tópica de gluconato de
clorexidina a 2%, foram colocados os campos estéreis.
3.5 Punção subaracnoidea
3.5.1 T́cnica de punção
No coelho o espaço mais caudal que permite a abordagem do espaço
subaracnoideo se encontra entre as vértebras S1 e S2. Para a identificação deste espaço
e a determinação do local da punção subaracnóidea, palpam-se as cristas ilíacas e se
Método 26
a 2 cm em direção caudal. O espaço S1-S2 se localiza 1 cm caudal ao processo
espinhoso da primeira vértebra sacral25.
O bloqueio subaracnoideo foi guiado com auxí io da ultrassonografia,
utilizando o aparelho da marca SonoSite (USA), modelo M-turbo, que possui o recurso
de Doppler tecidual de parede (TDI). Foi utilizado o transdutor micro-linear com
frequência de 6.0 a 13 MHz
A punção subaracnoidea foi realizada com agulha de Quincke de calibre
25G x 50 mm, por acesso mediano, com ângulo de inclinação de aproximadamente 45o.
A agulha foi introduzida lentamente, em direção cefálica, guiada por ultrassom, até
penetrar o espaço subaracnoideo.
Apó a identificação do espaço, os animais de G1 e G2 receberam as
soluções correspondentes. Foram registradas as dificuldades na realização da punção.
3.5.2 Volume injetado
Foram administrados 5 μL por cent́metro de medula espinal (0,2 mL)25,
injetados em 1 segundo, em seringa de 1 mL, descartável.
3.5.3 Solução administrada
A soluç̃o fisioló ica 0,9% (Grupo 1) foi sintetizada pela indústria
farmacêutica Hipolabor e o cloridrato de dexmedetomidina (Precedex®) sem
conservante em 10 g (Grupo 2) sintetizada pela indústria farmacêutica Abbott, foram
3.6 Observação cĺnica
Após a punção subaracnoidea ou a injeção da solução sorteada, os animais
foram retirados da mesa cirúrgica e, quando recuperados da anestesia intravenosa,
foram avaliados clinicamente quanto à motricidade e à sensibilidade dolorosa. A
motricidade foi avaliada pela observação clínica, baseado no critério estabelecido por
Drummond e Moore38,ou seja: 0 - movimento livre das extremidades inferiores; 1 -
assimetria e limitação para sustentar o corpo e para deambular por alteração nas
extremidades inferiores; 2 - inabilidade para sustentar o corpo pelas extremidades
inferiores; 3 - paralisia das extremidades inferiores. Na sequência, foi avaliada a
sensibilidade dolorosa por meio de preensão nas extremidades inferiores e superiores,
bem como da pele nas regiões dos dermátomos sacrais, lombares, torácicos e na orelha,
com auxílio de pinça dente de rato.
Os animais permaneceram em cativeiro durante 21 dias, sob observação
clínica. Foram verificadas as alterações de motricidade baseadas no critério de
Drummond e Moore38. A sensibilidade dolorosa foi avaliada pela observação dos
seguintes sinais indicativos de dor: retração da pata, mudança de postura e gemência
após a aplicação dos estímulos dolorosos descritos acima.
3.7 Sacrifício
O sacrif́cio foi realizado por decapitação, após anestesia prévia com
xilazina e cetamina pela via intravenosa. A porç̃o lombar e sacral da medula espinal e
as raí es da cauda equina foram retiradas em tempo inferior a três minutos, para
Método 28
medular, as raí es e as meninges foram fixadas em soluç̃o de formalina a 10% para
posterior exame histoló ico e imuno-histoquímico.
3.8 Exame histoĺgico
As peças anatômicas permaneceram, durante sete dias, em soluç̃o de
formalina. Os cortes transversais do tecido nervoso e das meninges se iniciaram,
aproximadamente, dez cent́metros acima do local onde foi realizada a punç̃o
subaracnoidea, estendendo-se até o final da cauda equina, em intervalos de meio
cent́metro. Os cortes dos tecidos foram colocados em blocos de parafina e corados pelo
método de hematoxilina-eosina (HE) e de imuno-histoquímica pelo marcador glial -
proteína cida glial fibrilar (GFAP)42-45.
3.8.1 Técnica imuno-histoquímica para GFAP
A realização da técnica de imuno-histoquímica para GFAP as amostras
incluídas em parafina foram seccionadas na espessura de três micra em micrótomo
rotativo e estendidas em lâminas histológicas de vidro previamente tratadas com
organo-silano. Depois de permanecerem por 18 horas em estufa a 58oC, os cortes
passaram pelo processo de desparafinização em três cubas com xilol no tempo de cinco
minutos em cada cuba, então por quatro cubas de etanol absoluto e também por cinco
minutos em cada uma delas, hidratação em água corrente e destilada.
A próxima etapa realizada foi o bloqueio da peroxidase endógena por meio
da incubação em solução de peróxido de hidrogênio a 3% por 10 minutos em
foram submetidos à recuperação antigênica pelo calor em panela pressurizada Pascal
(Dako) por três minutos em temperatura de 117oC em solução Trilogy (Cell Marque).
Seguindo-se a lavagem em água corrente e água destilada, as lâminas foram
transferidas para bandejas especiais para imuno-histoquimica, sendo os cortes cobertos
por PBS (solução salina tamponada pH 7.2 – 7.4) e depois de retirado o excesso desta
solução, receberam o anticorpo primário GFAP, clone 6F2 (Dako) previamente diluído
a 1:400, permanecendo assim incubado por 30 minutos em temperatura ambiente. Os
anticorpos primários foram retirados por meio de lavagem em PBS e incubados com o
anticorpo secundário e o terciário Hidef Polímero (Cell Marque) durante 10 minutos,
cada uma das incubações, em temperatura ambiente.
Os cortes novamente lavados em PBS foram revelados pelo cromógeno
3,3-diaminobenzidina (Cell Marque) e, após a revelação, foram lavados em água corrente e
contra corados em hematoxilina segundo Harris (MERCK) por um minuto. Os cortes
então passaram pelo processo de desidratação em quatro cubas com etanol absoluto e
diafanização em três cubas com xilol. Por fim as lâminas foram montadas com
lamínulas 24x32 (KNITTEL) por meio de resina sintética Permount (FISHER – SP
15-500) e lidas em microscópio óptico.
O exame histológico das lâminas foi realizado pela microscopia óptica. Os
resultados obtidos pela análise dos cortes do tecido nervoso e das meninges corados
pelo HE foram classificados como normais, quando não apresentaram alterações, ou
lesados, determinando-se os achados observados, de acordo com os seguintes critérios:
Tipo de lesão
1 - aracnoidite
Método 30
3 - lesão nervosa
Localização da lesão
1 - região posterior (P)
2 - região lateral (L)
3 - região anterior (A)
4 - P+L
5 - L+A
6 - P+L+A
Extensão da lesão
1 - <10%
2 - 10% - 50%
3 - >50%;
Profundidade da lesão
1 - substância branca
2 - substância cinzenta
3 - substâncias branca e cinzenta
Vaso sanguíneo
1 - normal
2 - espessamento fibroso
3 - trombose
Na presença de aracnoidite adesiva:
Aderência
0 - ausente
2 - A+pia máter (P)
3 - D+A+P
Espessamento de meninge
0 - ausente
1 - leve
2 - moderado
3 - intenso
Infiltrado linfoplasmocitário
0 - ausente
1 - leve
2 - moderado
3 - intenso
Fibrose
0 - ausente
1 - leve
2 - moderada
3 - intensa
Na presença de lesão de nervo
1 - vacuolização
2 - infiltrado linfoplasmocitário
3 - macrófagos
A avaliação dos resultados histológicos foi encoberta, realizada por três
Método 32
Organograma da avaliação histológica
Para análise aprofundada da celularidade medular foi estimada a
porcentagem de células a partir da avaliação da área imuno-histologicamente marcada
pelo GFAP nos cornos dorsais e ventrais da medula (Figura 1). Para tanto os cortes
histológicos corados pelo GFAP, após serem fotografados em resolução 1090 x 650 tipo
JPG, 96 dpi, 24 bits de cor, captada em microscópio Pannoramic MIDI 3DHISTECH,
sob objetiva 200x foram submetidos ao processamento digital segundo algoritmo abaixo
(Quadro 1), empregando o software Image J 1.46 e o plugin “Color Deconvolution”. Lesão
meníngea
localização vasos
sanguíneos
características celularidade
aderência espessamento
fibrose
infiltrado inflamatório
localização vasos profundidade características
Figura 1 - Segmento da região posterior da medula espinal. GFAP 40x. Exemplo de área utilizada para estimar o percentual de células marcadas.
Quadro 1 - Algoritmo de processamento das imagens para quantificação imuno-histoquímica
macro [1]" {
run("Colour Deconvolution", "vectors=[H&E DAB]"); }
macro [2]" { run("Crop");
run("Enhance Contrast", "saturated=0.5"); run("Make Binary");
run("Measure"); run("Open Next"); }
Método 34
As imagens foram, inicialmente, separadas por seus vetores componentes da
hematoxilina e DAB pelo plugin “Color deconvolution” (H-DAB). Após isso, foi
selecionada uma área retangular do tecido e realizado o aumento do contraste, de forma
padronizada, para a binarização da imagem.
Foi avaliado o percentual da área da imagem binarizada equivalente aos
pixels do tecido marcado pelo DAB (Figura 2), e comparadas as amostras entre os
grupos39-41.
A
B
Figura 2 - A. Área selecionada do tecido neural. B. Área binarizada após o processamento da imagem, resultando em 45% do tecido marcado.
3.9 Comiss̃o de ́tica em Experimentaç̃o em Animal
A presente pesquisa foi aprovada pela Comissão de Étic em
Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Botucatu (protocolo CEEA
3.10 Modelo de estudo
Este estudo foi controlado e randomizado. A análise histoló ica dos
resultados foi encoberta.
Os grupos foram randomizados a partir de lista gerada por computador e por
envelopes selados. A preparação das soluçõ s administradas nos animais de G1 e G2foi
realizada por pesquisador não envolvido diretamente na realização da técnica.
3.11 Ḿtodo estat́stico
Tendo como objetivo avaliar a homogeneidade dos grupos com relação ao
peso, ao comprimento da medula espinal e ao volume da solução administrada no
espaço subaracnoideo, foi realizado, como método estatístico, o teste t de Student
(resultados expressos em média e desvio padrão), e para comparar os resultados dos
percentuais das marcações histológicas das células pelo método do GFAP o teste não
paramétrico de Mann-Whitney (resultados apresentados em mediana e 1º e 3º quartis)
sendo considerados significativos os valores de p < 0,05.
Pressupondo-se uma estimativa de taxa de lesão do tecido nervoso de 70% e
de taxa induzida de 1%54 para a soluç̃o fisioló ica, para um valor α de significância de
5% (limite para detecção de erro tipo I) e um poder de 95%, foram necessários oito
Resultados 36
Os dois grupos foram homogêneos quanto ao peso (p=0,28) e ao
comprimento da medula espinal (p=0,23) (Tabela 1).
Não houve dificuldade na identificação e na abordagem do espaço
subaracnoideo em nenhum animal.
Todos os animais permaneceram clinicamente normais durante o período de
cativeiro.
Não foram encontradas alterações histológicas no tecido nervoso e nas
meninges dos animais pertencentes ao G1 (Figuras 3 e 4).
Em nove coelhos do G2 foram encontradas alterações histológicas nas
meninges, em áreas focais (inferiores a 5%). Não houve alterações histológicas no
tecido nervoso (Tabela 2; Figuras 5, 6, 7, 8, 9 e 10).
Não houve diferença estatisticamente significativa entre grupos quanto à
quantificação do marcador imuno-histoquímico (p=0,05) (GFAP). O box-plot da média
e desvio padrão dos valores de marcação do GFAP estão representados na figura 11.
Tabela 1 – Peso (g) e comprimento de medula espinal (cm). Valores expressos em média ± devio padrão (dp).
G1 G2 ESTATÍSTICA
Peso (g) 4,1 ± 0,44 4,3 ± 0,37 p = 0,28
C medula (cm) 39,2 ± 1,4 39,8 ± 0,37 p = 0,23
Resultados 38
Tabela 2 - Resultados histológicos do tecido nervoso e das meninges dos animais pertencentes ao G2. (Porcentagem do campo histológico comprometido)
C T N MENINGES
1 normal infiltrado inflamatório linfoplasmocitário perivascular focal na pia-máter e aracnóide (<%5),
2 normal infiltrado inflamatório linfoplasmocitário perivascular focal na pia-máter e aracnóide (<%5)
3 normal normal
4 normal aracnoide com espessamento discreto aderida à dura-máter (<%5)
5 normal áreas focais de infiltrado inflamatóriolinfoplasmocitário com adesão da pia-máter na aracnoide (<%5)
6 normal discreto infiltrado inflamatório linfoplasmocitário da pia-máter e aracnoide com áreas focais de adesão (<%5)
7 normal infiltrado inflamatório linfoplasmocitário perivascular com áreas de espessamento da pia-máter e aracnoide (<5%)
8 normal infiltrado inflamatório linfoplasmocitário perivascular focal na pia-máter e aracnoide (<%5)
9 normal infiltrado inflamatório linfoplasmocitário perivascular focal na pia-máter e aracnoide (<%5)
10 normal infiltrado inflamatório linfoplasmocitário perivascular focal na pia-máter e aracnoide (<%5)
Figura 3- Tecido nervoso (A), vasos sanguíneos (B) e meninges (C) normais de animal do G1 (C5). H&E 2.
Figura 4 - Tecido nervoso (A), vasos sanguíneos (B) e meninges (C) normais de animal do G1 (C5). H&E 10.
A
B
C
A
B
B
C
Resultados 40
Figura 5 - Tecido nervoso normal (A), vasos sanguíenos normais (B) e discreto infiltrado inflamatório linfoplasmocitário entre na pia-máter e aracnoide com áreas focais de adesão (C) de animal do G2 (C6). H&E 3,5.
Figura 6 - Tecido nervoso normal (A) e discreto infiltrado inflamatório linfoplasmocitário entre na pia-máter e aracnoide com áreas focais de adesão (B) de animal do G2 (C6). H&E 18.
C
B
A
C
B
B
Figura 7- Tecido nervoso normal (A) e discreto infiltrado inflamatório linfoplasmocitário entre na pia-máter e aracnoide com áreas focais de adesão (B) de animal do G2 (C6). H&E 30.
Figura 8- Tecido nervoso normal (A), infiltrado linfoplasmocitário perivascular com áreas de espessamento da pia-mater e da aracnoide (B e C) de animal do G2 (C7). H&E 6.
B
B
A
A
B
C
Resultados 42
Figura 9- Tecido nervoso normal (A), infiltrado linfoplasmocitário perivascular com áreas de espessamento da pia-mater e da aracnoide (B e C) de animal do G2 (C7). H&E 20.
Figura 10- Tecido nervoso normal (A), infiltrado linfoplasmocitário perivascular com áreas de espessamento da pia-mater e da aracnoide (B e C) de animal do G2 (C7). H&E 40.
B
C
C
C
C
A
C
C
B
Discussão 44
5.1 Discussão da metodologia
5.1.1 Ultrassonografia como guia de punção
Em modelos experimentais com objetivo de estudar alterações que soluções
introduzidas no espaço subaracnóideo determinam sobre o tecido nervoso e as meninges
é importante excluir a possibilidade de a punção subaracnoidea ser o fator determinante
de lesões. Citam-se como exemplo lesões consequentes ao trauma desencadeado pela
agulha utilizada na punção e administração de soluções no interior da raiz nervosa.
Em duas pesquisas realizadas em coelhos25,43, nos quais os fármacos foram
administrados no espaço subaracnoideo com punção única, não foram observadas, à
microscopia óptica, alterações histológicas do tecido nervoso medular da maioria dos
animais que receberam solução fisiológica (doze coelhos). Em apenas um deles foi
constatada laceração intensa da medula espinhal no local da punção43, que foi realizada
entre a última vértebra lombar e a primeira vértebra sacral.
Ready et al25 descreveram que, no coelho, o espaço subaracnoideo pode ser
abordado entre a primeira e a segunda vértebras sacrais, pela via paramediana, e que o
volume do líquor é pequeno e não refluiu através do canhão da agulha. Para diminuir a
manipulação da agulha e a possibilidade de trauma do tecido nervoso desencadeado
pela punção, o espaço subaracnoideo foi identificado com auxílio de estimulador de
nervo periférico.
Estudo anatômico do sistema nervoso central do coelho (Orictolagus
cuniculus) mostra que o comprimento do cone medular pode estender-se da segunda à
Discussão 46
Quando se pretende estudar neurotoxicidade em animais vivos, a
identificação e o posicionamento corretos da agulha, no espaço subaracnoideo, são
fundamentais para que haja confiabilidade nos resultados obtidos. Tal fato exclui a
possibilidade de que o trauma do tecido nervoso, a lesão dos vasos sanguíneos e a
injeção intraneural da solução sejam os responsáveis pela agressão ao tecido nervoso.
A utilização do ultrassom em anestesia regional facilitou a realização da
técnica anestésica, permitindo a melhor visibilidade das estruturas a serem abordadas
(nervos), assim como das adjacentes (vasos sanguíneos, pulmão, pleura). Possibilitou o
posicionamento adequado da agulha, evitando-se lesão de nervo e injeção intravascular
de anestésico local, alem de possibilitar a observação da área de dispersão da solução
injetada45.
Assim sendo, na presente pesquisa, a utilização do ultrassom como guia de
punção permitiu a visibilização do espaço subaracnoideo e a dispersão da solução
administrada no interior deste espaço, mostrando que técnica para a realização da
punção não foi o fator que determinaria possíveis alterações no tecido nervoso da
medula e nas meninges.
5.1.2 Grupos experimentais
O grupo 1, que recebeu a solução salina por via subaracnoidea, teve por
finalidade estudar os efeitos que o volume de solução administrada determinaria sobre o
tecido nervoso.
Como o espaço subaracnoideo do coelho, no local onde foi realizada a
punção, que é o mais caudal que permite a passagem da agulha, é pequeno, visto que
não fosse o fator desencadeador de lesões nervosas. Alguns autores aventaram a
hipótese de que aumentos agudos no volume do líquor poderiam levar ao aumento na
pressão liquórica, comprometer o fluxo sanguíneo medular e causar isquemia medular
com o surgimento de lesões neurológicas46. Somando-se ao que já foi descrito, este
grupo serviu, também, para excluir eventual injeção intraneural da solução. Está
descrito, na literatura, que a injeção de solução salina, em volume de 0,05 mL, no
interior dos fascículos de nervos periféricos de coelhos foi suficiente para degenerar os
axônios47,48.
Já o grupo 2, que recebeu a dexmedetomidina, teve por objetivo avaliar os
efeitos que o fármaco determinaria sobre o tecido nervoso.
5.1.3 G F A P
A ativação glial é muito estudada em decorrência de seu papel na lesão e
reparação do sistema nervoso central (SNC). Há muito se reconhece que a resposta
microglial a quase todas as formas de lesão do SNC pode ser considerada como um dos
primeiros indicadores da doença latente. A ativação microglial envolve um padrão
estereotipado de respostas celulares que incluem proliferação, recrutamento no local da
lesão e aumento da expressão de imunomoléculas49. Os astrócitos estão entre as
primeiras células que respondem à lesão do SNC. A hipertrofia e, em menor extensão, a
proliferação de astrócitos são as primeiras respostas observadas. Os astrócitos
aumentam de tamanho porque contêm grandes quantidades de organelas citoplasmáticas
Discussão 48
Existem evidências de que a microglia pode contribuir diretamente para ou
exacerbar a degeneração neuronal51,52. Assim sendo, a dosagem do GFAP serviu de
marcador precoce da lesão neural32.
5.1.4 Tempo de observação clínica no cativeiro
O tempo de observação clínica prolongada (21 dias) teve por objetivo
avaliar os efeitos tardios que a dexmedetomida poderia desencadear também sobre as
meninges, visto que resultados de pesquisas anteriores, realizadas em cães,
demonstraram que, quando o fármaco agride primariamente o tecido nervoso, as
alterações clínicas e histológicas são detectadas imediatamente após a administração do
agente42,53,54 porém, para detecção de lesões nas meninges, é necessário tempo maior
para que a inflamação e a aderência entre as meninges ocorram55-57.
5.1.5 Dexmedetomidina
A dexmedetomidina, agonista superseletivo dos receptores adrenérgicos α2,
possui efeitos sedativos e analgésicos2,58. Seus efeitos analgésicos são obtidos pela
ativação dos receptores α-2A do corno dorsal da medula4,19,59. Os neurônios da
superfície do corno dorsal da medula, especialmente de lâmina II (substância
gelatinosa), apresentam papel importante na modulação da transmissão nociceptiva
porque recebem fibras aferentes primárias mielinizadas Aδ e amieĺnicas C que
carregam informações nociceptivas da periferia para o sistema nervoso central60.
A administração subaracnoidea de dexmedetomidina inibe as respostas
evocadas pelas fibras C e lentifica o potencial de ação das raízes ventrais dos neurônios
do corno dorsal da medula61. O fármaco exerce antinocicepção espinal pela liberação de
aumenta os níveis de noradrenalina no liquor e induz a liberação de acetilcolina e óxido
nítrico62,63.
Estudo “in vitro” utilizando a substância gelatinosa dos neurônios da
medula espinal de ratos mostrou que a dexmedetomidina hiperpolariza o potencial de
ação dos neurônios do corno dorsal por meio da ativação dos canais de potássio
mediados pela proteína G nos receptores adrenérgicos64.
Em modelos experimentais de isquemia cerebral65,66 o fármaco apresentou
efeitos neuroprotetores mediados pela ativação de subtipos dos receptores α266. Em
decorrência destes efeitos especulou-se que a utilização da dexmedetomidina pelas vias
peridural e subaracnoidea poderia ser segura, desprovida de efeitos deletérios sobre o
tecido nervoso.
Quando administrada pela via subaracnoidea em animais a
dexmedetomidina mostrou ser agente antinociceptivo potente67. Por ser altamente
lipofílica liga-se mais eficientemente aos neurônios do corno da medula espinal22. A
lipofilicidade está relacionada à potência dos fármacos administrados no espaço
subaracnoideo e a potência à toxicidade22.
O fármaco (Precedex®) é sintetizado como solução isotônica, límpida, com
pH entre 4,5 e 7,0. Cada mililitro do Precedex® contém 118 µg de cloridrato de
dexmedetomidina (equivalente a 100 μg de dexmedetomidina) e 9 mg de cloreto de
sódio em água. A solução é livre de preservativos e não contém aditivos ou
estabilizantes químicos14.
E, embora dexmedetomidina esteja sendo utilizada como adjuvante do
anestésico local na anestesia subaracnoidea17-19, a sua apresentação farmacológica não
Discussão 50
5.2 Discussão dos resultados
Estudos experimentais abordaram os efeitos antinociceptivos da
dexmedetomidina, contudo pouco foi publicado sobre os efeitos sobre o tecido nervoso
e as meninges14. Konakci et al.14 estudaram os efeitos da administração peridural da
dexmedetomidina associada ou não à lidocaína em coelhos e observaram lesões
isquêmicas e edema leve e difuso da substância branca com ambas as drogas assim
como naqueles em que houve a associação entre elas, porém a desmielinização de
oligodendrócitos foi, somente, observada nos animais tratados com a dexmedetomidina.
Já Hou et al.68 investigaram os efeitos de diferentes doses de
dexmedetomidina introduzidas no espaço subaracnoideo de ratos e observou que
somente em doses elevadas (3 µg.kg-1) houve sinais de lesão neural, avaliada pelo
aumento na expressão de C Fos no corno dorsal, cujo aumento indica lesão da medula
espinal63.
Na presente pesquisa, na qual utilizamos a dose de 10 µg pela via
subaracnoidea, dose que promove efeito antinociceptivo intenso e prolongado67, pode-se
observar lesões inflamatórias focais da aracnoide e da pia máter com áreas de adesão
entre elas, alterações ausentes no grupo controle mostrando que de alguma forma o
fármaco comprometeu as meninges.
As alterações encontradas nas meninges são semelhantes às da fase inicial
da aracnoidite adesiva, ou seja, reação inflamatória da pia e aracnoide associado ao
edema e à hiperemia das raízes nervosas. Mais tardiamente as faixas de colágeno
começam a se formar entre a pia máter, a aracnoide e as raízes nervosas, culminando
com a aderência entre estas estruturas. Nesta fase o edema das raízes começa a
Muitas são as possíveis causas de aracnoidite adesiva, dentre elas a presença
de preservativos na solução, porém o fármaco utilizado na presente pesquisa
(Precedex®) não possui preservativos. Desta forma parece ser a dexmedetomidina o
fator desencadeante das lesões.
Na presente pesquisa não foram encontradas alterações histológicas do
tecido nervoso da medula e das raízes pelo método H&E, e também não houve aumento
do marcador glial (GFAP) nos animais do grupo tratados com dexmedetomidina. Este
fato vem demonstrar que o foco inicial de agressão não foi o tecido nervoso, mas sim
nas meninges.
Entretanto, outros estudos experimentais em outras espécies e doses devem
ser realizados para melhor elucidar os efeitos do fármaco quando administrado no
Conclusão 52
Neste modelo experimental, a dexmedetomidina administrada no espaço
subaracnóideo, em dose única, desencadeou alterações histológicas em meninges, mas
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