Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo para obtenção do Título de Doutor em Ciências
Bortolini, Maria Augusta Tezelli
Expressão de genes e de proteínas envolvidos na biossíntese da matriz extracelular no tecido vaginal de mulheres com e sem prolapso de órgãos pélvicos. / Maria Augusta Tezelli Bortolini – São Paulo, 2011.
xiv, 82f.
Tese (Doutorado): Universidade Federal de São Paulo 8 Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós8Graduação do Departamento de Ginecologia.
Título em inglês: Expression of genes and proteins related to the extracellular matrix biogenesis in vaginal tissue of women with and without pelvic organ prolapse.
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Prof. Dr. Afonso Celso Pinto Nazário
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“A ciência sem a religião é coxa, a religião sem a ciência é cega.” / $ 0 Em alguns momentos, temos a certeza de que há por trás uma força superior que transcende os limites explicáveis pela ciência...
Este trabalho é fruto do empenho de um time de profissionais que contribuíram direta ou indiretamente para a sua realização. Deixo aqui registrados o meu sincero apreço e agradecimento.
Ao Prof. Dr. Manoel João Batista Castello Girão, Titular do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo, pela confiança em mim depositada e oportunidade de desenvolver este projeto. Pela ajuda na viabilização dos recursos necessários para que o programa de doutorado8 sanduíche em colaboração com a Universidade de Toronto pudesse ser concretizado. Pela sabedoria constantemente transmitida.
Ao Prof. Dr. Rodrigo de Aquino Castro, Chefe do Setor de Uroginecologia e Cirurgia Vaginal, Universidade Federal de São Paulo, pelo apoio amigo e sincero em todas as etapas deste projeto. Rodrigo, eu sou grata por ter podido compartilhar as dificuldades e as alegrias nos diversos momentos. Obrigada por ser um grande incentivador e, principalmente, por valorizar...
Ao Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva, pela experiência e ajuda na elaboração do projeto inicial que culminou com a bolsa de estudos para o programa de doutorado com estágio no exterior.
À Profa. Dra. Marair Gracio Ferreira Sartori pelo exemplo de mulher e pela ajuda na fase final de elaboração desta tese.
vi
À Prof. Dra. May Alarab, pelo pioneirismo em pesquisas envolvendo Biologia Molecular aplicada ao estudo de afecções uroginecológicas no Hospital Mount Sinai, Universidade de Toronto, CA, propiciando a minha inserção neste contexto. Obrigada pelo apoio e orientações.
À Dra. Oksana Shynlova, brilhante cientista e gerente do laboratório no Instituto de Pesquisas Samuel Lunenfeld, Hospital Mount Sinai, Toronto, CA. Agradeço pelo seu envolvimento neste projeto, pela didática na transmissão de seus profundos conhecimentos técnico8científicos, pelo exemplo de profissionalismo e ética. Divido com você todos os méritos na execução deste trabalho e as conquistas que com ele vieram. Obrigada pelo prazer de sua amizade e convivência.
Ao Prof. Dr. Stephen Lye, chefe do laboratório no Instituto de Pesquisas Samuel Lunenfeld, Hospital Mount Sinai, Toronto, CA. Agradeço a oportunidade de trabalhar com uma ótima infra8estrutura e uma excelente equipe. Agradeço pela oportunidade de aprender com você. Obrigada pelo apoio, gentileza e humildade sempre.
Aos colegas e funcionários da Divisão de Uroginecologia e Cirurgia Pélvica Reconstrutora do Hospital Mount Sinai pelo convívio, amizade e ajuda na coleta das biópsias, especialmente Dr. Danny Lovatsis, Dr. Victor Miranda, Dr. Danny Kreichmann, Dr. Carolyn Best, Dr. Rodrigo Pineda e Carmen de Vera.
Aos colegas de laboratório do Instituto de Pesquisas Samuel Lunenfeld, Hospital Mount Sinai, pelas trocas de experiência e pelo aprendizado adquirido do convívio diário com todos vocês. Agradeço especialmente a Caroline Dunk, Mark Kibschull, Anna Dorogin e Nadiya Oleksiv.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo apoio financeiro e suporte na forma de bolsa de estudos para programa de estágio no exterior.
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Dedicatória... iv
Agradecimentos... v
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Sumário ix Lista de Figuras e Tabelas... xi
Lista de Abreviaturas e Símbolos... xii
Resumo... xiii
5 6 ... 1
5 6 ...
2.1 Prolapso de Órgãos Pélvicos: Epidemia Oculta... 2.2 POP: Fatores de Risco e Etiopatogênese... 2.3 Sustentação e Suporte do Assoalho Pélvico... 2.4 POP: Fisiopatologia... 2.5 Tecido Conjuntivo... 2.5.1 Matriz Extracelular... 2.5.1.1 Colágeno... 2.5.1.2 Elastina... 2.5.1.3 Proteínas de Ligação à Elastina (EBP)... 2.5.1.3.1 Fibrilinas... 2.5.1.3.2 Fibulina85... 2.5.2 Biossíntese do Colágeno e Elastina: Lisil Oxidases... 2.5.3 Biossíntese do Colágeno e LOXs: Pró8colágeno C Proteinase ou Proteína Morfogenética Óssea tipo I... 2.6 O Estudo do Tecido Vaginal em POP... 2.7 Matriz Extracelular e POP... 2.8 Modulação da Matriz Extracelular: Hormônios Ovarianos... 2.9 Racionalidade dos Estudos... 2.10 Hipóteses dos Estudos...
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4.1 Casuística... 4.1.1 Grupo Controle... 4.1.2 Grupo Caso – POP... 4.2 Métodos... 4.2.1 Coleta de Dados Clínicos... 4.2.2 Coleta de Material Biológico... 4.2.3 Processamento e Análise do Material Biológico...
46
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Prolapso de Órgãos Pélvicos Incontinência Urinária de Esforço
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xiii
AO ! C$: O prolapso de órgãos pélvicos (POP) resulta da falha na sustentação do assoalho
pélvico, e anormalidades do tecido conjuntivo podem estar envolvidas na etiologia e/ou na progressão da disfunção. Analisar8se8á a expressão diferencial de genes e de proteínas que participam da biossíntese do colágeno e da elastina: lisil oxidases (LOXs), fibulina85, fibrilinas81 e 82 e pró8colágeno C proteinase (PCP/BMP1), no tecido vaginal de mulheres sem e com POP acentuado consoante seu estado hormonal.
"0/F0! )" B!$#$0: Durante a histerectomia total, biópsias de parede vaginal anterior
foram obtidas de mulheres caucasianas na pré8menopausa (fase proliferativa do ciclo menstrual) e na pós8menopausa com POP acentuado (POPQ estadio III e IV), e de controles assintomáticas (POPQ 0). RNAm e proteínas totais foram extraídos usando Trizol e RIPA
. , e os genes e proteínas de interesse quantificados por RT8PCR em tempo real e Imunobloting, respectivamente. As seguintes análises comparativas foram realizadas: (1) expressão dos genes e das proteínas da família LOX (LOX e LOXL184), fibulina85 e fibrilinas8 1 e 82 em pacientes na pré8menopausa com e sem POP; (2) expressão do gene e da proteína PCP/BMP1 em pacientes na pré8 e pós8menopausa com POP, e respectivos controles. Os testes de D + # 8 e = foram usados para as análises estatísticas (p<0.05).
0/*!"#$0: Obtivemos amostras de 15 pacientes e 11 controles na pré8menopausa para o
estudo (1), e 39 pacientes na pré8menopausa (POP=23 e Controle=16) e 18 na pós8 menopausa (POP=13 e Controle=5) para o estudo (2). A partir das análises, observamos (1) diminuição significativa na expressão dos genes LOX, LOXL1 e LOXL3, bem como nas proteínas LOX e LOXL3 no tecido vaginal de pacientes POP na pré8menopausa comparadas com mulheres assintomáticas (p<0.05); (2) hipoexpressão do gene PCP/BMP1 nos tecidos vaginais de mulheres com POP acentuado comparadas com controles, tanto na pré8 menopausa como na pós8menopausa (ambos p=0.01); redução significativa das isoformas 130kDa, 92,5kDa e 82,5kDa da PCP/BMP1 no tecido vaginal de pacientes na pós8 menopausa (p=0.01), bem como hiperexpressão da isoforma 130kDa nas mulheres com POP acentuado na pré8menopausa (p=0.009), comparadas com as respectivas controles.
$ )*/03$: As expressões das enzimas LOXs e pró8colágeno C proteinase estão alteradas
no tecido vaginal de mulheres com POP, e são moduladas pelo estado hormonal. A alteração na regulação destas enzimas, envolvidas na biossíntese da matriz extracelular, pode contribuir para deficiente síntese do tecido conjuntivo e do suporte vaginal, e estar envolvida no desenvolvimento do POP.
"*"C "0%),"C . 1. Prolapso de Órgãos Pélvicos; 2. Colágeno; 3. Elastina; 4. Lisil
Este trabalho é resultado da parceria estabelecida entre o Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de
Medicina, Brasil, e > 4 4 , 2 < > 4
5 Canada, por meio do Programa de Doutorado com Estágio no Exterior
(PDEE), e - H? = 3 9 . O programa de doutorado8
sanduíche contou com o apoio financeiro, na forma de bolsa para estágio de doutorando no exterior, da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) (processo BEX 0160/0785). O projeto foi financiado pelo
;4 4 , 2 < e > 4
5 .
O estudo das alterações moleculares nos tecidos pélvicos de pacientes com prolapso de órgãos pélvicos fora idealizado pela candidata, sob a orientação do Prof. Dr. Manoel João Batista Castello Girão e colaboração do Prof. Dr. Rodrigo de Aquino Castro, com o título inicial “Expressão diferencial dos genes do metabolismo da elastina na fáscia endopélvica de mulheres com e sem incontinência urinária de esforço e prolapso de órgãos pélvicos”. No entanto, a proposta sofreu adaptações metodológicas de forma a ser possível sua viabilização em acordo com as condições financeiras e normas de ética em
pesquisa preconizadas pelo ? $ . (REB) do , 2
< e > 4 5 Deste modo, o projeto teve aprovação do REB e
desenvolveu8se na instituição estrangeira. As participantes do estudo eram pacientes regulares da clínica de Uroginecologia e da Ginecologia Geral do , 2 < coordenadas pelos Profs. Dr. Harold Paul Drutz e Dr. May Alarab. As análises bioquímicas e moleculares foram realizadas no 2
? 7 , 2 < , coordenados pelo Prof. Dr. Stephen Lye
e Dra. Oksana Shynlova. A etapa final de elaboração e apresentação da tese e preparo dos manuscritos foi realizada na Escola Paulista de Medicina.
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Métodos”, e como “Resultados” e “Discussão", e um (1) artigo de revisão complementando “Considerações Finais e Perspectivas”.
Os manuscritos citados são:
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Os resultados dos estudos foram apresentados em Congressos Científicos Internacionais sendo reconhecidos com duas premiações:
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-Define8se prolapso de órgãos pélvicos (POP) como o descenso de um ou mais compartimentos vaginais (parede anterior, parede posterior, ápice vaginal e/ou útero) (Haylen et al, 2010). A parede vaginal anterior é o segmento da vagina que com maior freqüência se prolapsa, e geralmente inclui a descida da bexiga chamada de cistocele. O prolapso apical pode envolver o útero ou a cúpula vaginal pós8histerectomia, e pode afetar a bexiga, o intestino delgado (enterocele) e/ou colon (sigmoidocele). O prolapso vaginal posterior envolve a parede do reto (retocele), mas pode incluir também o intestino delgado (Jelovsek et al, 2006).
POP raramente resulta em alta morbidade ou mortalidade, mas é causa de ampla sintomatologia afetando significativamente a qualidade de vida das mulheres acometidas (Bump et al, 1998; Jelovsek et al, 2006). Os sintomas podem apresentar8se como queixas de “bola na vagina” ou pressão na região pélvica. Estes comumente estão associados a sintomas urinários tais como urgência, frequência, incontinência ou demais disfunções miccionais; sintomas gastrointestinais variando de dificuldades de esvaziamento à incontinência fecal; queixas sexuais como dispareunia e dificuldade ao coito (Weber et al, 1995; Dietz et al, 2002; Burrows et al, 2004; Kahn et al, 2005; Jelovsek et al, 2007). Ellerkmann et al avaliaram 237 mulheres com POP e observaram que 63% apresentaram sintomas de “bola na vagina”, 73% incontinência urinária, 86% urgência ou aumento de frequência urinárias, 62% disfunção miccional, e 31% incontinência fecal (Ellerkmann et al, 2001). O hímen parece ser um importante ponto de corte para o desenvolvimento dos sintomas (Haylen et al, 2010). Swift et al avaliaram 477 mulheres durante exame ginecológico anual e relataram que o número de sintomas relacionados ao assoalho pélvico aumentou de uma média de 0,5 em pacientes com estadio I para 2,1 nas pacientes com prolapso ultrapassando o nível himenal (Swift et al, 2003; Jelovsek et al, 2007). Em contrapartida, alguns sintomas, especialmente a incontinência urinária de esforço (IUE), são menos prevalentes nos casos de prolapso estendendo8se para além do hímen, possivelmente pela obstrução uretral (Romanzi, 2002; Barber e al, 2003; Barber, 2005).
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grau de descida das paredes vaginais, com estadiamento variando de 0 a IV (Tabela 1).
"A *" .Estadios do suporte pélvico definido pela classificação POPQ.
0!"# $ - 23$
0 Ausência de prolapso
I A parte distal do prolapso está a pelo menos 1 cm acima do nível do hímen
II A parte distal do prolapso está a 1 cm ou menos proximal ou distal do nível himenal III A parte distal do prolapso está a mais de 1 cm abaixo do nível himenal, porém não
protrui mais do que o valor do comprimento vaginal total menos 2 cm IV Eversão completa. A parte distal do prolapso protrui pelo menos o valor do
comprimento vaginal total menos 2 cm além ou abaixo do nível himenal
5 $*"'0$ # +3$0 B*C )$0. ' # ( " )/*!"
Subak et al relataram que o POP afeta quase metade de todas as mulheres acima de 50 anos de idade, com prevalência de 30%850% ao longo de suas vidas (Subak et al, 2001). Estima8se que nos próximos 30 anos, a taxa de mulheres que procurarão tratamento para as disfunções do assoalho pélvico irá dobrar (Luber et al, 2001). Recentemente, um estudo de projeção populacional estimou que o número de mulheres norte8americanas que apresentarão POP aumentará cerca de 46% (de 3,3 para 4,9 milhões de mulheres) até o ano de 2050, acompanhando a taxa de envelhecimento populacional (Wu et al, 2009).
No estudo D V < 7 envolvendo 24.342 mulheres, 41% das
mulheres com idade entre 50879 anos apresentou algum grau de POP, sendo a parede vaginal anterior acometida em 34%, parede vaginal posterior em 19%, e prolapso uterino acometendo 14% desta população (Hendrix et al, 2002). Em estudo multicêntrico envolvendo 1.004 mulheres com idade entre 18883 anos que compareceram para atendimento ginecológico de rotina, 24% apresentavam suporte pélvico normal, enquanto 38% apresentavam POP estadio I, 35% estadio II, e 2% estádio III de prolapso (Swift et al, 2003).
mulheres de todas as faixas etárias (Kesharvarz et al, 2002). A incidência de cirurgia para o prolapso de órgãos pélvicos varia de 1,5 a 4,9 casos por 1.000 mulheres8ano nos EUA (Mant et al, 1997; Olsen et al, 1997; Bump et al, 1998; Brown et al, 2002). Estima8se que mulheres com expectativa de vida normal têm 11%812% de chance de realizaram pelo menos uma operação para correção de prolapso ou incontinência urinária aos 79 anos de idade, com uma taxa de reoperação de 29,2% (Olsen et al, 1997). Mais de 225.000 procedimentos cirúrgicos para tratamento de POP são realizados anualmente nos EUA (22,7 por 10.000 mulheres), com um custo estimado de mais de US$ 1 bilhão (Subak et al, 2001; Brown et al, 2002; Boyles et al, 2003).
Importante estudo econômico europeu mostrou que o número de internações para cirurgias de POP no ano de 2005 foi de 36.854 (0,87 por 1.000 mulheres) na Alemanha, 36.679 (1,14 por 1.000 mulheres) na França, e 28.959 (1,13 por 1.000 mulheres) na Inglaterra. As internações para tratamento cirúrgico do POP representaram 10,4%, 16,7% e 16,9% de todas as internações cirúrgicas para tratamento de doenças do trato genital nas mulheres na Alemanha, França e Inglaterra, respectivamente. Pelo menos 20% das histerectomias foram realizadas em decorrência de prolapso. Os custos para os contribuintes alemães, franceses e ingleses foram de 144.236.557 €, 83.067.825 € e 81.030.907 €, respectivamente (Subramanian et al, 2009).
Frente ao envelhecimento da população, à morbidade inerente ao prolapso de órgãos pélvicos e aos elevados custos do tratamento, pode8se concluir que estamos frente a um importante problema de saúde pública (Swift et al, 2005; Drutz, Alarab, 2006; Wu et al, 2009).
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tumores, tosse ou esforço crônicos), cirurgia pélvica, lesões ou doenças medulares, menopausa, envelhecimento, doenças genéticas, doenças do tecido conjuntivo, etnia e história familiar (Mant et al, 1997; Chiaffarino et al, 1999; Rinne et al, 1999; Moalli et al, 2003; Fornell et al, 2004; Nygaard et al, 2004; Schaffer et al, 2005; Lukacz et al, 2006). No entanto, é provável que a disfunção seja de causa multifatorial atribuível à combinação destes fatores, e variando de paciente para paciente (Schaffer et al, 2005). O parto vaginal, o avanço da idade e o aumento do índice de massa corporal são os fatores de risco mais consistentes, sendo o parto vaginal considerado o fator de risco mais importante e frequentemente associado ao POP (Mant et al, 1997; Bump et al, 1998; Hendrix et al, 2002; Schaffer et al, 2005) (Tabela 2).
O parto cesareana parece proteger parcialmente contra o desenvolvimento do prolapso, enquanto os riscos são aumentados com o uso de fórceps (Sze et al, 2002; Schaffer et al, 2005; Lukacz et al, 2006; Bortolini et al, 2010). O'Boyle et al observaram que a gravidez por si só associou8se ao aumento da incidência de POP em mulheres nulíparas em comparação com mulheres não8grávidas (O'Boyle et al, 2002). Apesar da forte relação entre fatores obstétricos e POP, na maioria dos casos os sintomas surgem um longo tempo após o parto vaginal, e a maioria das mulheres que têm filhos não desenvolvem prolapso sintomático (Bump et al, 1998; Patel et al, 2006).
Algumas evidências sugerem que fatores hereditários ou genéticos podem contribuir para o desenvolvimento do POP (Chiaffarino et al, 1999; Rinne et al, 1999; Hansell et al, 2004; Altman et al, 2008). Irmãs de mulheres jovens (menos de 55 anos) com prolapso acentuado têm risco cinco vezes maior de desenvolver POP comparado com a população geral (Jack et al, 2006) e, a prevalência de prolapso sintomático foi maior nas mulheres cujas mães ou irmãs submeteram8se à cirurgia para correção de prolapso comparadas com mulheres sem história familiar deste tipo (OR 3,1; IC 95% 1,483,0) (Miedel et al, 2009).
com as mulheres brancas (Hendrix et al, 2002). As razões para estas diferenças étnicas não são claras. No entanto, algumas evidências indicam que as mulheres afro8americanas têm pelves (áreas totais) menores do que as de ascendência européia (Bump et al, 1993; Baragi et al, 2002).
"A *" 5 Fatores de Risco para POP
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• Parto Vaginal
• Idade Avançada
• Obesidade
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• Fatores Obstétricos 1. Gestação
2. Parto Operatório Fórceps 3. Idade Materna Precoce 4. Período Expulsivo Prolongado 5. Macrossomia Fetal (peso >4500 g)
• Forma ou Orientação Constitucional da Pelve
• História Familiar Positiva para POP
• Raça ou Etnia
• Esforço Crônico
• Constipação
• Doenças do Tecido Conjuntivo
• Histerectomia Prévia
• Lesões Medulares
• Menopausa
57 /0! !"23$ /'$ ! #$ 00$"*,$ B*C )$
11
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suspensa de modo a repousar contra as paredes de suporte adjacentes; assim, o aumento da pressão força a vagina contra estas paredes mantendo8a no lugar (Nichols et al, 1970; DeLancey, 1993). Isto significa que na ausência de prolapso, os dois terços superiores da vagina dispõem8se horizontalmente, apoiadas pelo m. levantador subjacente (Nichols et al, 1970).
Assim, a vagina normal e intacta sustenta a bexiga, uretra, útero e reto (De Lancey, 1993).
& +/ " 5 ' 0 !"23$ 0E/ (4! )" #$0 FC 0 # /0! !"23$ #" "+ "
$*$ ! $ " " # B*C )"5 Nível I: “suspensão”, Nível II: “fixação”, Nível III:
“fusão”. As fibras do nível I estendem8se vertical e posteriormente em direção ao sacro. No nível II, a vagina é ligada ao arco tendíneo da fáscia pélvica e à fáscia superior do m. levantador do ânus. Adaptado de DeLancey J (1994).
A abertura no m. levantador do ânus por onde a vagina e a uretra passam é chamada de hiato urogenital, por onde também ocorrem os prolapsos (Figura 2). O reto, embora passando através da abertura, não é incluído no hiato porque o m. levantador do ânus liga8se diretamente ao ânus e ao esfíncter anal externo. O hiato urogenital é cercado pelos ossos púbicos anteriormente, pelo levantador do ânus lateralmente e pelo corpo perineal e esfíncter anal externo posteriormente. O levantador do ânus contrai8se continuamente, mantendo o hiato urogenital ocluído, fechando a vagina, a uretra e o reto pela compressão dos órgãos contra o púbis (Nichols et al, 1970; DeLancey, 1993).
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tempo que permite a mobilidade das vísceras de forma a realizarem suas funções fisiológicas: armazenamento e eliminação de urina e fezes, coito e parturição (DeLancey, 1993). As fibras musculares lisas, colágeno e elastina da parede vaginal são componentes da fáscia endopélvica (DeLancey, Starr, 1990). A musculatura lisa vaginal desempenha papel no suporte da vagina uma vez que as fibras derivadas da parede vaginal ligam8se ao complexo levantador do ânus (mm. pubococcígeo, puboretal e iliococcígeo) (DeLancey, 1993). Lesões das estruturas de tecido conjuntivo e parede vaginal são considerados importantes mecanismos envolvidos no desenvolvimento de POP.
& +/ " . ' 0 !"23$ 0E/ (4! )" #" /0)/*"!/ " 0! "#" # /0! !"23$ #$
00$"*,$ B*C )$5 M. levantador do ânus cercando o hiato urogenital, por onde passam
vagina, uretra e reto. Reproduzido de 2 9 3 1.
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esforço físico crônico, ou decorrer do processo normal de envelhecimento (DeLancey, 2005; Weidner et al, 2006)
Desde que o m. levantador do ânus esteja anatômica e funcionalmente preservado, o assoalho pélvico é fechado, e os ligamentos e fáscias encontram8 se sem tensão. Quando a musculatura relaxa ou é lesada, ocorre a diminuição do tônus muscular, podendo resultar na abertura do hiato urogenital. Neste caso, os órgãos pélvicos são mantidos em suas posições anatômicas normais pelos ligamentos que, sobrecarregados, sustentam a carga por um período de tempo, mas podem eventualmente ser também lesados e falharem na manutenção da sustentação da vagina (Singh et al, 2003; DeLancey, 2005). Esta falha não resulta somente de lesão aguda, mas pode decorrer da inabilidade de regeneração e reparação teciduais (Richardson et al, 1976).
No entanto, a extensão dos defeitos da musculatura do levantador do ânus nem sempre se correlaciona com a severidade do prolapso nas mulheres, o que sugere a potencial participação do tecido conjuntivo fibromuscular na fisiopatologia do POP (DeLancey, 2002; Dietz, Sttensma, 2006; Dietz, Simpson, 2008; Eisenberg et al, 2010).
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Os tecidos conjuntivos são responsáveis principalmente pelo estabelecimento e manutenção da forma do corpo, exercendo funções de preenchimento e conexão entre os órgãos e tecidos, e de sustentação. Atuam ainda no transporte de substâncias e na defesa do organismo (Bornstein, 1995; Aumailley, Gayraud, 1998; Raines, 2000; ten Dijke, Arthur 2007; Yanagisawa et al, 2009).
Estes tecidos são formados principalmente por uma rede de fibras protéicas imersas em gel de polissacarídeos denominado matriz extracelular. Além destes, no tecido conjuntivo encontram8se células diferenciadas como os fibroblastos, fibrócitos, plasmócitos, mastócitos, macrófagos e células adiposas (Hynes, 2009).
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A matriz extracelular (MEC) exerce papel fundamental na arquitetura e homeostase teciduais, desempenhando funções mecânicas, químicas e biológicas (Aumailley, Gayraud, 1998; Raines, 2000; Shen et al, 2008; Hynes, 2009; Yanagisawa et al, 2009). A MEC é composta de: (1) proteínas estruturais (colágeno e elastina); (2) móleculas de adesão celulares que incluem colágeno tipo IV, laminina e fibronectina; (3) cadeias de polissacarídeos denominadas glicosaminoglicanos (GAGs), usualmente ligados a proteínas na forma de proteoglicanos e ácido hialurônico (Hynes, 2009; Yanagisawa et al, 2009; Kregel, Miosge, 2010). Os componentes da MEC formam uma estrutura que, além de manter a integridade tecidual, regulam a migração celular e servem como reservatório de citocinas, fatores de crescimento, enzimas proteolíticas e seus inibidores, bem como mantém o nicho de células8tronco (Raines, 2000; Shen et al, 2008; Rozario, DeSimone, 2010).
tecidual requer de um lado a síntese, maturação e deposição, e de outro a degradação proteolítica dos componentes da MEC (Werb et al, 1980; Werb et al, 1982; Jensen et al, 2003; Daley et al, 2008). Pró8colágeno C proteinase (PCP/BMP1), família das lisil oxidases (LOXs), fibulinas e fibrilinas são algumas das proteínas responsáveis pela biossíntese da matriz extracelular. As enzimas proteolíticas capazes de degradar diversos componentes da MEC são divididas em três grupos principais: (1) proteinases de serinas (elastase neutrofílica é a mais conhecida das enzimas degradativas e é neutralizada pela alfa 18 antitripsina); (2) proteinases de cisteína (catepsinas L, S e K); (3) matriz metaloproteinases (MMPs, que são neutralizadas pelas enzimas inibidoras teciduais de metaloproteinases 8 TIMPs) (Werb et al, 1980; Werb et al, 1982; Paul, 1989; Van Wart, Birkedal8Hansen, 1990; Gomez et al, 1997; Prockop et al, 1998; Shapiro, 1998; Csiszar , 2001; Sternlicht, Werb, 2001; Chen et al, 2002, 2004; Kawabata et al, 2002; Kielty et al, 2002; Maki et al, 2002; Jensen et al, 2003; Kagan et al, 2003; Trackman, 2005; Kielty, 2006; Daley et al, 2008; Yanagisawa et al, 2009).
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tendões, ossos, cartilagens e pele; 2) colágenos não8fibrilares (incluídos os colágenos tipos IV, VI, VIII e X): organizam8se em forma de tramas ou redes, sendo a membrana basal um exemplo típico. O colágeno tipo I está presente em quase todos os tecidos do organismo, com exceção das cartilagens. É o tipo principal encontrado na derme, fáscia e tendões, e o maior componente dos tecidos cicatriciais. O colágeno tipo II ocorre nas cartilagens, córneas em desenvolvimento e no corpo vítreo ocular. O colágeno tipo III co8polimeriza com o tipo I, sendo prevalente na parede dos vasos sangüíneos e luz dos órgãos intestinais. Os colágenos tipos I e III são os mais encontrados no trato genito8 urinário. Os colágenos tipos V e XI são componentes menos expressivos e predominantemente encontram8se associados às fibras tipo I e II, respectivamente (Bergman et al, 1994; Byers et al, 2000; Myllyharju, Kivirikko, 2004). As fibras de colágeno são sintetizadas por células da MEC: fibroblastos, miofibroblastos, osteoblastos e condrócitos. Alguns colágenos são sintetizados também por células parenquimais adjacentes como as epiteliais, endoteliais e mesoteliais (Hynes, 2009).
& +/ " 75 0! /!/ " $* )/*" #"0 & A "0 # $*4+ $5 Domínios N8 e C8 terminal:
& +/ " 85 ' 0 !"23$ 0E/ (4! )" #" $00F ! 0 G $) 00"( !$ "!/ "23$
#"0 & A "0 # $*4+ $5Clivagem dos C8propeptídeos pela pró8colágeno C proteinase
(PCP/BMP1) seguida de organização e interligações ( # 8 ) das fibrilas de colágeno pela enzima Lisil Oxidase (LOX) no meio extracelular. Adaptado de Myllyharju, Kivirikko (2001).
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são armazenadas no interior do complexo de Golgi. Após o processamento e estruturação em forma em vesículas secretórias, o pró8colágeno é liberado para o espaço extracelular. A depender da demanda tecidual, as moléculas de pró8 colágeno imaturas passam por processo de maturação com diminuição da solubilidade. Para tal, os pró8peptídeos C (carboxi8terminal) e os pró8peptídeos N (nitrogênio8terminal) são clivados e extraídos por duas proteases específicas denominadas pró8colágeno C proteinase (PCP) e pró8colágeno N proteinase (PNP). Ambas as proteases pertencem à família das metaloproteinases Zn2+8 dependentes (Sarras, 1996; Prockop et al, 1998; Ge, Greenspan, 2006). A PCP também é conhecida como proteína morfogenética óssea tipo I (. , 9 E7BMP1). O arranjo estrutural e funcional das moléculas em fibrilas é feito pela formação das interligações covalentes cruzadas ( #
8 ), que contribuem para a resistência mecânica das fibrilas de colágeno. O estado de hidroxilação dos resíduos peptídicos de lisinas é crucial no processo de
# 8 entre as fibras. A enzima Cu2+8dependente lisil oxidase (LOX) cataliza a formação dos aldeídos dos resíduos de lisina e hidroxilisina nas regiões telopeptídicas. Reações espontâneas subsequentes resultam na formação das ligações cruzadas entre moléculas adjacentes (os aldeídos telopeptídicos derivados de lisina reagem com os resíduos de lisina de moléculas adjacentes). Estas ligações intermoleculares são pré8requisitos para as propriedades físicas e mecânicas das fibrilas de colágeno e para a formação de uma rede fibrosa estável (Prockop et al, 1998; Gelse et al, 2003; Trackman, 2005) (Figura 4).
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trato reprodutivo, onde as fibras elásticas estão constantemente em remodelação (Woessner et al, 1963; Starcher, Percival, 1985; Liu et al, 2004). As fibras elásticas garantem elasticidade ao tecido, e a falha na formação das fibras leva à perda da capacidade elástica retrátil tecidual. A elastina é estruturada como um complexo nuclear central formado por fibras de elastina interligadas entre si, cercada por uma bainha de microfibrilas formadas de fibrilinas associadas às glicoproteínas de ligação à elastina ($ . 9 H$.9) (Figuras 5 e 6). A elastina é secretada no meio extracelular sob a forma de sua molécula precursora solúvel: tropoelastina (65–70 kDa) (Tamburro et al, 2005; Kielty, 2006). A biossíntese da elastina começa com a deposição de tropoelastina numa plataforma pré8formada de microfibrilas (Mecham, Davis, 1994). A tropoelastina possui múltiplos e repetidos domínios hidrofóbicos e de ligações cruzadas ricas em lisina em sua estrutura (Toonkool et al, 2001; Kagan, Li, 2003). A polimerização das moléculas requer uma etapa inicial de deaminação oxidativa dos resíduos de lisina catalizados pela LOX. Os grupos aldeídos resultantes condensam8se espontaneamente com os aldeídos adjacentes ou grupos ε8amino de peptidil8lisinas, para formar as interligações covalentes cruzadas (Kagan, Li, 2003; Liu et al, 2004; Kielty, 2006; Yanagisawa et al, 2009).
& +/ " 95 ' 0 !"23$ 0E/ (4! )" #"0 ! "2H 0 ! $! F "0 #
+"23$ I *"0! " " *"0!$+J 0 5 A região N8terminal da LOXL1 liga8se à fibulina85.
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Estudos funcionais dos genes da fibulina85 e fibrilinas demonstram que estas proteínas são necessárias para o desenvolvimento das fibras elásticas (Kielty et al, 2002; Kielty, 2006; Yanagisawa et al, 2009; Ramirez, Sakai, 2010).
& +/ " :5 ' 0 !"23$ 0E/ (4! )" #$ $00F ! 0 #"0 & A "0 *40! )"05
Deposição da tropoelastina nas microfibrilas de fibrilinas no espaço pericelular. Potencial associação com a fibulina85. Adaptado de Kielty et al (2007).
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595 575 & A * "0
componentes formando complexos macroagregados (com ou sem elastina) na forma estrutural de esferas globulares (Sakai et al, 1991; Kielty et al, 2002).
A fibrilina81 e a fibrilina82, principais membros da familia, são codificadas por genes nos cromossomos 15 e 5, respectivamente (Pereira et al, 1993; Zhang et al, 1994). As fibrilinas contêm em sua estrutura os sítios de clivagen N8 e C8 terminais que sofrem ação das convertases (furinas); a deposição extracelular da proteína requer a remoção do extremidade C8terminal (Raghunath et al, 1999a; Ritty et al, 1999). As fibrilinas81 e 82 têm padrões de expressão teciduais distintos, porém que podem se sobrepor nos tecidos ricos em fibras elásticas (Zhang et al, 1995; Carta et al, 2006).
As fibrilinas são capazes de ligarem8se ao cálcio permitindo a estabilização de sua estrutura protéica. Acredita8se que a fibrilinas têm a função de orientar a elastogênese uma vez que elas são formadas antes da deposição de tropoelastina (Ramirez, Pereira, 1999; Kielty et al, 2002) (Figura 6). Especificamente, as fibrilinas81 e 82 estão envolvidas na homeostase tecidual e na morfogênese, respectivamente (Kielty et al, 2002). Mutações no gene da fibrilina81 causaram manifestações pleiotrópicos da síndrome de Marfan em animais (Pereira et al, 1997) e o bloqueio completo do gene causou morte perinatal nos animais por ruptura de aneurisma de aorta e disfunção pulmonar (Carta et al, 2006). Ratos que tiveram o gene da fibrilina82 bloqueado apresentaram anormalidades esqueléticas tais como sindactilia e aracnodactilia contratural congênita (Putnam et al, 1995). Estes dados confirmam a importância das fibrilinas para a formação das microfibrilas e integridade do tecido conjuntivo (Robinson, Godfrey, 2000).
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al, 1999; Nakamura et al, 1999). Trata8se de uma proteína de ligação à elastina, cálcio8dependente, de cerca de 55 kDa, que se localiza na superfície das fibras elásticas , sendo essencial na organização das mesmas (Nakamura et al, 2002; Yanagisawa et al, 2002; Kielty, 2006) (Figura 6). É altamente expressa em grandes vasos sanguíneos e válvulas cardíacas durante a embriogênese e em muitos tecidos adultos que contêm abundantes fibras elásticas, incluindo a aorta, pulmão, útero e pele (Kowal et al, 1999; Argraves et al, 2003; Chu et al, 2004; Freeman et al, 2005). Camundongos fibulina858/8 (8 8# ) apresentaram um sistema de fibras elásticas altamente desorganizado em todo o organismo ao nascimento. Os animais sobreviveram até a idade adulta, mas apresentaram aorta tortuosa com a perda da elasticidade, enfisema grave e pele frouxa (
+ ) (Loeys et al, 2002; Nakamura et al, 2002; Yanagisawa et al, 2002). Estes tecidos contêm a elastina fragmentada às custas de atividade elastásica não8 aumentada, indicando desenvolvimento defeituoso das fibras elásticas.
A fibulina85 interage diretamente com as fibras elásticas , e serve como um ligante de integrinas da superfície celular através de seu domínio aminoterminal (Mecham, Davis, 1994; Zheng et al, 2007; Yanagisawa et al, 2009). Assim, a fibulina85 funciona como uma ponte entre as fibras elásticas e as células, agindo para estabilizar e organizar as fibras elásticas da pele, pulmões e vasos sangüíneos (Kowal et al, 1999; Yanagisawa et al, 2009). Há evidências de que a fibulina85 interage com as fibrilinas81, o que sugere que seja uma ligação entre a tropoelastina e as microfibrilas no espaço pericelular durante a organização das fibras elásticas (Freeman et al, 2005).
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As lisil oxidades são monoaminases secretadas por células fibrogênicas incluindo os fibroblastos e as células musculares lisas. Cinco proteínas compõem a família das LOXs: LOX e proteínas C# 8 184 (LOXL1, LOXL2, LOXL3 e LOXL4), porém suas participações individuais na biossíntese do colágeno e da elastina permanecem não totalmente esclarecidas (Kagan, Li, 2003; Liu et al, 2004).
A primeira descrição do papel das isoenzimas LOX foi em estudos de inativação do gene em camundongos. A maioria dos embriões LOX8/8 morreram no final da gestação, e os poucos filhotes nascidos vivos desenvolveram cianose e morreram dentro de algumas horas por disfunções cardiovasculares. A autópsia revelou grandes aneurismas da aorta. A microscopia óptica demonstrou anormalidades estruturais nas paredes da aorta dos embriões, e posterior análise por microscopia eletrônica mostrou fibras elásticas altamente fragmentadas, descontinuidade nas camadas de células musculares lisas e danos às células endoteliais (Maki et al, 2002).
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também tem sido descrita nos meios intracelular e intranuclear (Li et al, 1997; Smith8Mungo, Kagan 1998).
& +/ " <5 ' 0 !"23$ 0E/ (4! )" #" " ! ) '"23$ #" $ $) 00$ #
$00%* N + #"0 & A "0 # $*4+ $ *"0! ". Adaptado de Rodriguez et al (2008).
Mais recentemente, novas funções têm sido atribuídas à LOX e envolvem a regulação do desenvolvimento, supressão tumoral, motilidade e senescência celulares (Li et al, 1997; Saito et al, 1997; Kagan, Li, 2003; Molnar et al, 2003; Lucero, Kagan, 2006). A atividade oxidativa da LOX requer a presença de forte ligação do átomo de Cu(II) no seu sítio ativo, e o processo de oxidação das aminas resulta na formação de H2O2 e NH3, com os quais as funções biológicas
al, 2001; Molnar et al, 2003; Lucero, Kagan, 2006). No entanto, a presença destas proteínas no tecido vaginal humano não fora identificada até o momento.
Além da função fundamental na síntese e reparação das fibras de colágeno e elastina, a LOX é altamente quimiotática para monócitos e células musculares lisas dos vasos sangüíneos (Lazarus et al, 1995; Li et al, 2000; Csiszar, 2001). As propriedades quimiotáticas da LOX são mediadas pela H2O2, produto de oxidação
na célula. Diante das evidências de que a LOX pode afetar a função das células, é interessante a observação destas enzimas bem como de vestígios de #
8 derivados de lisina no interior de núcleos de células musculares lisas dos vasos sangüíneos e de fibroblastos (Li et al, 1997). Em resumo, essas recém8 descobertas atividades da LOX juntamente com o seu papel na estabilização da matriz extracelular sugerem que esta enzima pode servir como um importante mensageiro de troca de informações entre os compartimentos intra e extracelulares.
Pouco é sabido a respeito dos substratos de ação específicos e funções das enzimas LOX8 8 , exceto pelo fato de que LOXL1 oxida substratos ricos em elastina (Borel et al, 2001), e que animais que tiveram o gene da LOXL1 bloqueado sobreviveram, mas exibiram anormalidades principalmente nos tecidos ricos em fibras elásticas (Liu et al, 2004). Além destes, estudos evidenciaram a LOXL1 como uma proteína secretora expressa na matriz extracelular de doenças fibróticas ativas (Wakasaki, Ooshima, 1990; Murawaki et al, 1991; Chanoki et al, 1995; Trivedi et al, 1999).
LOXL2 é abundantemente expressa em fibroblastos senescentes e em várias linhagens celulares de tumores aderentes. No entanto, mostrou8se hipoexpressa nos tumores não8aderentes, o que sugere seu papel nos processos metastáticos (Saito et al, 1997). LOXL2 apresenta distribuição espacial semelhante à LOX em placentas humanas e tecidos fetais na gestação inicial (Hein et al, 2001; Molnar et al, 2003).
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7 & ? &
no cérebro e nas células leucocitárias humanas (Asuncion et al, 2001; Maki et al, 2001; Molnar et al, 2003). LOXL3 e LOXL4 podem estar envolvidas na interligação das superfícies celulares e proteínas da matriz extracelular (Asuncion et al, 2001; Maki et al, 2001; Molnar et al, 2003).
& +/ " =5 ' 0 !"23$ 0E/ (4! )" $('" "! C" #"0 E/J ) "0 0! /!/ " 0
#"0 0$ K ("0 #" &"(F* " 5 As isoenzimas contêm uma região conservada na
extremidade COOH de cerca de 205 aminoácidos, responsável pela atividade catalítica amino8oxidativa comum a todos os membros da família. Adaptado de Maki J (2002)3.
Os membros da família das LOXs têm em suas estruturas: um peptídeo sinal no domínio N8terminal, seguido por uma região de seqüência e comprimento variáveis e a seguir, uma região C8terminal que demonstra semelhança significativa com o domínio catalítico da enzima LOX. Cada proteína difere principalmente na sua sequência N8terminal. Os polipeptídeos das isoenzimas são altamente conservados com relação aos aminoácidos das suas extremidades carboxi8terminal, onde encontram8se os sítios de ligação de Cu, os domínios de receptores do tipo citosinas8like (CRL) e fatores de crescimento, e os resíduos de
lisinas e tirosinas que formam os sítios de cofatores lisil8tirosil quinonas (LTQ) (Figura 8). Assim, o domínio C8terminal, comum a todas as LOXs, contribui para a atividade catalítica amino8oxidativa, enquanto que o domínio único N8terminal confere8lhes funções individuais (Csiszar, 2001; Maki et al, 2001).
O cobre é um cofator essencial para as atividades das LOXs, sendo que a atividade funcional das isoenzimas é abolida na ausência do metal (Opsahl et al, 1982; Harris, 1986).
O gene LOX está localizado no cromossomo 5q23.3831.2 (Hämäläinen et al, 1991) e codifica o polipeptídeo de mesmo nome formado por 417 aminoácidos, sendo que destes, os 21 resíduos iniciais correspondem ao peptídeo sinal (Hämäläinen et al, 1991; Mariani et al, 1992). O polipeptídeo LOX na sua forma madura tem peso molecular aproximado de 32 kDa (Csiszar, 2001).
O gene da LOXL1 contém 7 éxons e fora mapeado no cromossomo 15q24 em humanos (Szabo et al, 1997). O peptídeo LOXL1 consiste de 574 aminoácidos, com peso molecular estimado em 50 kDa na forma imatura (Csiszar, 2001). Semelhante à LOX, passa por modificações no meio extracelular resultando na forma ativa da proteína. Apresenta cerca de 76% de similaridade com a sequência da LOX na região carboxi8terminal, o que garante função semelhante à forma madura da LOX (Kenyon et al, 1993; Kim et al, 1995).
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O gene LOXL2 está localizado no cromossomo 8p21 nos humanos e consiste de pelo menos 11 éxons (Jourdan8Le Saux et al, 1998). O gene codifica um polipeptídeo de 87 kDa que compartilha de 48% de similaridade com a LOX nos resíduos 546 a 751, na extremidade C8terminal. Assim, esta região contém todas as seqüências de aminoácidos necessárias para o apropriado desempenho da função correspondente à forma madura da LOX (Saito et al, 1997; Jourdan8Le Saux et al, 1999).
O gene da LOXL3 é formado por 14 éxons e está localizado no cromossomo 2p13. O polipeptídeo correspondente tem peso molecular aproximado de 80.3 kDa. A proteína LOXL3 não8processada apresenta 55% de sua sequência de aminoácidos idêntica a das proteínas LOXL2 (Maki et al, 2001).
O gene da LOXL4 está localizado no cromossomo 10. O peso molecular estimado da proteína por ele codificada é de 84.5 kDa. A sequência da LOXL4 mostra uma alta similaridade com as dos polipeptídeos LOXL2 e LOXL3, sendo os graus de identidade aproximadamente 63,9% e 65,5%, respectivamente (Maki et al, 2001).
A LOX é inicialmente sintetizada no meio intracelular como uma pré8 proproteina (pré8proLOX) que sofrerá uma série de modificações pós8traducionais (hidrólise do peptídeo sinal, glicosilação da enzima na extremidade N8terminal, incorporação do Cu e formação do cofator LTQ) até originar uma pró8enzima cataliticamente inativa de 50 kDa (pró8LOX). A seguir, a pró8LOX é secretada para o meio extracelular onde é processada pela enzima proteolítica pró8colágeno C proteinase (PCP) ou proteína morfogenética óssea tipo I (BMP1), resultando então na forma ativa e madura da LOX de 32 kDa (Csiszar, 2001; Kagan, Li, 2003; Molnar et al, 2003; Lucero, Kagan, 2006).
& +/ " >5 ' 0 !"23$ 0E/ (4! )" #" $00F ! 0 "!/ "23$ #" $0
$0 ! " L! ") */*" . Participação da pró8colágeno C Proteinase (PCP) na
clivagem e remoção dos propeptídeos da forma imatura da LOX (50kDa). Adaptado de Maki J (2002)4.
5957 $00F ! 0 #$ $*4+ $ 0. 1% $*4+ $ $! "0 $/ $! F "
$ -$+ B! )" 00 " ! '$
Pró8colágeno C proteinase (PCP) ou proteína morfogenética óssea tipo I
(. , 9 E/.,9E) é uma metaloproteinase evolutivamente
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7 & ? &
Trackman, 2005; Ge, Greenspan, 2006; Berry et al, 2010). Apesar de seqüência e estrutura semelhantes que a faz ser incluída na família, PCP/BMP1 exerce funções distintas das demais BMPs 2816 que atuam principalmente como fatores de crescimento ósseos e de cartilagens (Sarras, 1996).
PCP/BMP1 exerce múltiplas funções na biossíntese da matriz extracelular e na ativação de fatores de crescimento teciduais TGFβ8 8 PCP/BMP1 está envolvida na maturação e processamento de vários componentes da matriz tais como o colágeno, as enzimas LOXs, as lamininas, proteoglicanos de baixo peso molecular, osteoglicinas e proteína da matriz dentinária (Veitch et al, 2003; Ge et al, 2004; Steiglitz et al, 2004; Moali et al, 2005; Ge, Greenspan, 2006; Berry et al, 2010). PCP/BMP1 é considerada como ponto de controle biológico para a regulação da deposição de fibras de colágeno. Atua na clivagem das moléculas precursoras de colágeno (pró8colágeno) e da LOX (pró8LOX) no meio extracelular, extraindo os C8propeptídeos destas moléculas como parte do processo de maturação proteíca (Trackman, 2005; Ge, Greenspan, 2006; Berry et al, 2010). Uma vez que libera e ativa os fatores de crescimento da família TGFβ incluindo BMP2 e BMP4, TGFβ1 e fatores de crescimento e diferenciação (GDF) 8/11 de seus complexos latentes, a PCP/BMP1 também participa de processos de embriogênese e desenvolvimento: esqueletogênese, neurogênese, formação da parede abdominal e comportamento celular (Berry et al, 2010).
Modelos de 8 8# do gene PCP/BMP1 evidenciam a crucial importância da proteína para a manutenção da matriz extracelular e morfogênese. A pele de ratos que tiveram a expressão do gene completamente abolida apresentou fibrilas de colágeno anormais à microscopia eletrônica. Os animais nasceram mortos ou morreram ao nascer, apresentando óbvias anormalidades anatômicas tais como falha no fechamento da parede abdominal e herniação do trato gastrointestinal, condições estas que assemelham8se à gastrosquise humana encontrada em recém8nascidos (Suzuki et al, 1996). Este fenótipo reflete a natureza defeituosa e frágil da matriz extracelular e, particularmente, aberrantes fibras colágenas.
Os pró8domínios das PCP/BMP1 devem ser removidos por proteólise pelas
Golgi, para tornarem8se maduras e atingirem atividade proteásica plena (Leighton, Kadler, 2003). Em determinadas circustâncias como da secreção por queratinócitos, as proteínas podem ser secretadas para o meio extracelular na forma imatura não8processada (Lee et al, 1997). No entanto, foi observado que as sequências da PCP/BMP1 que co8purificam com as demais BMPs TGFβ8 8 no tecido ósseo, são derivadas do pró8domínio, indicando que as formas maduras e imaturas da proteína persistem nestes tecidos e podem interagir com as BMPs TGFβ8 8 , o que é sugestivo de possível ação e função extracelular dos pró8 domínios de BMP1 (Wozney et al, 1988).
O gene que codifica a proteína PCP/BMP1 foi mapeado no cromossomo 8q21/22 (Takahara et al, 1995). A metaloproteinase apresenta em sua estrutura: uma região de ativação NH28terminal e um domínio de protease astacin8 8 , seguidos por domínio de fator de crescimento epitelial8 8 ($ ; 3
= H$;=# 8 ) e domínios CUB (- > e .,9E) de interação
proteína8proteína (Takahara et al, 1994; Bond, Beynon, 1995).
As poucas e mais atualizadas publicações referentes às diferentes isoformas da PCP/BMP1 mencionam a existência de 6 variantes (Janitz et al, 1988; Hintze et al, 2006). Porém, o Centro Nacional para Informações
Biotecnológicas (B - . 4 7 ) descreve 7
diferentes isoformas da PCP/BMP1 (variantes 187), de pesos moleculares variando de 33 kDa a 130 kDa5. Discrepâncias e inconsistências na nomenclatura utilizada para denominar as várias isoformas, bem como constantes modificações são observadas nas diferentes referências bibliográficas e bancos de dados eletrônicos.
As propriedades estruturais, moleculares e funcionais das isoformas não estão completamente esclarecidas. Elas parecem diferir no número e na organização dos seus componentes principais: domínios CUB e EGF8 8 , que podem explicar as diferentes eficiências nas atividades proteásicas entre as variantes (Janitz et al, 1988; Hartigan et al, 2003; Hintze et al, 2006) (Figura 10). As duas principais e mais descritas isoformas são denominadas BMP1/PCP ou BMP181 (variante 1; 70 kDa) e sua variante BMP1/mTld ou BPM183 (variante 3;
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130 kDa). Ambas as formas são responsáveis pela maior parte do processamento da LOX, sendo o processo reduzido em 70% após o bloqueio do gene da PCP/BMP1 em fibroblastos (8 8# ) (Uzel et al, 2001).
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0$-$ ("0 #" M 5 As isoformas têm em comum uma região de ativação NH28
Pesquisadores têm tentado estabelecer o papel de cada componente molecular na atividade proteásica para, em seguida, explicar todas as potenciais funções e diferenças entre suas isoformas. O módulo EGF28CUB4, presente apenas na BMP183 é a que mais fortemente liga8se ao peptídeo pró8colágeno, o que pode fornecer uma explicação quantitativa para as diferentes eficiências das isoformas principais, BMP181 e BMP183, na atividade de pró8colágeno C8 proteinase. BMP181 tem se mostrado 20 vezes mais eficiente que a variante 3 (Uzel et al, 2001; Hintze et al, 2006). Dados comparativos sobre a eficiência das outras isoformas ainda não estão disponíveis. A localização e expressão das diversas isoformas da proteína parece ser tecido8dependente. De modo geral, as proteínas encontram8se altamente expressas em placenta, tecidos ósseos e cartilaginosos e pele, e menos expressas em tecido cerebral (Janitz et al, 1988; Takahara et al, 1994; Pischon et al, 2005). As isoformas 4 e 6 são as variantes menos comumente encontradas nos diversos tipos teciduais e celulares, chegando a ser de 58100 vezes menos expressas que outras variantes. Especula8 se que a variante 4 seja uma forma inativa da proteína, capaz de ligar8se ao sítio alvo, porém incapaz de clivar a proteína (Janitz et al, 1988). Há evidências da expressão das proteínas PCP/BMP1 nos tecidos reprodutivos humanos como útero e ovários (Janitz et al, 1988; Auguściak8Duma et al, 2009), e recentemente fora observada sua expressão em mucosa vaginal de ratas (Roshanravan et al, 2010).
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camadas subepitelial e muscular), fornecendo suporte longitudinal e central (Weber, Walters, 1997; Kerkhof et al, 2009) (Figura 11).
O tecido paravaginal lateral é composto por tecido areolar frouxo contendo vasos sanguíneos, linfáticos e nervos incorporados ao tecido adiposo. A vagina é separada da bexiga anteriormente por uma continuação do tecido areolar frouxo que se funde com a camada adventícia. Na uretra, a adventícia é menos individualizada e há fusão das camadas musculares da vagina e da uretra (Weber, Walters, 1997).
Estruturalmente o trato genito8urinário inferior é sustentado pelos músculos do assoalho pélvico e o tecido conjuntivo sob a forma de ligamentos e fáscia endopélvica. Alguns estudos (Keane et al, 1997; Chen et al, 2003; Phillips et al, 2006) confirmaram que existe correlação entre os marcadores do metabolismo do colagéno e componentes da fáscia endopélvica, ligamento útero8sacro e tecido vaginal. Assim, vários pesquisadores têm utilizado amostras de tecido vaginal para estudos de POP (Jackson et al, 1996; Chen et al, 2002; Moalli et al, 2005;
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Karam et al, 2007). No entanto, a histologia do tecido mostra diferenças na composição da mucosa vaginal a depender da localização anatômica e comunicação com estruturas adjacentes (Weber & Walters, 1997). De fato, Man et al demonstraram não haver homogeneidade na expressão de genes que codificam elementos da MEC (LOXL1, elastase neutrofílica e alfa 18antitripsina) nas biópsias de diferentes locais da vagina de mulheres com POP, bem como a não8consistência no padrão de expressão dos genes quando os grupos foram controlados por compartimento anatômico de maior proeminência (Man et al, 2009). Portanto, é extremamente importante em estudos de POP a padronização dos locais de biópsia de tecido vaginal para análises comparativas a fim de se evitar vieses de estudo.
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Moalli et al, 2005; Gabriel et al, 2006; Kerkhof et al, 2009; Strinic et al, 2009). De fato, várias alterações moleculares, bioquímicas e celulares envolvendo estas proteínas têm sido descritas em tecidos de mulheres com POP.
Takano et al observaram diminuição na quantidade total de colágeno no paramétrio de mulheres com prolapso uterino comparadas com mulheres sem POP (Takano et al, 2002). Esta diminuição não foi às custas de diferença na concentração de fibras de colágeno tipo I, que mostrou8se quantitativamente inalterada entre os grupos, porém provavelmente devido a modificações qualitativas das fibras, que são menores, mais finas e esparsas no grupo de mulheres com POP comparado com o grupo controle (Barbiero et al, 2003). Quantidade aumentada das fibras colágeno tipo III nos ligamentos cardinal e útero8sacro, e na vagina fora observada em pacientes com POP (Ewies et al, 2003; Gabriel et al, 2005; Moalli et al, 2005). Apesar dos resultados controversos, parece que as pacientes com POP apresentam diminuição na quantidade de colágeno total, com maior proporção de colágeno tipo III e colágeno imaturo mais suscetíveis à ruptura (Jackson et al, 1996; Moalli et al, 2005; Kerkhof et al, 2009). Alguns estudos têm mostrado uma redução no teor de colágeno total secundárias ao aumento da atividade colagenolítica. A expressão de MMPs mostrou8se aumentada no ligamento útero8sacro e tecido vaginal de pacientes com o POP em relação às controles, assim como foram evidenciadas reduções significativas nas expressões da alfa81 antitripsina e TIMP81 em tecidos de mulheres com IUE / POP (Jackson et al, 1996; Chen et al, 2002; Moalli et al, 2005; Gabriel et al, 2006; Strinic et al, 2009; Budatha et al, 2011).
