ANA ZILDA NAZAR BERGAMO
Bráquetes Convencionais e Autoligados: Detecção de Micro-organismos na
Saliva e In Situ, Avaliação de Parâmetros Periodontais e Quantificação de
Citocinas no Fluido Crevicular.
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Programa: Odontopediatria.
Área de Concentração: Odontopediatria.
ORIENTADORA: PROFA.DRA.MIRIAN AIKO N.MATSUMOTO COORIENTADOR: PROF.DR.PAULO NELSON-FILHO
“Versão corrigida”
AUTORIZAÇÃO PARA REPRODUÇÃO
Autorizo a reprodução e/ou divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
FICHA CATALOGRÁFICA
Bergamo, Ana Zilda Nazar
Bráquetes Convencionais e Autoligados: Detecção de micro-organismos na saliva e in situ, avaliação de parâmetros periodontais e quantificação de citocinas no fluido crevicular. Ribeirão Preto, 2014.
112p.: il.; 30cm
“Versão corrigida da Dissertação/Tese. A versão original se encontra disponível na Unidade que aloja o Programa”
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto/USP.
Área de Concentração: Odontopediatria. Orientadora: Matsumoto, Mirian Aiko Nakane Coorientador: Nelson-Filho, Paulo
Bergamo AZN. Bráquetes convencionais e autoligados: detecção de micro-organismos na saliva e in situ, avaliação de parâmetros periodontais e
quantificação de citocinas no fluido crevicular.
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de Concentração: Odontopediatria.
Data da defesa: ____/_____/_____
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. ________________________________________________________________ Julgamento_______________________Assinatura_______________________________
Prof. Dr. ________________________________________________________________ Julgamento_______________________Assinatura_______________________________
Prof. Dr. ________________________________________________________________ Julgamento_______________________Assinatura_______________________________
Prof. Dr. ________________________________________________________________ Julgamento_______________________Assinatura_______________________________
DADOS CURRICULARES
ANA ZILDA NAZAR BERGAMO
Nascimento 21 de junho de 1968 – Batatais/SP.
Filiação Nelson Bergamo
Terezinha Darli Nazar Bergamo
1986-1989 Curso deGraduação - Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto – USP
2005-2007 Curso de Pós-graduação em Radiologia Odontológica - Área de concentração - Ortodontia, nível Mestrado. Faculdade de Odontologia de Piracicaba - UNICAMP. Dissertação: “Alterações dento-maxilares, em jovens com maloclusão de classe II,
1ª divisão dentária, após uso do AEB” (Bolsa CAPES).
2009-2009 Curso de Aperfeiçoamento em Pacientes Especiais – Departamento de Clínica Infantil - Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto - USP.
DEDICO ESTE TRABALHO,
À minha avó Zilda, exemplo de caráter e dedicação à família.
Aos meus pais Darli e Nelson, exemplos de amor, companheirismo e cumplicidade.
Tenho tanto orgulho de vocês...
À minha filha Júlia, meu grande amor...
Ao Prof. Dr. Wilson Abrão (tio Marujo), que tanto me apoiou para iniciar e
completar esta jornada, obrigada tio...
Aos meus irmãos Nelson e Bia, por estarem sempre ao meu lado, em todos os
momentos da minha vida.
Às minhas tias Rosa e Delma, sempre próximas, cuidando de mim com muito
carinho.
Aos meus sobrinhos Vinícius e Isabela, pelo amor incondicional dedicado.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
À Profa. Dra. Mirian Aiko Nakane Matsumoto, minha orientadora. Obrigada em
primeiro lugar por me receber. Por me tratar com respeito e carinho. Por me ensinar
muito!!!! Sobre Ortodontia, Odontologia, Pesquisa e sobre a vida. E principalmente por tudo
que fez pela Júlia... Eu não tenho como agradecer….
Ao Prof. Dr. Paulo Nelson-Filho, pela paciência, por compreender minhas
limitações e me ensinar a superá-las. Pela educação e respeito que demonstra quando
conversa conosco. Muito obrigada por ser coorientador deste trabalho.
À Profa. Dra. Alexandra Mussolino de Queiroz, pela amizade com que me
recebeu e pelo muito que me ensinou neste retorno à Faculdade.
À Dra. Carolina Paes Torres Mantovani, sem o seu apoio e sua generosidade, não
teria sido possível iniciar esta jornada.
À Profa. Dra. Marcela Cristina Damião Andrucioli, por participar efetivamente
da parte clínica deste trabalho. Pela amizade, lealdade e disponibilidade de ajudar sempre.
À Dra. Maya Fernanda Manfrin Arnez, por atender prontamente aos meus
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto – USP, na pessoa do Digníssimo
Diretor, Prof. Dr. Valdemar Mallet da Rocha Barros e a Vice-Diretora Profa. Dra. Léa
Assed Bezerra da Silva.
À Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Odontopediatria da Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto – USP, na pessoa da Coordenadora Profa. Dra. Léa Assed
Bezerra da Silva e da Vice-Coordenadora Profa.. Dra. Raquel Assed Bezerra da Silva
Segato.
À Profa. Dra. Aldevina Campos de Freitas, exemplo de amor à profissão e
dedicação.
Aos professores da Disciplina de Ortodontia da Faculdade de Odontologia de
Ribeirão Preto-USP: Prof. Dr. Adilson Tomasin por permitir triar na sua clínica de
especialização os pacientes que compõem a amostra desta tese. Profa.Dra. Mirian Aiko
Nakane Matsumoto, Prof. Dr. José Tarcisio Lima Ferreira, Profa. Dra. Maria Bernadete
Sasso Stuani e Prof. Dr. Fábio Lourenço Romano, pelos conhecimentos compartilhados.
Aos professores da Disciplina de Odontopediatria da Faculdade de Odontologia
de Ribeirão Preto-USP: Profa. Dra. Léa Assed Bezerra da Silva, Profa.Dra. Sada Assed,
Profa. Dra. Aldevina Campos de Freitas, Prof. Dr. Paulo Nelson Filho, Profa. Dra. Maria
Cristina Borsato, Profa. Dra. Alexandra Mussolino de Queiroz, Profa. Dra. Raquel Assed
Bezerra da Silva, Profa. Dra. Kranya Victoria Díaz Serrano, Profa. Dra. Andiara de Rossi
Daldegan e Prof. Dr. Fabrício Kitazono de Carvalho, pela atenção, ensinamentos e
Profa. Dra. Maria conceição Pereira Saraiva, da Disciplina de Epidemiologia e
Bioestatística da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto-USP, por compartilhar seus
conhecimentos de estatística e pela disponibilidade em cooperar sempre.
Aos funcionários do Departamento de Clínica Infantil da Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto-USP, Filomena Leli Placciti, Micheli Cristina Leite
Rovanholo, Matheus Morelli Zanela, Marco Antonio dos Santos, Nilza Letícia Magalhães,
Fátima Aparecida Jacinto Daniel e Carmo Eurípedes Terra Barretto, pelo agradável
convívio diário, que foi possível graças à educação, respeito e carinho com os quais vocês
nos tratam.
À Benedita Viana Rodrigues e Fátima Aparecida Rizoli, da Clínica de Pacientes
Especiais da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto-USP: que sempre nos acolhem
com carinho e respeito.
Aos funcionários da Clínica I, II e III da Faculdade de Odontologia de Ribeirão
Preto-USP e da Fundação Odontológica (FUNORP), pelo respeito, prontidão em atender e
pela disponibilidade em ajudar.
Ao Laboratório de Histologia e ao Laboratório de Biologia Molecular, do
Departamento de Clínica Infantil, da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto-USP,
pelo auxílio técnico na realização do processamento das amostras. Obrigada pela
dedicação e atenção.
Ao Departamento de Materiais Dentários e Prótese, da Faculdade de Odontologia
de Ribeirão Preto-USP, em especial ao Prof. Dr. Vinícius Pedrazzi, por permitir o
desenvolvimento de parte desta pesquisa no laboratório desse departamento. Ao Prof. Dr.
Cássio do Nascimento, por transmitir o seu conhecimento com competência e presteza
permitindo, assim, que parte das análises fossem realizadas. Obrigada principalmente pela
Ao Departamento de Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial e Periodontia,
da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto-USP, em especial ao Prof. Dr. Arthur
Belém Novaes Júnior, por ceder equipamentos fundamentais ao desenvolvimento dessa
pesquisa. Ao doutorando Humberto Demoner Ramos pelo auxílio na manipulação dos
equipamentos.
Ao Prof. Dr. Márcio Zaffalon Casat e Prof. Dr. Renato Corrêa Viana Casarin, da
Faculdade de Odontologia de Piracicaba - UNICAMP e UNIP, pela colaboração na análise
de citocinas.
Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de
Ribeirão Preto-USP: Isabel Cristina Galino Sola e Regiane Cristina Moi Sacilloto, por
estarem sempre à disposição e nos auxiliar com grande competência.
À secretária do Curso de especialização em Ortodontia, Rosemary Alves de Sá,
pelo auxílio constante em todas as necessidades.
Aos colegas do doutorado e do mestrado, pelo incentivo e constante apoio.
Aos amigos Dr. Francisco Wanderley Garcia de Paula e Silva e Dra. Marília Pacífico
Lucisano, pelos ensinamentos, cooperação e amizade.
À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), pela
bolsa concedida durante todo o curso.
À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo), pelo auxílio financeiro
SUMÁRIO
RESUMO ABSTRACT
1INTRODUÇÃO 21
2CAPÍTULO 1 29
Alterações no volume do fluido crevicular e nos parâmetros periodontais, após a colagem de bráquetes metálicos autoligados e convencionais.
3CAPÍTULO 2 41
Micro-organismos relacionados direta ou indiretamente à cárie dental, na saliva e in situ, em diferentes tipos de bráquetes (convencionais e autoligados).
4CAPÍTULO 3 55
Detecção de complexos microbianos pela técnica checkerboard DNA DNA hybridization, pré e pós-colagem de bráquetes convencionais e autoligados.
5CAPÍTULO 4 75
Níveis de citocinas no fluido crevicular e perfil microbiano in situ, após a colagem de bráquetes convencionais e autoligados.
6CONCLUSÃO 89
BERGAMO, AZN. Bráquetes Convencionais e Autoligados: Detecção de micro-organismos na saliva e in situ, avaliação de parâmetros periodontais e quantificação de citocinas no fluido crevicular. Ribeirão Preto 2014. 114p. [Tese doutorado]. Ribeirão Preto: Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo; 2014.
RESUMO
O aparelho ortodôntico promove alterações microbiológicas na cavidade bucal, em função da variedade de materiais sólidos e elásticos que possuem, os quais funcionam como áreas de retenção, levando a um acúmulo de biofilme e predispondo o hospedeiro à cárie dental e à doença periodontal. Os objetivos do presente estudo, in vivo, foram: 1) Avaliar, as alterações no índice de placa (PI), índice gengival (GI), índice de sangramento gengival (GBI) e no volume do fluido crevicular, em pacientes com 3 diferentes desenhos de bráquetes metálicos (autoligados e convencionais), a fim de verificar se o desenho dos bráquetes interfere no acúmulo de placa e na saúde gengival; 2) Estudar as alterações nos níveis de diferentes micro-organismos envolvidos direta ou indiretamente na cárie dental, na saliva e in situ, pré e pós-colagem de bráquetes convencionais e autoligados; 3) Avaliar os níveis salivares e in situ, de espécies de micro-organismos dos complexos roxo, verde, laranja e vermelho e de outras espécies, pré e pós-colagem de bráquetes convencionais e autoligados, por meio de sondas de DNA e 4) Quantificar citocinas pró-inflamatórias no fluido crevicular, antes e após a colagem dos diferentes bráquetes. A amostra foi constituída de 20 pacientes, com idade entre 11 e 15 anos (Média: 13,3 anos), que receberam bráquetes metálicos convencionais GeminiTM e dois
diferentes tipos de bráquetes autoligados: In-Ovation®R e SmartClipTM em incisivos e caninos
superiores. Os índices, o volume do fluido e as amostra de saliva (S0) foram obtidos antes da instalação dos aparelhos (T0) e após 30(T1) e 60(T2) dias. Um bráquete de cada tipo foi removido 30 e 60 dias após a colagem. Os dados foram submetidos à análise estatística utilizando-se os testes não-paramétricos de Friedman, Mann-Whitney e Wilcoxon e coeficiente de correlação não-paramétrico de Spearman. A análise da concentração de citocinas no fluido crevicular foi realizada segundo modelo de análise de variância misto, seguida pelo teste de Tukey, com nível de significância de 5%. Não houve correlação entre o grau de apinhamento, overjet e overbite com os escores do índice de placa (PI), índice gengival, índice de sangramento gengival e com o volume do fluido crevicular no tempo inicial T0 (p>0,05). Verificou-se a diferença significativa nos escores de PI e volume do fluido crevicular somente nos dentes que receberam bráquetes autoligados SmartClipTM, entre os tempos
T0-T2(p<0,05). Identificou-se a presença de 21 das 22 espécies bacterianas e 4 das 5 espécies fúngicas, na saliva, antes da colagem dos aparelhos ortodônticos. In situ, no bráquete autoligado SmartClipTM observou-se maiores níveis de espécies do complexo vermelho 60 dias
após a colagem. Para os bráquetes convencionais GeminiTM verificou-se diminuição nos níveis
de espécies do complexo roxo. Para o bráquete autoligado In-Ovation®R identificou-se
diferença significativa para C. rectus 30 dias após a colagem e para S. mutans 60 dias após a colagem. Quando comparou-se os níveis salivares e os in situ, verificou-se maiores níveis de espécies nos bráquetes, in situ, sendo que os autoligados apresentaram os maiores valores. Aumento significante foi verificado para os bráquetes autoligados In-Ovation®R, para S.
mutans e L. casei. Após 60 dias da colagem do aparelho ortodôntico observou-se um aumento nos níveis de TNF-α (p<0.005), em todos os tipos de bráquetes. Considerando-se as condições específicas desse estudo, pode-se concluir que o desenho do bráquete modulou o índice de placa, o volume do fluido crevicular, e os níveis bacterianos do complexo vermelho, sendo o bráquete autoligado SmartClipTM o que apresentou o pior desempenho, nesse aspecto. O
bráquete autoligado In-Ovation®R apresentou maiores níveis bacterianos relacionados à cárie
modulada pelo desenho do bráquete, ocorrendo um aumento na concentração de TNF-α nos três tipos de bráquetes (convencional e autoligados) 60 dias após a colagem.
A análise global dos resultados obtidos nos diferentes parâmetros analisados no presente estudo permitiu evidenciar, em geral, melhores resultados clínicos com o bráquete metálico convencional GeminiTM.
BERGAMO, AZN. Self-ligating and Conventional brackets: Microbial detection in the saliva and in situ, periodontal index evaluation and assessment of cytokines levels in the gingival crevicular fluid. Ribeirão Preto 2014. 123p. [Thesis]. Ribeirão Preto: Dentistry School of Ribeirão Preto, University of São Paulo; 2014.
ABSTRACT
The orthodontic appliance promoting several changes in oral cavity according to the variety of solid and elastic materials used in the treatment, leading to the biofilm development. The aim of this study, in vivo, was: 1) Evaluate the periodontal index: Plaque Index (PI), Gingival Index (GI), Gingival Bleeding Index (GBI)and gingival crevicular fluid volume. 2) The levels of cariogenic and periodontopatogenical bacteria in saliva and in two different metallic brackets: self-ligating and conventional, quantify the levels before and 30 and 60 days after bonding orthodontic appliance. 3) The levels of red, orange green and purple complex and others species, in situ and in the saliva. 4) The pro-inflammatory cytokines levels in the gingival crevicular fluid. The sample consisted of 20 patients, aged between 11 and 15 years (mean 13.3 years) who received conventional metal bracket GeminiTM and two different
types of self-ligating brackets: In-Ovation®R and SmartClipTM in maxillary incisors and canines. The
rates, the volume of the fluid and saliva sample (S0) were obtained before the device (T0), 30 (T1) and 60 (T2) after bonding. A type of each bracket was removed 30 to 60 days after bonding. Data were analyzed statistically using the nonparametric Friedman test, Mann-Whitney and Wilcoxon coefficient and nonparametric Spearman correlation with a significance level of 5 %. The cytokine levels was analyzed by the mixed models, follow to the Tukey test. There was no correlation among the scores of crowding, overjet and overbite with the scores of plaque index (PI), gingival index (GI), gingival bleeding index (GBI) and volume of crevicular fluid at the initial time T0 (p>0.05). There was a significantly difference in PI and crevicular fluid volume, when compared each bracket separately, only the teeth that received self-ligating bracket SmartClipTM, between times T0-T2 (p<0.05). We identified, in the
saliva, the presence of 21, bacterial species, of the 22 analyzed; 4 of the 5 fungal species, before bonding the orthodontic appliance. In situ, to the SmartClipTM the highest levels were observed to the
red complex 60 days after bonding. To the GeminiTM a decreased to the purple complex was observed
when compared 30 and 60 days after bonding. The In-Ovation®R showed a significantly difference to C. rectus, 30 days after bonding. S. mutans, 60 days after bonding. 30 days after bonding the microbial levels is highest in the saliva than in situ, the self-ligating brackets present the highest levels than conventional brackets. 60 days after bonding the TNF-α levels was increased (p<0,05). The microbial levels was highest in the self-ligating brackets than the conventional brackets. The bracket design seems influenced the plaque index, the volume of the crevicular fluid, the microbial adhesion. The levels in situ
are highest than in saliva. The TNF-α levels were increased 60 days after bonding. The bracket design change the PI, gingival crevicular volume and the red complex species, the SmartClipTM showed the
worst results in this point. The In-Ovation®R presented the highest levels of the species to the orange complex and cariogenic species. The design didn’t modulated the cytokine levels, th TNFα, increased for all brackets. The global analyses of the results allows us to conclude that the GeminiTM conventional
bracket showed the best results when compared to the others self-ligating.
Introdução | 23
INTRODUÇÃO
A cavidade bucal é colonizada por mais de 1000 espécies de micro-organismos (Wilson, 2004; Zanin et al., 2006), incluindo vírus, protozoários, fungos e bactérias, que coabitam em homeostase. Quando o equilíbrio biológico é rompido, as doenças podem se manifestar (Socransky et al., 1998; Socransky e Haffajee, 2005; Lang et al., 2009; Kebschull e Pn, 2011; Wade, 2013).
Sabe-se que os aparelhos ortodônticos são compostos por vários acessórios que apresentam superfícies irregulares, as quais funcionam como áreas de retenção, promovendo aumento no acúmulo de biofilme microbiano e elevando a concentração de micro-organismos (Ahn et al., 2007; Magno et al., 2008; Andrucioli et al., 2012; Jurela et al., 2013). Além disso, limitam a ocorrência da limpeza mecânica ocasionada pela saliva e pela movimentação da musculatura (Sukontapatipark et al., 2001; Faltermeier et al., 2007; Jurela et al., 2013).
Na presença de carboidratos fermentáveis ocorre queda do pH, com aumento do acúmulo e a maturação do biofilme microbiano, gerando um ambiente favorável para a formação de lesões de cárie (Anhoury et al., 2002; Naranjo et al., 2006; Iwano et al., 2010) e aumento na resposta inflamatória dos tecidos de sustentação. Muitas vezes, mesmo os pacientes com higiene bucal mecânica satisfatória apresentam desenvolvimento de gengivite, principalmente nos primeiros meses após a colocação do aparelho (Anhoury et al., 2002; Thomson, 2002; Naranjo et al., 2006; Sudjalim et al., 2007; Lang et al., 2009; do Nascimento et al., 2013).
As alterações microbiológicas que ocorrem após a instalação de aparelhos ortodônticos se tornaram um tópico bastante estudado a partir dos anos 1980, e os estudos têm revelado que inicialmente ocorre a colonização por espécies como S. mutans e
Lactobacillus que são cariogênicos (Brêtas et al., 2005; Brusca et al., 2007). A
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Dentre as espécies de micro-organismos que compõem o grupo mutans, S. mutans
é a espécie mais frequentemente isolada. Entretanto, estudos recentes relataram a importância da coexistência das espécies S. mutans e S. sobrinus no desenvolvimento da cárie dental e na elevação do risco à cárie nos pacientes multicolonizados. Os S. sobrinus são mais dependentes de sacarose que os S. mutans, sendo mais acidogênicos (Seki et al., 2006; Saravia et al., 2011; Ghasempour et al., 2013). Sabe-se que os níveis salivares de micro-organismos como S. mutans, Lactobacillus ssp. e S. sobrinus podem predizer o risco de desenvolver manchas brancas e lesões de cárie, durante o tratamento ortodôntico (Al Mulla et al., 2009; Sanpei et al., 2010; Jurela et al., 2013). Espécies de Candida ssp também interagem com S. mutans e Lactobacillus, favorecendo a criação de um micro-ambiente com pH ácido (Metwalli et al., 2013; Falsetta et al., 2014)
O acúmulo de biofilme sobre a superfície dental e seu desenvolvimento ao longo do tempo, também ocasiona inflamação dos tecidos periodontais, podendo conduzir à instalação da gengivite e da periodontite (Socransky et al., 1998; Huang e Artun, 2001; Socransky et al., 2002; Socransky e Haffajee, 2005; Naranjo et al., 2006; Sudjalim et al., 2007; Lang et al., 2009), principalmente na presença de micro-organismos anaeróbios Gram-negativos periodontopatogênicos (Socransky e Haffajee, 2005; Slots e Slots, 2011).
Na área da Ortodontia, trabalhos de pesquisa tem sido realizados para detecção de micro-organismos in situ, em aparelhos removíveis e fixos, incluindo bráquetes metálicos, tradicionalmente por técnicas de cultura microbiana (Brêtas et al., 2005; Lessa et al., 2007; Peixoto et al., 2011), por técnicas de microscopia (Magno et al., 2008; Nascimento et al., 2013) e, mais recentemente, por técnicas de biologia molecular (Anhoury et al., 2002; Nelson-Filho et al., 2011a,b; Andrucioli et al., 2012; Nelson-Nelson-Filho et al., 2012; Barker et al., 2013), entre outras. As técnicas de biologia molecular permitem a detecção de micro-organismos nutricionalmente exigentes e de difícil cultivo, tornando possível a identificação de espécies bacterianas de maneira mais confiável, por meio de sondas de DNA.
Dentre as técnicas de biologia molecular, encontra-se a técnica checkerboard DNA-DNA hybridization, preconizada por Socransky et al., em 1994, e empregada em Odontologia
Introdução | 25
Empregando a técnica checkerboard DNA-DNA hybridization, Haffajee et al. (2008) dividiram os micro-organismos encontrados no biofilme supragengival em complexos roxo, amarelo, verde, laranja, vermelho e grupo dos Actinomyces (complexo azul). Além disso, haviam micro-organismos que não foram classificados em nenhum dos complexos anteriores,
sendo considerados como “outras espécies”. Socransky et al. (1998) relataram que as espécies pertencentes ao complexo vermelho estão altamente associados com a doença periodontal, com bolsas periodontais profundas e com a presença de sangramento à sondagem. O complexo laranja parece preceder o vermelho e tem característica menos agressiva. As espécies dos complexos amarelo, verde, roxo e o grupo dos Actinomyces demonstraram grande associação entre si e menor associação com o vermelho e laranja, sendo compostos por diversas espécies consideradas compatíveis com o hospedeiro, detectadas nos sítios gengivais mais saudáveis, no início da formação do biofilme; não estão relacionados com doenças específicas e geralmente colonizam o biofilme dental previamente às espécies dos complexos laranja e vermelho.
Especificamente na Ortodontia, a técnica checkerboard DNA-DNA hybridization foi empregada inicialmente no estudo de Anhoury et al., (2002), para avaliar a contaminação microbiana de bráquetes metálicos e cerâmicos. Estudos posteriores foram publicados por nosso Grupo de Pesquisa, empregando essa técnica para a determinação da contaminação de bráquetes metálicos, in situ, por micro-organismos dos complexos roxo, amarelo, verde, azul, laranja e vermelho (Andrucioli et al., 2012), por micro-organismos cariogênicos (Nelson-Filho et al., 2011a), por Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Nelson-Filho et al., 2012) e por micro-organismos periodontopatogênicos Gram-negativos (Nelson-Filho et al., 2011b). No entanto, até o momento não há estudos publicados utilizando essa técnica para a avaliação dos níveis de contaminação microbiana de outros desenhos de bráquetes, como os autoligados.
Paralelamente, sabe-se que o acúmulo de biofilme nos tecidos dentários próximos à gengiva livre promove inflamação gengival, resultante diretamente da liberação de toxinas, lipopolissacarídeos (LPS) e enzimas e, indiretamente, pela resposta autoimune do organismo (Azuma, 2006; Sudjalim et al., 2007; Lo et al., 2008; Demling et al., 2009; Armitage e Robertson, 2012). Em condições patológicas, como nas periodontites e nas patologias periapicais, há liberação de citocinas e quimiocinas (Belibasakis e Bostanci, 2012).
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para o fluido crevicular, tais como as interleucinas (IL-1α, IL-1 , IL-6 e IL-8), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e imunoglobulinas (Marcaccini et al., 2010). Posteriormente, linfócitos T e B migram para o sítio da lesão (Ziegler et al., 2010).
A resposta imunológica pode ser do tipo adquirida, mediada por linfócitos T e B, e/ou inata, mediada por citocinas e quimiocinas inflamatórias ou por células fagocitárias (Lee et al. 2004; Iwasaki et al., 2006; Lang et al., 2009; Marcaccini et al., 2010). As respostas inatas são geradas nos sítios periféricos à penetração microbiana e, nestes locais, uma resposta imune-adaptativa é gerada, como nos nódulos linfáticos ou no baço. Os linfócitos T secretam citocinas (IL-1, IL-6, TNF-α, etc.) e quimiocinas (IL-8, proteínas teciduais, EGF, etc.) que induzem à citólise da célula alvo, enquanto que os linfócitos B secretam imunoglobulinas, que são responsáveis por eliminar micro-organismos extracelulares, por exemplo (Azuma, 2006).
Paralelamente, sabe-se que a movimentação ortodôntica gera um deslocamento gradual dos fluidos no interior do ligamento periodontal, com deformação das células e da matriz extracelular. Durante o movimento ortodôntico, o tecido periodontal responde rapidamente ao estresse mecânico, por meio de alterações metabólicas, liberando mediadores inflamatórios como as prostaglandinas E2, interleucinas e neuropeptídios. Estas alterações podem ser identificadas no fluido crevicular (Dudic et al., 2006).
O fluido crevicular é um derivado de soro, composto por leucócitos, micro-organismos, células epiteliais do periodonto, células do tecido conjuntivo e células ósseas, além de substâncias derivadas do metabolismo bacteriano e do hospedeiro, que emerge dos capilares teciduais, entre a superfície dental e o epitélio. Sua drenagem é feita através do sistema linfático (Griffiths, 2003). O fluido crevicular é um importante marcador da ecologia do sulco ou da bolsa periodontal, que elimina partículas de carbono e citocinas secretadas, além da capacidade de isolamento, fazendo com que substâncias externas não penetrem facilmente no sulco (Goodson, 2003; Griffiths, 2003; Lamster e Ahlo, 2007).
A análise do fluido crevicular é um método adequado para estudos em humanos, pois pode ser aplicado de forma não invasiva e permite repetir a coleta no mesmo sítio (Griffiths, 2003; Uitto, 2003; Yamaguchi, 2009; Zainal Ariffin et al., 2011). A quantidade e os tipos de citocinas encontradas no fluido crevicular podem determinar a severidade da doença e o grau de inflamação (Socransky et al., 1994; Kaufman e Lamster, 2000; Goodson, 2003; Lee et al., 2004; Haffajee et al., 2008). Um equipamento eletrônico denominado “Periotron®
8000” tem sido utilizado para determinar o volume coletado, sendo considerado como padrão
Introdução | 27
Tradicionalmente, a concentração de citocinas nos tecidos e nos fluidos teciduais são avaliadas por meio do imunoensaio ELISA (Ribagin e Rashkova, 2012; Kim et al., 2013; Wang et al., 2013). Entretanto, este teste requer volumes maiores para análise, limitando a avaliação de amostras com volumes reduzidos (Gaestel et al., 2002; Hoffmann et al., 2002). O Luminex® é uma técnica que utiliza cores de microesferas uniformes com dois corantes fluorescentes. Por meio de concentrações precisas destes corantes, 100 distintos conjuntos de esferas de cores podem ser criados, cada um revestido com um anticorpo de captura específico permitindo, assim, que pequenos volumes sejam avaliados com precisão, apesar de realizar múltiplas análises de citocinas simultaneamente (Dupont, 2005).
Estudos recentes apontam que as citocinas e as quimiocinas são a chave para a compreensão da reabsorção óssea, durante o movimento ortodôntico (Garlet et al., 2008; Andrade et al., 2009; García-López et al., 2013; Kitaura et al., 2014), e para o estudo de condições patológicas inflamatórias, como a gengivite e periodontite (Cochran, 2008; Ramseier et al., 2009). Estes mediadores podem levar à reabsorção óssea e/ou radicular (Consolaro e Consolaro, 2009; Viecilli et al., 2009; de Rossi et al., 2010; De Oliveira et al., 2014).
A remodelação óssea é controlada pelo equilíbrio entre RANK/RANKL/OPG (Yamaguchi, 2009; Belibasakis e Bostanci, 2012). O sistema RANK/RANKL/OPG é responsável pela estimulação/paralisação dos processos de reabsorção dos tecidos mineralizados (Yamaguchi, 2009; Belibasakis e Bostanci, 2012). Citocinas pró-inflamatórias como a IL-1 e o TNF-α regulam o equilíbrio entre as proteínas desse sistema, atuando de modo a aumentar a expressão de RANKL e diminuindo a OPG (Lee et al., 2004; Iwasaki et al., 2006; Carmona-Rodríguez et al., 2007; Belibasakis e Guggenheim, 2011) ocasionando, deste modo, patologia óssea destrutiva (Cochran, 2008).
Acredita-se que os diferentes desenhos dos bráquetes também poderiam interferir no maior ou menor acúmulo de biofilme bacteriano (van Gastel et al., 2007) e , possivelmente, modular a liberação de citocinas pro-inflamatórias . Os bráquetes autoligados apresentam um desenho que facilita a higienização e a ausência de ligaduras para fixação do arco ortodôntico no slot parece diminur o número de sítios de retenção de biofilme dental (Čelar et al., 2013;
28 | Introdução
autoligados ativos e passivos pode-se citar, respectivamente, o In-Ovation®R (Dentsply – GAC)
e o SmartClipTM (3M Unitek) (Chen et al., 2010; Fleming e Johal, 2010).
Na literatura específica, observa-se que vários autores vem se preocupando em avaliar a contaminação microbiana de bráquetes autoligados, após sua utilização clínica (Pellegrini et al., 2009; Ireland et al., 2013; Mummolo et al., 2013; Pejda et al., 2013). No entanto, esses trabalhos são restritos à utilização de técnicas de cultura microbiana e PCR (van Gastel et al., 2007; Pandis et al., 2010; Baka et al., 2013; Jurela et al., 2013). Além disso, de acordo com uma revisão sistemática recentemente publicada, os autores concluíram que não há evidências suficientes, até o momento para embasar uma possível influência do desenho do bráquete (convencional ou autoligado) sobre a formação de unidades formadoras de colônias e adesão, porém limitada aos Streptococcus mutans (Nascimento et al., 2014).
Pelo exposto, verifica-se a importância da realização de estudos clínicos avaliando o efeito do uso de diferentes desenhos/tipos de bráquetes sobre a microbiota salivar, sobre o biofilme in situ e sobre a concentração de citocinas pró-inflamatórias no fluido crevicular, a fim de estabelecer protocolos clínicos com menor risco de desencadear doenças como a cárie dental e a doença periodontal.
Para abordar o tema proposto, foram desenvolvidos estudos divididos nos 4 capítulos a seguir:
1. Alterações no volume do fluido crevicular e nos parâmetros periodontais, após a
colagem de bráquetes metálicos autoligados e convencionais.
2. Micro-organismos relacionados direta ou indiretamente à cárie dental, na saliva e in situ, em diferentes tipos de bráquetes (convencionais e autoligados).
3. Detecção de complexos microbianos pela técnica checkerboard DNA DNA hybridization, pré e pós-colagem de bráquetes convencionais e autoligados.
4. Níveis de citocinas no fluido crevicular e perfil microbiano in situ, após a colagem de
C
apítulo 1
Alterações no volume do fluido crevicular e nos parâmetros periodontais, após a colagem de bráquetes metálicosCapítulo 1 | 31
INTRODUÇÃO
A cavidade bucal é colonizada por vários micro-organismos incluindo bactérias, vírus e fungos. Sendo colonizada por bactérias que podem causar doenças como a cárie e a doença periodontal. Quando o equilíbrio biológico é rompido, a doença se manifesta (Socransky et al., 1998; Haffajee e Socransky, 2005; Wade, 2013).
O acúmulo de biofilme nos tecidos dentários próximos à gengiva livre promove a inflamação gengival, resultante diretamente da liberação de toxinas, lipopolissacarídeos ou enzimas, e indiretamente da resposta imune do organismo (Azuma, 2006; Sudjalim et al., 2007; Lo et al., 2008; Demling et al., 2009; van Gastel et al., 2009; Armitage e Cullinan, 2010). Fatores de proteção do hospedeiro, como o epitélio, o fluido crevicular, a imunidade e a capacidade de regeneração celular podem controlar a ação dos periodontopatógenos (Armitage e Cullinan, 2010).
Os aparelhos ortodônticos promovem alterações no meio bucal (Anhoury et al., 2002; Nelson-Filho et al., 2011a,b Andrucioli et al., 2012), em função da variedade de materiais sólidos e elásticos utilizados em sua composição (Steinberg e Eyal, 2004), bem como seus diferentes desenhos (van Gastel et al., 2007). As superfícies irregulares atuam como áreas de retenção elevando, assim, a concentração de micro-organismos(Leung et al. 2006; Lessa et al., 2007; Magno et al., 2008). Além disso, dificultam a higienização e limitam a autolimpeza mecânica promovida pela saliva e pela movimentação da musculatura (Faltermeier et al., 2007). A presença de apinhamento, overjet, overbite e mordida aberta também podem interferir no acúmulo de biofilme (Ashley et al., 1998; Staufer e Landmesser, 2004; Ngom et al., 2006).
32 | Capítulo 1
MATERIAL E MÉTODOS
O projeto de pesquisa foi previamente submetido à apreciação pelo Comitê de Ética em Pesquisa envolvendo Seres Humanos, da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, tendo sido aprovado sob o número 2010.1967.58.2. Foi obtido o consentimento livre e esclarecido dos pacientes ou responsáveis.
Selecionou-se 20 pacientes de ambos os sexos, sendo 11 do sexo feminino (55%) e 9 do sexo masculino (45%), com idade variando entre 11 e 15 anos (média de 13,3 anos; SD ± 1,03), com dentição permanente completa, da Clínica de Especialização de Ortodontia da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto - USP.
Foram adotados os seguintes critérios de inclusão: não terem realizado tratamento ortodôntico prévio; não terem feito uso de antibiótico nos 3 meses que antecederam o estudo; não estarem sob uso de medicação sistêmica; não terem sido submetidos a tratamento periodontal nos 3 meses anteriores ao início do estudo; não serem fumantes; não apresentarem sinal clínico de gengivite e não serem portadores de desordens sistêmicas que pudessem interferir na condição periodontal, previamente à instalação do aparelho; não apresentarem anomalias craniofaciais; e não apresentarem apinhamento, overjet e overbite severos, segundo critérios ICON (Daniels & Richmond, 2000).
Após a seleção dos pacientes procedeu-se à determinação do índice de placa (Löe, 1965); índice de sangramento gengival (Ainamo e Bay, 1975) e índice gengival (Löe, 1965). Para estes procedimentos foram utilizadas sondas periodontais milimetradas tipo PCPUNC-BR15 (HuFriedy do Brasil, RJ, RJ, Brasil).
Posteriormente, foi realizada a profilaxia utilizando pasta à base de água e pedra-pomes de granulação fina sem flúor (S.S. White, Petrópolis, RJ, Brasil), taça de borracha. A seguir os dentes foram lavados e secos com jatos de ar comprimido.
O fluido crevicular foi coletado como preconizado por Iwasaki et al. (2001): o dente foi isolado com rolo de algodão e levemente seco com jato de ar. Uma tira de papel absorvente (PerioPaper®, Oraflow Inc., Plainview, USA) foi introduzida, cuidadosamente, no sulco gengival
até o oferecimento de resistência, e mantida em posição por 30 segundos Foram coletadas amostras de 3 regiões da face vestibular, de incisivos e caninos superiores, (região mesial, central e distal) de maneira consecutiva, sendo obtido o volume total para cada dente.
O volume do fluido crevicular, em cada tira de papel, foi quantificado por meio do aparelho Periotron® 8000 (Oraflow Inc., Plainview, USA), previamente calibrado. Para
Capítulo 1 | 33
remoção. A curva de calibração foi construída por meio de regressão polinomial de quarta ordem (Chapple, 1999). Por meio desta curva de calibração, os volumes desconhecidos das amostras foram obtidos, convertendo-se os scores que o aparelho fornece em volume (µL) do fluido crevicular.
Em seguida, os 20 pacientes selecionados receberam, nos incisivos e caninos superiores, bráquetes metálicos convencionais (GeminiTM, 3M Unitek, Monrovia, CA, USA) e
dois tipos de bráquetes metálicos autoligados (In-Ovation®R, Dentsply, GAC e SmartClipTM, 3M
Unitek, Monrovia, CA, USA), que foram colados de forma aleatória em sistema de rodízio. Todos os bráquetes foram colados com adesivo ortodôntico fotopolimerizável (Sistema Transbond XT; 3M Unitek, Monrovia, CA, USA), seguindo as instruções do fabricante (Figura 1). Durante a colagem, tomou-se o cuidado para que o agente de união (XT primer) não entrasse em contato com o tecido gengival. Após a colagem foi inserido um fio ortodôntico
34 | Capítulo 1
Figura 1- Colagem dos bráquetes e colheita do fluido crevicular. A- Bráquete autoligado SmartClipTM .
B- Bráquete convencional GeminiTM .
C- Bráquete autoligado In-Ovation®R.
D- Colagem dos bráquetes nos seis dentes anteriores superiores. E- Aparelho Periotron® 8000.
F- Tira de papel absorvente, PerioPaper®.
Capítulo 1 | 35
Após a montagem dos aparelhos ortodônticos, todos os pacientes receberam instruções de higiene bucal, fornecidas por um único operador e, para minimizar a interferência de fatores de confusão nos resultados obtidos, os mesmos receberam escovas dentais (Professional®, Colgate-Palmolive Indústria e Comércio Ltda, S B Campo, SP, BR) e dentifrício
fluoretado (Creme Dental Oral-B® Pro-Saúde©, 2012 Procter & Gamble do Brasil) para higiene
bucal diária.
Decorridos trinta (T1) e sessenta (T2) dias da montagem do aparelho, nova coleta de dados foi realizada.
Para o índice de placa no tempo T0, utilizou-se a média do índice dos seis dentes anteriores,como preconizado por Pandis et al.(2008). Nos tempos T1 e T2 empregaram-se os valores individuais coletados de cada dente especificamente.
Análise estatística
Para comparação do PI, GI e GBI entre os diferentes tipos de bráquetes foram aplicados os testes não-paramétricos de Friedman e Wilcoxon, com correção de Bonferroni.
Para avaliar o volume do fluido crevicular empregou-se teste não-paramétrico de Wilcoxon. As variáveis do volume do fluido crevicular entre os sexos foi comparado por meio do teste não-paramétrico de Mann-Whitney.
A correlação entre os parâmetros periodontais, oclusão e fluido crevicular foi realizada pelo coeficiente de correlação não-paramétrico de Spearman.
O nível de significância adotado foi de 5%.
RESULTADOS
Não foi verificada diferença significativa (p>0,05) entre os sexos, para os escores de PI, GI e GBI escores e volume do fluido crevicular, entre os três diferentes tipos de bráquetes. Não houve correlação entre o grau de apinhamento, overjet e overbite com os escores de PI, GI e GBI e volume do fluido crevicular no tempo inicial T0 (p>0,05).
Os dentes que receberam o bráquete metálico convencional GeminiTM e o
autoligado In-Ovation®R não apresentaram diferença estatisticamente significativa para PI
quando comparados os tempos T0, T1 e T2 (p=0,54). Entretanto, os dentes que receberam bráquete autoligado SmartClipTM apresentaram diferença significativa para PI entre os tempos
36 | Capítulo 1
Figura 2- Índice de Placa. T0- antes da colagem; T1-30 dias depois da colagem; T2-60 dias depois da colagem dos bráquetes convencionais (GeminiTM), bráquetes autoligados (SmartClipTM e
In-Ovation®R); * diferença estatística.
Não foi observada diferença significativa no GBI e GI nos dentes analisados, independentemente do tipo de bráquete utilizado (p>0,05) (Tabelas 1 e 2).
Tabela 1- Análise descritiva do Índice de Sangramento Gengival, pré e pós colagem de bráquetes convencionais (GeminiTM), e autoligados (SmartClipTM e
In-Ovation®R)
Bráquete M
(Q1-Q3) p
T0 0,0
(0,0-1,0) GeminiTM
T1 0,0
(0,0-2,0)
>0,05
T2 0,0
(0,0-2,0) SmartClipTM
T1 0,0
(0,0-2,0)
>0,05
T2 0,0
(0,0-2,0) In-Ovation®R
T1 0,0
(0,0-2,0)
>0,05
T2 0,0
(0,0-2,0)
T0 – antes da colagem dos bráquetes; T1- 30 dias após a colagem dos bráquetes; T2- 60 dias após a colagem dos bráquetes; M – mediana; Q1- primeiro quartil; Q3- terceiro quartil.
0 1 2 3
T0 T1 T2 T1 T2 T1 T2
SmartClipTM GeminiTM In-OvationR
Capítulo 1 | 37
Tabela 2 – Análise descritiva do Índice Gengival, pré e pós colagem de bráquetes convencionais (GeminiTM), e autoligados (SmartClipTM e In-Ovation®R)
Bráquete Sítio Mesiovestibular M (Q1-Q3) Sítio Vestibular M (Q1-Q3) Sítio Distovestibular
M (Q1-Q3) p
T0 1,0
(1,0-1,67)
1,0 (1,0-1,0)
1,0 (1,0-1,17) GeminiTM T1 1,0
(1,0-1,0) 1,0 (1,0-1,0) 1,0 (1,0-1,0) >0,05
T2 1,0
(1,0-1,0)
1,0 (1,0-1,0)
1,0 (1,0-1,0) SmartClipTM T1 1,0
(1,0-1,0) 1,0 (1,0-1,0) 1,0 (1,0-1,17) >0,05
T2 1,0
(1,0-1,0)
1,0 (1,0-1,0)
1,0 (1,0-1,0) In-Ovation®R T1 1,0
(1,0-1,0) 1,0 (1,0-1,0) 1,0 (1,0-1,17) >0,05
T2 1,0
(1,0-1,0)
1,0 (1,0-1,0)
1,0 (1,0-1,0)
T0 – antes da colagem dos bráquetes; T1- 30 dias após a colagem dos bráquetes; T2- 60 dias após a colagem dos bráquetes; M – mediana; Q1- primeiro quartil; Q3- terceiro quartil.
Com relação ao volume do fluido crevicular, não foi possível detectar diferença significativa entre os dentes que receberam bráquete convencional GeminiTM e o autoligado
In-Ovation®R (p>0,05).
Para os dentes que receberam, bráquetes autoligados SmartClipTM, verificou-se
diferença significativa quando comparou-se T0 e T2 (0,01), sendo os valores de T2 maiores que os de T0 (Figura 3).
Figura 3- Volume do fluido crevicular, antes (T0) da colagem, 30 (T1) e 60 (T2) dias após a colagem de bráquetes autoligados SmartClipTM;
bráquetes convencionais GeminiTM e bráquetes autoligados
In-Ovation®R. *diferença estatística.
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 S m ar tC lip TM G em in i TM In -O va tio n R
*
S m ar tC lip TM G em in i TM In -O va tio n R T1T0 T0 T1 T0 T1 T0 T2 T0 T2 T0 T2
38 | Capítulo 1
Não houve correlação significativa entre PI e o volume do fluido crevicular, nos dentes que receberam os bráquetes autoligados In-Ovation®R e o convencionais GeminiTM.
Correlação positiva foi observada apenas nos dentes que receberam o bráquete autoligado SmartClipTM no tempo T2 (p=0,05).
DISCUSSÃO
No presente estudo não foi observada correlação entre o volume do fluido crevicular e os parâmetros periodontais com apinhamento, overjet e overbite, antes da colagem dos bráquetes. Este dado sugere que a maloclusão não interferiu nos resultados obtidos neste trabalho. Do mesmo modo, Ingervall et al. (1977) e Ashley et al. (1998) não encontraram efeito adverso do apinhamento sobre o periodonto, em casos de pacientes com adequada higiene bucal. No entanto, Staufer e Landmesser (2004) encontraram correlação entre gengivite crônica e apinhamento maior que 3mm. No presente estudo, a maioria dos pacientes não apresentaram apinhamento ou apresentaram apinhamento leve de aproximadamente 2mm, e apresentaram pequeno overbite e overjet.
Vários fatores podem interferir na gênese da doença periodontal, como o epitélio, o fluxo salivar, o fluido crevicular, a imunidade celular, a capacidade de regeneração celular inata do organismo (Zambon, 1996; Papaioannou et al., 2009; Armitage e Cullinan, 2010) e, também, a localização do dente na arcada, além da efetividade da higiene bucal (Papaioannou et al., 2009). Neste estudo os diferentes bráquetes foram colados na região de incisivos e caninos superiores em sistema de rodízio, uma vez que, segundo Haffajee et al. (2009), a região de incisivos e caninos superiores apresenta a menor quantidade e o menor número de espécies de micro-organismos, e é de fácil higienização, minimizando a interferência da capacidade individual de efetividade de escovação.
A posição de colagem dos acessórios é outro fator de inferência na alteração da microbiota e acúmulo de biofilme (van Gastel et al., 2007). Neste estudo, todos os acessórios foram colados supra-gengivalmente e no mínimo 0,5mm aquém da margem livre da gengiva. Portanto, as possíveis alterações encontradas não foram reflexo da penetração sub-gengival do acessório que, segundo Lee et al. (2005) e Gomes et al. (2007), podem interferir no acúmulo de biofilme e no volume do fluido crevicular.
Capítulo 1 | 39
presente estudo, a fim de efetuar uma avaliação longitudinal pós-colagem de diferentes tipos de bráquetes, os dados foram coletados antes da colagem e após 30 e 60 dias da colagem dos bráquetes, para que os resíduos de adesivo ou a ação do ácido condicionante(Lee et al., 2005; Gomes et al., 2007;) não interferissem no volume do fluido ou ocasionassem irritação gengival.
Há consenso na literatura de que, após a colagem do aparelho ortodôntico, ocorre alteração da microbiota bucal, podendo ocasionar gengivite e desenvolvimento de doença periodontal(Steinberg e Eyal, 2004; Baka et al., 2013; Nascimento et al., 2013). Neste estudo, verificou-se um aumento não significativo dos parâmetros avaliados nos tempo T1 e T2, quando comparou-se os três tipos de bráquetes, corroborando com os achados de Pandis et al. (2008) que não verificaram diferenças no índice de placa ao compararem bráquetes autoligados com convencionais.
No entanto, o aumento no índice de placa e no volume do fluido crevicular se mostrou significativo, quando comparou-se os dados coletados nos diferentes tempos, somente nos dentes que receberam os bráquetes autoligados SmartClipTM, sugerindo que o
desenho do bráquete pode aumentar o acúmulo de placa e o volume do fluido. Não houve diferença com relação ao aumento no índice de placa e do volume do fluido crevicular para bráquetes convencionais GeminiTM e autoligados In-Ovation®R, já o bráquete autoligado
SmartClipTM que apresenta um diâmetro mesio-distal maior que o outro bráquete autoligado
analisado e um sistema de travamento lateral, adotado pelo fabricante para diminuir área retentiva, promoveu maior retenção de placa, segundo os resultados obtidos neste trabalho, indicando que o tamanho e o desenho deste bráquete interferiu nos parâmetros analisados. O fluido crevicular é influenciado pela inflamação dos tecidos gengivais(Socransky e Haffajee, 2005). Em situações de saúde, apresenta um fluxo de 3-8µL/h e, quando estimulado, em situação de inflamação se transforma em um exsudato inflamatório e seu fluxo aumenta para 20 µL/h (Griffiths, 2003). No presente estudo, ocorreu alteração significativa do volume do fluido crevicular apenas para o bráquete autoligado SmartClipTM, entre os tempos
T0 e T2. De acordo com Teles et al.(2009), a alteração do volume do fluido pode ser um fator importante para o monitoramento da progressão da doença periodontal. Deve-se ressaltar que, no presente estudo, ocorreu aumento significativo em T2, no volume do flui
do crevicular e índice de placa, para o bráquete SmartClipTM.
40 | Capítulo 1
evolução de problemas periodontais, em pacientes jovens, são incertas e, portanto, medidas que venham prevenir e minimizar as alterações na microbiota devem ser adotadas.
Os dados do presente estudo também apontam para que medidas de prevenção sejam tomadas, visando minimizar possíveis alterações periodontais. Os resultados revelaram o aumento no Índice de placa e no volume do fluido crevicular 60 dias após a colagem dos bráquetes autoligados SmartClipTM, indicando que o desenho do bráquete pode influenciar nos
C
apítulo 2
Micro-organismos relacionados direta ou indiretamente à cárie dental, na saliva e in situ, emCapítulo 2 | 43
INTRODUÇÃO
A desmineralização do esmalte e a cavitação, em decorrência da cárie dental, estão entre os principais tópicos de interesse na área da Ortodontia (Baka et al., 2013; Jung et al., 2014), pois este problema clínico é relevante e compromete, inclusive, a estética (Ramoglu et al., 2009). A cárie dental é causada pela produção de ácidos, resultante da fermentação de carboidratos da dieta pelas bactérias, na cavidade bucal, principalmente pelas espécies S. mutans, S. sobrinus e Lactobacillus ssp.(Iwano et al. 2010; Saravia et al., 2011; Takahashi e Nyvad, 2011). Um aumento destas espécies ocorre entre 6 e 12 semanas após a instalação de aparelhos ortodônticos (Sanpei et al., 2010).
Dentre as espécies de micro-organismos que compõem o grupo mutans, S. mutans
é a espécie mais frequentemente isolada. Entretanto, estudos recentes relataram a importância da coexistência das espécies S. mutans e S. sobrinus no desenvolvimento da cárie dental e na elevação do risco à cárie nos pacientes multicolonizados. Os S. sobrinus são mais dependentes de sacarose que os S. mutans, sendo mais acidogênicos (Seki et al. 2006; Saravia et al. 2011; Ghasempour et al., 2013). Sabe-se que os níveis salivares de micro-organismos como S. mutans, Lactobacillus ssp. e S. sobrinus podem predizer o risco de desenvolver manchas brancas e lesões de cárie, durante o tratamento ortodôntico (Al Mulla et al., 2009; Sanpei et al., 2010; Jurela et al., 2013).
Paralelamente, a literatura relata a importância da avaliação de outras espécies como S. salivarius, S. gordonii, S. mitis, S. oralis e S. sanguinis, pois estas bactérias intituladas colonizadoras pioneiras estabelecem pontos de fixação e podem antagonizar ou favorecer a colonização por S. mutans e Lactobacillus (Becker et al., 2002; Kreth et al., 2005). Espécies de Candida ssp também interagem com S. mutans e Lactobacillus, favorecendo a criação de um microambiente com pH ácido (Metwalli et al., 2013; Falsetta et al., 2014).
As alterações microbiológicas que ocorrem após a instalação dos aparelhos ortodônticos também se tornaram um tópico bastante estudado a partir dos anos 1980. Estudos empregando técnicas de cultura microbiana (Bretas et al., 2005; Papaioannou et al., 2007; Lessa et al., 2007; Brusca et al., 2007; Magno et al. 2008; Maruo et al., 2008; Peixoto et al., 2011) e biologia molecular (Anhoury et al., 2002; Nelson-Filho et al., 2011 ab;Andrucioli et al., 2012; do Nascimento et al., 2013) revelaram a ocorrência de colonização in situ por micro-organismos cariogênicos, como S. mutans e Lactobacillus, nas diferentes partes que compõem os aparelhos ortodônticos, incluindo os bráquetes convencionais.
44 | Capítulo 2
autoligados, introduzidos na Ortodontia em 1930, apresentam um desenho que facilita a higienização e a ausência de ligaduras para fixação do arco ortodôntico no slot poderia diminuir o número de sítios de retenção de biofilme dental (Čelar et al., 2013; Fleming e O’Brien, 2013). No entanto, estudos avaliando a contaminação microbiana de bráquetes autoligados são escassos (Kaklamanos e Athanasiou 2011; Nascimento et al. 2014) e limitados basicamente ao bráquete da marca In-Ovation®R (Dentsply GAC), empregando técnicas de cultura
microbiana (Chen et al., 2010; Fleming e Johal, 2010).
Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar as alterações nos níveis de diferentes micro-organismos envolvidos direta ou indiretamente na cárie dental, na saliva e in situ, pré e pós-colagem de diferentes tipos de bráquetes metálicos (convencionais e autoligados).
MATERIAL E MÉTODOS
Após aprovação do projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa envolvendo Seres Humanos, da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (processo número 0062.0.138.000-10), foi obtido o consentimento livre e esclarecido dos pacientes ou responsáveis pelos pacientes participantes da pesquisa.
O cálculo amostral foi realizado pelo programa SPSS SamplePower (IBM software- Statistical Package for the Social Sciences, In. Chicago Illinois, USA), indicando que em uma
amostra de 20 pacientes por grupo haveria 80% de probabilidade de ser evidenciado um efeito estatisticamente significativo. O cálculo foi baseado em cinco fatores: diferença das médias, dispersão dos escores, perda amostral, valor de alfa em 0,05 e considerando-se que os dados seriam avaliados segundo uma análise bicaldal.
Selecionou-se 20 pacientes de ambos os sexos, sendo 11 do sexo feminino (55%) e 9 do sexo masculino (45%), com idade variando entre 11 e 15 anos (média de 13,3 anos; SD ± 1,03), com dentição permanente completa, da Clínica de Especialização em Ortodontia da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo.
Capítulo 2 | 45
Além disso, todos os pacientes apresentavam, inicialmente, ausência de alterações periodontais, confirmada pelos seguintes índices: Índice de Placa (Loe, 1965); Índice de Sangramento Gengival (Ainamo e Bay, 1975); e Índice Gengival (Loe, 1965) no sítio mesiovestibular, Índice Gengival no sítio vestibular e Índice Gengival no sítio distovestibular nos incisivos e caninos superiores. Os valores medianos (1o quartil e 3o quartil) obtidos na
amostra selecionada foram: Índice de placa 1,0 (1,0-2,0); Índice de sangramento gengival 0,0 (0,0-1,0); Índice Gengival no sítio mesiovestibular 1,0 (1,0-1,67); Índice Gengival no sítio mesial 1,0 (1,0-1,0); e Índice Gengival no disto vestibular 1,0 (1,0-1,17).
Previamente à colagem dos bráquetes ortodônticos foi coletado 1 mL de saliva não estimulada, em tubos tipo Falcon, contendo pérolas de vidro. Um total de 30 µL de saliva foram transferidos para tubos plásticos para microcentrífuga (Eppendorf AG Barkhausenweg 1 22339 - Hamburg, Germany), contendo 120 µL de solução tampão TE [10 mM Tris-HCL (Sigma-Aldrich, Co., St.Luis, MO, EUA)] pH 7,6, homogeneizada em vortex por 30 segundos a 2000 rpm. A seguir, foram acrescentados 100 µL de NaOH (Labsynth) e os tubos foram estocados a -20°C, até o momento da análise molecular, para a determinação dos níveis iniciais dos seguintes micro-organismos (bactérias e fungos) na saliva (baseline – amostra S0):
Streptococcus mutans (ATCC-25175), Streptococcus sobrinus (ATCC-27352), Streptococcus gordonii (ATCC-10558), Streptococcus mitis (ATCC-49456), Streptococcus oralis
(ATCC-35037), Streptococcus sanguinis (ATCC-10556), Lactobacillus casei (ATCC-393), Candida tropicalis (ATCC-13803), Candida krusei (ATCC-2159), Candida glabrata (ATCC-66032),
Candida dubliniensis (ATCC-44508) e Candida albicans (ATCC-10231).
Após a realização de profilaxia utilizando pasta à base de pedra-pomes e água e taça de borracha montada em contra-ângulo, em baixa rotação, os 20 pacientes selecionados receberam, nos incisivos e caninos superiores, bráquetes metálicos convencionais (GeminiTM,
3M Unitek, Monrovia, CA, USA) e dois tipos de bráquetes metálicos autoligados (In-Ovation®R,
Dentsply GAC Islandia, NY, USA; e SmartClipTM, 3M Unitek, Monrovia, CA, USA), que foram
colados de forma aleatória, em sistema de rodízio. Todos os bráquetes foram colados com adesivo ortodôntico fotopolimerizável (Sistema Transbond XT; 3M, Monrovia, CA, USA), seguindo as instruções do fabricante, por 1 operador experiente. Após a colagem, foi inserido
um fio ortodôntico 0,14” (Dentsply GAC, Islandia, NY, USA), de maneira passiva para não
46 | Capítulo 2
Após a colagem dos bráquetes ortodônticos, todos os pacientes receberam instruções de higiene bucal, fornecidas pelo mesmo operador e, para minimizar a interferência de fatores de confusão nos resultados obtidos, os mesmos receberam escovas dentais (Professional® Colgate-Palmolive Indústria e Comércio Ltda, São Bernardo do Campo, SP, BR)
e dentifrício fluoretado (Colgate Máxima Proteção Anticáries®, Colgate-Palmolive Indústria e
Comércio Ltda, São Bernardo do Campo, SP, BR) padronizados, para higiene bucal diária. Decorridos 30 (T1) e 60 (T2) dias após a colagem dos bráquetes, foi realizada nova colheita de 1 mL de saliva não estimulada (amostras S1 e S2) e remoção de um bráquete de cada tipo (convencional e autoligados In-Ovation®R e SmartClipTM), para avaliação
microbiológica in situ.
Um bráquete de cada tipo foi removido em T1, nestes dentes novos bráquetes foram colados. Em T2 todos os bráquetes foram removidos e analisados somente os que permaneceram por 60 dias na cavidade bucal. Quando removido o bráquete convencional, analisou-se o conjunto: bráquete e ligadura elastomérica, em T1 a ligadura permaneceu 30 dias e em T2 60 dias na cavidade bucal.
Os bráquetes removidos foram colocados individualmente em tubos plásticos para microcentrífuga (Eppendorf AG Barkhausenweg 1 22339 - Hamburg, Germany), contendo 150 µL de solução tampão TE [10 mM Tris-HCL (Sigma-Aldrich, Co.,St.Luis, MO, EUA)], pH 7,6. Os tubos foram codificados e agitados vigorosamente em aparelho Mixtron, em velocidade máxima, para dessorção do material, sendo os bráquetes retirados dos tubos com uma pinça clínica esterilizada. Em seguida, foram acrescentados 100 µL NaOH (Labsynth) a 0,5M e os tubos foram estocados a -20˚C, até o momento da análise microbiológica.
As amostras de saliva e as amostras obtidas dos bráquetes in situ foram analisadas pelo método checkerboard DNA-DNA hybridization, no Laboratório de Diagnóstico Odontológico Molecular da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto - USP, seguindo o protocolo descrito por do Nascimento et al. (2009; 2010). As amostras foram fervidas por 5 minutos para desnaturação do DNA. Posteriormente, foram acrescentados 800µl de acetato de amônia (5M). O conteúdo de cada tubo das amostras foi depositado individualmente na membrana de nylon (HybondN+, Amershan Biosciences, Buckinghamshire, UK) a qual foi
levada ao forno de hibridização por 2 horas a uma temperatura de 80°C, para fixação. Como controle, foram utilizadas quantidades de DNA correspondentes a 105 e 106 células dos
micro-organismos em estudo, as quais foram também desnaturadas, precipitadas e aplicadas sobre as membranas.
Capítulo 2 | 47
da aplicação de sondas marcadas com o genoma das espécies em estudo. A hibridação foi realizada por 16 horas (overnigth) a 60°C, com solução de hibridização, sob suave agitação.
No dia seguinte, as membranas foram lavadas duas vezes, a 65°C por 30 minutos, em solução primária de lavagem (urea 2M; sodium dodecyl sulphate (SDS) 0,1%; NaH2PO4 50
mM pH 7,0; NaCl 150 mM; MgCl2 1mM; blocking reagent 0,2) e duas vezes com solução
secundária de lavagem (Tris base 1M; NaCl 2M, MgCl2 1M), à temperatura ambiente, por 15
minutos. Após a lavagem, as membranas foram incubadas com reagente de detecção CDP-Star (GE Healthcare). Sinais positivos de hibridização foram detectados pela exposição da membrana em ECL Hyperfilm-MP (GE Healthcare). As imagens obtidas no filme foram
digitalizadas e analisadas pelo programa TotalLab™ Quant v13 software (TotalLab Ltd,
Newcastle, UK).
Pela comparação da intensidade dos sinais de quimioluminescência das amostras dos bráquetes com os grupos controles obtidos pelo checkerboard DNA-DNA hybridizatiion, obteve-se a quantidade de micro-organismos em cada bráquete, em µg.
A comparação da quantidade de cada espécie avaliada na saliva e in situ, para os diferentes tipos de bráquetes, nos diferentes tempos, foi realizada por meio de teste não-paramétrico de Friedman e pós-teste de Dunn. Todas as análises foram realizadas no SPSS Statistics 17.0 software (IBM Software-Statistical Package for the Social Sciences, Inc., Chicago, Illinois, USA). O nível de significância adotado foi 5%.
RESULTADOS
Antes da colagem dos bráquetes ortodônticos identificou-se, na saliva, a presença de todos os micro-organismos avaliados, exceto S. gordonii. Por outro lado, nos períodos de 30 e 60 dias após a colagem, todas as 12 espécies de micro-organismos (bactérias e fungos) estavam presentes nas amostras coletadas.
Trinta dias após a colagem dos bráquetes ortodônticos, verificou-se aumento significante, nos níveis salivares, apenas para S. sobrinus (p=0,02), L. casei (p=0,005) e S. oralis (p=0,02). No período de 60 dias, observou-se diferença significante apenas para 2
espécies de Candida [C. krusei (p=0,0003) e C. glabrata (p=0,048)], cujos níveis sofreram redução, em comparação aos demais períodos.
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Tabela 3 - Níveis de micro-organismos (em µg) na saliva de pacientes, antes e após 30 e 60 dias da colagem dos bráquetes
Micro-organismos S0 M (Q1-Q3) S1 M (Q1-Q3) S2 M (Q1-Q3) p
S. sobrinus 0,0
(0,0-271037) 280064 (266564-324660) 0,0 (0,0-330291) 0,0242*
(S0≠S1)
L. casei (0,0-325257) 0,0 (0,0-214312) 170599 (0,0-0,0) 0,0 (S00,0058≠S1) *
S. mutans 0,0
(0,0-0,0)
0,0 (0,0-193411)
0,0
(0,0-171906) 0,6361
S. gordonii 0,0
(0,0-0,0)
0,0 (0,0-0,0)
0,0
(0,0-0,0) 0,1462
S. mitis (0,0-0,0) 0,0 (0,0-188220) 80252 (0,0-196861) 0,0 0,1520
S. oralis 0,0
(0,0-273842) 209922 (0,0-251802) 0,0 (0,0-0,0) 0,0180*
(S0≠S1)
S. sanguinis (0,0-272674) 0,0 (202190-286498) 249863 (0,0-0,0) 0,0 0,1409
C. tropicalis (0,0-270540) 260190 (0,0-188482) 161459 (166561-204803) 197384 0,3628
C. krusei 271641
(259741-289643) 227514 (39416-263161) 191768 (0,0-218399) 0,0003* (S0≠S1)
C. glabrata (0,0-268632) 128245 (0,0-0,0) 0,0 (0,0-0,0) 0,0 0,0487*
C. dubliniensis 131089
(0,0-274239)
214949 (0,0-274196)
0,0
(0,0-216409) 0,4325
C. albicans (0,0-277106) 0,0 (0,0-187348) 66045 (0,0-222619) 210996 0,9852 S0: amostra de saliva obtida antes da colagem dos bráquetes; S1: amostra de saliva obtida 30 dias após a colagem; S2: amostra de saliva obtida 60 dias após a colagem; M – mediana; Q1- primeiro quartil; Q3- terceiro quartil. *: diferença significante; ≠: diferença significante no pós-teste.
Com relação aos níveis de micro-organismos nos bráquetes, in situ, observou-se a presença das 12 espécies de micro-organismos avaliadas (bactérias e fungos), 30 e 60 dias após a colagem, independentemente do desenho do bráquete (convencional ou autoligado). Os níveis dos micro-organismos avaliados (bactérias e fungos) nos bráquetes GeminiTM
(convencional), In-Ovation®R e SmartClipTM (autoligados), antes e após 30 e 60 dias da
