UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO
Desenvolvimento de metodologia analítica para a investigação de
anfetaminas em amostras de saliva, empregando cromatografia em
fase gasosa acoplada a espectrometria de massas
Rafael Barcellos Bazzarella
Ribeirão Preto
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO
Desenvolvimento de metodologia analítica para a investigação de
anfetaminas em amostras de saliva, empregando cromatografia em fase
gasosa acoplada a espectrometria de massas
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Toxicologia para a obtenção de título de Mestre em Ciências
Área de concentração: Toxicologia
Orientado: Rafael Barcellos Bazzarella
Orientador: Prof. Dr. Bruno Spinosa De Martinis
Ribeirão Preto
AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR
QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE
ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Barcellos Bazzarella, Rafael
Desenvolvimento de metodologia analítica para a investigação de anfetaminas em amostras de saliva, empregando cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas. Ribeirão Preto, 2010.
82 p. : Il. ; 30 cm
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Toxicologia
Orientador: Bruno Spinosa De Martinis
FOLHA DE APROVAÇÃO
Nome do aluno: Rafael Barcellos Bazzarella
Título do trabalho: Desenvolvimento de metodologia analítica para a investigação de
anfetaminas em amostras de saliva, empregando cromatografia em fase gasosa
acoplada a espectrometria de massas
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Toxicologia para obtenção do título de Mestre em Ciências.
Área de concentração: Toxicologia
Orientador: Bruno Spinosa De Martinis
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof Dr. _____________________________________________________________
Instituição:____________________________Assinatura: ______________________
Prof Dr. _____________________________________________________________
Instituição:____________________________Assinatura: ______________________
Prof Dr. _____________________________________________________________
RESUMO
O uso de drogas estimulantes por motoristas é reconhecidamente
responsável por um aumento significativo na quantidade de acidentes nas estradas
e rodovias. A própria exigência do trabalho muitas vezes acaba direcionando-os
para a busca de algo que lhes proporcione maior estado de vigília e atenção nas
estradas. Com base na importante correlação entre a profissão e o uso de
substâncias anfetamínicas, foi proposta uma metodologia analítica para a
determinação de anfetamina, metanfetamina, 3,4 – metilenodioxianfetamina, 3,4 –
metilenodioximetanfetamina e 3,4 – metilenodioxietilanfetamina em amostras de
saliva através de técnica de extração líquido-líquido e análise por cromatografia em
fase gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC-MS). Para o
desenvolvimento do método foi utilizado 1 mL de saliva, extração líquido-líquido com
o solvente acetato de etila, derivatização com anidrido heptafluorobutírico (HFBA) e
detecção com GC-MS. A metodologia foi validada e demonstrou linearidade de 10 a
400 ng/mL de saliva para todos os compostos. Os limites de detecção estabelecidos
se encontraram entre 2,5 ng/mL e 7,5 ng/mL, enquanto os de quantificação foram de
10 ng/mL para todos os compostos. A exatidão apresentou valores entre 93,8% e
108,3%, a precisão intra-ensaio valores entre 4,05% e 9,34% e a precisão
inter-ensaio valores entre 5,28% e 9,90%. A metodologia validada foi aplicada em
amostras de saliva de caminhoneiros que trafegavam na região da cidade de
Roseira – SP em um evento de atendimento ao público promovido pela Sest/Senat
(Serviço Social do Transporte/ Serviço Nacional de Aprendizagem do Transporte)
em parceria com a Polícia Rodoviária Federal. Duas amostras de saliva de um total
de 40 amostras analisadas apresentaram resultado positivo para anfetamina.
ABSTRACT
The use of stimulants by professional drivers is known as an increasing risk of
accidents on the roads. The type of work itself induces the drivers to look out for
something that provides better state of alertness and reduced sleep. Based on this
important correlation between the occupation and use of stimulants, an analytical
methodology was proposed for the determination of amphetamine,
methamphetamine, and their methylenedioxy derivatives 3,4 –
methylenedioxyamphetamine, 3-4 – methylenedioxymethamphetamine and 3,4 –
methylenedioxyethylamphetamine on oral fluid samples using solvent extraction and
gas chromatography coupled with mass spectrum for detection and quantification of
these analytes. The developed methodology used 1 mL of oral fluid, liquid-liquid
extraction, heptafluorobutyric anhydride and gas chromatography-mass spectrometry
for the detection and quantification. The methodology was validated and showed
good linearity within the limits of 10 ng/mL and 400 ng/mL of oral fluid. The limits of
detection were between 2.5 ng/mL and 7.5 ng/mL, while the limits of quantification
were 10 ng/mL for all analytes. The accuracy showed values between 93.8% e
108.3%, the intra-assay precision between 4.05% e 9.34% and the inter-assay
precision between 5.28% e 9.90%. The validated methodology was tested in oral
fluid samples collected from truck drivers near the city of Roseira – São Paulo during
an event of health assistance fomented by SEST/SENAT in partnership with Federal
Police. It was collected 40 saliva samples and two of them presented positive result
for amphetamine.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esqueleto básico da β-fenetilamina ... 13
Figura 2. Esquema demonstrando a biotransformação de algumas drogas para produzir anfetamina e metanfetamina ... 17
Figura 3. Esquema demonstrando principais mecanismos de biotransformação de anfetamina e metanfetamina ... 18
Figura 4. Estrutura da mescalina... 22
Figura 5. Metabolismo do MDMA ... 23
Figura 6. Cromatograma com a abundância de íons da ANF ... 43
Figura 7. Cromatograma com abundâncias de íons da ANF – d11 ... 43
Figura 8. Cromatograma com a abundância de íons da MET ... 44
Figura 9. Cromatograma com a abundância de íons da MET – d14 ... 44
Figura 10. Cromatograma com a abundância de íons do MDA ... 45
Figura 11. Cromatograma com a abundância de íons do MDA – d5... 45
Figura 12. Cromatograma com a abundância de íons do MDMA ... 46
Figura 13. Cromatograma com a abundância de íons do MDMA – d5... 46
Figura 14. Cromatograma com a abundância de íons do MDEA ... 47
Figura 15. Separação cromatográfica dos analitos ... 59
Figura 16. Linearidade da anfetamina ... 61
Figura 17. Linearidade da metanfetamina ... 62
Figura 18. Linearidade do MDA ... 62
Figura 19. Linearidade do MDMA... 63
Figura 20. Linearidade do MDEA ... 63
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Íons utilizados na identificação e quantificação dos analitos .. 42
Tabela 2. Soluções utilizadas para preparação da curva de calibração e controles de qualidade... 48
Tabela 3. Analitos com seus respectivos tempos de retenção ... 58
Tabela 4. Limites de detecção e de quantificação dos analitos em amostras de saliva ... 60
Tabela 5. Valores de precisão intra-ensaio... 64
Tabela 6. Valores de precisão Inter-ensaio ... 64
Tabela 7. Valores de exatidão ... 65
Tabela 8. Recuperação dos analitos ... 66
Tabela 9. Especificidade dos analitos ... 67
Tabela 10. Valores de estabilidade de curta duração ... 68
Tabela 11. Valores de estabilidade de longa duração ... 69
Tabela 12. Valores de estabilidade de congelamento e descongelamento... 69
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANF Anfetamina
MET Metanfetamina
MDA 3,4, - metilenodioxianfetamina
MDMA 3,4, - metilenodioximetanfetamina
MDEA 3,4, - metilenodioxietilanfetamina
GC-MS
Cromatografia gasosa acomplada à espectrometria de
massas
HFBA Anidrido heptafluorobutírico
SEST Serviço Social do Transporte
..37 .... 36 ... 36 ... 35 ... 35 SUMÁRIO RESUMO... iv
ABSTRACT ... v
LISTA DE FIGURAS ... vi
LISTA DE TABELAS ... vii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... viii
1. INTRODUÇÃO ... 13
1.1. Anfetamina/Metanfetamina ... 13
1.1.1. Uso no Brasil ... 16
1.2. Anfetaminas alucinógenas ... 20
1.3. Amostras alternativas ... 24
1.3.1. Saliva ... 25
1.4. Determinação de anfetamina e derivados: revisão bibliográfica ... 28
2. OBJETIVOS ... 33
3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 35
3.1. Materiais ...
3.2. Equipamentos e acessórios ...
3.3. Preparação de soluções e reagentes ...
3.3.1. Preparação de soluções padrões de calibradores, controles de qualidade e padrões internos ...
3.3.2. Preparação dos reagentes ...
... 37 ... 40 ... 47 ...66 ... 65 ... 65 ... 64 ... 60 ...55 ... 55 ... 54 ... 53 ... 52
mula: ... 52
...50
... 50
3.3.2.2. Preparação do tampão Na2CO3/NaHCO3 3.3.2.3. Preparação do tampão Tris de pH 7,4 ... 3.4. Desenvolvimento da metodologia ... 39
3.4.1. Escolha do solvente de extração... 39
3.5. Determinação das anfetaminas, metilenodioxi derivados e metabólitos em amostras de saliva ... 3.6. Curva de Calibração ... 3.7. Validação da metodologia de análise das anfetaminas, metilenodioxi derivados e metabólitos em saliva por cromatografia em fase gasosa/espectrometria de massas ... 48
3.7.1. Limites de detecção ... 49
3.7.2. Limites de quantificação ... 49
3.7.3. Linearidade ... 3.7.4. Precisão ... 3.7.5. Exatidão: é a proximidade obtida entre o resultado da análise em relação a um valor verdadeiro. É calculada pela fór 3.7.6. Recuperação ... 3.7.7. Especificidade ... 3.7.8. Estabilidade ... 3.7.9. Carry Over ... 3.8. Casuística ... 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 58
4.1. Limites de detecção e quantificação ... 59
4.2. Linearidade ...
4.3. Precisão ...
4.4. Exatidão ...
4.5. Recuperação ...
o ... 82
... 81
... 81
... 76
... 74
4.7. Estabilidade ... 68
4.7.1. Estabilidade de curta duração ... 68
4.7.2. Estabilidade de longa duração ... 69
4.7.3. Estabilidade de congelamento e descongelamento ... 69
4.7.4. Estabilidade pós-processamento ... 70
4.8. Carry Over ... 70
4.9. Aplicação da metodologia na análise da saliva dos motoristas ... 70
5. CONCLUSÕES ...
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...
ANEXOS ...
Anexo 1 - Questionário ...
1. INTRODUÇÃO
O termo anfetamínicos refere-se a um grupo de substâncias de ações
simpatomiméticas que possuem em suas estruturas o esqueleto básico da β
-feniletilamina, demonstrado na Figura 1.
Figura 1 - Esqueleto básico da β-feniletilamina
A anfetamina é a substância precursora desse importante grupo de
estimuladores do sistema nervoso central, mas muitos outros derivados já foram
sintetizados e podem ser facilmente encontrados em vários medicamentos, como em
formulações farmacêuticas contendo efedrina, fenilefrina, femproporex,
anfepramona, sibutramina, entre outros (Oga, 2003). Além dessas, existem
anfetaminas de uso proscrito no Brasil definido pela portaria 344 da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (Lista F), como a 3,4 – metilenodioximetanfetamna
(MDMA) e a 2,5 – dimetoxibromoanfetamina (DOB).
1.1. Anfetamina/Metanfetamina
A anfetamina foi sintetizada primeiramente em 1887, mas apenas quatro
décadas depois teve seus efeitos farmacológicos estudados, sendo largamente
hiperatividade em crianças. Na década de 30, além da busca por suas propriedades
estimulantes e reforçadoras, utilizava-se a anfetamina para vários outros fins, como
descongestão nasal, tratamento para esquizofrenia, dependência de morfina,
nicotina, cafeína, hipotensão, enjôos e soluços intensos (Yonamine, 2004).
A anfetamina e a metanfetamina são consideradas estimulantes de ação
indireta, já que atuam liberando a norepinefrina das vesículas de armazenamento.
Além disso, são inibidoras da enzima monoaminooxidase (MAO), responsável pelo
catabolismo das catecolaminas. O uso contínuo da anfetamina e metanfetamina
podem acarretar depleção de dopamina em longo prazo, além de perda de
transportadores para esse neurotransmissor. A metanfetamina possui ação central
mais potente que a anfetamina, e ações periféricas menos proeminentes.
Exposições crônicas à metanfetamina descritas acarretaram decréscimo da
capacidade de locomoção e prejuízo no aprendizado verbal. Outros estudos
recentes também revelaram severas alterações funcionais e estruturais associadas
com aprendizado e memória (Volkow et al., 2001a e 2001b).
Devido a essas propriedades estimulantes e de acréscimo nas capacidades
de atenção, concentração e raciocínio já bastante difundidas em várias partes do
mundo, as anfetaminas são, ainda hoje, uma classe de substâncias de uso
freqüente, sobremaneira entre estudantes e motoristas de caminhão. Além desses
efeitos desejáveis, elevam a freqüência respiratória e cardíaca, a pressão arterial, a
capacidade de desempenhar atividade física, provocam decréscimo no apetite e
podem causar hipertermia. Exposições longas podem causar excessiva perda de
peso, problemas dentários, ansiedade, confusão, insônia, alterações do humor e
comportamento violento. Além desses, há ainda distúrbios psicóticos, entre eles a
Embora a prevalência do uso de metanfetamina no Brasil ainda seja bem
reduzida, ela representa um sério problema social nos Estados Unidos, onde é
classificada como um estimulante Schedule II, que indica alta capacidade para
abuso e sua compra somente pode ser feita com receita médica controlada. Na
forma de “droga de rua” é conhecida como ice ou speed, que é uma solução
saturada e alcalinizada de cloridrato de metanfetamina que, após aquecida e
resfriada, forma cristais denominados ice drops que podem ser fumados, à
semelhança do que ocorre com o crack (Levine, 1999).
O uso ilícito em práticas esportivas também ficou bastante conhecido. Atletas
das mais variadas atividades esportivas já fizeram uso de anfetaminas buscando a
melhoria no desempenho atlético. Entre as ações que se almejam obter com as
anfetaminas estão: melhora no tempo de reação em competições que exijam melhor
condicionamento físico; acréscimo na força muscular e agressividade; aumento da
aceleração; elevação dos níveis de ácido lático durante exercício máximo; aumento
da capacidade aeróbica; estímulo do metabolismo através da indução da perda de
gordura corporal. Atualmente o percentual do uso de estimulantes como agentes de
dopagem vêm gradativamente decrescendo. Outros agentes de dopagem estão aos
poucos ocupando o espaço antes pertencente aos estimulantes. Todavia, o uso
ilícito de estimulantes anfetamínicos ainda persiste e deve ser sempre investigado
em triagens antidoping, pois além da indevida vantagem conferida ao usuário,
oferece riscos sérios à saúde, devido principalmente à elevação da temperatura
corporal a níveis perigosos e ao risco maior de ocorrência de infarto do miocárdio
1.1.1. Uso no Brasil
O Brasil na última década se destacou no uso de anfetamínicos prescritos
como supressores de apetite. O International Narcotic Control Board no ano de 1996
divulgou o Brasil como quarto maior consumidor de supressores de apetites no
mundo (International Narcotic Control Board, 1996).
Com relação à utilização dos anfetamínicos como redutores de sonolência,
um estudo realizado com motoristas profissionais na região de Ponta Grossa no
Paraná indicou alto consumo destas substâncias durante a jornada de trabalho.
Apenas 3,12% dos motoristas entrevistados afirmaram nunca terem usado algum
tipo de medicamento para reduzir o sono. O restante (96,88%) afirmou ter usado
pelo menos uma vez ou utilizam rotineiramente medicamentos com a finalidade de
aumentar o estado de vigília (Wendler, et al. 2003).
Em um trabalho realizado com motoristas do estado de São Paulo por
Yonamine et al., (2004), 558 motoristas foram avaliados quanto ao uso de
anfetamina, metanfetamina, cocaína, etanol e delta-9-tetrahidrocanabinol através de
análise em urina e saliva. Dentre as amostras de urina analisadas, 39 (7%)
forneceram resultado positivo para as drogas avaliadas, sendo que 7 resultaram
positivo para a anfetamina. A análise das amostras de saliva apresentou 17 (3%)
resultados positivos para esses compostos, sendo 4 para anfetamina. Não foi
observado resultado positivo para metanfetamina tanto na urina quanto na saliva
(Yonamine, 2004).
A análise das anfetaminas e a interpretação subsequente de seus resultados
requerem alguns cuidados. Um deles se refere à origem da anfetamina ou
grande de precursores pode ser metabolizado a anfetamina e metanfetamina:
anfetaminil, benzfetamina, clobenzorex, deprenil, famprofazona (conversão para
metanfetamina), fencamina, femproporex, furfenorex, mefenorex, prenilamina (Liu et
al., 1995).
A Figura 2 representa um esquema da biotransformação dos medicamentos
femproporex, selegilina e clobenzorex.
Figura 2 - Esquema demonstrando a biotransformação de algumas drogas para
produzir anfetamina e metanfetamina (Yonamine, 2004).
A anfetamina e metanfetamina possuem 6 principais processos de
metabolização: Hidroxilação aromática (posição para), cujos metabólitos são
geralmente excretados conjugados com sulfatos; hidroxilação alifática no carbono
conversão da dopamina em noradrenalina) estericamente seletiva para os
enantiômeros S (+) da anfetamina e metanfetamina; N-dealquilação, responsável
pela conversão de metanfetamina em anfetamina; desaminação oxidativa;
N-oxidação e conjugação do nitrogênio.
Figura 3 - Esquema demonstrando principais mecanismos de biotransformação da
Anfetamina e Metanfetamina. A: Metanfetamina, B: Anfetamina, C:
4-hidroximetanfetamina, D: 4 – hidroxianfetamina, E: 4 – hidroxinorefedrina, F:
Norefedrina, G: Fenilacetona, H: Ácido benzóico, I: Glicina, J: Ácido Hipúrico (Liu e
Goldberger, 1995).
Os enantiômeros da anfetamina apresentam diferenças com relação a sua
na produção de efeitos periféricos, enquanto que o isômero S(+) é 3 a 4 vezes mais
potente na estimulação do sistema nervoso central. Com relação ao metabolismo
das anfetaminas em geral, o isômero S(+) é metabolizado mais rapidamente. A
enzima CYP2D6 é enantioseletiva e cataliza a β-hidroxilação na anfetamina. Esse
fato resulta na razão entre os enantiômeros R/S maior que 1 quando a anfetamina é
consumida como racematos (De La Torre, et al., 2004; Pizarro, et al., 2003).
A análise dos enantiômeros das anfetaminas pode auxiliar na interpretação
laboratorial com relação à origem do resultado positivo observado. Por exemplo, um
resultado positivo apenas para um dos enantiômeros não é condizente com o uso de
femproporex, já que este quando metabolizado produz anfetamina nas duas formas
enantioméricas (Cody, 1996).
A meia-vida de eliminação das anfetaminas é totalmente dependente do pH
urinário. Exemplificando com a anfetamina, em pH ácido (5,5 – 6,0), 60% do
composto é excretado de forma inalterada em 48 horas, enquanto que em pH básico
(7,5 – 8), somente 3 a 7% é excretado nesse mesmo intervalo de tempo. Isso é
explicado pela natureza básica dos compostos anfetamínicos. Em pH urinário ácido
a maior parte da anfetamina se encontra na forma ionizada, logo, não é bem
reabsorvida pelos rins. Em pH alcalino, entre 7,5 e 8, a forma não ionizada da
anfetamina, mesmo não sendo preponderante, pode ser constantemente
reabsorvida pelos rins e, consequentemente, elevar consideravelmente a meia-vida
do composto (Oga, 2003).
Em pH alcalino, o mecanismo principal de eliminação da anfetamina do
organismo é por metabolismo, devido à intensa reabsorção renal da anfetamina
nesse pH. Nessas condições, o enantiômero R(-) é encontrado em maiores
condições ácidas, situação em que a taxa mais elevada de excreção da droga
intacta não permite que o metabolismo estereoespecífico provoque alteração
significativa na relação entre os enantiômeros(Liu e Goldberger, 1995).
1.2. Anfetaminas alucinógenas
As anfetaminas alucinógenas são uma classe de drogas sintéticas
estruturalmente semelhantes à anfetamina e à mescalina (Figura 4), e atualmente
classificadas como “drogas recreacionais”. Estas propriedades alucinógenas se
devem aos grupamentos metilenodioxi nas posições 3 e 4 no anel aromático (Oga,
2003). O principal representante desse subgrupo de anfetaminas é o 3,4 –
metilenodioximetanfetamina (MDMA), popularmente conhecido como ecstasy,
patenteado em 1912 pela Merck Pharmaceuticals na Alemanha. Apenas no final da
década de 60 constam as primeiras sínteses em comprimidos. Em 1970 houve o
primeiro caso publicado de uso recreacional da substância e em 1977, o início da
comercialização do MDMA como “droga de rua”. Na década de 80 teve seu uso
bastante difundido em freqüentadores de festas de música eletrônica em todo o
mundo. Apenas em 1985, após comprovados os potenciais de abuso e toxicidade do
MDMA nos Estados Unidos, ele foi incluído na lista Schedule I, proibindo sua
comercialização. Até então já era uma droga bastante conhecida e com muitos
adictos. Somente após a inclusão do MDMA na Schedule I é que análogos do
ecstasy, como o 3,4 – metilenodioxietilanfetamina (MDEA), tiveram um breve
período de expansão até 1986, quando finalmente foi criada a lei que controlou
também a comercialização dos compostos análogos aos já proibidos anteriormente
Os efeitos do MDMA duram aproximadamente de 3 a 5 horas e incluem euforia,
relaxamento, diminuição de ansiedade, sentimentos de aproximação e empatia com
outras pessoas e maior facilidade para comunicação. Tem uso associado a festas de
música eletrônica, as conhecidas raves. Estas possuem como características o longo
período de duração e hiperatividade física. A ação estimulante da droga e seus efeitos
alucinógenos tornaram o MDMA uma opção bastante atrativa para os freqüentadores
desse tipo de festa (Gouzouliz-Mayfrank et al., 2006).
A ação principal do MDMA é inibir a recaptação da serotonina, ocasionando
um aumento da concentração desta na fenda sináptica. No entanto, em longo prazo
o uso continuado produz um decréscimo da atividade da enzima triptofano
hidroxilase, responsável pela síntese de serotonina (Steele, et al., 1994). Há ainda
outros mecanismos de ação verificados no MDMA comuns a outras anfetaminas,
como inibição na recaptação de dopamina, embora consideravelmente menos
intensa que a inibição provocada na recaptação de serotonina, e liberação de
noradrenalina e dopamina das vesículas de armazenamento (Kalant, 2001).
O decréscimo em funções cognitivas já foi descrito em usuários, embora se
acredite que possa ser resultante de combinação de efeitos do MDMA com outras
drogas. Dentre as reações mais graves inerentes ao MDMA está a hipertermia,
responsável por falências no sistema cardiovascular, nos rins, e no fígado. Outros
sintomas associados ao MDMA são: aumento da freqüência cardíaca e da pressão
arterial, sudorese excessiva, tensão muscular, ranger de dentes, náuseas, desmaios
(Kolbrich et al., 2008).
Assim como as anfetaminas não-alucinógenas, o MDMA é um composto
quiral utilizado normalmente como racemato. Com relação à atividade, alguns
(mescaline-like), enquanto o S(+) produz efeito mais estimulante (amphetamine-like) (Kalant
2001). Os enantiômeros do MDMA também diferem quanto a metabolização. A
enzima CYP2D6 também é enantioseletiva para o MDMA S(+) e catalisa as
desmetilações no metabolismo do MDMA, responsável pela conversão do MDMA
em MDA. Assim, o enantiômero S(+) possui uma meia-vida menor que o
enantiômero R(-), por ser preferencialmente metabolizado para S(+) MDA (De La
Torre, et al. 2004; Pizarro, et al. 2003);
Figura 4 - Estrutura da Mescalina.
Acredita-se que o isômero S(+) do MDMA seja mais neurotóxico. No entanto,
para o MDA, ambos os enantiômeros produzem neurotoxicidade no sistema
serotoninérgico. A maior parte da neurotoxicidade atribuída ao MDMA, na realidade,
é devida ao seu metabólito MDA (produzido por N-desmetilação do MDMA), por ser
um composto mais neurotóxico (Levine, 1999).
O MDMA é rapidamente absorvido pelo trato gastrointestinal e produz o pico
de concentração no plasma em aproximadamente 2 horas após a administração
oral. A eliminação da droga é relativamente lenta, com meia-vida de eliminação por
MDMA seja eliminado do organismo. Alguns metabólitos do MDMA, especialmente o
primeiro deles (MDA), ainda possuem atividade farmacológica, o que torna a
duração de ação do MDMA mais prolongada do que a permanência do próprio
composto no organismo (Kalant, 2001).
O MDMA e compostos análogos são metabolizados principalmente por:
1) Degradação da cadeia lateral para formar metabólitos N-desaquilados e 2)
o-desmetilação para formar metabólitos dihidroxilados, seguido por metilação de um
dos grupamentos hidroxila (De Martinis et al., 2007). A Figura 5 apresenta um
esquema das vias de metabolização do MDMA.
Pizarro, ao analisar a urina de 6 usuários recreacionais de MDMA, encontrou
que 44% da dose do composto foi excretada em 24 horas na urina como MDMA,
MDA, HMMA e HMA. Dos 44% excretados foram encontrados para o MDMA, MDA,
HMMA e HMA respectivamente 23,9%; 1,8%; 17,1%; e 1,9% (Pizarro et al., 2002).
Em torno de 65% do MDMA é excretado na forma inalterada pelos rins em 72h. 3%
a 7% do MDMA é transformado em MDA e 28% em outros metabólitos (Camí et al.,
1997; Verebey et al., 1988).
1.3. Amostras alternativas
A utilização de matrizes biológicas alternativas ao sangue e urina tem
ganhado cada vez mais importância em áreas como toxicologia forense, toxicologia
clínica, controle antidoping e toxicologia ocupacional. Os recentes avanços em
técnicas analíticas foram determinantes para que os progressos nas pesquisas em
matrizes alternativas fossem possíveis, já que, em muitos casos, é necessário lidar
com concentrações bastante reduzidas dos analitos, a principal desvantagem ao se
analisar amostras alternativas (Gallardo e Queiroz, 2008).
As amostras alternativas mais comumente utilizadas são: saliva, cabelo, suor
e mecônio. Em geral, oferecem vantagens por serem consideradas não invasivas e
serem mais facilmente coletáveis quando comparadas ao sangue, que apresenta a
desvantagem de invasividade na coleta e a necessidade de profissional qualificado,
e à urina, que requer local apropriado para a coleta além de esta não poder ser
supervisionada diretamente, permitindo possíveis adulterações ou trocas de
amostras. Além disso, algumas amostras alternativas, como cabelo, apresentam
exposição a drogas muito maior que as amostras convencionais (Gallardo e Queiroz,
2008).
1.3.1. Saliva
Alguns fluidos são combinados para formar o que é comumente referido como
saliva. Na realidade, a saliva é o fluido de cada glândula salivar, livre de outros
constituintes, ao passo que fluido oral é uma mistura de saliva produzida pelas
glândulas salivares e sulcos gengivais, e contém outros materiais que podem estar
presentes na cavidade oral, como células mucosas e resto alimentares (Schramm et
al., 1993).
A composição salivar é formada, em sua maior parte, pela secreção das
células serosas e mucosas das glândulas parótidas (25%), submandibulares (71%) e
sublinguais (4%). Há ainda produção salivar por sulcos gengivais (área entre os
dentes e a gengiva), e glândulas salivares menores contidas na língua, mucosa
bucal e no palato (com um número estimado entre 450-750 glândulas), além de
secreções oro-naso-faríngeas (Veerman et al., 1996).
Cada glândula salivar produz uma secreção típica. A glândula parótida produz
um fluido seroso; a glândula submandibular produz uma secreção seromucosa; e a
glândula sub-lingual produz uma saliva mucosa; as glândulas menores secretam
uma saliva mais viscosa. Células serosas secretam um fluido aquoso e incolor rico
em eletrólitos, enquanto as células mucosas, um fluido mais viscoso contendo
amilases, mucoproteínas e mucopolissacaridases (Veerman et al., 1996).
A saliva é geralmente hipotônica em relação ao sangue. Os íons mais
fosfato estão presentes em menores concentrações. São todos originados do
sangue, de onde são transportados ativamente para dentro dos ácinos e ductos
estriados. Os componentes orgânicos encontrados na saliva, como proteínas e
glicoproteínas, são sintetizados pelas células secretoras. Algumas proteínas como
lisozima, lactoferrina, lactoperoxidase, cistatinas e histatinas desempenham um
papel importante como agentes antifúngicos e antibacterianos. Mucinas, além de
contribuírem para a característica viscosa da saliva desempenham um papel
antiviral. Alfa-amilase, lipase, proteinase, DNAase e RNAase são importantes no
processo digestivo . O fluido oral ainda contém bactérias e seus metabólitos, células
epiteliais, eritrócitos, leucócitos e restos de alimentos (Johan et al., 2005).
O fluxo salivar é controlado por estímulo hormonal e por neurotransmissores e
pode variar de 0 a 10 mL/minuto, resultando em um total de 500 a 1500 mL/dia. Fatores
como o ritmo circadiano, estímulos do paladar e olfato, estímulo mecânico, drogas que
atuam nos sistemas simpático e parassimpático, variação hormonal relacionados com
gravidez ou menopausa, stress e dor podem alterar a produção salivar. Tanto o
estímulo simpático como o parassimpático podem induzir a salivação, apesar da
distinção entre as secreções em constituição e volume. O estímulo simpático tende a
produzir uma saliva mais viscosa devido ao estímulo maior à produção de mucinas e
outras proteínas, embora não seja um estímulo que produza aumento de volume da
saliva. Já o estímulo parassimpático induz à produção de uma saliva de volume maior e
com viscosidade mais baixa (Johan et al., 2005).
A taxa de secreção salivar, concentração dos eletrólitos e concentração
protéica na saliva foram relatadas não variarem no decorrer da vida, embora a
atividade da amilase sofra considerável decréscimo no decorrer dos anos
O pH salivar é levemente acidificado (pH 5,5), mas se eleva quando há
estímulo salivar, podendo alcançar valores de pH 7,9. O conteúdo salivar também
sofre variação de acordo com o fluxo, mas consiste basicamente de 90% de água, e
10% de eletrólitos, amilase, glicose, uréia, lipídeos, proteínas e hormônios. Para
drogas básicas, com o decréscimo do pH, uma porção maior da droga será ionizada
e a concentração da droga no fluido oral deverá aumentar, ocorrendo o inverso em
pH básico (O’neal et al. 2000). No entanto, se o pKa de um fármaco é maior que 8,5
para substâncias de caráter básico, ou menor que 5,5 para substâncias de caráter
ácido, ou se o fármaco não for ionizável, a variação de pH salivar praticamente não
interferirá na concentração do fármaco na saliva. Esse tipo de fármaco tende a
apresentar uma melhor correlação saliva/plasma (Kidwell et al., 1998). A anfetamina,
apesar de ser um fármaco de caráter levemente básico, possui pKa em torno de 9,9,
e, conseqüentemente, subtende-se que sofra pouca variação em sua concentração
na saliva com variação de fluxo salivar.
As drogas são incorporadas à saliva por difusão passiva, ultrafiltração, e/ou
secreção ativa do sangue. Difusão passiva é o caminho mais comumente utilizado para
as drogas serem incorporadas à saliva, exceto para substâncias com reduzido peso
molecular, que podem se incorporar à saliva por ultrafiltração. A passagem através das
membranas celulares é limitada para moléculas com elevado peso molecular e restrita
para drogas ionizadas ou ligadas a proteínas . As drogas não metabolizadassão mais
comumente encontradas na saliva do que seus metabólitos, pois são mais lipofílicas e
tendem a atravessar mais facilmente os capilares e membranas das células ácinas até
o fluido oral. Assim, os valores de pH sanguíneo e salivar, o pKa da droga, o grau de
ligação desta às proteínas plasmáticas e sua lipofilicidade irão determinar a partição da
O tempo para detecção de substâncias no fluido oral é, em geral, similar ao
sangue. Ambas as amostras são referidas para se investigar uso recente da
substância de interesse. No entanto, a grande vantagem da utilização de saliva em
relação ao sangue é a coleta não invasiva e não necessitar de profissional
especializado para a realização da coleta (Drummer, 2006).
Uma variedade de formas estão disponíveis para a coleta de fluido oral. Uma
dessas formas é a coleta não estimulada, em que a saliva é coletada através do ato
de deixá-la escorrer diretamente da cavidade oral para um recipiente de coleta.
Várias técnicas já foram descritas para se estimular a produção de saliva. Entre as
mais simples estão os movimentos realizados com a língua, bochechas e lábios sem
a utilização de estímulo externo. Mastigação de cera de parafina, parafilm®, teflon®,
gomas e gotejar limão ou ácido cítrico sobre a língua são exemplos de estímulos
externos para a produção de saliva. Após produzida, a saliva pode ser succionada,
absorvida ou coletada com o auxílio de swab. Algumas técnicas de coleta combinam
estimulação com coleta utilizando-se materiais absorventes como algodão. Após a
saturação do material absorvente, o fluido oral é coletado através de centrifugação
ou aplicação de pressão. Um dispositivo que combina estimulação com extração é o
Salivette®, que utiliza algodão para absorver fluido oral da cavidade oral e
centrifugação para separar o fluido oral do algodão (Crouch, 2005).
1.4. Determinação de anfetamina e derivados: revisão bibliográfica
Várias metodologias já foram desenvolvidas para a determinação de
anfetaminas e derivados em amostras biológicas, tanto para cromatografia em fase
utiliza amostras convencionais como sangue e urina. Há entanto algumas
publicações referindo-se à amostras alternativas como saliva, cabelo e suor.
Peters et al. (2007), determinaram anfetamina e derivados e seus respectivos
enantiômeros em saliva. Utilizaram um volume bastante reduzido de amostra (entre
10 e 50 µL) e derivatização com reagente quiral anteriormente à extração
líquido-líquido. Para detecção e quantificação dos analitos, foi utilizada a técnica de
cromatografia em fase gasosa/espectrometria de massas no modo de ionização
química negativa.
Scheidweiller e Huestis (2006), determinaram metanfetamina, MDMA e seus
metabólitos em saliva utilizando 400 µL de amostra, extração em fase sólida para
preparação das amostras, derivatização com o reagente HFBA e a técnica de
cromatografia em fase gasosa/espectrometria de massas para detecção dos
compostos.
Gunnar et al. (2005), desenvolveram metodologia para identificar 30
compostos, entre eles estimulantes anfetamínicos, utilizando 250 µL de saliva,
extração em fase sólida e detecção por cromatografia em fase
gasosa/espectrometria de massas. As anfetaminas foram derivatizadas com o
reagente acilante HFBA.
Kankaanpaa et al. (2004), determinaram estimulantes anfetamínicos em
amostras de sangue total, plasma, saliva e urina. O procedimento para saliva utilizou
100 µL de amostra e a extração é realizada juntamente com a derivatização pelo
reagente acilante HFBA. Foi utilizada a técnica de cromatografia em fase
Yanomine (2004) determinou anfetamina e metanfetamina em amostras de
saliva aplicando microextração em fase sólida como técnica de preparação de
amostras e cromatografia em fase gasosa/espectrometria de massas.
Wood et al. (2003), desenvolveram uma metodologia para investigação de
anfetamina, metanfetamina, efedrina, MDA, MDMA e MDEA em 50 µL de saliva. A
preparação das amostras foi realizada apenas com precipitação por metanol e, para
detecção, foi utilizada cromatografia em fase líquida acoplada a espectrometria de
massas em tandem (LC-MS-MS).
Mortier et al. (2002), determinaram opióides, anfetaminas, cocaína e
benzoilecgonina em amostras de saliva utilizando extração em fase sólida e
cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas para detecção.
Navarro et al. (2001), analisaram MDMA e metabólitos em amostras de
plasma e saliva para se investigar se há correlação entre as concentrações dessas
duas amostras após administração controlada de ecstasy em voluntários. Foi
utilizado 1 mL de saliva, extração em fase em fase sólida e detecção e quantificação
cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas. Concluíram
que a saliva é uma boa matriz alternativa ao sangue para a investigação de ecstasy.
Rasmussen et al. (2006), determinaram anfetaminas e derivados e seus
respectivos enantiômeros em amostras de sangue total utilizando extração
líquido-líquido, derivatização com reagente quiral e cromatografia gasosa acoplada a
espectrometria de massas.
Pizarro, et al. (2002), analisou MDMA e metabólitos em plasma e urina e
utilizou extração em fase sólida para extração dos compostos e detecção por
cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas, além de
Jenkins et al. (2004), determinaram MDMA e metabólitos em urina utilizando
extração em fase sólida para extração dos analitos. Para detecção foram
comparados cromatografia em fase líquida acoplada a espectrometria de massas,
cromatografia líquida com detector de UV e cromatografia gasosa com detector de
nitrogênio e fósforo.
De Martinis et al. (2007), determinaram MDMA e derivados com seus
respectivos metabólitos em amostras de suor. Utilizaram a extração em fase sólida
para preparação das amostras e detecção por cromatografia em fase gasosa
acoplada a espectrometria de massas.
No presente trabalho, foi desenvolvida e validada uma metodologia para a
determinação qualitativa e quantitativa de anfetaminas, metilenodioxi derivados e
metabólitos em amostras de saliva, empregando a extração líquido-líquido e
detecção por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas.
A metodologia desenvolvida foi aplicada na investigação do consumo de
2. OBJETIVOS
1) Desenvolver e validar metodologia analítica para a investigação de
anfetaminas e metilenodioxi derivados em amostras de saliva, empregando as
técnicas de extração líquido-líquido e cromatografia em fase gasosa acoplada a
espectrometria de massas;
2) Aplicar a metodologia na análise de anfetaminas e derivados em amostras
de saliva coletadas de motoristas de caminhões;
3) Verificar as informações constantes no questionário preenchido pelos
motoristas sobre a utilização de anfetaminas durante as jornadas de trabalho na
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Materiais
Padrões analíticos certificados de Anfetamina (ANF), Anfetamina - d11 (ANF -
d11), Metanfetamina (MET), Metanfetamina – d14 (MET - D14), MDA, MDA – d5,
MDMA, MDMA – d5 e MDEA foram obtidos da Cerilliant (EUA); acetato de etila e
metanol foram obtidos da J. T. Baker (EUA); heptano, trietilamina e anidrido
heptafluorbutírico (HFBA) foram obtidos da Sigma-Aldrich (EUA). As amostras de
saliva, utilizadas para o desenvolvimento e validação da metodologia, foram
coletadas do próprio pesquisador.
3.2. Equipamentos e acessórios
Cromatógrafo em fase gasosa (CP 3800) acoplado a espectrômetro de
massas (Saturn 2000) da Varian® (EUA); coluna capilar de sílica fundida DB – 5MS
de 30 m de comprimento x 0,25 mm de diâmetro interno x 0,25 µm de espessura de
filme da J & W Scientific® (EUA); cilindro de gás hélio 5.0 analítico da White Martins®
(Brasil); amostrador automático CombiPal da CTC Analytics® (Suiça); seringas de
injeção cromatográfica Hamilton (EUA). Centrífuga Universal 32 da Hettich®
(Alemanha), Evaporador de amostras TurboVap LV da Caliper® (EUA); Banho Seco
TE-21 da Tecnal (Brasil); Mesa de agitação TE-140 da Tecnal® (Brasil); Vortex
AP-56 da Phoenix® (Brasil); Deionizador de água Simplicity da Millipore® (EUA); Balança
analítica BP211D da Sartorius® (Alemanha), dispositivos coletores Salivette® foram
3.3. Preparação de soluções e reagentes
3.3.1. Preparação de soluções padrões de calibradores, controles de qualidade
e padrões internos
Para a preparação dos calibradores e controles de qualidade, ampolas dos
padrões analíticos de Anfetamina (ANF), Metanfetamina (MET), MDA, MDMA e
MDEA na concentração de 1 mg/mL foram transferidas individualmente com o
auxílio de pipetas de Pasteur para 5 balões volumétricos distintos de 10 mL, e os
volumes completados com metanol para originarem concentrações de 100 µg/mL
em cada balão volumétrico. Em seguida, com o auxílio de pipeta volumétrica, 1 mL
de cada solução contida nos balões volumétricos foi transferido para um único balão
volumétrico de 10 mL e o volume ajustado 10 mL com metanol, resultando na
concentração de 10 µg/mL da mistura de padrões. Dessa solução foi retirado 1 mL
para obter uma solução da mistura de padrões a uma concentração de 1 µg/mL em
novo balão volumétrico de 10 mL. O procedimento de diluição foi novamente
repetido para se obter a solução da mistura de padrões na concentração de 100
ng/mL.
Procedimento semelhante foi empregado para se obter soluções dos padrões
internos deuterados. Ampolas dos padrões internos de Anfetamina - d11 (ANF -
d11), Metanfetamina – d14 (MET - D14), MDA – d5 e MDMA – d5 tiveram o
conteúdo transferido para balões volumétricos de 10 mL separadamente com o
auxílio de pipetas de Pasteur, originando soluções na concentração de 10 µg/mL.
Posteriormente, 1 mL foi retirado de cada um dos balões volumétricos e adicionados
concentração de 1 µg/mL de uma solução da mistura de padrões internos
deuterados.
Todas as soluções preparadas de padrões e padrões internos foram
armazenadas a -20°C. em tubos com tampa de rosca e envolvidos em papel
alumínio.
3.3.2. Preparação dos reagentes
3.3.2.1. Preparação da solução de Trietilamina 0,1M em heptano
Pipetar 140 µL de Trietilamina e dispensar em um balão volumétrico de 10
mL. Completar o volume com heptano e agitar. A solução deve mantida sob
refrigeração e utilizada no período máximo de uma semana.
3.3.2.2. Preparação do tampão Na2CO3/NaHCO3 de pH 9,3
Preparar uma solução saturada de bicarbonato de sódio (60 g/L de água
deionizada). Ajustar o pH para 9,3 adicionando-se carbonato de sódio anidro à
solução e agitando-a continuamente. Caso haja presença de sólido no fundo,
removê-lo. A solução deve mantida sob refrigeração.
3.3.2.3. Preparação do tampão Tris de pH 7,4
Pesar 0,66 g do sal cloridrato de tris hidroximetil amino metanoe 0,1 g de tris
e agitar. Adicionar ácido clorídrico a 0,1M gota a gota para ajustar o pH para 7,4.
Armazenar em frasco de vidro à temperatura ambiente.
3.4. Desenvolvimento da metodologia
3.4.1. Escolha do solvente de extração
Inicialmente foi avaliada a possibilidade de se realizar extração com solvente
(extração líquido-líquido), já que esta é uma metodologia mais simples, de baixo
custo e pela saliva não ser considerada uma matriz biológica muito complexa. Foram
realizados experimentos com vários solventes. Primeiramente foram testadas
diluições da saliva fortificada com as substâncias de interesse utilizando-se tampões
de diferentes valores de pH, que foram submetidos a subseqüente extração com o
solvente acetato de etila. Os tampões utilizados foram: tampão fosfato de pH 6,0;
tampão Tris de pH 7,4; e tampão Na2CO3/NaHCO3 em pH 9,3. Como já era previsto,
o tampão que melhor contribuiu para extração das substâncias foi o tampão de pH
básico, pois as anfetaminas, sendo substâncias de caráter básico, tendem a
permanecer na forma não-ionizada (mais lipofílica) quando presentes em pH
também básico e a migrar para o meio de caráter mais apolar (solvente orgânico).
Testou-se o uso de tampão fosfato em pH 10 para se investigar melhor a influência
do pH na recuperação da metodologia, porém, além do aumento da formação de
emulsão, não houve ganho na recuperação da extração.
Após estabelecido o pH do tampão mais apropriado, foram testados
diferentes volumes de tampão adicionados à amostra. Em 500 µL de saliva foram
volume de saliva/volume de tampão para se realizar a extração. Foram testados 0,5
mL, 1,0 mL e 1,5 mL de tampão para a diluição da saliva, mas, não foi verificada
alteração muito significativa quanto à capacidade de extração empregando-se
diferentes volumes de tampão. Assim, decidiu-se por utilizar o volume de 1,0 mL de
tampão, pois demonstrou ser um volume suficiente para deixar a saliva mais fluida
para permitir melhor mistura entre as fases aquosa e orgânica e uma menor
formação de emulsão.
Em testes utilizados com agitação mais intensa foi necessária a adição de
NaCl após a centrifugação para reduzir a formação de emulsão. Após a adição,
repetiu-se a centrifugação e a formação de emulsão foi reduzida. Contudo, as
agitações mais brandas já se mostraram suficientes para proporcionar adequada
mistura entre a fase aquosa e a fase orgânica com pouquíssima formação de
emulsão e sem a necessidade da adição de NaCl.
Os solventes que foram testados para se verificar as capacidades de extração
foram: éter etílico, acetato de etila, diclorometano, éter de petróleo, hexano, tolueno
e clorobutano.
O éter etílico não pôde ser utilizado, pois uma pequena porção deste solvente
se dissolve no meio aquoso, reduzindo o volume da fase orgânica e dificultando seu
isolamento da fase aquosa.
Os solventes que apresentaram melhor capacidade de extração das
substâncias de interesse foram: acetato de etila, diclorometano, tolueno,
cloro-butano e hexano. Após definidos os melhores solventes quanto à capacidade de
extração, foi avaliada a velocidade de evaporação desses, essencial para a redução
do tempo de análise. Os solventes que reuniram as duas características desejadas
clorobutano e o acetato de etila. Entre os dois solventes preferiu-se utilizar o acetato
de etila.
Foram comparadas extrações utilizando-se volumes de saliva diferentes. Os
volumes testados foram de 1 mL e 0,5 mL de saliva e estes foram fortificados com a
mesma quantidade em massa dos analitos. O método de extração líquido-líquido,
por ter como característica a extração exaustiva do analito da matriz, apresentou
resultado equivalente para os diferentes volumes de saliva. Assim, optou-se por
utilizar o volume de 1 mL para o aumento da sensibilidade da metodologia.
3.5. Determinação das anfetaminas, metilenodioxi derivados e metabólitos em
amostras de saliva
O volume de 1 mL de saliva isenta das substâncias a serem estudadas, é
transferido para um tubo de ensaio, onde são adicionados 50 µL da solução de
padrões internos (ANF-d11; MET-d14; MDA-d5 e MDMA–d5) na concentração de
1000 ng/mL. As amostras são então agitadas em vortex e diluídas com 1 mL de
tampão Na2CO3/NaHCO3 de pH 9,3. Após, adiciona-se 2 mL de acetato de etila, e
submete-se o tubo a agitação branda em mesa agitadora por 20 minutos. O tubo é
então centrifugado (3000 RPM por 7 minutos) e 1,0 mL da fase orgânica é
transferido para outro tubo de fundo cônico e o solvente eliminado em evaporador
sob fluxo de N2. Os analitos presentes no resíduo foram então derivatizados de
acordo com a metodologia descrita por (Scheidweiler, et al. 2006), na qual as
anfetaminas são ressuspendidas com 100 µL da solução trietilamina a 0,1M em
heptano e 10 µL do derivatizante anidrido heptafluorbutírico (HFBA). O tubo é então
minutos. Ao término da incubação adiciona-se 200 µL de tampão Tris de pH 7,4. O
tubo é agitado intensamente em vortex (2 minutos com pequenas pausas a cada 10
segundos) e posteriormente é centrifugado (2200 RPM por 5 minutos). A fase
orgânica (60 µL) são transferidos para um vial de amostrador automático e 1 µL é
injetado no cromatógrafo.
As concentrações de anfetaminas, metilenodioxi derivados e metabólitos
foram determinados utilizando cromatógrafo em fase gasosa acoplado a um
espectrômetro de massas com analisador de massas ion trap no modo SIS (Single
Íon Selected). Os compostos foram separados em coluna capilar de sílica fundida
DB – 5MS de 30 m de comprimento x 0,25 mm x 0,25 µm de espessura de filme. As
amostras são injetadas no modo splitless. Gás hélio foi utilizado como gás de arraste
a um fluxo de 1,0 mL/min.
A temperatura do injetor é de 250 °C. A rampa de aq uecimento utilizada na
coluna analítica é de 70 °C (2 min), 15 °C/min, 280 °C (3 min).
A temperatura utilizada no trap é de 200 °C, no transfer line é de 230 °C e no
manifold é de 40 °C.
A Tabela 1 apresenta os íons monitorados na identificação e quantificação
Tabela 1. Íons utilizados na identificação e quantificação dos analitos
Íons monitorados
Analitos Identificação Quantificação
ANF 91,118, 240 240
ANF-d11 126, 244 244
MET 118, 210, 254 254
MET-d14 213, 261 261
MDA 135, 162, 380 135
MDA-d5 167, 380 167
MDMA 162, 210, 254 254
MDMA-d5 213, 258 258
MDEA 162, 240, 268 268
As Figuras de 6 a 14 apresentam os picos cromatográficos correspondentes
Figura 6. Cromatograma com a abundância de íons da ANF
Figura 8. Cromatograma com a abundância de íons da MET
Figura 10. Cromatograma com a abundância de íons do MDA
Figura 12. Cromatograma com a abundância de íons do MDMA
Figura 14. Cromatograma com a abundância de íons do MDEA
3.6. Curva de Calibração
Após definida a metodologia, foi estabelecida a curva de calibração
utilizando-se 8 pontos: 10 ng/mL; 30 ng/mL; 50 ng/mL; 100 ng/mL; 150 ng/mL; 200 ng/mL; 300
ng/mL; 400 ng/mL. As concentrações dos controles de qualidade (CQs) utilizados
foram de 25 ng/mL, 210 ng/mL e 350 ng/mL. Para obter essas concentrações foram
utilizadas 3 soluções da mistura de padrões nas concentrações de 100 ng/mL, 1
µg/mL e 10 µg/mL. A concentração utilizada da mistura de padrões internos foi de 50
ng/mL saliva e foi obtida pipetando-se 50 µL da solução de 1 µg/mL da mistura de
padrões internos. A Tabela 2 apresenta a concentração dos padrões e o volume
Tabela 2. Soluções utilizadas para preparação da curva de calibração e controles de qualidade. Concentrações Solução 1 100 ng/mL Solução 2 1 µg/mL Solução 3 10 µg/mL
10 ng/mL 100 µL - -
30 ng/mL - 30 µL -
50 ng/mL - 50 µL -
100 ng/mL - 100 µL -
150 ng/mL - - 15 µL
200 ng/mL - - 20 µL
300 ng/mL - - 30 µL
400 ng/mL - - 40 µL
CQ1 25 ng/mL - 25 µL -
CQ2 210 ng/mL - - 21 µL
CQ3 350 ng/mL - - 35 µL
Na curva de calibração, foi necessário aplicar métodos matemáticos de ponderação
da curva de calibração. Foi utilizado o fator de ponderação 1/X na curva de calibração.
3.7. Validação da metodologia de análise das anfetaminas, metilenodioxi
derivados e metabólitos em saliva por cromatografia em fase
gasosa/espectrometria de massas
Os parâmetros avaliados durante a validação da metodologia foram
selecionados conforme a resolução - RE nº 899, de 29 de maio de 2003 da Agência
3.7.1. Limites de detecção
É a menor concentração capaz de gerar um resultado positivo. É estabelecido
por meio da análise de soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do
analito, até o menor nível detectável, porém não necessariamente quantificado.
Pode-se estabelecer a relação sinal:ruído de 3:1 para se determinar o limite de
detecção.
Para a determinação dos limites de detecção, utilizou-se a relação de 3:1 do
sinal em relação ao ruído. Foram obtidos fortificando-se amostras de saliva em
duplicata com 1 ng, 2,5 ng, 5 ng e 7,5 ng dos analitos. O limite de detecção foi
determinado pela menor concentração em que os compostos obtiveram picos
cromatográficos maiores ou iguais à relação sinal:ruído 3:1 nas duas análises da
duplicata.
3.7.2. Limites de quantificação
O limite inferior de quantificação é a menor concentração na qual os analitos
podem ser detectados e quantificados com precisão de até 20% e exatidão entre
80% e 120%. O limite superior de quantificação é a maior concentração que pode
ser determinada com precisão de até 15% e exatidão entre 85% e 115%.
O limite de inferior de quantificação foi estabelecido por meio da análise de
matriz biológica contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível
quantificável com precisão e exatidão aceitáveis. O limite superior de quantificação
o valor em que foi provocado declínio do ponto em relação à curva de calibração que
prejudicou significativamente a quantificação do limite inferior.
3.7.3. Linearidade
É a capacidade que a metodologia deve possuir de produzir picos
cromatográficos com áreas diretamente proporcionais à concentração do analito na
amostra analisada dentro de um intervalo especificado. Este parâmetro é avaliado
através da injeção de amostras em concentrações crescentes para se obter um
gráfico cujos pontos são determinados correlacionando-se cada concentração com o
valor obtido na razão entre a área do íon de quantificação do padrão sobre a área do
íon de quantificação do padrão interno. Posteriormente, faz-se uma regressão linear
a fim de se observar o intervalo de concentrações em que o composto apresenta
disposição linear na reta determinada pela regressão linear.
3.7.4. Precisão
A precisão representa o grau de repetibilidade entre os resultados de análises
individuais, quando o procedimento é aplicado diversas vezes numa mesma amostra
homogênea, em idênticas condições de ensaio. É verificada utilizando-se, no mínimo
3 concentrações (baixa, média e alta), contemplando o intervalo adotado na curva
de calibração de maneira uniforme, realizando-se, no mínimo, 5 determinações por
Precisão Intra-Ensaios: é a concordância entre os resultados obtidos em
análises dentro de um curto período de tempo, com o mesmo analista e mesma
instrumentação.
Precisão Inter-Ensaios (Precisão Intermediária): é a concordância entre os
resultados obtidos pelo mesmo laboratório em dias diferentes, com analista diferente
e/ou equipamentos diferentes.
Pode ser expressa como Desvio Padrão Relativo (DPR) ou Coeficiente de
Variação (CV%), não se admitindo valores superiores a 15%, exceto para o limite de
quantificação, para o qual se admite valores até 20%, segundo a fórmula abaixo:
DPR = (DP/CMD)x100
Onde:
DPR = Desvio Padrão Relativo
DP = Desvio Padrão
CMD = Concentração Média Determinada
Foram necessários cinco dias para a validação da precisão. Foram avaliadas
as precisões intra-ensaio e inter-ensaio com utilização de 5 replicatas para cada um
dos três controles de qualidade (baixo, médio e alto). A precisão intra-ensaio foi
calculada obtendo-se os coeficientes de variação dos controles de qualidade de
cada composto dividindo-se o desvio padrão pela média aritmética em cada dia de
análises. Para a precisão inter-ensaio foi calculado o coeficiente de variação de
3.7.5. Exatidão: é a proximidade obtida entre o resultado da análise em relação
a um valor verdadeiro. É calculada pela fórmula:
Exatidão = (CME/CT)X100
Onde:
CME: Concentração Média Experimental
CT: Concentração Teórica
O parâmetro de exatidão é validado utilizando-se no mínimo 3 concentrações
(baixa, média e alta) ao longo da faixa de variação da curva de calibração, com um
mínimo de 5 determinações por concentração. Os valores de concentração obtidos
para os controles de qualidade não devem originar resultados abaixo de 85% ou
acima de 115%, exceto para o limite inferior de quantificação, que permite que sejam
aceitos valores entre 80% e 120%. A exatidão da metodologia foi avaliada
juntamente com a precisão. O cálculo da exatidão foi aplicado nas médias das
concentrações dos cinco dias de análises para cada controle de qualidade.
3.7.6. Recuperação
A recuperação avalia a capacidade da metodologia de extrair o analito da
amostra biológica dentro de um limite de variação. Recuperações próximas a 100%
para o analito e para o padrão interno são desejáveis, embora se admita valores de
recuperações menores, desde que a metodologia seja precisa, exata e apresente
determinada comparando-se os resultados de quantificação obtidos em amostras
fortificadas posteriormente à extração (fortificação do extrato) com os resultados de
quantificação obtidos pelo procedimento padrão de fortificação com posterior
extração. Os padrões internos foram adicionados anteriormente à extração nas duas
situações, de forma que os resultados de quantificação obtidos pudessem avaliar a
capacidade do solvente de extrair os analitos da saliva quando fossem comparados
com uma situação que, em tese, equivale à situação de 100% de eficiência de
extração (fortificação posterior do extrato obtido na extração dos padrões internos).
As recuperações foram avaliadas nos 3 controles de qualidade (baixo, médio e alto).
3.7.7. Especificidade
É a capacidade do método de detectar e quantificar com exatidão aceitável
um composto em presença de outros componentes, tais quais impurezas, produtos
de decomposição, metabólitos, medicamentos possíveis de utilização concomitante
e componentes da matriz biológica. O limite inferior de quantificação não deve ser
quantificado fora do intervalo entre 80% e 120% quando calculado na presença dos
interferentes investigados. Foi determinada através da fortificação das amostras de
saliva na concentração dos controles de qualidade inferiores juntamente com
quantidades elevadas de possíveis compostos interferentes que podem estar
presentes em situações reais de análises. Os interferentes foram avaliados a uma
concentração de 500 ng/mL. Os interferentes avaliados foram: ácido acetilsalicílico,
alprazolam, benzoilecgonina, cafeína, clomipramina, clonazepam, cocaína, 9-THC,
diazepam, dipirona, efedrina, fenilefrina, fluoxetina, lorazepan, nicotina,
3.7.8. Estabilidade
É a propriedade que o analito, e conseqüentemente a metodologia, deve
possuir de resistir a condições normalmente exigidas durante a análise. Deve ser
avaliada a estabilidade do analito após armazenagem de longa duração
(congelamento) e curta duração (à temperatura ambiente), após ciclos de
congelamento e descongelamento e pós-processamento.
Para a avaliação das estabilidades, foram utilizados 6 tubos de ensaio
contendo 1 mL de saliva em cada. Foram fortificados com os compostos, sendo três
controles de qualidade baixos e três altos.
Estabilidade de curta duração: A estabilidade de curta duração avalia o tempo
em que o composto pode resistir à temperatura à qual normalmente está exposto
sobre a bancada de análise. Foi determinada expondo-se os controles de qualidades
durante 6 horas à temperatura ambiente analisando-os em seguida.
Estabilidade de longa duração: A estabilidade de longa duração avalia o
tempo em que do composto pode permanecer em uma matriz biológica quando
congelado a -20 °C. A estabilidade de longa duração não pôde ser determinada em
um intervalo grande de tempo, pois houve modificações da curva de calibração no
decorrer da validação e consequentemente dos respectivos controles de qualidade.
Assim, a estabilidade de longa duração foi determinada em apenas duas semanas
após as amostras terem sido congeladas.
Estabilidade de congelamento e descongelamento: A estabilidade de
congelamento e descongelamento avalia a capacidade do composto de resistir à
