Avaliação de diferentes tipos de fases estacionárias para separações rápidas em cromatografia líquida utilizando antidiabéticos orais como modelo

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

LAURA MARIA FONTES PRADO

AVALIAÇÃO DE DIFERENTES TIPOS DE

FASES ESTACIONÁRIAS PARA SEPARAÇÕES

RÁPIDAS EM CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

UTILIZANDO ANTIDIABÉTICOS ORAIS COMO

MODELO

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LAURA MARIA FONTES PRADO

AVALIAÇÃO DE DIFERENTES TIPOS DE FASES

ESTACIONÁRIAS PARA SEPARAÇÕES RÁPIDAS EM

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA UTILIZANDO

ANTIDIABÉTICOS ORAIS COMO MODELO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Gerson Antônio Pianetti - UFMG Co-orientador: Prof. Dr. Christian Fernandes - UFMG

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Prado, Laura Maria Fontes.

P896a Avaliação de diferentes tipos de fases estacionárias para separações _{rápidas em cromatografia líquida utilizando antidiabéticos orais como}

modelo / Laura Maria Fontes Prado. – 2013.

188 f. : il.

Orientador: Dr. Gerson Antônio Pianetti. Co-orientador: Dr. Christian Fernandes.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Farmácia, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.

1. Cromatografia líquida de alta eficiência - Teses. 2.

Medicamentos – Teses. 3. Validação de método – Teses. I. Pianetti, Gerson Antônio. II. Fernandes, Christian. III. Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Farmácia. IV.Título.

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Dedico este trabalho aos meus pais, Guilherme e Dôra, pelo amor e dedicação

incondicionais à ciência. Obrigada por me apresentarem à pesquisa científica e por

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AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Gerson Antônio Pianetti, por fornecer todas as condições necessárias para o desenvolvimento dessa dissertação e por confiar no meu trabalho.

Ao professor Dr. Christian Fernandes, pela co-orientação, dedicação, contribuições técnicas e pelas valiosas discussões.

Ao Ricardo, pela ajuda na operação do UHPLC, pela amizade e disponibilidade em ajudar durante toda a execução desse trabalho.

Aos amigos do LCQ, Betânia, Fernando, Geovani, Iara, Isabela, Juliana, Léo, Luciano, Mariana, Paula Enéas, Paula Chelini, Ricardo, Taízia, Tiago e Vinícius, pelos ensinamentos e amizade.

Aos professores e funcionários da Faculdade de Farmácia da UFMG, em especial ao Eduardo, pela agradável convivência.

À CIFARMA e à FUNED pelo fornecimento das matérias primas utilizadas.

À minha mãe, minha orientadora desde sempre! Pela preocupação e incentivo durante toda a minha formação acadêmica. Em especial pela colaboração na correção desse trabalho, pelas intermináveis discussões e pelo entusiasmo contagiante, capaz de transformar a correção de uma simples frase em algo extremamente recompensante.

Ao meu pai, pelo apoio, incentivo e terno cuidado dispensados a mim.

Aos meus irmãos, Renata, Lívia, Paula, Fábio e Andréia, pelo companheirismo e

por, literalmente, “encherem” a minha vida.

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Ao Guilherme, que sonha comigo os meus sonhos, que me permite sonhar os seus e, assim, juntos, sonhamos os nossos! Pela dedicação, carinho, companheirismo e

por encher a minha vida de amor e alegrias.

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“Gostaria de te desejar tantas coisas. Mas nada seria suficiente.

Então, desejo apenas que você tenha muitos desejos.

Desejos grandes.

E que eles possam te mover a cada minuto.”

(Carlos Drummond de Andrade)

“Ambição é o caminho para o sucesso. Persistência é o veículo no qual se chega lá”.

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RESUMO

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) convencional, que emprega fase estacionária com partículas totalmente porosas de diâmetro entre 3-5 µm (CV), apresenta limitações no que concerne à possibilidade de gerar análises rápidas mantendo elevada eficiência cromatográfica. Diante da demanda por métodos rápidos e eficientes, diferentes fases estacionárias foram desenvolvidas: fases com partículas de núcleo fundido (NF), com partículas totalmente porosas com diâmetro inferior a

2 µm (Sub 2 μm) e monolíticas (MN). Como ainda há poucos estudos que aplicam e comparam essas novas fases, o objetivo do presente trabalho foi comparar esses novos materiais, utilizando como modelo métodos analíticos para determinação de antidiabéticos orais (clorpropamida, glibenclamida, glimepirida e gliclazida). Inicialmente foi desenvolvido e otimizado método em coluna CV C18 100 x

2,1 mm, 5 μm, acetonitrila:Solução acetato de amônio 5 mM pH 3,0 (50:50) como fase móvel,

volume de injeção 2 μl, detecção em 230 nm, 30 o

C. Esse método foi transferido para as colunas MN

(C18 100 x 2,0 mm), NF (C18 100 x 2,1 mm, 2,7 μm) e Sub 2 μm (C18 100 x 2,1 mm, 1,8 μm), após

ajustes nas proporções de acetonitrila e solução de acetato de amônio. Todas as colunas foram caracterizadas quanto à porosidade total, capacidade de retenção, seletividade, permeabilidade e volume morto. Com o objetivo de reduzir o efeito extracoluna os parâmetros instrumentais volume do loop, diâmetro interno do tubo de PEEK e frequência de aquisição dos dados/constante de tempo do detector foram otimizados. Aplicando-se os parâmetros otimizados e os métodos para determinação de antidiabéticos, as colunas foram comparadas em termos de eficiência (análise das curvas de Van Deemter, de Knox e gráficos de performance cinética), velocidade de análise, resolução, simetria do pico e pressão. A coluna monolítica, apesar de compatível com equipamentos de HPLC e de propiciar análises mais eficientes do que a convencional em vazões elevadas, apresentou eficiência inferior a gerada pelas colunas de núcleo fundido e Sub 2 μm, além de dar origem a picos de pior simetria.

Considerando a determinação da glimepirida como exemplo, verificou-se que coluna de núcleo fundido gerou análises com 90% da eficiência máxima e da velocidade ótima propiciadas pela coluna

Sub 2 μm, com a vantagem de não gerar pressões acima de 400 bar, o que permite o uso de equipamento de HPLC. Além disso, assim como a coluna Sub 2 μm, a de núcleo fundido foi capaz de

manter elevada eficiência em altas velocidades de análise e de gerar picos de boa simetria. Com o objetivo de comparar as colunas em uma situação limite de pressão e resolução, métodos extremamente rápidos para determinação de antidiabéticos foram desenvolvidos. Verificou-se que o método extremo com a coluna Sub 2 μm foi o mais rápido, mas levando-se em conta velocidade de análise, eficiência e pressão, o método extremo com a coluna de núcleo fundido foi o ideal. Assim, o método rápido com esta coluna foi validado, utilizando-se a glibenclamida como modelo. Demonstrou-se a capacidade da coluna de núcleo fundido em gerar resultados quantitativos confiáveis.

Palavras-chave: coluna monolítica, coluna de núcleo fundido, partículas sub 2 μm, UHPLC, curva de

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ABSTRACT

Conventional High Performance Liquid Chromatography (HPLC), which uses columns packed with totally porous particles with diameter between 3-5 µm (CV), has some limitations regarding the possibility to generate fast analysis maintaining high efficiency. Recently new stationary phases, such as those packed with fused core particles (FC), packed with fully porous particles with diameter less

than 2 μm (Sub 2 μm) and monolithic phases (MN) have been introduced in the market in order to

reduce analysis time maintaining high resolution and efficiency. However, there are few studies comparing and applying these new approaches. With this in view this study aimed to compare these new stationary phases, using analytical methods for oral antidiabetics (chlorpropamide, glibenclamide, gliclazide and glimepiride) determination as model. Initially the followed analytical method for antidiabetics determination was developed and optimized in CV column (C18 column 100 x 2.1 mm, 5

μm): mobile phase composed of acetonitrile and ammonium acetate buffer 5 mM pH 3.0 (50:50), volume of injection 2 μl, detection at 230 nm, 30 oC. This method has been transferred to MN (C18 100 x 2.0 mm), NF (C18 100 x 2.1 mm, 2.7 μm) and Sub 2 μm columns (C18 100 x 2.1 mm, 1.8 μm), after adjustments in acetonitrile and buffer proportion. The columns (CV, MN, FC and Sub 2 μm) were characterized in terms of dead volume, porosity, retention factor, selectivity and permeability. In order to reduce extra-column volume the followed instrumental chromatographic parameters were optimized: loop volume, internal diameter (id) of PEEK tube and data acquisition frequency/detector time constant. Applying the optimized parameters and the methods for antidiabetics determination, the columns were compared in terms of performance (analysis of Van Deemter, Knox and kinetic plots), analysis speed, resolution, peak symmetry and pressure. According to the results fused core column is the best alternative to conventional one. Although monolithic column conducted to more efficient

analyzes at higher flow rates than conventional one, it was less efficient than fused core and Sub 2 μm

columns. Besides, peaks from monolithic column presented worse symmetry. Considering the determination of glimepiride as example, fused core column provided analysis with 90% of maximum

efficiency and optimal speed achieved by sub 2 μm column with the advantage of generate pressure

bellow 400 bar, which allows the use of conventional HPLC instrument. Furthermore, as Sub 2 μm

column, fused core was able to maintain high efficiency at high analysis speed and generate peak with suitable symmetry. Aiming to compare the columns in a extreme situation of pressure and resolution, fast methods for antidiabetics determination were developed. Extremely method developed in Sub 2

μm column was the fastest, but taking into account analysis speed, efficiency and pressure, the

extreme method developed in fused core column was the ideal. Considering that fused core column showed the best relation between speed, efficiency and pressure, a quantitative evaluation of its performance was carried out. The extreme method in fused core column was validated for glibenclamide and the ability of this column to provide reliable quantitative results was demonstrated.

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LISTA DE FIGURAS

INTRODUÇÃO GERAL

1 Histórico do desenvolvimento de partículas para fases estacionárias... ₂₇

CAPÍTULO 1 1.1 Estrutura geral das sulfoniluréias... ₃₅

1.2 Estruturas químicas da CL, GB, GM e GZ... ₃₆

1.3 Cromatograma de rosiglitazona (1), pioglitazona (2), glipizida (3), gliclazida (4), glibenclamida (5), celecoxibe - padrão interno (6) e repaglinida (7). (a) branco, (b) plasma humano contaminado com os padrões dos antidiabéticos e padrão interno (c) mistura sintética contendo antidiabéticos e o padrão interno... 40

1.4 Curva de Van Deemter... ₄₄

1.5 Espectros de varredura dos antidiabéticos... ₅₁

1.6 Curvas de Van Deemter da CL em diferentes fases móveis... ₅₂

1.7 Curvas de Van Deemter da GZ em diferentes fases móveis... ₅₂

1.8 Curvas de Van Deemter da GB em diferentes fases móveis... ₅₂

1.9 Curvas de Van Deemter da GM em diferentes fases móveis... ₅₃

1.10 Relação entre percentual de ACN na fase móvel e k dos antidiabéticos... 53

1.11 Relação entre vazão e Rs (GM/GB) nas diferentes fases móveis... 54

1.12 Relação entre vazão e pressão do sistema nas diferentes fases móveis... ₅₅

1.13 Curvas de Van Deemter da GM nas concentrações de 100 e 250 _μg/ml... ₅₇

1.14 Curvas de Van Deemter da CL nos diferentes volumes de injeção... ₅₉

1.15 Curvas de Van Deemter da GM nos diferentes volumes de injeção... ₅₉

1.16 Cromatograma obtido durante análise de antidiabéticos em coluna convencional ₆₁ CAPÍTULO 2 2.1 Micrografia da fase monolítica de sílica... ₆₉

2.2 Macroporos de 2 μm (a) e mesoporos de 13 nm (b) da fase monolítica... ₇₀

2.3 Micrografia de partícula de núcleo fundido... ₇₄

2.4 Esquema de partícula de núcleo fundido... ₇₄

2.5 Relação entre a porcentagem de acetonitrila presente na fase móvel e retenção (k) da gliclazida nas diferentes colunas... ₈₅

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2.7 Relação entre u0 e ∆Pc nas diferentes colunas... 87

CAPÍTULO 3 3.1 Esquema de equipamento de HPLC - em vermelho, os fatores que contribuem para o efeito extracoluna -... 95

3.2 Medida da largura na linha de base (4 σ) e da largura n_{a meia altura (2,354 σ)}... ₉₇

3.3 Relação entre vazão e _σ2 extracoluna em análises com loopsde 2, 5 e 10 μl... 103

3.4 Relação entre vazão e _σ2 extracoluna em análises com PEEK de 0,0025 e 0,004 polegada de di... ₁₀₄

3.5 Relação entre vazão e pressão em análises com PEEK de 0,0025 e 0,004 polegada de di... ₁₀₅

3.6 Relação entre vazão e _σ2 extracoluna em análises com diferentes pares de F/t... ₁₀₆

3.7 Relação entre vazão e Er dos antidiabéticos em loopsde 10 e 2 μl - Coluna CV... 108

3.8 Relação entre vazão e Er dos antidiabéticos em loopsde 10 e 2 μl - Coluna MN... 108

3.9 Relação entre vazão e Er dos antidiabéticos em loopsde 10 e 2 μl - Coluna NF... 109

3.10 Relação entre vazão e Erdos antidiabéticos em loopsde 10 e 2 μl - Coluna Sub 2 μm... ₁₀₉

3.11 Relação entre F/t e Er dos antidiabéticos - vazão de 0,6 ml/min... 112

3.12 Relação entre F/t e Er dos antidiabéticos - vazão de 0,15 ml/min... 112

CAPÍTULO 4 4.1 Efeito da difusão de Eddy (A) no alargamento do pico... 119

4.2 Efeito da difusão longitudinal (B) no alargamento do pico... 119

4.3 Efeito da resistência à transferência de massa (C) no alargamento do pico... 120

4.4 Contribuição dos termos A, B e C na obtenção da curva de Van Deemter... 120

4.5 Curvas de Van Deemter em quatro diferentes colunas obtidas para o etilbenzeno... 122

4.6 Gráfico de performance cinética (N x t0) ... 128

4.7 Transformações matemáticas para o cálculo de u0 otm... 132

4.8 Curvas de Van Deemter da CL nas diferentes colunas... ₁₃₄

4.9 Curvas de Van Deemter da GZ nas diferentes colunas... ₁₃₄

4.10 Curvas de Van Deemter da GB nas diferentes colunas... ₁₃₅

4.11 Curvas de Van Deemter da GM nas diferentes colunas... ₁₃₅

(13)

4.13 Gráfico de performance cinética N x t0/N

2_{da GM}

... ₁₄₁

4.14 Gráfico de performance cinética N x L da GM... 142

4.15 Gráfico de performance cinética np x tr da GM... 143

4.16 Cromatogramas relativos às análises dos antidiabéticos nas colunas (a) CV, (b) MN, (c) NF e (d) Sub 2 μm - ordem de eluição: CL, GZ, GB, e GM... 146

4.17 Relação entre vazão e pressão nas diferentes colunas... ₁₄₈

CAPÍTULO 5 5.1 Cromatogramas referentes à formulação de lidocaína - (1) metilparabeno, (2) 2,6-dimetilanilina, (3) propilparabeno e (4) lidocaína... 157

5.2 Cromatograma das substâncias relacionadas da glimepirida a (1) e b (2), glibenclamida (3) e glimepirida (4)... 158

5.3 Cromatogramas referentes às análises dos antidiabéticos utilizando os métodos extremos desenvolvidos em coluna (a) CV (b) MN (c) NF (d_{) Sub 2 μm}- ordem de eluição: CL, GZ, GB e GM... 171

5.4 Cromatogramas da GB (a) padrão, (b) amostra, (c) diluente (d) placebo - coluna CV... 172

5.5 Cromatogramas da GB (a) padrão, (b) amostra, (c) diluente (d) placebo - coluna NF... 173

5.6 Curva analítica para a determinação de GB em comprimidos - coluna CV... ₁₇₆

5.7 Curva analítica para a determinação de GB em comprimidos - coluna NF... ₁₇₆

5.8 Gráfico de distribuição de resíduos - coluna CV... ₁₇₆

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LISTA DE QUADROS

CAPÍTULO 1

1.1 Concentração de glicose plasmática (mg/dl) para diagnóstico de Diabetes

Mellitus e seus estágios pré-clínicos... 33

1.2 Medicamentos utilizados no tratamento do DM 2... 34

1.3 Propriedades físico-químicas dos fármacos CL, GB, GM e GZ... 37

1.4 Métodos farmacopeicos de análise de CL, GB, GM e GZ... 41

1.5 Parâmetros analíticos dos métodos cromatográficos farmacopeicos para determinação de CL, GB, GM e GZ... 42

(15)

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1

1.1 Fabricante, número de lote, pureza e validade dos insumos farmacêuticos

ativos dos fármacos CL, GB, GM e GZ... 46

1.2 Condições analíticas preliminares... ₄₈

1.3 Otimização das condições cromatográficas em coluna convencional... ₄₉

1.4 Fatores de assimetria dos picos dos antidiabéticos nas diferentes fases móveis... 56

1.5 Fatores de assimetria dos picos dos antidiabéticos nas concentrações de 100 e 250 μg/ml... 58

1.6 Condições de análise para determinação de antidiabéticos nas diferentes colunase valores de k... 62

CAPÍTULO 2 2.1 Condições de análise para determinação de antidiabéticos nas diferentes colunas... 82

2.2 Pressões máximas suportadas pelas colunas e valores de vazão máximos empregados em cada coluna para determinação de Kv0... 82

2.3 Volume morto e porosidade total das colunas... ₈₃

2.4 Inclinação do gráfico das retas u0 x ∆Pc, viscosidade da fase móvel, comprimento e permeabilidade das colunas... 87

CAPÍTULO 3 3.1 Experimentos de otimização dos parâmetros instrumentais cromatográficos... ₁₀₀

3.2 Condições de análise para determinação de antidiabéticos nas diferentes colunas... 101

3.3 Er para a glibenclamida nas quatro colunas - vazão de 0,3 ml/min... 110

3.4 Erdos antidiabéticos na coluna sub 2 μm - vazão de 0,3 ml/min... 111

3.5 Er da clorpropamida em diferentes vazões e relações F/t... 113

3.6 Er dos antidiabéticos em diferentes relações F/t - vazão de 0,6 ml/min... 113

3.7 Volumes dos componentes do equipamento de UHPLC (Acquity®) e volume extracoluna ... 114

(16)

4.2 Equações referentes às curvas de Van Deemter da CL e GZ - Figuras 4.8 e

4.9... 136

4.3 Equações referentes às curvas de Van Deemter da GB e GM - Figuras 4.10 e 4.11... ₁₃₆

4.4 Valores de Hmin e u0 opt relativos às curvas de Van Deemter das figuras 4.8 a 4.11... 138

4.5 Equações e valores de hmin e v0 opt referentes às curvas de Knox da GM... 140

4.6 Valores de resolução entre GZ/CL, GB/GZ e GM/GB, nas diferentes colunas... ₁₄₄

4.7 Fatores de assimetria dos picos dos antidiabéticos orais nas diferentes colunas... 147

CAPÍTULO 5 5.1 Condições de análise para determinação de antidiabéticos nas diferentes colunas... 160

5.2 Pressão máxima suportada pelas diferentes colunas... ₁₆₁

5.3 Função farmacotécnica, percentuais usuais e percentuais adicionados dos excipientes presentes no comprimido referência de glibenclamida (Daonil®)... 164

5.4 Preparo das soluções de glibenclamida para avaliação da linearidade... ₁₆₅

5.5 Preparo das soluções para o ensaio de exatidão... ₁₆₇

5.6 Distribuição das variáveis nos experimentos de robustez... ₁₆₈

5.7 Condições analíticas para determinação extremamente rápida de antidiabéticos nas diferentes colunas... 169

5.8 Parâmetros cromatográficos obtidos em análises de antidiabéticos utilizando os métodos extremos desenvolvidos... 170

5.9 Valores médios e DPR dos parâmetros de adequabilidade do sistema... 173

5.10 Áreas das soluções padrão de trabalho e amostra por período de 4 horas... 174

5.11 Testes estatísticos aplicados aos dados de regressão linear... 174

5.12 Concentrações de glibenclamida e valores de área para a construção das curvas analíticas... 175

5.13 Valores de área e teor de glibenclamida em comprimidos para avaliação da precisão dos métodos extremos relativos às colunas CV e NF... 177

5.14 Percentual de recuperação de glibenclamida adicionada ao placebo para avaliação da exatidão dos métodos extremos nas colunas CV e NF... 178

5.15 Limites de detecção e quantificação... 179

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LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

A Coeficiente de difusão axial ou difusão de Eddy ACN Acetonitrila

As Fator de assimetria

AU Absorbância

B Coeficiente de difusão longitudinal BP Farmacopeia britânica

C Coeficiente de resistência à transferência de massa

CA Chemical Abstract

CL Clorpropamida

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

cp Centipoise

CV Coluna convencional Conc. Concentração

Dm Coeficiente de difusão do analito

DM 1 Diabetes Mellitus tipo 1 DM 2 Diabetes Mellitus tipo 2 di Diâmetro interno

dp Diâmetro da partícula

DPR Desvio Padrão Relativo

 Porosidade total

Er Eficiência remanescente

Eur. Farmacopeia europeia

ECV Extra-column volume

exp. Experimento

F Frequência de aquisição dos dados F. Bras Farmacopeia Brasileira

FM Fase Móvel

GB Glibenclamida

GM Glimepirida

GZ Gliclazida

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h Altura do prato teórico reduzido Hmin Altura mínima do prato teórico

hmin Altura mínima do prato teórico reduzido

HPLC High Performance Liquid Chromatography HTLC High Temperature Liquid Chromatography IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística K Constante característica da qualidade da injeção k Fator de retenção

K+ATP Canais de potássio ATP dependentes Kv0 Permeabilidade da coluna

L Comprimento da coluna min. Minutos ou Mínima

max. Máxima

MN Coluna monolítica

N Número de pratos teóricos

 Viscosidade da fase móvel np Fator de capacidade do pico

NF Coluna com partículas de núcleo fundido OMS Organização Mundial de Saúde

∆Pmax Pressão máxima

∆Pc Pressão da coluna

∆Pec Pressão extracoluna

∆Pt Pressão total

P Pressão do sistema cromatográfico

PEEK Poly(ether-ether-ketone)

rc Raio da coluna

r Coeficiente de correlação linear

Rs Resolução

RENAME Relação Nacional de Medicamentos Essenciais

Sub 2 μm Coluna com partículas porosas de diâmetro menor que 2 μm t Constante de tempo do detector

T Temperatura

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t0 Tempo morto

u0 Velocidade linear da fase móvel

u0 otm Velocidade linear ótima da fase móvel

UHPLC Ultra High Performance Liquid Chromatography USP United State Pharmacopeia

V Vazão

v0 Velocidade linear da fase móvel reduzida

v0 otm Velocidade linear ótima da fase móvel reduzida

Vm Volume morto

Vinj Volume de injeção

w0,5 Largura do pico na meia altura

w Largura do pico na linha de base

 Comprimento de onda

α Seletividade

2

coluna/2 c Variância da coluna

2

extracoluna /2 ec Variância extracoluna

2

total/2 t Variância total

2

ec max Variância extracoluna máxima aceitável

 Desvio padrão

 Fator de resistência da coluna

(20)

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO GERAL... 25

1 ESTADO DA ARTE DA CLAE... 26

2 JUSTIFICATIVA... 29

3 OBJETIVO GERAL... 29

REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS... 30

CAPÍTULO 1 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA EM DIFERENTES COLUNAS PARA DETERMINAÇÃO DE ANTIDIABÉTICOS ORAIS... 31

1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 32

1.1 Diabetes Mellitus... 32

1.2 Tratamento... 33

1.3 Sulfoniluréias... 35

1.4 Curva de Van Deemter... 44

2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 45

3 MATERIAIS E MÉTODOS... 46

3.1 Materiais... 46

3.1.1 Insumos farmacêuticos ativos... 46

3.1.2 Solventes, reagentes e vidrarias... 46

3.1.3 Equipamentos e colunas cromatográficas... 46

3.2 Métodos... 47

3.2.1 Desenvolvimento de método analítico por cromatografia líquida para a determinação de CL, GB, GM e GZ em coluna CV... 47

3.2.2 Otimização de método analítico por cromatografia líquida para a determinação CL, GB, GM e GZ em coluna CV... 48

3.2.3 Transferência do método desenvolvido e otimizado em coluna CV para as colunas MN, NF e Sub 2 μm... 49

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 50

(21)

4.2 Otimização de método analítico por cromatografia líquida para a

determinação de CL, GB, GM e GZ em coluna CV... 51

4.2.1 Fase móvel... 51

4.2.2 Concentração... 57

4.2.3 Volume de injeção... 58

4.2.4 Temperatura... 61

4.3 Transferência do método desenvolvido e otimizado em coluna CV para as colunas MN, NF e Sub 2 μm... 62

5 CONCLUSÃO... 63

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 64

CAPÍTULO 2 CARACTERIZAÇÃO FÍSICA DAS COLUNAS CROMATOGRÁFICAS... 67

1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 68

1.1 Coluna monolítica... 68

1.2 Coluna empacotada com partículas de núcleo fundido... 72

1.3 Coluna empacotada com partículas porosas sub 2 µm... 75

2 OBJETIVO ESPECÍFICO... 78

3 MATERIAIS E MÉTODOS... 78

3.1 Materiais... 78

3.1.1 Insumos farmacêuticos ativos... 78

3.1.2 Solventes, reagentes e vidrarias... 78

3.1.3 Equipamentos e colunas cromatográficas... 78

3.2 Métodos... 78

3.2.1 Estimativa do volume morto e porosidade total das colunas... 78

3.2.2 Avaliação da retenção e seletividade das colunas... 79

3.2.3 Estimativa da permeabilidade das colunas... 80

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 83

4.1 Estimativa do volume morto e porosidade total das colunas... 83

4.2 Estimativa da retenção e seletividade das colunas... 84

4.2.1 Retenção... 84

4.2.2 Seletividade... 86

(22)

CAPÍTULO 3 OTIMIZAÇÃO DE PARÂMETROS INSTRUMENTAIS CROMATOGRÁFICOS... 93

1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 94 1.1 Efeitos extracoluna e a eficiência cromatográfica... 94

(23)

4.3 Cálculo do volume extracoluna (ECV) real... 114 5 CONCLUSÃO... 114

CAPÍTULO 4 AVALIAÇÃO E COMPARAÇÃO QUALITATIVA DA EFICIÊNCIA DE COLUNAS CROMATOGRÁFICAS... 117

1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 118 1.1 Curvas de Van Deemter e de Knox... 118 1.2 Características das curvas de Van Deemter e de Knox das colunas MN, NF e Sub 2 μm... 122 1.2.1 Coluna monolítica... 122 1.2.2 Coluna empacotada com partículas de núcleo fundido... 123 1.2.3 Coluna empacotada com partículas sub 2 μm... 125 1.3 Gráficos de performance cinética... 126

2 OBJETIVO ESPECÍFICO... 129

3 MATERIAIS E MÉTODOS... 130 3.1 Materiais... 130 3.1.1 Insumos farmacêuticos ativos... 130 3.1.2 Solventes, reagentes e vidrarias... 130 3.1.3 Equipamentos e colunas cromatográficas... 130 3.2 Métodos... 130 3.2.1 Avaliação da eficiência e velocidade de análise das colunas... 130 3.2.2 Avaliação da resolução, fator de assimetria e pressão... 133

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 134 4.1 Avaliação da eficiência e velocidade de análise das colunas... 134 4.1.1 Curvas de Van Deemter... 134 4.1.2 Curvas de Knox... 140 4.1.3 Gráficos de performance cinética... 141 4.2 Avaliação da resolução, fator de assimetria e pressão... 143 4.2.1 Resolução... 143 4.2.2 Fator de assimetria dos picos... 146 4.2.3 Pressão do sistema cromatográfico... 148

(24)

CAPÍTULO 5 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS EXTREMAMENTE RÁPIDOS... 155

1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 156 1.1 Métodos analíticos extremamente rápidos... 156 1.2 Métodos analíticos para determinação de sulfoniluréias... 158

3 MATERIAIS E MÉTODOS... 159 3.1 Materiais... 159 3.1.1 Insumos farmacêuticos ativos... 159 3.1.2 Solventes, reagentes e vidrarias... 159 3.1.3 Equipamentos e colunas cromatográficas... 160 3.1.4 Substâncias químicas de referência e amostras... 160 3.2 Métodos... 160 3.2.1 Desenvolvimento e comparação de métodos analíticos extremamente rápidos para determinação de antidiabéticos nas colunas

CV, MN, NF e Sub 2 μm... 160 3.2.2 Comparação das colunas CV e NF em termos quantitativos... 162

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 169 4.1 Desenvolvimento e comparação de métodos analíticos extremamente rápidos para determinação de antidiabéticos nas colunas CV, MN, NF e

Sub 2 μm... 169 4.2 Comparação das colunas CV e NF em termos quantitativos... 172 4.2.1 Seletividade e adequabilidade do sistema (system suitability)... 172 4.2.2 Estabilidade das soluções padrão de trabalho e amostra... 174 4.2.3 Linearidade... 174 4.2.4 Precisão intra-corrida e precisão inter-corridas... 177 4.2.5 Exatidão... 178 4.2.6 Limites de detecção e quantificação... 179 4.2.7 Robustez... 179

(25)

CONCLUSÃO FINAL... 184

(26)

(27)

1 ESTADO DA ARTE DA CLAE

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), em inglês High Peformance Liquid Chromatography (HPLC), é considerada a técnica mais desenvolvida, difundida e empregada em laboratórios analíticos de indústrias farmacêuticas, químicas e de pesquisa. Isso se justifica, pois esta técnica é adequada para a separação eficiente de substâncias, o que se aplica, por exemplo, às análises de controle de qualidade, nas quais são realizadas determinações quantitativas de fármacos, de impurezas de síntese e de produtos de degradação, análises farmacocinéticas e estudos pré-clínicos de moléculas candidatas a fármacos [1, 2, 3].

Desde o início do desenvolvimento da Cromatografia a Líquido, na década de 1950, até os dias atuais, muitos avanços, impulsionados pelo desenvolvimento de novas partículas de fases estacionárias e da instrumentação, foram alcançados. A necessidade de execução de análises mais rápidas, sem que houvesse o comprometimento do desempenho cromatográfico, foi o que impulsionou as pesquisas com o objetivo de tornar a técnica mais rápida e eficiente. Em 1950 eram utilizadas colunas empacotadas com partículas irregulares de 100-200 μm, que

alcançavam eficiência de apenas 200 pratos/15 cm. Por volta dos anos 60 foram introduzidas as colunas contendo partículas peliculares rígidas de 40-50 μm,

mecanicamente resistentes, que ofereciam maior eficiência (1000 pratos/15 cm). A

transição para partículas porosas menores com diâmetro em torno de 10 μm ocorreu

por volta dos anos 70, propiciando eficiência de 6000 pratos/15 cm. A partir dos anos 80, com a introdução das partículas esféricas, o desenvolvimento voltou-se basicamente para a redução do diâmetro das partículas da fase estacionária e

surgiram as primeiras partículas esféricas de diâmetro de 5 μm. Hoje já há disponíveis colunas com partículas esféricas porosas de 1,7 μm, que permitem

(28)

Ano de

introdução Tamanho da partícula mais popular Tamanho nominal (μm) (Aproximado) Pratos/15 cm

1950 100 200

1967 50 pelicular 1000

1972 10 6000

1985 5 12000

1992 3-3,5 22000

1996 1,5* pelicular 30000

1999 5,0 superficie porosa 8000**

2000 2,5 25000

2003 1,8 32500

2006 2,7 -

*Sílica não porosa ou resina ** Para proteína PM 5.700

Figura 1 - Histórico do desenvolvimento de partículas para fases estacionárias [Adaptado de 4 e 5]

Na área farmacêutica houve um grande aumento no número de análises de pureza, análises aplicadas aos estudos farmacocinéticos e análises de controle de qualidade, o que fez com que laboratórios farmacêuticos se tornassem uma das forças motrizes para o desenvolvimento de análises rápidas. O crescimento da indústria farmacêutica ocorreu em todo mundo, inclusive no Brasil. Segundo dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), as vendas da indústria farmacêutica nacional cresceram 9,43% de 2011 para 2012, comparando dados dos meses de janeiro a julho de ambos os anos. Esse crescimento só foi possível, e só poderá ser mantido ou ampliado, se a capacidade analítica das indústrias aumentarem, o que justifica o interesse por técnicas cada vez mais rápidas [2, 6].

O atual domínio do uso dos métodos cromatográficos na área farmacêutica, em especial da técnica HPLC, é evidente nas farmacopeias. Na Farmacopeia

Formato

irregular

(29)

Americana número 16, publicada em 1960, os métodos cromatográficos eram empregados em aproximadamente 3% das monografias. Já na Farmacopeia Americana número 34, de 2011, 77% das monografias continham ao menos um método cromatográfico e 54% eram por HPLC. Esse aumento expressivo na aplicação da cromatografia em análises farmacêuticas em substituição aos métodos tradicionais (exemplos: espectrometria no visível e ultravioleta; volumetrias) resultou em um controle mais efetivo da identidade, potência e pureza dos fármacos [7].

Atualmente a técnica HPLC que emprega fase estacionária convencional, empacotada com partículas totalmente porosas de diâmetro entre 3 e 5 µm (CV), ainda é a mais comum nos laboratórios. Cromatógrafos destinados a esse tipo de cromatografia operam com valores de pressão máxima de 400 bar. Apesar de o desempenho cromatográfico ser adequado, uma análise corrida analítica por HPLC pode levar, em média, de 10 a 45 minutos [2, 8].

Alternativas estão sendo desenvolvidas para diminuir o tempo e melhorar a eficiência de análises realizadas por HPLC. Uma delas refere-se à substituição das colunas com partículas totalmente porosas tradicionais por colunas monolíticas (MN) ou de núcleo fundido (NF). Outras opções são a Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (UHPLC, do inglês Ultra High Performance Liquid Chromatography), em que o diâmetro médio das partículas porosas constituintes da fase estacionária é inferior a 2 µm (Sub 2 µm), e a Cromatografia Líquida de Alta Temperatura (HTLC, do inglês High Temperature Liquid Chromatography) [9].

Nesse trabalho foi realizado um estudo dessas novas alternativas para reduzir o tempo e melhorar a eficiência de análise por HPLC, excetuando-se a HTLC. Portanto, colunas MN, NF e Sub 2 µm foram os objetos de estudo desse trabalho, assim como a coluna CV, utilizada como referência. O presente estudo foi dividido nos seguintes capítulos:

Capítulo I: Desenvolvimento de métodos analíticos por cromatografia líquida em diferentes colunas para determinação de antidiabéticos orais

(30)

Capítulo III:Otimização de parâmetros instrumentais cromatográficos

Capítulo IV: Avaliação e comparação qualitativa da eficiência de colunas cromatográficas

Capítulo V: Desenvolvimento de métodos analíticos extremamente rápidos

2 JUSTIFICATIVA

O atual crescimento das indústrias farmacêuticas vem acompanhado de uma demanda por análises cada vez mais rápidas e, ao mesmo tempo, eficientes. As análises rápidas por Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência foram desenvolvidas a partir do ano 2000, e ainda há poucos estudos em que se aplicam e comparam as novas abordagens. Dentre essas abordagens destacam-se a utilização de colunas cromatográficas monolíticas (MN), de partículas de núcleo fundido (NF) e de

partículas porosas sub 2 μm (Sub 2 μm). A importância da utilização dessas colunas

modernas em análises farmacêuticas justifica as pesquisas sobre o assunto, tendo em vista a demanda por análises rápidas e eficientes.

Antidiabéticos orais (clorpropamida-CL, glibenclamida-GB, glimepirida-GM e gliclazida-GZ) foram escolhidos como modelo para o estudo de diferentes tipos de fases estacionárias para separações rápidas em cromatografia líquida. A escolha desses fármacos se justifica pela sua ampla utilização, que é consequência da elevada prevalência de Diabetes Mellitus tipo 2 na população. Faz-se necessário, portanto, métodos rápidos e eficientes para o controle de qualidade desses fármacos. Outra razão para a escolha desses fármacos é o fato de que eles, por apresentarem polaridades diferentes, apresentam também retenções bem distintas, o que possibilita que as colunas sejam comparadas de uma maneira mais completa.

3 OBJETIVO GERAL

Avaliar e comparar diferentes tipos de colunas cromatográficas (CV, MN, NF e Sub 2

(31)

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] AL-SAYAH, M. A.; RIZOS, P.; ANTONUCCI, V.; WU, N. High throughput screening of active pharmaceutical ingredients by UPLC. Journal of Separation Science. v. 31, p. 2167-2172, 2008.

[2] MALDANER, L.; JARDIM, I. C. S. F. O estado da arte da cromatografia líquida de ultra eficiência. Química Nova. v. 32, n. 32, p. 214-222, 2009.

[3] WREN, S. A. C.; TCHELITCHEFF, P. Use of ultra performance liquid chromatography in pharmaceutical development. Journal of Chromatography A. v. 1119, p. 140-146, 2006.

[4] MAJORS, R. E. Fast and ultrafast HPLC on sub-2-µm porous particles - where do we go from here? LCGC North America. v. 23, n. 12, p. 1248-1255, 2005.

[5] GUIOCHON, G.; GRITTI, F. Shell particles, trials, tribulations and triumphs. Journal of Chromatography A, v. 1218, p. 1915-1938, 2011.

[6] INDICADORES ECONÔMICOS, 2012. Disponível em: <http://www. sindusfarma comunica.org.br/indicadores-economicos>. Acesso em: 30 de Agosto de 2012.

[7] GÖRÖG, S. The paradigm shifting role of chromatographic methods in pharmaceutical analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. v. 69, p. 2-8, 2012.

[8] GUILLARME, D.; NGUYEN, D.; RUDAZ, S.; VEUTHEY, J. Method transfer for fast liquid chromatography in pharmaceutical analysis: Application to short columns packed with small particle. Part I: Isocratic separation. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. v. 66, p. 475-482, 2007.

(32)

CAPÍTULO 1

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS POR

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA EM DIFERENTES COLUNAS

(33)

1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1 Diabetes Mellitus

De acordo com dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), aproximadamente 346 milhões de pessoas sofrem de Diabetes Mellitus (DM) no mundo. Em 2004, cerca de 3,4 milhões de pessoas morreram em consequência de DM e de acordo com projeções da OMS, entre 2005 e 2030, o número de mortes irá dobrar [1].

O DM não é uma única doença, mas um grupo heterogêneo de distúrbios metabólicos que apresenta em comum a hiperglicemia, a qual é resultado de defeitos na ação ou na secreção de insulina ou ambos. Atualmente é classificado como DM tipo 1 (DM 1), DM tipo 2 (DM 2), DM gestacional e outros tipos específicos [2].

O DM 1, presente em 5% a 10% dos casos, é o resultado da destruição de células beta pancreáticas, com consequente deficiência da produção de insulina. Na maioria das vezes essa destruição de células beta é mediada por autoimunidade, porém existem casos em que não há evidência do processo autoimune, sendo, portanto, referida como forma idiopática. O tratamento envolve a administração diária de insulina. Sintomas incluem poliúria, polidipsia, fome constante, perda de peso, alterações na visão e fadiga [1, 2].

(34)

O diagnóstico do DM é feito por meio da determinação de valores de glicose plasmática. Os valores de glicose indicativos da doença estão apresentados no Quadro 1.1.

Quadro 1.1 - Concentração de glicose plasmática (mg/dl) para diagnóstico de Diabetes

Mellitus e seus estágios pré-clínicos [2]

Categoria Jejum* Duas horas após

75 g de glicose Casual**

Glicemia normal < 100 < 140 _

Tolerância à glicose

diminuída > 100 e < 126 ≥140 e < 200 _

Diabetes Mellitus ≥126 ≥ 200 ≥ 200 com sintomas

clássicos***

* Falta de ingestão calórica por no mínimo 8 horas

** Realizada a qualquer hora do dia, sem se observar o intervalo desde a última refeição. *** Sintomas clássicos: poliúria, polidipsia e perda não explicada de peso.

Nota: deve-se sempre confirmar o diagnóstico de DM pela repetição do teste em outro dia, a menos que haja hiperglicemia inequívoca com descompensação metabólica aguda ou sintomas óbvios de DM.

1.2 Tratamento

O DM 1, assim que diagnosticado, deve ser tratado com insulina. Já o tratamento do DM 2 envolve o uso de antidiabéticos orais, e se necessário uso paralelo de insulina para auxiliar no controle metabólico. Associado ao tratamento medicamentoso faz-se necessário o controle da alimentação e a prática de atividade física [2].

(35)

Quadro 1.2 - Medicamentos utilizados no tratamento do DM 2 [Adaptado de 6]

Classificação Fármaco Mecanismo de ação

Sulfoniluréia de 1ª geração

Tolbutamida Clorpropamida

Tolazamida

Estimula a liberação de insulina pelas células β pancreáticas por mecanismo

independente de glicose Sulfoniluréia de 2ª geração

Glimepirida Glibenclamida

Gliclazida Glipizida Meglitinida Repaglinida

Nateglinida Biguanida Fenformina Metformina

Inibição da gliconeogênese e redução da resistência dos tecidos à insulina

Tiazolidinedionas

Ciglitazona Pioglitazona Troglitazona Rosiglitazona

Reduz a resistência do fígado e tecido periféricos à insulina

Inibidor de α glicosidase Acarbose Retarda a absorção de amido, dextrina e dissacarídeos

Inibidor de Dipeptipeptidase 4 Linagliptina Estimula a liberação de insulina pelas

células β pancreáticas por mecanismo

dependente de glicose e suprimem a secreção de glucagon Peptídeo glucagon tipo 1 Exenatide

Dentre os antidiabéticos orais disponíveis, atenção especial será dada às sulfoniluréias, já que a clorpropamida, glibenclamida, gliclazida e glimepirida serão objetos de estudo desse trabalho [3]. Dentre as sulfoniluréias que serão utilizadas, a glibenclamida e a gliclazida estão presentes na Relação Nacional de Medicamentos Essenciais (RENAME) do Ministério da Saúde de 2012 [7].

(36)

Por aumentarem a secreção de insulina, as sulfoniluréias são chamadas de

“secretagogos de insulina”. Em curto prazo promovem o aumento da secreção de insulina, mas a longo prazo essa secreção pode estar igual ou até diminuída em relação aos níveis iniciais. No entanto o efeito hipoglicemiante persiste devido às ações extra-pancreáticas. Alguns estudos sugerem que as sulfoniluréias aumentam o número de receptores de insulina e/ou possuem efeito pós-receptor, facilitando as ações desse hormônio, além de atuarem reduzindo a sua depuração hepática [3, 9].

1.3 Sulfoniluréias

Sulfoniluréias são arilsulfoniluréias que diferem quanto aos substituintes na posição para do anel benzênico e no nitrogênio terminal do grupo ureia (Figura 1.1) [9].

S O

O N

R₂

O

N R₁

H H

Figura 1.1 - Estrutura geral das sulfoniluréias [10]

(37)

S O O N O N H H N O OMe Cl H S O O N O N H H N O N H O Et Me S O O N Me O N N H H S O O N Cl O N H H

Figura 1.2 - Estruturas químicas da CL, GB, GM e GZ [10]

As propriedades físico-químicas dos antidiabéticos, cujas estruturas estão apresentadas na Figura 1.2, estão descritas no Quadro 1.3.

Glibenclamida

(38)

Clorpropamida Glibenclamida Glimepirida Gliclazida

Características Físicas Pó cristalino branco

Pó cristalino, branco ou quase branco, inodoro ou quase inodoro

Pó branco ou quase branco

Pó cristalino branco ou quase branco

Fórmula química C10H13ClN2O3S C23H28ClN3O5S C24H34N4O5S C15H21N3O3S

Nome CA (Chemical Abstract)

4-cloro-N- [(propilamino) carbonil]

benzenosulfonamida

5-Cloro-N-[2-[4-[[[(cicloexilamino)

carbonil]amino] sulfonil]fenil]etil]-2 metoxibenzamida

1H-Pirrol-1-carboxamida,

3-etil-2,5-diidro-4-metil-N-[2-[4-[[[[(trans-4 metilciclohexil)amino] carbonil]amino]sulfonil]

fenil]etil]-2-oxo-

N[[(Hexaidrociclopenta [c]pirrol-2(1H)-il)amino]

carbonil]-4 metil benzenossulfonamida

log P (25 o_C) _{2,295 ± 0,326} _{3,076 ± 0,475} _{3,446 ± 0,536} _{1,610 ± 0,245}

Volume Molar

(20 °C, 760 Torr) 207,4 ± 3,0 cm

3_/mol _{362,9 ± 5,0 cm}3_/mol _{378,8 ± 5,0 cm}3_/mol _{239,2 ± 5,0 cm}3_/mol

Massa Molecular 276,74 g 494,00 g 490,62 g 323,41 g

pKa (grupo ácido/25o_C) _{4,71 ± 0,10} _{5,11 ± 0,10} _{5,10 ± 0,10} _{6,07 ± 0,10}

(39)

Solubilidade

Praticamente insolúvel: Água

Facilmente solúvel: Acetona

Cloreto de metileno

Solúvel: Etanol

Éter etílico

Pouco solúvel: Metanol Etanol Clorofórmio

Ligeiramente solúvel: Cloreto de metileno

Solúvel:

Dimetilformamida

Pouco solúvel: Metanol

Ligeiramente solúvel: Cloreto de Metileno

Solúvel:

Dimetilformamida

Praticamente insolúvel Água

Pouco solúvel Etanol

Ligeiramente solúvel Acetona

(40)

Encontram-se descritos na literatura inúmeros métodos para quantificação de sulfoniluréias isoladamente ou associadas a fármacos de outras classes de antidiabéticos orais.

Em trabalho desenvolvido para quantificar glimepirida em formulações farmacêuticas, empregaram-se coluna C18 250 x 4,6 mm, 5 μm, detecção em 228 nm, vazão de 0,5 ml/min e fase móvel composta por acetonitrila e solução de ácido fórmico 2%, pH 3,5 (80:20). O tempo de retenção foi de 7 minutos [14].

Em outro trabalho, com o intuito de determinar gliclazida, utilizaram-se coluna C18, detecção em 230 nm, fase móvel composta de solução aquosa de fosfato de sódio monobásico 0,1% p/v pH 2,1 ajustado com ácido fosfórico e acetonitrila (34:66). O tempo de retenção foi de 5,4 minutos [15].

Em estudo realizado em 2011 empregou-se método por HPLC, modo isocrático, para análise de comprimidos contendo glibenclamida. Para esta análise foram utilizados coluna C18 250 x 4,6 mm, 5 µm, vazão de 1,0 ml/min e volume de injeção 20 µl. A análise foi realizada a temperatura ambiente e leitura em 210 nm. O tempo de retenção da glibenclamida foi de 3,0 minutos [16].

Em estudo publicado em 2010, para determinação de clorpropamida e substâncias relacionadas, empregou-se coluna C18 250 x 4,6 mm, 5 µm, vazão de 1,0 ml/min, fase móvel composta de acetonitrila e diidrogenofosfato de amônia pH 3,5 ajustado com ácido fosfórico (62,5:37,5) [17].

Há também na literatura a descrição de métodos para determinação simultânea de antidiabéticos. Foi desenvolvido e validado método para determinação simultânea de glibenclamida, gliclazida, glipizida, pioglitazona, repaglinida e rosiglitazona em formulações farmacêuticas e em plasma. Empregaram-se coluna C18 250 x 4,6 mm,

(41)

Figura 1.3- Cromatograma de rosiglitazona (1), pioglitazona (2), glipizida (3), gliclazida (4), glibenclamida (5), celecoxibe - padrão interno (6) e repaglinida (7). (a) branco, (b) plasma humano contaminado com os padrões dos antidiabéticos e padrão interno (c) mistura sintética

contendo antidiabéticos e o padrão interno [18]

Outros pesquisadores desenvolveram método para determinação simultânea de glipizida, rosiglitazona, pioglitazona, glibenclamida e glimepirida em formulações de comprimidos. Foram utilizados fase móvel composta por solução aquosa de trietanolamina 0,05% v/v (pH 3,5, ajustado com ácido ortofosfórico), acetonitrila (ACN) e metanol (55:15:30), vazão de 1 ml/min, coluna C18 150 × 4,6 mm, 5 μm. Os fármacos foram monitorados em 248 nm e separados em 20 minutos [19].

Nota-se que na maioria dos métodos de análise desenvolvidos para determinação de sulfoniluréias isoladamente ou em associações, colunas cromatográficas convencionais, com partículas porosas de 5 µm, foram utilizadas. Foi encontrada apenas uma referência na qual coluna monolítica (C18 100 x 4,6 mm) foi aplicada na determinação simultânea de glibenclamida e glimepirida e suas respectivas substâncias relacionadas. A fase móvel foi preparada misturando-se ACN e tampão pH 3,0 (55:45) e o comprimento de onda de detecção foi de 228 nm. O tempo de análise foi de 1,6 minutos [20].

(42)

de análise dos métodos farmacopeicos que empregam sistemas de HPLC para determinação desses antidiabéticos.

Quadro 1.4 - Métodos farmacopeicos de análise de CL, GB, GM e GZ

Farmacopeia Brasileira (F.Bras) 5ª Ed.

[11] Insumo Farmacêutico Ativo HPLC; Volumetria de neutralização Comprimido HPLC; UV Insumo Farmacêutico Ativo HPLC; Volumetria de neutralização Comprimido HPLC _ Insumo Farmacêutico Ativo Volumetria de neutralização Farmacopeia Americana (USP) 34ª Ed.

[12] Insumo Farmacêutico Ativo HPLC Comprimido HPLC Insumo Farmacêutico Ativo HPLC Comprimido HPLC Insumo Farmacêutico Ativo HPLC Comprimido HPLC _ Farmacopeia Européia (Eur.) 7a Ed.

[13] _ Insumo Farmacêutico Ativo Volumetria de neutralização Insumo Farmacêutico Ativo HPLC _ Farmacopeia Britânica (BP) BP 2011

(43)

Quadro 1.5 - Parâmetros analíticos dos métodos cromatográficos farmacopeicos para determinação de CL, GB, GM e GZ

F. Bras. 5ª Ed.

[11]

Insumo Farmacêutico Ativo C18 150 x 4,6 mm, 5 μm T = 30 o_{C V}

inj = 20 μl

 = 240 nm V = 1,5 ml/min FM = Ácido acético glacial (1:100) e ACN (50:50)

Conc. = 0,05 mg/ml em FM

Comprimido

Mesmo método do insumo farmacêutico ativo da F. Bras.

Insumo Farmacêutico Ativo C8 150 x 4,6 mm, 5 μm T= 30 o_{C V}

inj = 20 μl

 = 230 nm V = 1,5 ml/min FM = Tampão fosfato pH 3,0 e ACN (45:55)

Conc. = 5,5 μg/ml em tampão fosfato pH 7,3

Comprimido

Mesmo método do insumo

farmacêutico ativo da F. Bras, exceto: FM = Tampão fosfato pH 3,0 e ACN (47:53)

Conc. = 0,2 mg/ml em metanol e água (10:1)

_ _

USP 34ª Ed.

[12]

Insumo Farmacêutico Ativo Mesmo método insumo

farmacêutico ativo e comprimido da F. Bras exceto:

C18 250 x 4,6 mm

Insumo Farmacêutico Ativo C8 4,6 × 250 mm

T = 30 oC Vinj = 10 µl

 = 254 nm V = 2 ml/min FM = Fosfato de amônio e ACN pH 5,25

Conc. = 0,416 mg/ml

Obs: A progesterona é padrão interno

Insumo Farmacêutico Ativo C18 4,0 x 250 mm

T = 30 oC Vinj = 20 µl

 = 228 nm V = 1 ml/min FM = Tampão fosfato pH 2,1-2,7 e ACN (50:50)

Conc. = 0,2 mg/ml em ACN e água (4:1)

(44)

Quadro 1.5 (Continuação)

USP 34ª Ed.

[12]

Comprimido

Mesmo método do insumo farmacêutico ativo e comprimido da F. Bras, exceto:

Coluna = C18 250 x 4,6 mm

Comprimido

Mesmo método do insumo farmacêutico ativo da USP

Comprimido

Mesmo método do insumo

farmacêutico ativo da USP, exceto: C18 4,0 x 125 mm

Conc. = 0,2 mg/ml em ACN e água (9:1)

_

Eur. 7a_Ed.

[13]

_ _

Insumo Farmacêutico Ativo C18 4,0 x 250 mm, 4 μm T = 30 oC Vinj = 20 μl

 = 228 nm V = 1 ml/min FM = Tampão fosfato pH 2,5 e ACN (50:50)

Conc. = 0,2 mg/ml em ACN e água (4:1) _ BP BP2011 [21] _ Comprimido

C18 100 x 4,6 mm, 5 μm T= 30 o_{C V}

inj = 20 μl

 = 300 nm V = 1,5 ml/min FM = Tampão fosfato de potássio monobásico pH 3,0

e ACN (53:47).

Conc. = 0,23 mg/ml em metanol e água (10:1)

Insumo Farmacêutico Ativo

Mesmo método do insumo farmacêutico ativo da Eur.

Comprimido

C8 4,0 x 250 mm, 4 μm Vinj = 20 μl

 = 235 nm V = 0,9 ml/min

FM = Trietanolamina, ácido trifluoroacético, ACN e água (0,1:0,1:45:55)

(45)

1.4 Curva de Van Deemter

Curva de Van Deemter (Figura 1.4) é aquela na qual se plota a altura do prato teórico (H) em função da velocidade linear da fase móvel (u0). O hábito de plotar (H x

u0)surgiu devido ao interesse pela relação entre o alargamento do pico e a vazão da

fase móvel. Por meio da curva de Van Deemter é possível determinar a velocidade linear (diretamente relacionada à vazão da fase móvel) na qual a altura do prato teórico (diretamente relacionado ao alargamento do pico) é mínima, ou seja, velocidade na qual a eficiência é máxima. Um prato teórico representa uma etapa de equilíbrio do soluto entre as fases móvel e estacionária. Dessa maneira, a altura de um prato teórico está relacionada ao comprimento da coluna necessário para que esse equilíbrio ocorra. Quanto menor a altura do prato, mais estreita será a largura de uma banda cromatográfica e maior será a eficiência [22,23].

Figura 1.4 - Curva de Van Deemter [23]

Para a elaboração desse gráfico varia-se a vazão da fase móvel que a coluna é submetida. Para cada valor de vazão um pico é obtido, e a ele correspondem determinado número de pratos teóricos (N) e determinado tempo de retenção (tr). O

(46)

N L

H  (1.1)



1 

0





k



t

L

u

r

(1.2)

H = altura do prato teórico, L = comprimento da coluna, N = número de pratos teóricos, u0 = velocidade linear da fase móvel, tr = tempo de retenção, k = fator de

retenção.

O cálculo de k, necessário para estimar u0, é realizado utilizando-se a equação (1.3)

[24].

0 0

t

k



r



_(1.3)

k = fator de retenção, tr = tempo de retenção e t0 = tempo morto.

2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Foram objetivos dessa etapa do trabalho:

1- Desenvolver e otimizar método por cromatografia líquida utilizando coluna convencional com partículas porosas de 5 µm de diâmetro (CV), para a determinação simultânea dos antidiabéticos orais clorpropamida (CL), glibenclamida (GB), glimepirida (GM) e gliclazida (GZ).

(47)

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais

3.1.1 Insumos farmacêuticos ativos

A identificação do fabricante, número de lote, pureza e validade dos insumos farmacêuticos ativos clorpropamida, adquirido na farmácia artesanal, glibenclamida, gentilmente cedido pela Fundação Ezequiel Dias, e glimepirida e gliclazida, gentilmente cedidos pela CIFARMA, estão descritos na Tabela 1.1.

Tabela 1.1 - Fabricante, número de lote, pureza e validadedos insumos farmacêuticos ativos dos fármacos CL, GB, GM e GZ

Insumo Fabricante Lote Pureza Validade

Clorpropamida - CP1007 100,12% 06/2015

Glibenclamida Cadila Pharmaceuticals 0GLL009 99,50% 12/2014

Glimepirida Mantena lab GD/021/11/2011 99,96% 10/2016

Gliclazida Shandong Keyuan

Pharmaceutical 0809130 99,10% 09/2012

3.1.2 Solventes, reagentes e vidrarias

Acetato de amônio Synth (Diadema, Brasil), ácido acético glacial Vetec (Duque de Caxias, Brasil), acetonitrila grau HPLC Sigma Aldrich (St Louis, Estados Unidos da America), uracila (Sigma Aldrich, St. Louis, Estados Unidos da America) membrana

de celulose regenerada com porosidade de 0,22 μm Sartorius (Goettingen,

Alemanha), dispositivos filtrantes de celulose regenerada Minisart 15 mm x 0,45 μm

(Goettingen, Alemanha), água ultra pura, pipetas e balões volumétricos calibrados, béqueres, erlenmeyers, kit de filtração.

3.1.3 Equipamentos e colunas cromatográficas

(48)

UHPLC (Waters Acquity®_{UPLC), potenciômetro (Metrohm} _{modelo 827 pH lab),}

coluna com partículas porosas (ACE, C18, 100 x 2,1 mm, 5 µm - Convencional), coluna com partículas de núcleo fundido (Poroshell®_{, Agilent, C18, 100 x 2,1 mm, 2,7}

µm - Núcleo Fundido), coluna com partículas porosas (Zorbax®_{, Agilent, C18, 100 x}

2,1 mm, 1,8 µm - Sub 2 μm), coluna monolítica (Onyx®_{, Phenomenex, C18, 100 x 2,0}

mm - Monolítica)

3.2 Métodos

3.2.1 Desenvolvimento de método analítico por cromatografia líquida para a determinação de CL, GB, GM e GZ em coluna CV

A seleção da fase móvel e diluente do método analítico para a determinação de CL, GB, GM e GZ foi realizada com base nos métodos para quantificação de sulfoniluréias descritos na literatura e nas características físico químicas dos fármacos. O objetivo era que o diluente selecionado tivesse composição similar à fase móvel, de maneira a evitar o alargamento dos picos cromatográficos.

Após seleção preliminar da fase móvel e do diluente foi realizada uma corrida exploratória de varredura na região do ultravioleta (200-400 nm) de uma solução

contendo 250 μg/ml de cada um dos antidiabéticos, utilizando as condições analíticas preliminares descritas na Tabela 1.2. Para obtenção dessa solução partiu-se de soluções estoques de cada um dos antidiabéticos, a 1 mg/ml, preparadas em ACN:água (4:1) e submetidas a banho de ultra som por 5 minutos. Posteriormente realizaram-se diluições dessas soluções estoques de modo a obter uma solução de trabalho com os quatro antidiabéticos na concentração de 250 μg/ml. O volume da

(49)

Tabela 1.2 - Condições analíticas preliminares*

* Foram utilizados loopde 10 μl, tubo de poli éter cetona (polyether-ether-ketone - PEEK) de 0,004 polegada e frequência de aquisição dos dados/constante de tempo do detector iguais a 20 Hz/0,1 s.

3.2.2 Otimização de método analítico por cromatografia líquida para a determinação de CL, GB, GM e GZ em coluna CV

Após seleção das condições cromatográficas preliminares e do comprimento de onda da análise, algumas condições cromatográficas foram otimizadas. Inicialmente foram testadas três fases móveis com diferentes proporções de ACN e solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0. Utilizando a fase móvel selecionada, foram testadas três concentrações de trabalho. Em seguida, utilizando a fase móvel e a concentração de trabalho selecionadas, testaram-se três volumes de injeção. Por último, fazendo-se uso da fase móvel, concentração de trabalho e volume de injeção selecionados, três temperaturas foram avaliadas. O esquema de otimização está sumarizado na Tabela 1.3.

Em cada condição teste apresentada na Tabela 1.3, dez diferentes vazões de fase móvel, variando de 0,02 a 0,6 ml/min, foram experimentadas. Determinaram-se o número de pratos teóricos e o tempo de retenção dos picos referentes aos quatro fármacos, em cada vazão avaliada, em cada condição teste. Outro parâmetro determinado em cada vazão avaliada e em cada condição teste foi o tempo morto da coluna. Para estimativa do tempo morto, injetaram-se 2 μl de uracila (10 μg/ml).

Parâmetros Condições

Fase móvel ACN:Solução de acetato de amônio 5mM pH 3,0 _(50:50)

Vazão da fase móvel 0,2 ml/min

Volume de injeção 2 μl

Coluna C18 100 x 2,1 mm, 5 μm

Temperatura da coluna 30 o_C

Solução de CL, GB, GM e GZ 250 μg/ml em fase móvel

(50)

Tabela 1.3 - Otimização das condições cromatográficas em coluna convencional

Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Experimento 4

Fase Móvel Concentração Volume de injeção Temperatura

ACN:Solução (55:45)* 250 μg/ml 5 μl 30 oC ACN :Solução (50:50)* 100 μg/ml 2 μl 35 o_C

ACN:Solução(45:55)* 20 μg/ml 1 μl 40 o_C

Condições

cromatográficas Conc. = 250 μg/ml

Vinj = 2 μl

T = 30 oC  = 230 nm V = 0,02 a 0,6 ml/min

Condições

cromatográficas FM = Escolhida no

experimento 1 Vinj = 2 μl

T = 30 o_C

 = 230 nm V = 0,02 a 0,6 ml/min

Condições

experimento 1 Conc . = Escolhida no

experimento 2 T = 30 oC  = 230 nm V = 0,02 a 0,6 ml/min

Condições

experimento 1 Conc. = Escolhida no

experimento 2 Vinj = Escolhido no

experimento 3  = 230 nm V = 0,02 a 0,6 ml/min *Solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0

A partir dos dados de número de pratos teóricos, tempo de retenção e tempo morto, foi construída uma curva de Van Deemter para cada antidiabético em cada condição testada. Para os cálculos foram utilizadas as equações (1.1), (1.2) e (1.3).

A seleção da fase móvel, concentração, volume de injeção e temperatura ideais foram realizadas com base na análise das curvas de Van Deemter e também com base na análise dos parâmetros fator de retenção (k), resolução (Rs), fator de

assimetria dos picos (As) e pressão do sistema cromatográfico (P).

3.2.3 Transferência do método desenvolvido em coluna CV para as colunas MN, NF

e Sub 2 μm

O método desenvolvido e otimizado para análise de antidiabéticos orais em coluna convencional foi aplicado às colunas cromatográficas empacotadas com partículas

sub 2 μm, com partículas de núcleo fundido e coluna monolítica. Todos os