Caracterização molecular de isolados
de
Paracoccidioides brasiliensis
obtidos de
Dasypus novemcinctus
(tatu) e sua correlação com virulência
e origem geográfica
Orientador
: Prof. Dr. Eduardo Bagagli
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-Graduação em Patologia – Área de
Concentração em Patologia, da Faculdade
de Medicina – UNESP, Universidade
Estadual Paulista para obtenção do título de
Mestre
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ELZA NUMATA Barbosa, Flavia Hebeler
Caracterização molecular de isolados de Paracoccidioides brasiliensis
obtidos de Dasypus novemcinctus (tatu) e sua correlação com virulência e
origem geográfica / Flavia Hebeler Barbosa. – 2002.
Dissertação (mestrado) – Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2002.
Orientador: Eduardo Bagagli
1. Paracoccidioides brasiliensis – Genética
CDD 616.969
Palavras-chave: Paracoccidioides brasiliensis; Virulência; Tatus; RAPD;
ÍNDICE
INTRODUÇÃO... 1
Aspectos Gerais da Doença e do seu Agente Etiológico... 1
Aspectos Ecológicos e Epidemiológicos... 2
O Tatu como Indicador Biológico da Paracoccidioidomicose... 4
Aspectos da Virulência dos Isolados... 5
Aspectos Moleculares... 8
OBJETIVOS E DELINEAMENTO EXPERIMENTAL... 13
MATERIAL E MÉTODOS... 14
1 - Isolados Fúngicos... 14
2 - Origem Geográfica... 14
3 - Caracterização da Virulência... 17
3.1 - Animais... 17
3.2 - Preparo do Inóculo... 17
3.3 - Inoculação... 17
3.4 - Avaliação do Grau de Infecção... 17
3.5 - Análise Histopatológica... 18
3.6 - Pesquisa de anticorpos anti-P. brasiliensis... 18
3.7 - Análise Estatística... 19
4 - Caracterização Molecular... 20
4.1 - Extração do DNA... 20
4.2 - Identificação Molecular... 21
4.3 - RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)... 22
4.4 - PCR com os primers para região robossômica... 23
4.5 - Purificação dos Produtos Amplificados... 24
4.6 - Sequenciamento da Região ITS (Internal Transcribed Spacer) e do Gene 5.8 S dos Isolados de Paracoccidioides brasiliensis... 25
RESULTADOS... 27
1 - Virulência... 27
1.1 - Unidades Formadoras de Colônias (UFC)... 27
1.2 - Análise Histopatológica... 33
1.3 - Análise Sorológica (ELISA)... 36
2 - Caracterização Molecular... 38
2.1 - Identificação Genética... 38
2.2 - RAPD... 40
2.3 - PCR (ITS4/ITS5) e Sequenciamento... 44
DISCUSSÃO... 53
CONCLUSÕES... 62
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 63
INTRODUÇÃO
Aspectos Gerais da Doença e do seu Agente Etiológico
A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica, de natureza granulomatosa com freqüente evolução crônica, envolvendo os pulmões, o sistema fagocítico macrofágico, áreas mucocutâneas e outros órgãos (FRANCO, 1986).
Esta doença foi descrita pela primeira vez por Adolfo Lutz, em 1908, sendo também conhecida como blastomicose sul-americana ou micose de Lutz-Splendore-Almeida (LACAZ et al., 1991).
A PCM infecção, forma assintomática da doença, é muito comum como comprovado pela alta positividade aos testes intradérmicos nas populações das áreas endêmicas (FAVA NETTO, 1961; MARQUES et al., 1983). Na PCM doença duas formas clínicas principais são descritas: a forma aguda ou subaguda (tipo juvenil) e a forma crônica (tipo adulta) (MONTENEGRO, 1986). A forma aguda é severa, de evolução rápida, afetando pacientes jovens de ambos os sexos e comprometendo preferencialmente o sistema fagocítico mononuclear (baço, fígado, linfonodos e medula óssea) (FRANCO
et al., 1987). A forma crônica ocorre em mais de 90% dos pacientes, afetando principalmente indivíduos do sexo masculino, na faixa etária de 30 a 40 anos, envolvidos em atividades agrícolas. As lesões podem aparecer em um único órgão (forma unifocal) ou em mais de um órgão ou sistema (forma multifocal), sendo o pulmão o órgão mais atingido. Esta predominância da doença no sexo masculino está relacionada a fatores hormonais, visto que a transformação de micélio para levedura, primeiro passo para o estabelecimento da infecção, é inibida por hormônios femininos (estrógeno) (SALAZAR et al., 1988; STEVENS, 1989).
animal em condições de parasitismo e na forma micelial in vitro a 25°C ou quando no ambiente em condições de saprofitismo. Na forma leveduriforme as colônias são pequenas, facilmente destacáveis do meio, de coloração creme, aspecto cerebriforme e compostas de células leveduriformes de diferentes diâmetros (6 - 30 µm) com parede bi-refringente, geralmente arredondadas ou ovais com multibrotamentos, aspecto este característico do fungo e que ficou conhecido como "roda de leme" (LACAZ et al., 1991). Na forma micelial, em ágar Sabouraud, as colônias apresentam coloração branca a creme, elevada com pregas e bordas, aspecto de pipoca estourada. O micélio aéreo é curto, e a colônia é bastante aderida ao meio. A micromorfologia da forma miceliana mostra hifas septadas, com artrósporos, clamidósporos intercalares e aleuriósporos globosos (MARQUES & CAMARGO et al., 1998).
Aspectos Ecológicos e Epidemiológicos
A paracoccidioidomicose é a micose sistêmica mais importante da América Latina, com maior incidência no Brasil, Colômbia, Venezuela e Argentina (LACAZ, 1982; WANKE & LONDERO, 1994). Por se tratar de doença endêmica nessas regiões, de evolução crônica e de difícil controle, tem merecido a atenção de vários grupos de pesquisadores, principalmente Latino-americanos (NEGRONI, 1968; ALBORNOZ, 1971; FRANCO et al., 1994).
Diferentemente de outras micoses sistêmicas também provocadas por fungos dimórficos, como a blastomicose, coccidioidomicose e histoplasmose, em que o micro nicho ecológico dos agentes etiológicos é conhecido (AJELLO, 1967; SCHWARZ, 1986), o P. brasiliensis tem sua ecologia praticamente desconhecida. Embora existam relatos sobre o isolamento do P. brasiliensis
1989) e ração para cachorros (FERREIRA et al., 1990), os dados não são totalmente conclusivos, principalmente devido ao caráter casual e não repetitivo destas observações. O grande número de resultados negativos na tentativa de isolar o fungo do ambiente e a baixa reprodutibilidade destes isolamentos provavelmente refletem um nicho ecológico restrito, uma fase saprofítica curta e transitória ou mesmo uma baixa capacidade de esporulação do fungo (FRANCO et al., 2000).
Aliado à dificuldade de isolamento ambiental regular do P. brasiliensis, existem outros fatores que também dificultam a elucidação do habitat deste microrganismo, como a falta de surtos epidêmicos e o prolongado período de latência da doença. Isto, em conjunto com as freqüentes migrações das populações das áreas endêmicas, torna praticamente impossível identificar o(s) local (s) exato onde a infecção foi adquirida. Em outras micoses sistêmicas por fungos patogênicos dimórficos, alguns animais domésticos, principalmente cães, desenvolvem a doença e representam verdadeiros indicadores biológicos da ocorrência do fungo em uma determinada área (SAROSI et al., 1979; ARMSTRONG & BARTOLA, 1983; KABLI & KOSCHMANN, 1986). O mesmo não foi até o momento observado na PCM, embora uma certa positividade aos testes intradérmicos possa ser observada tanto em animais domésticos (MOS & FAVA-NETTO, 1974; COSTA et al., 1995a) como silvestres (COSTA et al., 1995b).
O Tatu como Indicador Biológico da PCM
A confirmação de que o tatu (Dasypus novemcinctus) é um reservatório natural do fungo abriu novas oportunidades para o estudo desta doença (RESTREPO et al., 2000, 2001). P. brasiliensis foi primeiramente isolado de tatus por NAIFF et al., 1986, 1989 na cidade de Tucuruí, Pará, Brasil. Desde então, vários outros grupos vêm confirmando este fato em diferentes regiões do Brasil, como Botucatu, São Paulo (BAGAGLI et al., 1998), Minais Gerais (SILVA-VERGARA et al., 1999), e Goiás (MACEDO et al., 1999), e também na Colômbia (CORREDOR et al., 1999).
Esta espécie de tatu, popularmente conhecida como tatu-galinha, é comumente utilizada como suplemento alimentar em muitas comunidades rurais. Sua distribuição geográfica é similar à da PCM humana (RESTREPO, 1994) e o contato com estes animais está associado a um aumento nos fatores de riscos para a infecção em pessoas residentes nas áreas endêmicas da doença (CADAVID & RESTREPO, 1993).
Embora existam poucos estudos sobre a ecologia e aspectos comportamentais desta espécie de tatu, sabe-se que estes animais apresentam contato íntimo com materiais de solo, devido ao constante hábito escavatório, tanto para procura de alimentos como para construção de tocas de moradia. Esta espécie animal, de hábito principalmente noturno, locomove-se em trilhas relativamente constantes no interior de pequenas matas de galerias localizadas em beiras de rios ou outros corpos de água, sem evidências de hábitos migratórios. Os animais alimentam-se principalmente de insetos de solo (formigas e cupins) e ainda outros invertebrados ou mesmo frutas e raízes (WIRTZ, 1985). Têm como hábito utilizar materiais vegetais na construção de seus ninhos, seja no interior da toca (TABER, 1945; TAMAGE & BUCHANAN, 1954) ou mais raramente, na superfície dela (LAYNE & WAGGENER, 1984).
STORRS, 1971; STORRS et al., 1974). Eles apresentam temperaturas corporais relativamente baixas (32-35°C) e sistema imunológico, com uma atividade imune celular aparentemente baixa (PURTILO et al., 1975; ULRICH et al., 1976), facilitando o desenvolvimento de doenças infecciosas.
Em relação à paracoccidioidomicose, os tatus representam, no momento, o modelo mais importante como indicador biológico, tanto para a elucidação do nicho ecológico do P. brasiliensis, como para um melhor entendimento de outros aspectos epidemiológicos ainda não esclarecidos desta doença (BAGAGLI et al., 1998).
Aspectos da Virulência dos Isolados de
P. brasiliensis
A influência da virulência do P. brasiliensis na relação parasita-hospedeiro pode ser evidenciada pelas diferentes manifestações clínicas da PCM, incluindo padrão de formação do granuloma e órgãos envolvidos (FRANCO et al., 1993).
tem sido um animal muito utilizado na paracoccidioidomicose experimental e é o modelo mais susceptível à infecção pela via intratesticular (IABUKI & MONTENEGRO, 1979; PERAÇOLI et al., 1982; PERAÇOLI et al., 1999), possibilitando o estudo da disseminação fúngica para os diversos órgãos, além de reproduzir lesões semelhantes às formas progressivas da doença no homem (COELHO et al., 1994). Outros trabalhos já demonstraram que os isolados de tatus têm grande capacidade de disseminação nestes animais (PERAÇOLI et al., 1992; BAGAGLI et al., 1998) e em camundongos isogênicos BALB/c (NISHIKAKU, 1999).
Essa habilidade de causar doença nos animais e no homem está relacionada a fatores peculiares do fungo, denominados fatores de virulência. Levando-se em consideração as condições ambientais e fatores relacionados ao hospedeiro (idade, sexo, estado imunológico) eles são responsáveis pela capacidade de invasão e estabelecimento do agente nos tecidos. Crescimento à temperatura de 37ºC, dimorfismo, aderência aos tecidos do hospedeiro, presença de cápsula, componentes da parede celular, produção de toxinas e enzimas são exemplos de fatores de virulência de fungos patogênicos (HOGAN etal., 1996; KUROKAWA, et al., 1998).
A composição da parede celular é uma das principais propriedades dos fungos patogênicos que possivelmente interferem na relação hospedeiro-parasita (SAN-BLAS, 1982). Tanto fungos dermatófitos, agentes de micoses subcutâneas, como agentes de micoses sistêmicas e fungos oportunistas possuem polissacarídeos em sua parede celular que parecem estar relacionados com a patogenicidade destas amostras.
Estudos de outros fungos patogênicos dimórficos como Histoplasma capsulatum e Blastomyces dermatitidis, têm relacionado a composição da parede celular, mais especificamente a quantidade de α-1,3-glucana, com o grau de virulência dos isolados (HOGAN et al., 1994; KLIMPEL et al., 1988).
de defesa do hospedeiro (SAN-BLAS & SAN-BLAS, 1977). A importância da composição da parede celular no mecanismo de patogenicidade deste fungo tem sido bem documentada (SAN-BLAS & SAN-BLAS, 1985).
Estudos realizados com isolados de P. brasiliensis indicam que a α-1,3-glucana atua na proteção do fungo contra enzimas digestivas de leucócitos e macrófagos do hospedeiro (GOIHMAN-YAHR et al., 1985).
Outro fator de virulência clássico em P. brasiliensis é a glicoproteína de peso molecular 43 kDa (gp 43), que é uma proteinase capaz de hidrolisar caseína, colágeno e elastina, facilitando a invasão dos tecidos do hospedeiro (MENDES-GIANNINI et al., 1989; PUCCIA & TRAVASSOS, 1991). Esta molécula tem ainda, capacidade de ligação a laminina das células do hospedeiro, permitindo a disseminação fúngica (VICENTINI et al., 1994). BEDOYA-ESCOBAR et al., (1993) também estudou a produção de enzimas proteolíticas por cepas de P. brasiliensis, tanto na sua forma leveduriforme quanto micelial, demonstrando uma grande capacidade do fungo para degradar colágeno e elastina.
Características morfológicas da forma micelial do P. brasiliensis
também têm sido associadas com a patogenicidade do fungo. Colônias de aspecto glabro são características de cepas de baixa virulência e colônias de aspecto algodonoso caracterizam cepas de maior virulência (SANO et al., 1997).
Muito trabalhos procuram avaliar ainda, a interferência das condições de manutenção do fungo in vitro na patogenicidade da amostra (KASHINO
et al., 1990; SANO et al, 1991). Assim, é bem conhecido que a virulência de uma cepa pode ser atenuada devido à sua manutenção in vitro por um longo período (BRUMMER et al., 1990; KASHINO et al., 1990). Tal fenômeno também tem sido descrito para a cepa Pb 18, considerada padrão de alta virulência (REZKALLAH-IWASSO et al., 1984; CALICH et al., 1994). Esta perda da patogenicidade, no entanto, pode ser revertida pelo reisolamento do fungo de hospedeiros infectados (KASHINO et al., 1990).
(SINGER-VERMES et al, 1994). Neste trabalho, os autores observaram uma tendência de aumento da LD 50% e diminuição da intensidade das lesões em camundongos B10A infectados com as cepas provenientes de pacientes com a forma crônica branda da PCM.
Virulência de isolados clínicos e componentes imunes envolvidos foram avaliados por BURGER et al., 1996. Estes autores infectaram camundongos atímicos com 2 isolados de P. brasiliensis (Pb 18 e Pb 265) e demonstraram que o isolado Pb 18 causava doença mais severa que o isolado Pb 265. Foi observado grande número de órgãos infectados e curto período de sobrevida nos animais infectados com Pb 18, contrariamente aos animais infectados com Pb 265, resistentes à infecção.
Em relação aos isolados de tatus, é importante conhecer o padrão de virulência, que além de contribuir para uma correta identificação da espécie, também possibilita o melhor entendimento do tipo de relação estabelecida com o(s) hospedeiro(s). Seriam estes fungos isolados de tatus mais adaptados à condição patogênica?
Aspectos Moleculares
Estudos moleculares são poderosos instrumentos que vêm sendo utilizados para melhor caracterização de diversos patógenos (EINSENSTEIN et al., 1990). Com o uso de técnicas como RAPD, RFLP, PCR-RFLP e microssatélites, várias questões biológicas importantes sobre especiação, modo de reprodução e genética populacional podem ser investigadas. O conhecimento obtido destes estudos pode ser usado no desenvolvimento de métodos alternativos de diagnóstico, novas abordagens terapêuticas, bem como produção de vacinas (McEWEN et al., 2000).
O RAPD é uma técnica baseada na PCR que consiste na amplificação de fragmentos aleatórios do DNA. Isto ocorre porque os primers são pequenos (geralmente 10 pares de bases), diferentemente daqueles usados na PCR, o que permite a ligação em muitas regiões do genoma. Outra diferença é que no RAPD só um primer é utilizado na reação, ao contrário da PCR, em que dois primers são necessários para amplificar a região de interesse.
Várias espécies fúngicas de importância médica têm sido caracterizadas através desta técnica, como Aspergillus fumigatus
(AUFAUVRE-BROWN et al., 1992; MONDON et al., 1995), Candida albicans (MAGEE et al., 1987; JAIN et al., 2001), Blastomyces dermatitidis
(YATES-SIILATA et al., 1995; McCULLOUGH et al., 2000), Cryptococcus neoformans (RUMA et al., 1996) e Histoplasma capsulatum (KERSULYTE
et al., 1992; WOODS et al., 1993; POONWAN et al., 1998; MUNIZ et al., 2001; PERROTTA et al., 2001).
grupos em relação à virulência, testada em camundongos susceptíveis da linhagem B10.A. Quatro isolados do primeiro grupo causaram infecção localizada restrita ao fígado, mostrando granulomas epitelióides compactos contendo poucos fungos, portanto foram considerados fungos de menor virulência, enquanto dois isolados do segundo grupo causaram infecção disseminada, reação granulomatosa frouxa e grande número de células fúngicas viáveis. Porém, em outros trabalhos, a correlação entre virulência e padrão genético não foi tão precisa, apesar da observação de associação entre estes dois parâmetros quando alguns isolados eram analisados, inclusive aqueles classificados como fungos de alta virulência (Bt83 e Bt 79) (KUROKAWA, 1997, MONTEIRO, 1999).
O primeiro trabalho, ainda com a técnica de RAPD, estudando isolados de tatus e isolados clínicos foi feito por SANO et al., (1999), no qual 19 isolados humanos e três isolados de tatus foram caracterizados através do RAPD. As cepas foram classificadas em três grandes grupos, com indicação de que existem isolados comuns que acometem homem e animal, e que um mesmo animal pode albergar mais de um genótipo do patógeno.
(BRUNS et al., 1992; LECLERC et al., 1994, BOWMAN et al., 1996; HERR
et al., 2001). Por outro lado, as regiões presentes entre estes genes, denominadas ITS (Internal Transcribed Spacer), apresentam uma variabilidade genética que permite a identificação de espécies dentro de um mesmo gênero (LOTT et al., 1998; HENRY et al., 2000) ou a caracterização de indivíduos da mesma espécie (JIANG et al., 2000; IMAI et al., 2000b). Análise deste cluster gênico é relativamente fácil devido à presença de várias cópias (120 a 150) por célula (WHITE et al., 1990).
Esta região tem sido analisada em muitas espécies patogênicas, desde fungos causadores de micoses superficiais cutâneas (HARMSEN et al., 1999), fungos oportunistas (HENRY et al., 2000; LOTT et al., 1998) até fungos patogênicos dimórficos (BOWMAN et al., 1996; JIANG et al., 2000; McCULLOUGH et al., 2000), incluindo o P. brasiliensis (SANDHU et al., 1997; PETERSON et al., 1998; MOTOYAMA et al., 2000; IMAI et al., 2000; BIALEK et al., 2000).
SANDHU et al., 1997 sequenciaram uma parte do gene 28S e construíram uma sonda capaz de identificar o P. brasiliensis dentre outras 47 espécies representativas de 25 gêneros. MOTOYAMA et al., 2000 amplificaram e sequenciaram os genes ribossomais 5.8 S e 28 S e as regiões intergênicas ITS 1 e ITS 2 de uma cepa de P. brasiliensis, Pb01. A partir disso, desenharam primers específicos para esta região e foram capazes de identificar o P. brasiliensis dentre outros fungos patogênicos pela PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). Também recentemente, baseado em dados de sequenciamento do gene 5.8S e das regiões ITS de 29 isolados de P. brasiliensis provenientes de diferentes regiões do Brasil, Costa Rica, Japão e Argentina, IMAI et al., (2000a) desenharam um primer específico para a espécie com o objetivo de padronizar uma técnica de diagnóstico para o P. brasiliensis baseada na PCR. A especificidade da técnica foi demonstrada pela comparação com vários outros fungos, dentre eles B. dermatitidis.
OBJETIVOS
3 Avaliar a virulência de 10 isolados de P. brasiliensis obtidos de diferentes tatus, comparando-os com isolados clínicos
3 Caracterizar molecularmente os isolados através das técnicas de RAPD e sequenciamento
3 Correlacionar os dados moleculares com a origem geográfica e perfil de virulência dos isolados
DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Variações no perfil de virulência foram definidas pela inoculação de células leveduriformes dos diferentes isolados, via intratesticular, em hamsters (10 hamsters para cada isolado), sendo que estes foram sacrificados em dois períodos: 4 e 8 semanas. Foram feitos então: 1) avaliação do grau de infecção através da recuperação de fungos viáveis do testículo, fígado, baço e pulmão; 2) histopatologia das lesões em testículo, fígado, baço, pulmão e linfonodo periarterial ou inguinal; 3) pesquisa de anticorpos anti-P. brasiliensis por ensaio imunoenzimático (ELISA).
MATERIAL E MÉTODOS
1. Isolados fúngicos
Foram avaliados dez isolados de P. brasiliensis (T1F1, T3B6, T4B14, T5LN1, T7F6, T8LN1, T9B1, T10B1, T13LN1 e T15LN1) obtidos de tatus da área endêmica de Botucatu (BAGAGLI et al., 1998) e quatro isolados clínicos (Pb265, Bt 60, Bt 84 e Bt85). Um isolado de B. dermatitidis também foi incluído no estudo molecular, como grupo-externo.
Os isolados foram cultivados em meio GPY ágar (20 g glucose, 5 g bactopeptona, 5 g extrato de levedura, 15 g ágar e 1000 ml água) e mantidos em sua fase leveduriforme a 35°C por 7 dias.
2. Origem geográfica
Figura 1
- Localização geográfica dos isolados de
Paracoccidioides brasiliensis
obtidos de
tatus e de pacientes
10 Km
49°30’W
23°S
Pardinho
Área Estudada
Manduri
T4B14
T7F6
T13LN1
T15LN1
Bt60
T1F1
T3B6
Botucatu
T9B1
T10B1
T8LN1
T5LN1
Tabela 1 - Distância (em km)* dos locais de coletas dos tatus
(1, 3, 4, 5, 7, 8, 9 10, 13 e 15) dos quais os respectivos
isolados de
P. brasiliensis
foram obtidos.
Tatu
1 3 4 5 7 8
9
10
13
3
45,0
4
62,5
62,3
5
32,5
32,4
89,5
7
62,5
62,3
0
89,5
8 32,3 32,3 89,4
0,17
89,4
9 32,3 32,3 89,4
0,17
89,4 0
10 34,6 34,6 92,8 3,85 92,8 3,80 3,80
13 65,2 65,1 9,2 94,0 9,2 94,0 94,0 97,1
15 59,2 59,0 3,39 86,4 9,88 86,4 86,4 89,7 9,88
3. Caracterização da Virulência
3.1. Animais
Hamsters Golden Syrian adultos machos com dois meses de idade foram utilizados em todos experimentos. Cada isolado (T1F1, T3B6, T4B14, T5LN1, T7F6, T8LN1, T9B1, T10B1, T13LN1, T15LN1 e Pb 265) foi inoculado em dez hamster, sendo sacrificados 4 e 8 semanas após infecção.
3.2. Preparação do Inóculo
Com auxílio de uma pipeta foram transferidos 4mL de solução salina tamponada (SST) (pH=7,2) para o tubo contendo o fungo. Após homogeneização, a suspensão fúngica obtida foi transferida para tubo com pérolas de vidro e agitada por alguns segundos em Vortex. Esta solução foi colocada em tubo tipo penicilina e 50µL transferidos para câmara de Newbauer. A viabilidade foi sempre maior que 95%, determinada pela coloração com lactofenol azul algodão (SANO et al., 1993). Após contagem, foram feitas diluições, quando necessário, a fim de se obter 8 x 106 células
leveduriformes /mL.
3.3. Inoculação
A inoculação de 0,2 mL de suspensão fúngica, contendo 1,6 x 106
células leveduriformes, foi realizada pela via intratesticular com auxílio de seringa tipo insulina.
3.4. Avaliação do Grau de Infecção
foram anestesiados com éter etílico, sendo realizada punção cardíaca para coleta do sangue. Tórax e abdome foram abertos assepticamente e fragmentos de baço, fígado, pulmão e testículo retirados, pesados em placas de petri estéreis e transferidos individualmente para graal de porcelana onde foram homogeneizados em SST (2mL). Em seguida, 100 µl dessa suspensão foram semeados em meio BHIA (Brain Heart Infusion Agar), suplementado com 4% de soro de cavalo e 5% de filtrado de cultura de células leveduriformes da cepa 192 de P. brasiliensis, cultivada em meio líquido durante 7 dias (SINGER-VERMES et al., 1992). A suspensão dos órgãos foi espalhada, com auxílio de bastões de vidro, por toda a superfície do meio de cultura. Cada órgão foi processado separadamente e cultivado em triplicata. A seguir, as placas de Petri foram vedadas e incubadas em estufa a 35 ° C por 2 a 3 semanas até estabilização do número de colônias. O número de colônias foi contado e o resultado expresso como logarítimo decimal de UFC / g de tecido.
3.5. Análise Histopatológica
Fragmentos de testículo, baço, fígado, pulmão e linfonodo periaórtico foram fixados em formalina 10% e processados para análises histopatológicas. As lâminas foram coradas com Hematoxilina-Eosina (HE), Gomori grocott-methanamine Silver (GMS) e Periodic Acid Schiff (PAS). A gravidade das lesões foi avaliada semi-quantitativamente (escala de 0 a 3 cruzes), levando-se em consideração o número e tamanho dos granulomas. Atribuiu-se uma cruz quando menos de 1/3 do órgão estava acometido, duas cruzes quando 1/3 ou metade do órgão estava acometido e três cruzes quando mais da metade do órgão mostrava-se afetado.
3.6. Pesquisa de Anticorpos anti- P. brasiliensis
através da técnica de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent Assay). Placas de 96 orifícios, com fundo plano, foram sensibilizadas com 100 µL de antígeno de P. brasiliensis na concentração de 20 µg de proteína/mL, diluído em tampão carbonato-bicarbonato 0,05 M, pH 9,6 e incubação das mesmas a 25°C durante 18 horas. Após esse período, as placas foram lavadas 4 vezes com SST pH 7,4 contendo Tween 20 a 0,05% (SST-T), os orifícios preenchidos com 100 µl de SST-T contendo 5% de leite desnatado (Molico-Nestlé) (SST-TM) para bloqueio dos sítios livres e as placas incubadas a 37°C por 60 minutos. Após nova lavagem da placa (5 vezes) com SST-T foram adicionados 100 µl de soro dos hamsters infectados ou normais, diluídos em SST-TM, de forma seriada na base 2, com diluição inicial de 1:2, seguindo-se incubação a 37°C por 60 minutos. A seguir, as placas foram lavadas com SST-T (5 vezes), sendo adicionado a cada orifício 100 µl de IgG de cabra anti-imunoglobulina de hamster conjugada com peroxidase (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL). Após incubação a 37°C por 60 minutos e nova lavagem com SST-T, foram adicionados 100 µl de substrato contendo 2 µl/ml de peróxido de hidrogênio, 0,4 mg/ml de ortofenilenodiamina em tampão citrato-fosfato 0,1M, pH 5,0. As placas foram colocadas à temperatura ambiente, no escuro, durante 30 minutos e a reação bloqueada pela adição de 50 µl de ácido sulfúrico 4N, sendo a leitura da reação, feita em leitor automático de ELISA (Dynatech MR500), por densidade óptica (DO), em comprimento de onda de 492 nm. O cutoff foi obtido pela média das DO dos soros de animais normais não infectados e diluídos 1:2. O título de cada amostra de soro foi expresso como a recíproca da maior diluição que apresenta DO maior que o cutoff.
3.7. Análise Estatística
Para a comparação dos títulos de anticorpos produzidos foram utilizados testes não-paramétricos. O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado na comparação dos diversos isolados, dentro do mesmo período. Comparações entre 4 e 8 semanas, do mesmo isolado, foram realizadas pelo teste não paramétrico de Mann-Whitney. O nível de significância adotado em todas análises foi de 5%.
4. Caracterização molecular
4.1. Extração de DNA
Extraiu-se o DNA de todos isolados de tatus e isolados clínicos. Uma cepa de Blastomyces dermatitidis (Ascomycota, Onygenales, Onygenaceae) foi usada como grupo-externo, pois este fungo está muito próximo filogeneticamente do P. brasiliensis e ocorre apenas na América do Norte (BIALEK et al., 2000).
O método de extração empregado foi aquele descrito por VAN BURIK
et al., 1998, em um trabalho no qual compararam seis diferentes métodos de extração de DNA de fungos filamentosos. Segundo estes autores, o método que utiliza pérolas de vidro e vórtex mostrou-se melhor que os demais em vários aspectos: facilidade, rapidez, segurança, necessidade de poucos equipamentos, além de produzir os melhores resultados.
centrifugados a 10.000 g por 15 minutos. Em seguida, a fase aquosa superior clara foi coletada, re-extraída duas vezes em igual volume de Phe/Chl/IAA (25:24:1) e uma vez em igual volume de Chl/IAA (24:1). A cada re-extração os eppendorfs foram centrifugados a 10.000 g por 15 minutos.
A fase aquosa obtida após a última centrifugação foi precipitada adicionando-se 10 µL de Acetato de sódio (NaOAc) e 0,54 volumes de Isopropanol. O DNA precipitado foi lavado três vezes em etanol 70% e ressuspendido em 350 µL de tampão TE [10 mM Tris-HCl; 0,1 mM de EDTA].
A quantificação do DNA das amostras foi feita em espectrofotômetro, pela medida da absorbância nos comprimentos de 260 e 280 nm. A concentração de DNA de cada amostra (ng/µL) foi obtida pela fórmula abaixo.
[DNA] (ng/µL) = A260 x 2,5 x 1000
4.2. Identificação molecular
Para identificação dos isolados quanto à presença do gene da gp 43, foi realizada a reação de PCR com os primers sense PC1 (TCATCTCACGTCGCATCTCACATT) e anti-sense PC2 (GGCTCCTCAAAGTCTGCCATGAGGAAG).
As reações foram realizadas em tubos de microcentrífuga de 0,5 ml em volumes totais de 25 µl contendo 2,5 µL de tampão de reação (200 mM Tris-HCl pH 8.4, 1,5 mM MgCl2 50mM, 500 mM KCl), 0,2 mM de
amplificações foi monitorada pela eletroforese em gel de agarose 1,0% preparado em tampão de Tris-borato-EDTA (89 mM Tris-HCl, 89 mM ácido bórico e 20 mM EDTA), seguido de coloração com brometo de etídio e visualização em transluminador UV. (MANIATIS et al., 1982).
4.3. RAPD
Foram empregados no RAPD 24 primers arbitrários da Operon Technology. São eles:
Primers Sequência OPR 01 TGCGGGTCCT
OPZ 07 CCAGGAGGAC OPZ 09 CACCCCAGTC
Nas reações foram utilizados os seguintes reagentes: 25 pM de primer, 2,5 unidades de Taq polimerase, 0,2 mM de cada dNTP 10 mM, 5 ng de DNA fúngico e 2,5 µL de tampão de reação (200 mM Tris-HCl pH 8.4, 1,5 mM MgCl2 50mM, 500 mM KCl) num volume total de 25 µL. Os parâmetros
utilizados no termociclador foram: 94°C por 2 minutos para o primeiro ciclo (desnaturação), 40 ciclos de: (i) 1 minuto a 94°C, (ii) 2 minutos a 34°C (anelamento do primer), (iii) 2 minutos a 72°C. Após o 40° ciclo, as amostras foram incubadas por 7 minutos a 72°C para extenção da cadeia. Controles negativos também foram incluídos em todas reações de RAPD. Alíquotas de 8 µL do material amplificado homogeneizadas com 2 µL de tampão de corrida (0,05% azul de bromofenol, 40% sucrose, 0,1 M EDTA pH 8, 0,5% SDS) foram submetidas à corrida eletroforética em gel de agarose 1,4% com brometo de etídio, em voltagem de 120 V por cerca de 2 horas e a seguir fotografada em transluminador UV.
Matrizes numéricas foram construídas a partir dos dados sobre presença ou ausência das bandas, as quais foram empregadas para análise de agrupamento pelo método de Neighbor-joining (SNEATH & SOKAL 1973), e construção do respectivo fenograma através do programa computacional Treecon for Windows (VAN DE PEER et al., 1997).
4.4. PCR com os primers para região ribossômica
Ladder (Gibco, Life Technologies) que indica, de acordo com o tamanho do fragmento no gel, as concentrações de 10, 20, 40, 80, 120 e 200 ng de DNA. Além de possibilitar a análise da qualidade do DNA, este procedimento permite estimar a quantidade de DNA presente na amostra, de acordo com o brilho e intensidade das bandas, comparando-as com as bandas do marcador.
A amplificação da região ITS (internal transcribed spacer) com finalidade de sequenciamento foi realizada com os primers ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC)e ITS5 (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG).
Os parâmetros utilizados nesta reação foram diferentes daqueles empregados na amplificação da gp43 descritos acima, pois para o sequenciamento são necessárias quantidades maiores de DNA amplificado. Assim a reação foi realizada num volume total de 50 µl, contendo 10 ng de DNA genômico, 1 X Taq Buffer (200 mM Tris-HCl pH 8.4, 500 mM KCl), 1,5 mM MgCl2, 0,20 mM of each dNTP, 25 pM of each primer (ITS4 e ITS5) e 5
U of Taq polymerase. Os parâmetros usados no termociclador foram: 94oC
por 5 min, 25 ciclos de 94oC por 1 min, 60oC por 2 min e 72oC for 2 min,
seguido de extensão final da cadeia por 7 min a 72oC.
4.5. Purificação dos produtos amplificados
4.6. Sequenciamento da regiaõ ITS (internal transcribed spacer) e do gene 5.8 S dos isolados de P.brasiliensis
Esta etapa do trabalho foi realizada na Fazenda Experimental do Lageado-UNESP/Botucatu, Departamento de Defesa Fitosanitária, sob coordenação da Dra. Eiko E. Kuramae e colaboração da Dra. Roseli C. Fenille. O grupo de pesquisa desta docente está envolvido nos projetos genoma da FAPESP, sendo assim, tivemos plena disponibilidade de equipamentos e de orientação para realizar todos os experimentos.
Primeiramente, foi feita nova quantificação em gel agarose 1%, agora do DNA amplificado e purificado. Foram aplicados 4 µl da amostra homogeneizados com 5 µl do tampão de corrida.. Como marcador molecular utilizamos o Marcador Pgem (Perkim Elmer, 50 ng/µ). A corrida eletroforética foi feita em cuba contendo solução de TBE 1X (Tris-Borato-EDTA) submetida a uma voltagem de 100 V. Todos isolados continham quantidades semelhantes de material amplificado (aproximadamente 30 ng) com exceção das amostras de DNA dos isolados T13LN1 e Bt 84. Portanto para estes isolados utilizamos nas reações: 7 µl de DNA, 2 µl de Big Dye (DYEnamicTM Terminator Cycle Sequencing Kit - Amersham Pharmacia) e 1
µl do primer. Para os demais, foram usados os seguintes reagentes: 3 µl água, 4 µl DNA, 2µl BigDye, 1µl do primer sense ITS4 ou 1µl do primer antisense ITS5. Vale ressaltar, portanto, que o sequenciamento foi feito em ambas direções, a fim de obtermos uma qualidade melhor. Todos foram colocados em termociclador e submetidos a 40 ciclos de (i) 95oC por 20
minutos, (ii) 50oC por 15 minutos e (iii) 60oC por 2 minutos. Em seguida, o
centrifugados nas mesmas condições por 5 minutos. Retiramos cuidadosamente todo o sobrenadante para não remover o pellet e deixamos secar até completa evaporação do etanol. Ressuspende-se o pellet em 3,4 µl de Formamida (Loading Dye, Amersham Pharmacia).
O sequenciamento automático foi feito em gel de poliacrilamida (Long Ranger SingelTM Pack, Perkin Elmer), submetido à corrida eletroforética por
RESULTADOS
1. VIRULÊNCIA
1.1. Unidades Formadoras de Colônias (UFC)
As figuras de 2 a 5 mostram as médias e respectivos desvios padrão dos dados de UFC/g de tecido, juntamente com as comparações pelos testes estatísticos.
A contagem de UFC/g tecido mostrou que quase 100% dos animais apresentaram leveduras viáveis no testículo. Disseminação fúngica foi observada em todos isolados de tatus em ambos períodos após a inoculação. Por outro lado, não houve recuperação de células viáveis nos órgãos de disseminação (baço, fígado ou pulmão), quando da inoculação do isolado clínico Pb 265. Nos isolados T3B6, T4B14, T5LN1, T8LN1 e T9B1, a contagem de UFC aumentou após 8 semanas tanto no baço quanto no fígado (Figuras 3 e 4), enquanto nos isolados T1F1 e T7F6 essa contagem diminuiu significativamente no fígado e no baço, respectivamente. Nos isolados T13LN1, T15LN1 e Pb 265, diferenças no número de UFC entre 4 e 8 semanas não foram significativas.
Figura 2- Unidades formadoras de colônias no pulmão dos hamsters, 4 e 8 semanas após
inoculação com dez isolados de P. brasiliensis obtidos de tatus e um isolado
clínico
P u l m ã o
0 1 2 3 4 5
T1F1 T3B6 T4B14
T5LN1 T7F6 T8LN1 T9B1 T10B1
T13LN1 T15LN1 Pb265
Log
10
UFC/g
4 8
Tukey (médias com a mesma letra não são significativamente diferentes)
Médias ™ordem decrescente Semanas
T10 T1 T9 T8 T13 T7 T15 T4 T3 T5 Pb265
4 2,84A 2,27 AB 1,22ABC 0,92BC 0,78BC 0,45BC 0,37BC 0,0 C 0,0C 0,0C 0,0 C
T8 T1 T9 T3 T13 T5 T7 T4 T15 Pb265 T10
# p < 0.05 na comparação entre 4 e 8 semanas
Figura 3 - Unidades formadoras de colônias no fígado dos hamsters, 4 e 8 semanas após
inoculação com dez isolados de P. brasiliensis obtidos de tatus e um isolado
clínico
F í g a d o
0 1 2 3 4 5 6
T1F1 T3B6
T4B14 T5LN1 T7F6 T8LN1 T9B1 T10B1
T13LN1 T15LN1 Pb265
Log10 UFC/g
4
8
#
# #
#
Tukey (médias com a mesma letra não são significativamente diferentes)
Médias ™ordem decrescente Semanas
T10 T1 T13 T3 T5 T9 T8 T15 T4 T7 Pb265
4 4,90A 4,07AB 3,83ABC 2,93BCD 2,72BCD 2,63BCD 2,62BCD 2,47BCD 2,35CD 1,61D 0,0E
T13 T3 T9 T5 T8 T1 T15 T4 T7 Pb265 T10
B a ç o
0 2 4 6 8
T1F1 T3B6
T4B14 T5LN1 T7F6 T8LN1 T9B1 T10B
1
T13LN
1
T15LN
1
Pb265
Log
10
UFC/G
4 8
# # # # #
# p < 0.05 na comparação entre 4 e 8 semanas
Figura 4 - Unidades formadoras de colônias no baço dos hamsters, 4 e 8 semanas após
inoculação com dez isolados de P. brasiliensis obtidos de tatus e um isolado
clínico
Tukey (médias com a mesma letra não são significativamente diferentes)
Médias ™ordem decrescente Semanas
T10 T1 T3 T13 T5 T15 T7 T4 T8 T9 Pb265
4 5,49A 4,36AB 3,61AB 3,55AB 2,80BC 2,58BCD 2,44BCD 0,58CDE 0,45DE 0,39DE 0,0E
T8 T3 T13 T1 T5 T4 T15 T9 T7 Pb265 T10
# p < 0.05 na comparação entre 4 e 8 semanas
Figura 5 - Unidades formadoras de colônias no testículo dos hamsters, 4 e 8 semanas após
inoculação com dez isolados de P. brasiliensis obtidos de tatus e um isolado
clínico
Te s t íc u lo
0 1 2 3 4 5 6 7
T1F1 T3B6
T4B14 T5LN1 T7F6 T8LN1 T9B1 T10B1
T13LN1 T15LN1 Pb265
LOG
10
UFC/g
4 8 #
Tukey (médias com a mesma letra não são significativamente diferentes)
Médias ™ordem decrescente Semanas
T10 T9 T13 T1 T8 T7 T5 Pb265 T15 T4 T3
4 4,30A 4,28A 4,06AB 3,97AB 3,85AB 2,87AB 2,29AB 2,27AB 2,12AB 2,12AB 0,94B
T8 T1 T9 T7 T3 T13 T4 Pb265 T15 T5 T10
1.2. Análise Histopatológica
A análise semi-quantitativa da extensão das lesões está ilustrada na Tabela 2. O testículo foi o órgão mais afetado, seguido pelo linfonodo, fígado, baço e pulmão.
Testículo. Todos isolados foram capazes de infecção e multiplicação neste órgão. Em geral, havia extensas lesões em todos animais e granulomas confluentes contendo fungos que ocupavam 2/3 ou toda a superfície de corte. Este padrão foi observado inclusive quando da inoculação do isolado clínico Pb 265.Os testículos de todos animais infectados com as cepas T7F6, T10B1 e T1F1 apresentaram inclusive extensa necrose central circundada por granulomas epitelióides, envolvendo a maior parte da superfície de corte. Alguns animais infectados com Pb265 (4 animais), T4B14 (3 animais), T15LN1 (3 animais) e T9B1 (2 animais) também apresentaram necrose central.
Assim, as lesões eram características da PCM, ou seja, presença de granulomas epitelióides contendo número variável de fungos.
Fígado. O fígado estava comprometido em todos animais exceto naqueles inoculados com o isolado clínico Pb 265. As lesões foram mais severas nos hamsters infectados com os isolados T1F1, T10B1 e T13LN1, nos quais havia vários granulomas confluentes contendo fungos. Nos hamsters infectados com T1F1, um halo mononuclear também pode ser observado. Naqueles infectados com T3B6, T5LN1, T7F6 e T8LN1, havia raros e pequenos granulomas contendo fungos em ambos períodos de sacrifício. Os isolados T4B14 e T9B1 induziram lesões nos hamsters somente no período de 4 semanas após a infecção.
animais com vários granulomas confluentes) e T7F6 (80% dos hamsters com raros e pequenos granulomas contendo fungos).
Pulmão. Foi o órgão para o qual os isolados disseminaram menos. A maioria dos animais não apresentavam lesões no pulmão, salvo alguns casos isolados, como por exemplo: 1 animal inoculado com T8LN1-4s; 1 animal inoculado com T10B1-4s, 1 animal inoculado com T1F1-4s, 2 animais inoculados com T9B1-4s e 2 animais inoculados T9B1-8s (poucos granulomas confluentes). Na maioria destes animais foi observado um único granuloma confluente com fungo.
Linfonodo. Este órgão foi o segundo mais afetado em todos os grupos de animais. As únicas exceções foram os isolados T4B14, que produziu lesões em apenas um animal do grupo de 8 semanas, e o isolado Pb 265, que produziu lesões em apenas 33.3% dos animais.
Tabela 2 - Extensão das lesões nos órgãos dos hamsters inoculados pela via intratesticular com um isolado clínico e isolados ambientais de P. brasiliensis após 4 e 8 semanas de inoculação, em lâminas coradas com HE e PAS.
Extensão das lesões
Número
de
semanas
Isolado Baço Fígado Testículo Linfonodo
T1F1 ++ +++
+++
+++
T3B6 0
+
0/+
0/+
T4B14 0
0
0/
+++
+
T5LN1 0
+
0/+
+
T7F6 + +
+++
++
T8LN1 0
+
+
+
T9B1 0
0
+++
++
T10B1 +++ ++
+++
+++
T13LN1 0
++
+++
0
T15LN1 0
+
0/+++
0
4
Pb265 0
0
+++
0
T1F1 ++ ++
+++
+++
T3B6 0 0/+ 0/+++ 0/+++
T4B14 0
+
0/+++
0
T5LN1 0 0/+
0/+
0
T7F6 + +
+++
+++
T8LN1 0
+
+++
+
T9B1 0
+
+++
++/+++
T13LN1 0
++
0/+++
0/++
T15LN1 0
+
0/+++
0/++
8
Pb265 0
0
+++
0
1.3. Análise sorológica (ELISA)
Figura 6 - Títulos de anticorpos anti-P.brasiliensis em hamsters infectados, pela via intratesticular, com 1.6 x 106 células leveduriformes de
cada isolado.
# p < 0.05 na comparação entre 4 e 8 semanas
4 semanas:
p < 0.05 (T10B1 vs T1F1, T3B6, T4B14, T5LN1, T7F6, T8LN1, T9B1,T13LN1, T15LN1 e Pb 265)
p < 0.05 (T1F1 vs T7F6, T9B1 e T13LN1)
8 semanas:
p < 0.05 (T7F6 vs T4B14 e T7F6 vs T1F1)
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
T1F1 T3B6
T4B14 T5LN1 T7F6 T8LN1 T9B1 T10B1
T13LN1 T15LN1 Pb265
is olad os
recíproca da
diluição do soro
4 s
8 s #
# #
# 106
105
104
103
102
10
2. CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR
2.1. Identificação genética
O método de extração de DNA foi bom, pois é seguro, de fácil execução e permite obter DNA de alta qualidade.
Figura 7 - PCR com os primers PC1/PC2 dos isolados T1F1 (linha A), T3B6 (linha B), T4B14 (linha C), T5LN1 (linha D), T7F6 (linha E), T8LN1 (linha F), T9B1 (linha G), T10B1 (linha H), T13LN1 (linha I), T15LN1 (linha J), Bt 60 (linha L), Bt 84 (linha M), Bt85 (linha N) e Pb 265 (linha O). Marcador molecular (linha 1) com fragmentos de 100, 200, 300, 400, 500, 600 (banda intensa), 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 e 2072 pares de bases.
1 A B C D E F G H I J L M N O
2.2. RAPD
Todos os 24 primers apresentaram pelo menos uma banda polimórfica. Os primers OPR01, OPR03, OPZ07, OPK17 e OPK19 apresentaram os maiores polimorfismos (Figura 8). A matriz de similaridade genética (obtida em porcentagem) está apresentada na Tabela 3. A Figura 9 sumariza os dados de agrupamento, origem geográfica e perfil de virulência dos isolados. Nesta figura está incluída na análise uma cepa de B. dermatitidis, agrupada separadamente dos isolados de P. brasiliensis com apenas 27% de similaridade genética. Assim, o RAPD foi capaz de separar geneticamente estas duas espécies.
O RAPD permitiu ainda a separação dos isolados de P. brasiliensis em dois grupos com aproximadamente 70% de similaridade genética. O grupo I corresponde aos isolados T10B1 e Bt84, com 81,02% de similaridade. Vale ressaltar que o isolado T10B1 apresentou importantes diferenças genéticas em relação aos demais isolados (similaridade foi menor que 70% na maioria da vezes). O grupo II reúne o restante dos isolados, ou seja, T3B6, Bt60, T15LN1, Bt85, T13LN1, T4B14, T5LN1, T8LN1, Pb265, T1F1, T9B1 e T7F6.
1 A B C D E F G H I J L M N O P 1 A B C D E F G H I J L M N O P
OPR01 OPR03
1 A B C D E F G H I J L M N O P
OPK17
Figura 8 -
RAPD com os primers OPR-01, OPR-03, OPK-19, OPK-17 e OPZ-07 dos isolados T1F1 (linha A), T3B6 (linha B), T4B14 (linha C), T5LN1 (linha D), T7F6 (linha E), T8LN1 (linha F), T9B1 (linha G), T10B1 (linha H), T13LN1 (linha I), T15LN1 (linha J), Bt 60 (linha L), Bt 84 (linha M), Bt85 (linha N),Blastomyces dermatitidis (linha O) e Pb 265 (linha P). Marcador molecular (linha 1) com fragmentos de 100, 200, 300, 400, 500, 600 (banda intensa), 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 e 2072 pares de bases.
OPK 19
1 A B C D E F G H I J L M N O P
OPK 19 OPK 19
1 A B C D E F G H I J L M N O P
OPZ 07
1 A B C D E F G H I J L M N O P
OPZ 07 OPZ 07
Tabela 3
- Matriz de similaridade genética (em %) dos isolados de
P. brasiliensis
obtida através do RAPD, juntamente com dados da
cepa de
B. dermatitidis
estudada
Coeficiente de similaridade entre os isolados
Isolados 1 3 4 5 7 8 9 10 13 15 Bt60 Bt84 Bt85 B.d.* Pb265
1
100
3
87,94
100
4
91,24
93,62
100
5
86,52
95,71
92,20
100
7
83,72
75,89
78,83
75,71
100
8
85,91
92,31
90,21
93,62
75,18
100
9
91,72 88,65 91,97 87,23 83,08 86,62 100
10
71,03 68,18 69,54 67,97 68,61 67,53 70,55 100
13
84,40 92,20 91,43 89,44 74,82 86,21 85,11 68,21 100
15
87,23 95,04 92,91 92,25 75,18 90,28 86,62 70,86 95,65 100
Bt60
87,86 97,12 92,20 92,91 75,71 89,58 87,23 70,20 93,52 96,40 100
Bt84
67,10 68,79 67,95 68,59 60,13 67,09 63,46 81,02 66,67 70,32 70,78 100
Bt85
87,86 95,71 92,20 92,91 75,71 89,58 87,23 69,08 90,78 93,62 95,68 70,78
100
B.d.*
27,56 27,27 27,78 26,06 24,66 27,44 25,79 26,97 25 27,44
27,61
31,79 27,61 100
Pb265
85,71 82,98 86,13 81,56 79,69 82,27 82,27 70,92 79,43 82,27 81,56 66,89 85,51 28,0 100
*NA (não avaliada)
Figura 9
- Fenograma de similaridade entre isolados de
P.brasiliensis
obtidos de tatus e de pacientes, gerado pelo
método de Neighbor-joining, utilizando-se de 24 primers da Operon Technologies, acrescido dos dados
de origem geográfica e perfil de virulência
2.3. PCR (ITS4 / ITS5) e Sequenciamento
Os dados de sequenciamento forneceram resultados precisos e confiáveis sobre a variabilidade genética na região ITS entre os isolados.
Figura 10 - PCR com os primers ITS4/ITS5 dos isolados T1F1 (linha A), T3B6 (linha B), T4B14 (linha C), T5LN1 (linha D), T7F6 (linha E), T8LN1 (linha F), T9B1 (linha G), T10B1 (linha H), T13LN1 (linha I), T15LN1 (linha J), Bt 60 (linha L), Bt 84 (linha M), Bt85 (linha N), B. dermatitidis (linha O), Pb 265 (linha P) e Controle negativo (linha Q). Marcador molecular (linha 1) com fragmentos de 100, 200, 300, 400, 500, 600 (banda intensa), 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 e 2072 pares de bases
Figura 11 - Seqüência de mRNA transcrita a partir do DNA ribossômico (genes 18 S, 5.8 S e 28 S) que dará origem às subunidades ribossomais. A flecha indica a região seqüenciada.
1 A B C D E F G H I J L M N O P Q
ITS1
ITS2
A figura 12 mostra a árvore filogenética obtida com os dados do sequenciamento. Duas sequências gênicas de P. brasiliensis, gi|3582686|Pb
(não publicada) e gi|6576803|Pb (IMAI et al., 2000) e uma de A. dermatitidis (gi|639452|Ajellomyces) obtidas pelo programa BLAST foram incluidas na análise. Os isolados clínicos foram agrupados juntamente com os isolados de tatus, sendo a seqüência gênica das cepas Bt60, Bt84, Bt85 e das cepas obtidas no GenBank, idêntica à seqüência de outros sete isolados de tatus. A região ITS apresentou pouca variabilidade genética entre os isolados, exceto pelo isolado T10B1 (14 diferenças na seqüência analisada). O isolado T9B1 apresentou 2 substituições de base, as mesmas detectadas no isolado T10B1. A localização geográfica pode ser um fator importante, pois ambos isolados são provenientes de Botucatu. Os isolados T3B6, T7F6 e Bt84 apresentaram apenas 1 mudança de nucleotídeo. Assim, o único isolado que apresentou maior variação gênica foi o mesmo com perfil de virulência e perfil de RAPD distintos dos demais (T10B1). As regiões ITS 1 e ITS 2 apresentaram praticamente o mesmo número de polimorfismos, do ponto de vista interespecífico. Foram observadas 10 substituições de base na região ITS 1 e 9 na região ITS 2, considerando todos os isolados de P. brasiliensis estudados. A figura 13 mostra as seqüências alinhadas pelo programa Clustal X. Estão incluídas aquelas, acima descritas, depositadas no GenBank e obtidas pelo programa BLAST. Identificamos as trocas de bases com cores distintas, sendo que as diferenças na sequência de B. dermatitidis foram colocadas em vermelho e as diferenças entre os isolados de P. brasiliensis estão em azul. Na sequência do fungo A. dermatitidis
Figura 13-CLUSTAL X(1.81) multiple sequence alignment
BT84 -GGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCCGTGGGGGGACGGGGCCC- T3B6 -GGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCCGTGGGGGGACGGGGCCC- T13LN1 -GGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCCGTGGGGGGACGGGGCCC- BT85 -GGGGGACCTCGGGAAGGATCATTAACGCGCCGTGGGGGGACGGGGCCC- gi|3582686|Pb ---AAGGATCATTAACGCGCCGTGGGGGGACGGGGCCC- gi|6576803|Pb ---CGCGCCGTGGGGGGACGGGGCCC- T5LN1 -GGTGAACT-GCGGAAGGATCATTAACGCGCCGTGGGGGGACGGGGCCC- T7F6 -GGTGAACTTGCGGAAGGATCATTAACGCGCCGTGGGGGGACGGGGCCC- T4B14 -GGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCCGTGGGGGGACGGGGCCC- T1F1 -GGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCCGTGGGGGGACGGGGCCC- PB265 -GGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCCGTGGGGGGACGGGGCCC- T15LN1 -GGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCCGTGGGGGGACGGGGCCC- BT60 --GTGAACCTGCGGAAGGATCAT-AACGCGCCGTGGGGGGACGGGGCCC- T8LN1 -GTTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCCGTGGGGGGACGGGGCCC- T9B1 -GTTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCCGTGGGGGACCGGGGCCC- T10B1 -GGTGAACTTCCGAAGGATCCATTAACGCCCCTGGGGGGACCGGGCCCC- B.d. GGTTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCCGTGGGGGGTTGGACCTCC
gi|639452|Ajellomyces -GGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCCGTGGGGGGTTGGACCTCC
*** ** ***** ** * *
BT84 --GATCGGGT---TCCCGGCCCTCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATTCT- T3B6 --GATCGGGT---TCCCGGCCCTCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATTCT- T13LN1 --GATCGGGT---TCCCGGCCCTCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATTCT- BT85 --GATCGGGT---TCCCGGCCCTCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATTCT- gi|3582686|Pb --GATCGGGT---TCCCGGCCCTCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATTCT- gi|6576803|Pb --GATCGGGT---TCCCGGCCCTCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATTCT- T5LN1 --GATCGGGT---TCCCGGCCCTCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATTCT- T7F6 --GATCGGGT---TCCCGGCCCTCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATTCT- T4B14 --GATCGGGT---TCCCGGCCCTCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATTCT- T1F1 --GATCGGGT---TCCCGGCCCTCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATTCT- PB265 --GATCGGGT---TCCCGGCCCTCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATTCT- T15LN1 --GATCGGGT---TCCCGGCCCTCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATTCT- BT60 --GATCGGGT---TCCCGGCCCTCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATTCT- T8LN1 --GATCGGGT---TCCCGGCCCTCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATTCT- T9B1 --GATCGGGT---TCCCGGCCCTCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATTCT- T10B1 --GATCGGGT---TCCCGGCCCTCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATTCT- B.d. TAGACCGGAGGAACCCCGGCCCCCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATTTTT
gi|639452|Ajellomyces TAGACCGGAGGAACCCCGGCCCCCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATTTTT
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BT84 ACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGGGCTCG-GCC T3B6 ACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGGGCTCG-GCC T13LN1 ACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGGGCTCG-GCC BT85 ACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGGGCTCG-GCC gi|3582686|Pb ACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGGGCTCG-GCC gi|6576803|Pb ACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGGGCTCG-GCC T5LN1 ACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGGGCTCG-GCC T7F6 ACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGGGCTCG-GCC T4B14 ACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGGGCTCG-GCC T1F1 ACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGGGCTCG-GCC PB265 ACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGGGCTCG-GCC T15LN1 ACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGGGCTCG-GCC BT60 ACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGGGCTCG-GCC T8LN1 ACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGGGCTCG-GCC T9B1 ACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGGGCTCG-GCC T10B1 ACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGGGCTCA-GCC B.d. ACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGAGTTTTCACT
gi|639452|Ajellomyces ACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGCCGGGGGAGTTTTCACT
**************************************** * * *
BT84 TCCCGGGCTCGTGCCCGCCGGGGACACCGTT-GAACTTCTTGTTCGGAGC T3B6 TCCCGGGCTCGTGCCCGCCGGGGACACCGTT-GAACTTCTGGTTCGGAGC T13LN1 TCCCGGGCTCGTGCCCGCCGGGGACACCGTT-GAACTTCTGGTTCGGAGC BT85 TCCCGGGCTCGTGCCCGCCGGGGACACCGTT-GAACTTCTGGTTCGGAGC gi|3582686|Pb TCCCGGGCTCGTGCCCGCCGGGGACACCGTT-GAACTTCTGGTTCGGAGC gi|6576803|Pb TCCCGGGCTCGTGCCCGCCGGGGACACCGTT-GAACTTCTGGTTCGGAGC T5LN1 TCCCGGGCTCGTGCCCGCCGGGGACACCGTT-GAACTTCTGGTTCGGAGC T7F6 TCCCGGGCTCGTGCCCGCCGGGGACACCGTT-GAACTTCTGGTTCGGAGC T4B14 TCCCGGGCTCGTGCCCGCCGGGGACACCGTT-GAACTTCTGGTTCGGAGC T1F1 TCCCGGGCTCGTGCCCGCCGGGGACACCGTT-GAACTTCTGGTTCGGAGC PB265 TCCCGGGCTCGTGCCCGCCGGGGACACCGTT-GAACTTCTGGTTCGGAGC T15LN1 TCCCGGGCTCGTGCCCGCCGGGGACACCGTT-GAACTTCTGGTTCGGAGC BT60 TCCCGGGCTCGTGCCCGCCGGGGACACCGTT-GAACTTCTGGTTCGGAGC T8LN1 TCCCGGGCTCGTGCCCGCCGGGGACACCGTT-GAACTTCTGGTTCGGAGC T9B1 TCCCGGGCTCGTGCCCGCCGGGGACACCGTT-GAACTTCTGGTTCGGAGC T10B1 TCCCGGGCTCGTGCCCGCCGGGGACACCGTT-GAACTTCTGGTTCGGAGC B.d. CCCCGGGCTCGTGCCCGCCGAGGACACCGCTAGAACTTCTGGT--GAACG
gi|639452|Ajellomyces CCCCGGGCTCGTGCCCGCCGAGGACACCGCTAGAACTTCTGGT--GAACG
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BT84 TTTGACGTCTGAGAC--CTATCATAATCAGTAAAAACTTTCAACAACGGA T3B6 TTTGACGTCTGAGAC--CTATCATAATCAGTAAAAACTTTCAACAACGGA T13LN1 TTTGACGTCTGAGAC--CTATCATAATCAGTAAAAACTTTCAACAACGGA BT85 TTTGACGTCTGAGAC--CTATCATAATCAGTAAAAACTTTCAACAACGGA gi|3582686|Pb TTTGACGTCTGAGAC--CTATCATAATCAGTAAAAACTTTCAACAACGGA gi|6576803|Pb TTTGACGTCTGAGAC--CTATCATAATCAGTAAAAACTTTCAACAACGGA T5LN1 TTTGACGTCTGAGAC--CTATCATAATCAGTAAAAACTTTCAACAACGGA T7F6 TTTGACGTCTGAGAC--CTATCATAATCAGTAAAAACTTTCAACAACGGA T4B14 TTTGACGTCTGAGAC--CTATCATAATCAGTAAAAACTTTCAACAACGGA T1F1 TTTGACGTCTGAGAC--CTATCATAATCAGTAAAAACTTTCAACAACGGA PB265 TTTGACGTCTGAGAC--CTATCATAATCAGTAAAAACTTTCAACAACGGA T15LN1 TTTGACGTCTGAGAC--CTATCATAATCAGTAAAAACTTTCAACAACGGA BT60 TTTGACGTCTGAGAC--CTATCATAATCAGTAAAAACTTTCAACAACGGA T8LN1 TTTGACGTCTGAGAC--CTATCATAATCAGTAAAAACTTTCAACAACGGA T9B1 TTTGACGTCTGAGAC--CTATCATAATCAGTAAAAACTTTCAACAACGGA T10B1 TTTGACGTCTGAGAC--CTATCATAATCAGTAAAAACTTTCAACAACGGA B.d. ATTGACATCTGAGAAAATAACTATAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGA gi|639452|Ajellomyces ATTGACATCTGAGAAAATAACTATAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGA ***** ******* * ********* ******************
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BT84 GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC T3B6 GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC T13LN1 GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC BT85 GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC gi|3582686|Pb GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC gi|6576803|Pb GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC T5LN1 GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC T7F6 GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC T4B14 GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC T1F1 GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC PB265 GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC T15LN1 GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC BT60 GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC T8LN1 GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC T9B1 GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC T10B1 GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC B.d. GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC gi|639452|Ajellomyces GTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGC **************************************************
BT84 CCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCA T3B6 CCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCA T13LN1 CCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCA BT85 CCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCA gi|3582686|Pb CCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCA gi|6576803|Pb CCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCA T5LN1 CCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCA T7F6 CCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCA T4B14 CCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCA T1F1 CCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCA PB265 CCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCA T15LN1 CCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCA BT60 CCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCA T8LN1 CCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCA T9B1 CCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCA T10B1 CCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCA B.d. CCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCAACCCTCA gi|639452|Ajellomyces CCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCAACCCTCA **************************************** *********
BT84 AGCGCGGCTTGCGTGTTGGGCCCGCGTCCCCCCGTGGACGTGCCCGAAAT T3B6 AGCGCGGCTTGCGTGTTGGGCCCGCGTCCCCCCGTGGACGTGCCCGAAAT T13LN1 AGCGCGGCTTGCGTGTTGGGCCCGCGTCCCCCCGTGGACGTGCCCGAAAT BT85 AGCGCGGCTTGCGTGTTGGGCCCGCGTCCCCCCGTGGACGTGCCCGAAAT gi|3582686|Pb AGCGCGGCTTGCGTGTTGGGCCCGCGTCCCCCCGTGGACGTGCCCGAAAT gi|6576803|Pb AGCGCGGCTTGCGTGTTGGGCCCGCGTCCCCCCGTGGACGTGCCCGAAAT T5LN1 AGCGCGGCTTGCGTGTTGGGCCCGCGTCCCCCCGTGGACGTGCCCGAAAT T7F6 AGCGCGGCTTGCGTGTTGGGCCCGCGTCCCCCCGTGGACGTGCCCGAAAT T4B14 AGCGCGGCTTGCGTGTTGGGCCCGCGTCCCCCCGTGGACGTGCCCGAAAT T1F1 AGCGCGGCTTGCGTGTTGGGCCCGCGTCCCCCCGTGGACGTGCCCGAAAT PB265 AGCGCGGCTTGCGTGTTGGGCCCGCGTCCCCCCGTGGACGTGCCCGAAAT T15LN1 AGCGCGGCTTGCGTGTTGGGCCCGCGTCCCCCCGTGGACGTGCCCGAAAT BT60 AGCGCGGCTTGCGTGTTGGGCCCGCGTCCCCCCGTGGACGTGCCCGAAAT T8LN1 AGCGCGGCTTGCGTGTTGGGCCCGCGTCCCCCCGTGGACGTGCCCGAAAT T9B1 AGCGCGGCTTGCGTGTTGGGCCCGCGTCCCCCCGTGGACGTGCCCGAAAT T10B1 AGCGCGGCTTGCGTGTTGGGTCCGCGTCCCCCCGTGGACGTGCCCGAAAT B.d. AGCGCGGCTTGTGTGTTGGGCCTTCGTCCCCCCGTGGACGTGCCCGAAAT gi|639452|Ajellomyces AGCGCGGCTTGTGTGTTGGGCCTTCGTCCCCCCGTGGACGTGCCCGAAAT *********** ******** * **************************
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BT84 AGG T3B6 AGT
T13LN1 AGG BT85 AGG gi|3582686|Pb AGG gi|6576803|Pb AGG T5LN1 AGG T7F6 AGG T4B14 AGG T1F1 AGG PB265 AGG T15LN1 AGG BT60 AGG T8LN1 AGG T9B1 AGG T10B1 AGG B.d.
---gi|639452|Ajellomyces
DISCUSSÃO
Vários estudos têm sido realizados com o objetivo de avaliar a virulência de diferentes isolados clínicos de P. brasiliensis, e vários modelos experimentais têm sido empregados (ZACCHARIAS et al., 1986, SANO et al., 1991, SINGER-VERMES et al., 1993, SINGER-VERMES et al., 1994, BURGER et al., 1996). Estes resultados confirmam que isolados distintos de
P. brasiliensis variam na sua virulência, um fato que pode explicar a detecção das diferentes manifestações clínicas da doença dentro de uma população (FRANCO, 1986).
Neste trabalho procurou-se avaliar a virulência de isolados recentes de tatus para melhor esclarecer a relação que este fungo estabelece com seu hospedeiro. São mais virulentos que isolados clínicos? Podem causar maiores lesões ou estão mais adaptados para sobreviver no tecido animal?
Os hamsters foram bastante susceptíveis à infecção pelo fungo, confirmando outros trabalhos nos quais isolados clínicos de P. brasiliensis
foram inoculados pela via intratesticular (IABUKI & MONTENEGRO, 1979; PERAÇOLI et al., 1982; PERAÇOLI et al., 1999). Os primeiros autores, através da histopatologia de vários órgãos, observaram grande disseminação da infecção em todos os animais, além de alta taxa de mortalidade. PERAÇOLI et al., (1982) observaram paracoccidioidomicose disseminada em 100% dos animais após a primeira semana de infecção. A forma disseminada da doença no hamster após a 11ª semana foi associada com depressão da imunidade celular, presença de granulomas frouxos, aumento do número de fungos, envolvimento progressivo de linfonodos, baço e outros órgãos e finalmente amiloidose.
(1999), estudo histopatológico, contagem de UFC de pulmão e dosagem de anticorpos específicos por imunodifusão. Por outro lado, o mesmo isolado de tatu apresentou baixa virulência quando inoculado em testículos de cobaias ou no coração de ratos Wistar (VIDAL et al., 1995).
A correlação entre extensão e padrão das lesões e UFC/g de tecido foi positiva. Valores elevados de UFC foram obtidas de órgãos com muitos granulomas epitelióides confluentes contendo grande quantidade de fungos, enquanto menores UFC foram obtidas quando a histopatologia mostrava poucos granulomas ou granulomas contendo fungos calcificados. Essa relação entre virulência e comprometimento dos órgãos já foi observada em trabalho anterior (ZACCHARIAS et al., 1986). Estes autores infectaram camundongos pela via intravenosa e observaram que a cepa Pb18, considerada de alta virulência, induziu grande lesão no pulmão, baço, fígado e adrenais, enquanto a cepa Pb 192, de baixa virulência, induziu lesões menores e a cepa Pb 265, avirulenta neste estudo, não induziu qualquer lesão.
