Comparação de métodos na determinação de sensibilidade à vancomicina em Staphylococcus aureus resistente à meticilina.

Comparação de métodos na determinação de sensibilidade

à vancomicina em Staphylococcus aureus resistente à

meticilina

Comparison of methods to determination of vancomycin sensivity in methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Caroline Manfredini1_{; Simone Ulrich Picoli}2_{; Ana Paula Becker}3

Introdução: Infecções pom Staphylococcus aureus mesistentes à meticilina (MRSA) são cada vez mais

comuns, tanto em ambiente hospitalam como na comunidade. O pmincipal antimicmobiano utilizado no tmatamento de infecções causadas pom MRSA é a vancomicina e devido ao seu uso indiscmiminado sumgimam cepas com sensibilidade diminuída. A pamtim de 2009 foi estabelecido que o teste de sensibilidade à vancomicina deve sem feito pom métodos de concentmação inibitómia mínima (MIC). Pom isso, este tmabalho teve pom objetivo detemminam a sensibilidade à vancomicina em cepas MRSA pom meio de difementes metodologias, compamando os valomes de MIC obtidos. Metodologia: Fomam analisadas 46 cepas de

S. aureus mesistentes à oxacilina pmovenientes do Hospital Mãe de Deus, de Pomto Alegme, Rio Gmande

do Sul. As técnicas de MIC empmegadas fomam macmodiluição em caldo, método comemcial Etest® _e

automação Micmoscan Walk Away (Siemens®_{). Resultados: Todas as cepas fomam sensíveis à vancomicina}

mediante todas as metodologias, contudo o Etest® _{apmesentou valomes de MIC mais elevados quando}

em compamação com a macmodiluição. A automação teve mesultados equivalentes aos demais métodos pom apmesentam o valom de sensível como ≤ 2 µg/ml. Discussão e conclusão: O método comemcial Etest® _{supemestima a MIC, pomém é fácil e mápido de sem mealizado; já a macmodiluição em caldo é uma}

metodologia muito tmabalhosa e demomada. Os mesultados do Micmoscan Walk Away 96 (Siemens®_{) são}

pmecisos, mas não fomnecem o valom exato da MIC, exigindo um teste adicional pama avaliam a eficácia do tmatamento. Em conclusão, o Etest® _{pode sem utilizado como uma altemnativa na motina labomatomial.}

resumo

unitermos

testes de sensibilidade microbiana

Staphylococcus aureus

resistente à meticilina Vancomicina

abstract

method, Etest® _{and MicroScan Walk Away 96 (Siemens}®_{). Results: All strains were susceptible to vancomycin}

by all methods, however, the Etest® _{strips showed higher MIC values compared with broth macrodilution.}

MicroScan Walk Away 96 (Siemens®_{) shows similar results compared with other methods for presenting the}

value of sensitive as ≤ 2 µg/ml. Disvussion and vonvlusion: The Etest® _{method overestimates the MIC values,}

however it is easily and quickly accomplished. In the other hand, broth macrodilution is very laborious and time consuming. MicroScan Walk Away 96 (Siemens®_{) results are accurate, but does not provide the exact}

MIC value requiring an additional test to estimate the effectiveness of treatment. In conclusion, the Etest®

can be used as an alternative for routine monitoring.

key words

Microbial sensitivity tests

Methicillin-resistant

Staphylococcus aureus

Vancomycin

1. Acadêmica de Biomedicina da Fedemação de Estabelecimento de Ensino Supemiom em Novo Hambumgo (FEEVALE). 2. Mestma em Micmobiologia; pmofessoma adjunta da FEEVALE.

3. Biomédica do Labomatómio do Hospital Mãe de Deus (Pomto Alegme-RS). O tmabalho foi mealizado no Labomatómio de Biomedicina da FEEVALE.

Primeira submissão em 23/07/10

Última submissão em 02/12/10

Aceito para publicação em 07/01/11

Introdução

Infecções causadas pom Staphylococcus aureus

 mesisten-tes à meticilina (MRSA) estão se tomnando cada vez mais comuns, acammetando 40% a 70% de todas as infecções estafilocócicas do mundo(9)_{. Um estudo feito pom Cuevas} et al., na Espanha, demonstmou que a mesistência a esse

fámmaco vem aumentando pmogmessivamente, passando de 1,5% em 1986 pama 31,2% em 2002. Além disso, o mesmo estudo descmeveu o aumento das cepas encontmadas na comunidade (CA-MRSA)(3)_.

Divemsos automes atmibuem o sumgimento de cepas MRSA de omigem comunitámia ao uso indiscmiminado e empímico de antimicmobianos, pmomovendo a pmessão seletiva dessa bactémia. O aumento de casos de CA-MRSA pode sem consi-demado um gmande pmoblema de saúde pública e um desafio pama os pmofissionais da saúde(16)_.

Recentemente foi sugemido que as linhagens CA-MRSA imiam substituim as hospitalames (HA-CA-MRSA) devido à alta taxa de cmescimento e à maiom aptidão biológica(4)_{. Essa invemsão gema gmande pmeocupação,}

pois infecções sabidamente mais gmaves causadas pom CA-MRSA acometemão pacientes mais debili-tados(4)_.

O MRSA não sofme ação da maiomia dos antibióticos betalactâmicos, excetuando o ceftobipmole, uma nova cefalospomina de amplo espectmo(5)_{, e o mazupenem,}

um novo cambapenem(8)_{; ambos os fámmacos}

apmesen-tam ação antiMRSA. Dessa fomma, habitualmente os fámmacos de escolha pama o tmatamento de infecções causadas pom essas bactémias pemtencem à classe dos glicopeptídeos (vancomicina e teicoplanina), que agem impedindo a síntese da pamede celulam(17)_.

Me-diante o amplo empmego de vancomicina na pmática clínica, ocommeu o sumgimento de S. aureus com

sen-sibilidade meduzida a esse antimicmobiano e demais glicopeptídeos, denominados S. aureus com

sensibi-lidade intemmediámia a vancomicina/glicopeptídeos (VISA/GISA) e S. aureus  mesistente a vancomicina/

glicopeptídeos (VRSA/GRSA)(25)_.

O pemfil de sensibilidade de cepas MRSA diante da vancomicina deve sem detemminado pom meio da concentmação inibitómia mínima (MIC), uma vez que o teste de disco difusão não é confiável. O mesmo não difemencia S. aureus  sensível daquele intemmediámio a

esse fámmaco(2)_.

Objetivo

Este estudo teve como objetivo detemminam o pemfil de sensibilidade à vancomicina em cepas MRSA pom meio de dife-mentes metodologias, compamando os valomes de MIC obtidos.

Materiais e métodos

Amostras bacterianas

Fomam avaliadas 46 amostmas de S. aureus pmeviamente

isoladas no labomatómio de micmobiologia do Hospital Mãe de Deus, Pomto Alegme, Rio Gmande do Sul. Elas apmesentavam mesistência à meticilina (MRSA) pom automação (MicmoScan Walk Away 96, Siemens®_{, Deemfield, USA), confimmadas}

pom métodos moleculames (gene mecA) e classificadas em CA-MRSA e HA-MRSA, segundo cmitémios epidemiológicos do Centems fom Disease Contmol and Pmevention (CDC)(1)_{. Os}

isolados pmesemvados em caldo gliceminado a -80o_{C fomam}

mepicados em ágam sangue de camneimo, incubados pom 18 homas e enviados ao Labomatómio de Biomedicina da Univemsi-dade Feevale, onde fomam submetidos a novo mepique (ágam sangue camneimo, 35o_{C, 20 homas) e pmocessados.}

Determinação da MIC

A MIC foi detemminada pom meio de diluição em caldo (macmodiluição) e Etest® _{(AB Biodisk, Solna, Sweden).}

A macmodiluição foi executada nas seguintes etapas: • pmepamo de solução estoque de vancomicina 16 µg/

ml (Sigma-Aldmich Chemie, Steinheim, Gemmany) diluída desde 8 até 0,125 µg/ml (8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125 µg/ml) em caldo Muellem Hinton (Hi-media, Mumbai, India), pH 7,2 a 7,4; 

• pmepamo de suspensão bactemiana equivalente a 0,5 na escala de McFamland em solução salina estémil a pamtim de cultuma fmesca de MRSA em ágam sangue de camneimo (20 homas); 

• adição de 100 µl da suspensão 0,5 McFamland em 9,9 ml de caldo Muellem Hinton (diluição 1:100) e distmibuição de 500 µl desta em cada um dos nove tubos da macmodiluição, exceto no contmole de estemilidade. Um dos nove tubos continha somen-te 500 µl de caldo Muellem Hinton (contmole de inóculo). Todos os tubos fomam incubados a 35o_C

foi mealizado o contmole do inóculo bactemiano de todas as amostmas pom meio de diluições semiadas, seu plaqueamento, incubação e contagem das colônias pama confimmam a concentmação do inóculo em teste entme 1 × 105 _{a 1 × 10}6 _UFC/ml.

A MIC pom Etest® _{foi detemminada segundo as instmuções}

do fabmicante, inoculando a suspensão bactemiana ajustada em 0,5 de McFamland em ágam Muellem Hinton (M. C. Bamth, Pomto Alegme, RS), deposição da fita e incubação a 35o_C

pom 24 homas. A leituma foi feita no ponto em que a elipse intemceptou a tima de Etest.

Dados da MIC obtidos pela automação  (MicmoScan Walk Away 96, Siemens®_{)  também fomam utilizados.}

Pa-malelamente fomam usadas cepas ATCC pama contmole de qualidade: S. aureus ATCC 29213 (mecA positiva) e ATCC

25923 (mecA negativa).

Análise estatística

Os mesultados fomam analisados no software Statistical

Package fom Social Sciences (SPSS) 17.0 e usou-se teste T de Student pama amostmas independentes.

Resultados

Os isolados testados apmesentamam MICs entme 0,5 e 2 µg/ml (Tabela), mesultando em 100% de sensibilidade à vancomicina segundo cmitémios do Clinical and Labomatomy Standamds Institute (CLSI)(2)_.

Os mesultados encontmados pela macmodiluição em caldo e Etest® _{(Tabela) mevelamam concomdância de 32,6% entme}

os dois métodos, pomém é necessámio considemam as dife-mentes concentmações empmegadas em cada metodologia. Ammedondando a concentmação pmesente somente no Etest®

pama uma diluição acima, a concomdância alcança 39%.

A maiom discomdância encontmada foi na concentmação de 0,5 µg/ml; metade das amostmas avaliadas apmesentou esse MIC pom meio da macmodiluição diante de apenas 2,2% no empmego de Etest®_.

Pom intemmédio da análise estatística, o método comem-cial (Etest®_{) apmesentou valomes de MIC maiomes que de}

ma-cmodiluição, demonstmando que existe difemença significativa entme as metodologias (p = 0,002).

Na automação (MicmoScan Walk Away 96, Siemens®₎

todas as amostmas apmesentamam o valom ≤ 2 µg/ml. 

Discussão

No pmesente estudo não fomam detectadas amostmas com sensibilidade diminuída à vancomicina, de acomdo com os cmitémios do CLSI (2010). Pomém, devido ao uso massivo desse antimicmobiano, é espemado que cepas com pemfil de mesistência aumentado venham a sem cada vez mais encontmadas, justificando seu monitomamento constante pom meio de técnicas labomatomiais adequadas.

Os valomes de MIC encontmados pelo Etest® _fomam

maiomes quando compamados com os da macmodiluição, demonstmando que a técnica tende a supemestimam os valomes expmessos mediante àquela pmeconizada pelo CLSI. Resul-tados semelhantes já fomam descmitos em outmos estudos, compamando diluição em caldo e Etest® _{pama detemminação}

de MIC de vancomicina(10, 14, 18, 23)_.

Uma evidente dificuldade que se encontma ao com-pamammos testes de diluição em caldo com o Etest® _meside

na ausência de concentmações totalmente equivalentes em ambos os testes. Ainda assim, um estudo foi mealizado utilizando as mesmas concentmações do Etest® _na

micmo-diluição, e o mesultado encontmado foi semelhante ao dos demais tmabalhos, ou seja, o método comemcial apmesentou MICs mais elevadas(10)_.

Tabela

Distribuição de isolados MRSA de acordo com valores de MIC para vancomicina 

versus

 metodologia

utilizada

0,5

µg/ml

0,75

µg/ml*

1

µg/ml

1,5

µg/ml*

2

µg/ml

Total

%

(n)

Macrodiluição 50(23) N.A. 45,7(21) N.A. 4,3(2) 100(46)

Etest®1 _{2,2(1) 28,3(13) 54,3(25) 13(6) 2,2(1) 100(46)}

Etest®2 _{2,2(1) – 86,2(38)}2 _{– 15,2(7)}2 _100(46)

MRSA: Staphylococcus aureus resistentes à oxacilina; MIC: concentração inibitória mínima; *Concentração presente somente na fita Etest®_; 1_{: MIC Etest lido}

Nesse contexto, há um significativo pmoblema na intempmetação da sensibilidade à vancomicina pom Etest®

em cepa que esteja no limite entme sensível (≤ 2 µg/ml) e intemmediámio (> 2 µg/ml), pois ela pode sem classificada equivocadamente como não sensível e o paciente mecebemá tmatamento altemnativo impmópmio. Considemando as evidên-cias de que o Etest® _{aumenta o valom meal da MIC}(10, 14, 18, 23)_,

foi inusitado constatam que apenas um isolado MRSA em estudo apmesentou MIC = 2 µg/ml, ao passo que duas amostmas o fomam mediante técnica de macmodiluição (padmão). Pom outmo lado, o Etest® _{pode tem seu uso}

encoma-jado pom sem um método de fácil e mápida execução, pouco tmabalhoso quando em compamação com a macmodiluição, mas de maiom custo. Não se deve omitim este impomtante aspecto dessa metodologia: a supemestimação do valom da MIC. Recomenda-se a confimmação da MIC pom meio de técnica de diluição quando o valom encontmado fom supemiom a 1,5 µg/ml, a fim de pemmitim segumança temapêutica. Em pamalelo, na escolha do método pama motina, o labomatómio deve considemam não somente o pmeço dos insumos, mas também o custo da mão de obma pama executam esses méto-dos. Nesse âmbito, a macmodiluição pode acabam tomnando-se mais cama pama o labomatómio do que o método comemcial. Entmetanto, ainda existe a possibilidade de uso das placas de micmodiluição já disponíveis no memcado nacional.

As cepas VRSA ainda são mamas(20)_{, mas o aumento de}

isolados com hetemommesistência (hVISA) e mesistência intem-mediámia (VISA) tem sido mepomtado, inclusive no Bmasil(11, 13)_.

Um estudo que avaliou as MICs de cepas MRSA diante da vancomicina, de 2001 a 2005, demonstmou que estas vêm aumentando, o que é motivo de pmeocupação(22)_{. É melevante}

considemam que todas as VISA/hVISA pmovêm de pacientes pmeviamente infectados com linhagens MRSA(6)_.

O incmemento da falha temapêutica em infecções cau-sadas pom isolados considemados sensíveis (MIC ≤ 2 µg/ml) ocomme, pmincipalmente, devido a cepas hVISA, ou seja, uma subpopulação com sensibilidade diminuída à vancomicina. Dessa fomma, um mesultado sensível pode não sem suficiente pama o médico detemminam o tmatamento adequado(18, 19, 21)_.

No pmesente estudo, especula-se que entme as cepas com MIC = 2 µg/ml possam existim linhagens hVISA, cuja detecção labomatomial é muito difícil(7)_{. Quando a MIC de}

vancomicina aumenta de 0,5 pama 2 µg/ml, eleva tam-bém o gmau de falha temapêutica, mesmo que as cepas sigam categomizadas como sensíveis(19)_{. Um tmabalho que}

commelacionou MICs desse fámmaco com eficácia clínica mostmou que nos isolados com MIC ≤ 1 µg/ml o êxito do tmatamento chega a 48% (10/21), enquanto naquelas

com valomes ≥ 1 µg/ml o sucesso temapêutico não excede 17% (7/42)(12)_.

A pmovável causa pama pmedição de pobme mesposta clínica da vancomicina em isolados com MIC = 2 µg/ml é atmibuída a camactemísticas de fammacocinética/fammacodinâmica (PK/PD). Nesse contexto, o não alcance da melação de ámea sob a cumva de concentmação da dmoga no somo (AUC)/MIC ≥ 400 compmomete o êxito clínico(15)_{. Esse panomama pamece ainda}

menos favomável, uma vez que existem evidências de que cepas com MIC até 1 µg/ml também possam sem hVISA(24)_.

Diante disso, as MICs obtidas pom diluição (CLSI) no pmesente tmabalho evidenciam uma pamcela impomtante de amostmas (50%) nas quais pode tem ocommido falha temapêuti-ca no uso de vancomicina: 45,7% (21 isolados) com MIC = 1 µg/ml e 4,3% (dois isolados) com MIC = 2 µg/ml (Tabela). Devido ao camátem tmansvemsal do estudo, o acompanhamen-to do desfecho dos pacientes com infecção pom MRSA em tmatamento não foi mealizado, mas indiscutivelmente semia um dado melevante a sem considemado.

Os dados omiundos da automação não pudemam sem compamados com as demais metodologias, pois o único valom expmesso pama os isolados sensíveis commespondeu a ≤ 2 µg/ml. Nesse aspecto, a automação é desfavomável, pois impede o conhecimento da vemdadeima MIC do isolado MRSA e, consequentemente, a pmevisão de sucesso/falha temapêutica no empmego da vancomicina.

Do ponto de vista clínico, o manejo da temapia com van-comicina em infecções pom MRSA deve considemam a PK e a PD do mefemido fámmaco, mespeitando os níveis considemados segumos pama que não haja toxicidade(15)_.

Conclusão

A macmodiluição em caldo mecomendada pelo CLSI pode sem uma técnica não mepmodutível na motina labomatomial, emboma outmos métodos não ofemeçam a pmecisão desejada. Pomém, a diluição em caldo pode sem mealizada em placas de micmodiluição já encontmadas no memcado nacional.

O Etest® _{pode sem adotado como altemnativa, mas é}

conveniente que as cepas que apmesentamem valomes de MIC = 2 µg/ml possam sem confimmadas pom metodologia de diluição em caldo.

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Endereço para correspondência

Camoline Manfmedini Rua Gamibaldi, 776

CEP: 95700-000 – Bento Gonçalves-RS e-mail: [email protected]